Dissertationen zum Thema „Pathogen (Ralstonia solanacearum)“

The plant pathogen Ralstonia solanacearum is the causal agent of bacterial wilt, a highly aggressive disease responsible for important worldwide economic losses. Many virulence factors in R. solanacearum have been already identified; however, their transcriptional regulation during disease development remained unknown. In an effort to better characterize the gene expression changes driving bacterial virulence, we first provided the complete genome sequence of the potato R. solanacearum UY031 strain as a tool to perform robust transcriptomics in planta. By taking advantage of the novel sequencing technology called SMRT, we also supplied hints on the methylome profile and its contribution to virulence gene expression in UY031. In this work, we performed two different in planta transcriptome approaches at different potato infection stages. On one hand, we analyzed the bacterial gene expression during root colonization and demonstrated that, although it is cost-ineffective, microbial transcriptomes in planta at low bacterial densities are possible without a prior enrichment of prokaryotic RNA. Furthermore, we identified a novel player controlling bacterial fitness during early infection stages that we named RepR for Repressor Regulator, since we discovered that it is a repressor of specific metabolic pathways. On the other hand, we performed a time- course transcriptome and show that expression of R. solanacearum virulence factors and metabolism is dynamic along the infection process. With our system, we validated the expression patterns of known virulence factors such as the Type III Secretion System (T3SS) or the flagellum, and unraveled the profiles of others like Type IVb pili or the T6SS. Contrary to the assumption that the T3SS might play only a role at early infection stages, we demonstrate that effector transcription is extremely high in advanced disease stages. Finally, we performed a pilot test to identify T3SS inhibitors and demonstrate that some salicylidene acylhydrazides can potentially prevent bacterial plant diseases via T3SS transcription inhibition. This work adds growing knowledge on the pathogen behavior and its physiology at different points of the disease, which could eventually lead to the identification of new drugs targeting keys steps in disease development.
Ralstonia solanacearum és l’agent causant del marciment bacterià en plantes, una malaltia altament agressiva i responsable de considerables pèrdues econòmiques d’impacte mundial. Molts factors de virulència de R. solanacearum han sigut identificats, però la seva regulació transcripcional al llarg del desenvolupament de la malaltia encara es desconeixia. En un intent de caracteritzar els canvis en l’expressió genètica que modulen la virulència del bacteri, en primer lloc hem proporcionat la seqüència completa del genoma de la soca de patateres R. solanacearum UY031 com a eina per a dur a terme transcriptomes robustos dins de la planta. Gràcies a la nova tecnologia de seqüenciació anomenada SMRT, també proporcionem algunes pistes sobre el seu perfil de metilació i la contribució d’aquest en l’expressió de gens de virulència a UY031. En aquest estudi hem realitzat dos transcriptomes del bacteri en patateres en diferents estadis d’infecció. Per una banda hem analitzat l’expressió genètica bacteriana durant la colonització de l’arrel i hem demostrat que, malgrat ser poc rentable, és possible analitzar el transcriptoma del bacteri dins de la planta sense enriquir prèviament les mostres amb ARN procariota. Així mateix, hem identificat un nou membre que regula l’eficàcia biològica del bacteri durant els estadis inicials de la infecció que hem anomenat RepR, de Repressor Regulador, ja que hem descobert que reprimeix rutes metabòliques concretes. Per altra banda, hem fet un transcriptoma a diferents estadis de la infecció i demostrem que l’expressió de factors de virulència i del metabolisme de R. solanacearum és dinàmica al llarg del procés infectiu. Amb el nostre sistema, hem validat els patrons d’expressió de factors de virulència ja coneguts, com el Sistema de Secreció de Tipus III (SST3) o el flagel, i hem desxifrat els perfils d’altres factors com el dels pilus de tipus IVb o el SST6. En contra de l’assumpció que el SST3 juga principalment un paper als estadis primerencs de la infecció, hem demostrat que la transcripció de molts efectors és extremadament alta en estadis avançats de la malaltia. Finalment, hem dut a terme una prova pilot per a identificar inhibidors del SST3 i hem demostrat que algunes salicidèn-acilhidrazides tenen potencial per a prevenir malalties bacterianes de plantes mitjançant la inhibició de la transcripció del SST3. Aquest treball afegeix nou coneixement en el comportament i la fisiologia del patogen en diferents estadis de la malaltia, que amb el temps podria contribuir a la identificació de nous fàrmacs dirigits en passos claus en el desenvolupament de la malaltia.

Ralstonia solanacearum est une bactérie phytopathogène à la gamme d'hôte exceptionnellement large et à la répartition mondiale. Cet organisme présente une biologie à facettes multiples et s'est adapté à quasiment tous les types de sols, à la vie planctonique, et à de nombreux hôtes et plantes réservoirs. Cette capacité d'adaptation est attestée par une très forte hétérogénéité des souches qui unifient ce complexe d'espèces, aussi bien au plan de la diversité génétique, phénotypique, que de la gamme d'hôte. Des approches phylogénétiques ont montré une structuration de la population mondiale en quatre phylotypes qui correspondent globalement à l'origine géographique des souches. Les travaux de thèse portent sur des souches du phylotype II qui ont valeur de modèle expérimental car épidémiologiquement inféodées à un hôte particulier : souches Moko pathogènes du bananier, souches ‘Brown rot’ adaptées à la pomme de terre et souches émergentes NPB, un variant du pouvoir pathogène. La question de recherche centrale porte sur la compréhension des mécanismes d'adaptation à l'hôte. Pour cela, une dizaine de génomes ont été séquencés dans une perspective (i) de revisiter la taxonomie de ce complexe d'espèce, (ii) d'en faire une analyse génomique comparative et (iii) d'analyser les paysages transcriptomiques produits lors de l'infection (in planta). L'ensemble des ces approches complémentaires permettent ainsi d'intégrer la complexité génétique et phénotypique de l'organisme de manière plus systémique
Ralstonia solanacearum is a plant pathogenic bacterium globally distributed with a particularly broad host range. This organism is biologically diverse and is adapted to all types of soil, to planktonic lifestyle and to many plant hosts and natural reservoirs. This bacterium is a species complex and its genetic, phenotypic and host range diversity is a direct consequence of adaptation mechanisms. Phylogenetic analyses have divided this species complex into four distinct phylotypes correlating mostly with strains’ geographical origin. This thesis focuses on using phylotype II strains as an experimental model due to their adaptation to specific hosts: Moko strains pathogenic to banana, ‘Brown rot’ strains adapted to potatoes and emergent pathological variant NPB strains. Our main research topic is the understanding of host adaptation processes. In order to tackle this problematic we sequenced about ten genomes as a starting point of (i) a taxonomic revision of the species complex (ii) a comparative genomic analysis and (iii) an in planta transcriptomic analysis. Together, these complementary approaches allow a more systemic view of this organism’s genetic and phenotypic complexity

Ralstonia solanacearum is a genetically diverse and geographically widespread plant pathogen. It has a wide host range and is a significant pathogen of potato, causing brown rot. Brown rot is caused by a distinct, closely-related, intraspecific group: race 3, biovar 2A. In Europe, infection of potato crops with brown rot primarily occurs via irrigation with contaminated surface water. Brown rot has never been found in Scottish potatoes though the bacterium has been found previously in one Scottish river system, the River Tay, both in water samples and on its secondary host, bittersweet (Solanum dulcamara), growing on the river banks. A molecular strain-typing method principally used in clinical microbiology, multi-locus sequence typing (MLST), was used to study genetic variation within a collection of 106 R. solanacearum isolates, principally race 3 biovar 2A isolates from potato, S. dulcamara and contaminated water sources. Twenty-seven isolates from contaminated water and S. dulcamara from Scotland and other isolates from diverse geographic locations, from a variety of diseased plants and the environment, were resolved into 16 sequence types. A subsequent follow-up to the first experiment was carried out by looking at more variable genes within the race 3, biovar 2A genome and again similar or identical relationships were uncovered. All Scottish isolates were found to be identical and similar to most race 3 biovar 2A isolates tested. Analysis of Variable Number Tandem Repeats (VNTRs) confirmed this observation. After sequencing one of the tandem repeat regions, the results strongly suggest that contamination of the River Tay in Scotland occurred as a single or limited event, since the Scottish isolates had a unique tandem repeat pattern different from the patterns observed for the rest of the race 3 biovar 2A isolates and strains studied. This suggests that the Scottish isolates are clonal and the contamination is a single event and not a multiple contamination.

A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, afeta principalmente as solanáceas, destacando-se as culturas da batata, berinjela, jiló, pimentão e tomate. No presente trabalho foi conduzida a caracterização molecular de isolados de R. solanacearum e sua possível relação com características relacionadas à morfologia, bioquímica, patogenicidade, agressividade e distribuição geográfica. Foram utilizados 51 isolados pertencentes à biovar 2, sendo 9 provenientes de berinjela e 42 de batata, coletados em diversas regiões brasileiras. A análise molecular permitiu separar os isolados em quatro grupos distintos de padrões de bandas para os iniciadores BOX e ERIC, e em cinco para o iniciador REP. Não foi encontrada relação dos grupos de isolados caracterizados molecularmente com tamanho de colônias, ocorrência de mutantes, produção de melanina, capacidade de colonização do sistema radicular e resistência a antibióticos/fungicidas. A identificação de isolados de batata, como biovar 2-A, e de berinjela, como biovar 2-T, com base em teste bioquímico do uso de trealose, foi confirmadas pela análise molecular. Não houve variação de agressividade entre os isolados inoculados em batata e berinjela, exceção feita ao isolado avirulento CNPH-65. Portanto, isolados das biovares 2-A e 2-T podem infectar estas duas hospedeiras com a mesma intensidade sob altas temperaturas. Para todos os isolados, o desenvolvimento da população bacteriana foi significativamente maior no sistema radicular de plantas das cultivares suscetíveis, tanto para batata como para berinjela. No entanto, dentro de cada cultivar, os isolados se comportaram de maneira semelhante, não sendo possível fazer distinção entre os mesmos. A tentativa de se associar grupos de isolados caracterizados molecularmente com os locais de origem revelou alguns aspectos interessantes. O grupo I agregou somente isolados do Paraná. No grupo II ficaram isolados da Bahia, Distrito Federal e do Paraná. No Grupo III, foram reunidos todos os isolados de berinjela e um único de batata, sendo todos procedentes do Distrito Federal. O grupo IV, de forma semelhante ao grupo II, reuniu isolados de locais diversos como Paraná, Goiás, Rio Grande do Sul e Distrito Federal. Portanto, nos grupos I e III parece haver uma tendência de relação entre grupamento molecular e local de origem, enquanto que para os grupos II e IV, isolados de características genéticas similares são provenientes de locais distintos, apontando considerável diversidade genética do patógeno.
The bacterial wilt disease caused by Ralstonia solonacearum affects mainly the solanaceous species, specially potato, eggplant, peppers, tomato and brazilian gilo (Solanum gilo). This work reports the molecular characterization of R. solanacearum biovar 2 isolates and the possible relationship of this molecular data with other characteristics related to morphology, biochemistry, pathogenicity, aggressiveness and geographical distribution. Fifty-one biovar 2 isolates were studied, 9 isolated from eggplant and 42 from potato, all of them collected from different regions of Brazil. According to the molecular analysis, the isolates were clustered in four different groups, with distinct band patterns to the primers BOX and ERIC, and five groups to the primers REP. There was no relationship between the groups clustered through molecular analyses and phenotypic characteristics, such as colony size, presence of mutants, melanin presence, capability of root system colonization and antibiotic/fungicide resistance. The identification of potato isolates as the biovar 2-A, and the eggplant isolates as biovar 2-T, based on biochemical tests using trealose were confirmed with the molecular analyses. There was no variation of aggressiveness in the isolates inoculated on potato an eggplant, except the avirulent isolate CNPH-65. Consequently, isolates of biovars 2-A and 2-T are able to infect both hosts with the same aggressiveness under high temperatures. The population of all isolates developed in significant levels at the root system of susceptible cultivars of both hosts, potato and eggplant. However, considering each cultivar tested, there was no difference between isolates. Interesting results were observed when the isolates clustered based on molecular data were associated with the geographical region of their collection. The group I clustered only the isolates collected in Paraná. The group II clustered the isolates collected in Bahia, Federal District and some in Paraná. The group III clustered all isolates from eggplant and only one of potato, all of them collected in the Federal District. The group IV, as the group II, clustered isolates from different regions, like Paraná, Goiás, Rio Grande do Sul and Federal District. These results suggest a relationship between the isolates clustered through molecular analysis in the groups II and III and their geographical region of collection. The isolates clustered in the same way, with similar genetic background in the groups II and IV, were however collected in different regions, showing the great genetic variation of this pathogen.

Les lectines sont des protéines capables de reconnaître des glucides complexes de manière spécifique et réversible sur des surfaces des cellules et des membranes cellulaires. Ce travail de thèse est centré sur l’étude des interactions entre des lectines produites par les bactéries pathogèniques burkholderia cenocepacia et ralstonia solanacearum et leurs ligands carbohydrates. Différents outils, tels que la cristallographie, la résonance plasmonique de surface, la microcalorimétrie de titration… ont été utilisés pour caractériser deux lectines. La bactérie ralstonia solanacearum, pathogène de plantes, produit trois lectines solubles, RSI, RS-III et RS20L. Ces lectines ont été précédemment cristallisées mais la caractérisation de RS20L n’est pas complète. Au cours de cette thèse, la production de RS20L recombinante a été optimisée et son comportement physicochimique analysé par 2D SDS-PAGE / MALDI-MS et DSC. Cependant tous les essais pour déterminer la spécificité et l’affinité de cette lectine se sont révélés infructueux et de nouvelles stratégies devront être développées. La deuxième partie de ce travail est consacrée à une lectine de la bactérie opportuniste burkholderia cenocepacia, responsable d’une forte mortalité pour les patients qui souffrent de la mucoviscidose ou de granulomatose chronique. La lectine BC2L-C est une protéine de 28 kDa, composée de deux domaines qui ont été clonés séparément, produits dans E. Coli et caractérisés. Le domaine C-terminal montre des similarités de séquences et de structure avec la lectine PA-IIL de Pseudomonas aeruginosa et a une forte affinité pour les oligosaccharides mannosylés. Le domaine N-terminal a aussi la faculté de lier des glucides avec une spécificité forte pour les oligosaccharides fucosylés tels que déterminants de groupe sanguin de type H ou Lewis. Le domaine N-terminal en complexe avec le selenio-methyl-fucoside cristallise dans une forme trimérique qui n’a pas été encore observée chez les lectines mais qui est très similaire au TNF-α ou au composant C1q du complément. La lectine BC2L-C représente donc une nouvelle superlectine avec deux domaines et leur spécificité
Lectins are carbohydrate-binding proteins of non-immune origin that bind specifically to complex carbohydrates. The presented Ph. D. Thesis is approaching the study of molecular mechanisms of interactions between lectins produced by pathogenic bacteria Burkholderia cenocepacia and Ralstonia solanacearum and their carbohydrate ligands. Cristallography, surface plasmon resonance, titration microcalorimetry and other tools were used for the characterisation of two lectins. The plant bacterial pathogen Ralstonia solanacearum produces three soluble lectins RSL, RS-IIL and RS20L. All of them have been previously studied but the characterisation of RS20L was not complete. During this thesis, the production of the RS20L lectin was optimised and its physicochemical behaviour analysed by 2D SDS-PAGE / MALDI-MS analysis and DSC. However, different assays for determining carbohydrate specificity and affinity were not successful and different strategies have to be designed. The second part of the thesis is devoted to a lectin from the human opportunistic pathogen Burkholderia cenocepacia, responsible of high mortality in patients with cystic fibrosis or chronic granulomatous diseases. The BC2L-C lectin is a 28 kDa protein composed of two distinct domains that were separately cloned and produced in E. Coli and characterised. The C-terminal domain shows sequence and structure similarity to the Pseudomonas aeruginosa lectin (PA-IIL) and recognises with high affinity D-mannosylated glycans. The N-terminal domain also displays sugar-binding ability with a strong preference for L-fucosylated oligosaccharides such as H-type and Lewis histo-blood group determinants. The N-terminal domain complexed with selenio-methyl-fucoside crystallises as a trimeric assembly that has not been observed for lectins earlier but that is highly similar to the TNF- α or C1q complement structures. The BC2L-C lectin is therefore a new superlectin with two different carbohydrate-biding domains and specificities

Several recent studies have shown that bacteria which are non pathogenic to in vivo plants become pathogenic to in vitro plants. Bacteria can occur in the internal tissue of in vivo plants, often remaining in a latent state and be retained within the explant during the process of in vitro culture. The reasons why non pathogenic bacteria often become pathogenic to plants under in vitro conditions are unknown. In this study plant~bacterial complexes were established to measure the interactions between plant and bacteria in axenic plants grown under in vitro and photoautotrophic conditions. The plant~bacterial complexes were developed using Solanum tuberosum cv. Atlantic with a plant pathogen Pseudomonas solanacearum,(virulent and avirulent forms), and a plant saprophyte Pseudomonas fluorescens.These complexes were used to study interactions that would correlate with known plant defence mechanisms. Interactions of the plant~bacterial complexes were investigated by determining the following aspects: the activity of the enzyme peroxidase; the number of colony forming units mL-1 in infected tissue; attachment and envelopment of bacteria by the plant cell wall using transmission electron microscopy; attachment of bacteria to external surfaces of roots using scanning electron microscopy; the anatomical changes in infected roots and stems using light microscopy; and points of entry of bacterial cells into the root system using light microscopy and scanning electron microscopy.Peroxidase activity in uninfected plants grown under in vitro conditions was significantly higher than in plants grown in photoautotrophic axenic conditions. The factors of low light and sucrose were shown to increase the peroxidase levels in the stem of uninfected plants.

Ralstonia solanacearum, agent du flétrissement bactérien, affecte près de 200 espèces végétales. Les gènes RRS1-R confèrent à l'écotype d'A. Thaliana Nd-1 une résistance à différentes souches de R. Solanacearum. RRS1-R code une protéine de structure modulaire associant les domaines typiques de nombreuses protéines de résistance TIR-NBS-LRR et un domaine signature de facteurs de transcription WRKY. Dans l'écotype sensible Col-0, le gène RRS1-S code pour une protéine qui présente une structure très semblable. Au cours de ce travail, nous avons montré que les gènes RRS1-R et RRS1-S s'expriment essentiellement dans les cellules du péricycle et les cellules de passage de l'endoderme des racines matures et de la base de l'hypocotyle, cellules qui correspondent aux sites de pénétration des bactéries dans le système vasculaire où elles se multiplient. Nous avons montré que les deux domaines WRKY des protéines codées par ces gènes se fixent spécifiquement aux boites W, reconnues par les facteurs de transcription de la famille WRKY. Nous avons par la suite développé une approche DamID (DNA adenine methyltransferase IDentification) visant à identifier les gènes cibles des protéines RRS1-R et RRS1-S in vivo. L'analyse a été focalisée sur l'identification des gènes cibles de RRS1-R, dans le fond génétique résistant Nd-1 exprimant, ou pas, la protéine d'avirulence PopP2 sous contrôle d'un promoteur inductible. Dans chacun des cas le séquençage d'une centaine de FARMs (Fragments Associated to RRS1-driven Methylation) a permis de proposer des cibles potentielles et un modèle de fonctionnement de RRS1-R comme régulateur transcriptionel. Ce travail se poursuit par une analyse globale au niveau du génome, grâce au séquençage haut débit des FARMS et par l'étude de la fonction dans la réponse de la plante et de la régulation transcriptionelle de quelques cibles d'intérêt. Les résultats de ce travail illustrent dans leur ensemble l'importance de RRS1-R pour réguler la réponse des plantes à R. Solanacearum
In nature, plants are constantly exposed to microbial pathogens and have evolved an effective and dynamic immune system in order to survive. R. Solanacearum, the causing agent of wilt disease, is a soil-borne bacteria pathogenic on more than 200 plant species. Bacteria enter roots, invade xylem vessels and then spread rapidly to aerial parts of the plant through the vasculature. In A. Thaliana Nd-1 plants, RRS1-R, with its partner RPS4 allows resistance to strains of R. Solanacearum that deliver PopP2, a type III effector, into the plant cells. Previous studies showed that RRS1 and RPS4 are two NBS-LRR receptor proteins involved in the perception of the effector. Interestingly, RRS1 also harbors a WRKY transcription factor domain in its C-terminal end. In a susceptible Arabidopsis ecotype Col 0, RRS1-S is an allelic gene of RRS1-R, which encodes a similar structure. The recognition of bacterial and plant proteins leads to RRS1 protein accumulation in the nucleus, triggering possibly transcriptional gene regulation. Important genomic reprogramming of the infected plant cells has indeed been shown. My work shows that the RRS1-S and RRS1-R genes are expressed mainly in mature roots and basal hypocotyls, in pericycle cells and passage cells from the endoderm. These cells correspond to entry sites of the invading R. Solanacearum bacteria within the vascular tissues. We also demonstrated the binding of WRKY domain of RRS1-R and RRS1-S, in vitro, to W boxes which are cis-regulatory elements recognized by WRKY transcription factors. In order to identify the in vivo target sequences of RRS1-R and RRS1-S, a DamID (DNA adenine methyltransferase IDentification) approach, detecting transitory DNA-protein associations was developed. DamID is based on the fusion of a protein of interest to a DNA Adenine Methyl-transferase from E. Coli, which will methylate DNA in the vicinity of the binding sites of this protein. The fingerprints can be further mapped by DNA restriction with methylation sensitive enzymes, and cloned or directly sequenced. Analysis was focused on RRS1-R, by cloning FARMs (Fragment Associated to RRS1 driven Methylation) from Nd-1 plants expressing or not an inducible PopP2 gene. This allowed the identification of several putative targets of RRS1-R and led us to propose a model for its function as a transcription factor. High throughput sequencing was then initiated at a whole genome scale analysis. The function and transcriptional regulation of a putative RRS1 target gene was evaluated. Taken together, the results of this study illustrate the important role of RRS1-R in the regulation of the plant response to R. Solanacearum

Ralstonia solanacearum a dans son répertoire d’effecteurs de type III une famille de gènes codant pour des protéines nommées GALA. Ces protéines possèdent une structure caractéristique des protéines à F-box eucaryotes qui entrent dans la composition des complexes SCF impliqués dans l’ubiquitination des protéines. Nous avons démontré l’action collective des protéines GALA dans la virulence de la bactérie. Nous avons identifié au sein de cette famille le premier effecteur contrôlant la virulence de la bactérie sur une plante hôte. Il est apparu que les effecteurs GALA se comportent comme des protéines à F-box de plante et pourraient ainsi contrôler l’ubiquitination de protéines cibles dans la cellule végétale. Une cible candidate a été identifiée. Nous avons mis en évidence une protéine végétale susceptible d’être impliquée dans une voie de signalisation contrôlant la mise en place du Flétrissement bactérien. Nous proposons une hypothèse sur l’activité moléculaire des effecteurs GALA
Ralstonia solanacearum type III effector candidate repertory contains a gene family coding for proteins designated GALA. The GALA proteins possess a protein structure characteristic of eukaryotic F-box proteins. F-box proteins are subunits of SCF complexes involved in protein ubiquitination; a process controlling eukaryotic cellular homeostasis. In the course of this work, we demonstrated that GALA proteins are genuine effectors, and that they collectively play a role in R. Solanacearum virulence. Within the family, we identified the first effector from this bacteria controlling virulence on a specific host. Our studies revealed that GALA effectors behave as plant F-box proteins and that they could mediate ubiquitination of target proteins in the host cell. A target has been identified. We identified for the first time a plant protein potentially involved in a signaling pathway controlling Bacterial wilt establishment. We propose a model for the molecular activity of GALA effectors

HrpG est le régulateur central de la virulence chez la bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum. HrpG intègre des signaux environnementaux et hôte-dépendants et induit la transcription du système de sécrétion de type III via HrpB, ainsi que près de 200 gènes indépendants de HrpB. Un régulateur fortement homologue à HrpG a été identifié et caractérisé. Ce régulateur, PrhG, induit également l'expression de hrpB mais uniquement en réponse au signal environnemental. Nous avons montré que HrpG et PrhG sont deux régulateurs directs de hrpB et dont les séquences cis-régulatrices sont partiellement communes. Les études effectuées visent à comprendre comment HrpG et PrhG se partagent le contrôle de l'expression de hrpB et à mieux définir le régulon HrpG pour identifier les fonctions impliquées dans la colonisation et l'adaptation in planta
HrpG is the central virulence regulator of the phytopathogenic bacterium Ralstonia solanacearum. HrpG integrates environmental and host-dependent signals and induces the expression of type III secretion system genes via HrpB, as well as almost 200 genes independent from HrpB. A regulator highly homologous to HrpG was identified and characterised. This regulator, called PrhG, also induces the expression of hrpB, but only upon the environmental signal. We showed that HrpG and PrhG are two direct regulators of hrpB and that they partly require the same cis-regulatory sequences. The objective of our study is to understand how HrpG and PrhG share the control of hrpB expression and to define more precisely HrpG regulon in order to identify functions implicated in colonisation and adaptation to the host environment

Les souches de Ralstonia solanacearum dites 'race 3 biovar 2' sont les agents responsables de la maladie de la pourriture noire de la pomme de terre, une maladie dévastatrice dans les régions intertropicales et émergente en Europe. Par une analyse de génomique comparative, nous avons identifié chez la souche IPO1609 une délétion génomique de 77 kilobases entrainant une perte quasi-complète de virulence chez la souche IPO1609. La caractérisation fonctionnelle de cette région delétée a permis d'identifier deux loci majeurs contribuant à la virulence de la souche IPO1609: deux gènes de la voie de biosynthèse de la méthionine, metER, et des gènes vraisemblablement impliqués dans la biosynthèse d'auxine. L'expression des gènes metER est dépendante du régulateur central de la pathogénie HrpG. Un mutant metER n'est pas auxotrophe mais est significativement atténué en virulence, démontrant ainsi un premier lien direct entre le métabolisme de la méthionine et la pathogénie de R. Solanacearum
Ralstonia solanacearum is one of the most devastating plant pathogen worldwide. Through a comparative genomic analysis between R. Solanacearum 'race3 biovar 2' strains, the causal agent of potato brown rot, we identified a 77kb region which is absent in the hypovirulent strain IPO1609. We proved that IPO1609 indeed carries a 77kb genomic deletion and we provide genetic evidence that presence of this deletion is responsible for almost complete loss of pathogenicity of this strain. We identified two loci having a major contribution to IPO1609 pathogenesis: the methionine biosynthesis genes metER and a gene cluster putatively involved in the biosynthesis of the phytohormone auxin. Expression of metER is controlled by the pathogenicity regulator HrpG, and the finding that a metER mutant is not auxotrophic but is significantly reduced in virulence provides the first direct link between methionine metabolism and pathogenicity in R. Solanacearum

Le complexe d'espèces Ralstonia solanacearum (RSSC) est un pathogène de plantes très agressif qui affecte plus de 250 espèces végétales dont la tomate, la pomme de terre, le Pelargonium, le gingembre et le bananier. De plus, ce pathogène multi-hôtes est connu pour sa capacité d'adaptation rapide à de nouvelles plantes hôtes et à de nouveaux environnements. Afin de combattre ce pathogène, il est nécessaire de mieux connaitre les mécanismes moléculaires qui gouvernent ces capacités adaptatives. Les objectifs de cette thèse ont été (1) d'identifier les bases génétiques de l'adaptation d'une souche RSSC à un cultivar résistant, (2) d'analyser le rôle potentiel des modifications épigénétiques dans l'adaptation à l'hôte et (3) d'analyser l'impact de l'espèce végétale sur les modifications génétiques, transcriptomiques et épigénétiques dans les clones bactériens adaptés. Cette étude a été menée sur des clones générés par évolution expérimentale de la souche GMI1000 de RSSC après 300 générations de passages en série sur la tomate résistante 'Hawaii 7996', l'aubergine sensible 'Zebrina' et le haricot tolérant 'Blanc précoce'. Des tests de compétition avec le clone ancestral GMI1000 ont démontré que 95% des clones évolués sur Hawaii 7996 étaient mieux adaptés à la croissance dans cette espèce de tomate que le clone ancestral. L'analyse des séquences génomiques de ces clones adaptés a révélé entre 0 et 2 mutations par clone et nous avons démontré que ces mutations étaient des mutations adaptatives. L'analyse des transcriptomes des clones évolués sur Hawaii 7996, Zebrina et Haricot a révélé un chevauchement parmi les listes des gènes différentiellement exprimés, suggérant une convergence vers un recâblage global du réseau de régulation de la virulence. Deux régulateurs de transcription, HrpG, l'activateur du régulon du système de sécrétion de type III et EfpR, un régulateur global de la virulence et des fonctions métaboliques, sont apparus comme des nœuds clés du réseau de régulation qui sont fréquemment ciblés par des modifications génétiques ou potentiellement épigénétiques affectant leur expression. Des variations transcriptomiques significatives ont également été détectées dans des clones évolués n'ayant aucune mutation, suggérant ainsi un rôle probable des modifications épigénétiques dans l'adaptation. La comparaison des profils de méthylation de l'ADN entre les clones évolués et le clone ancestral a révélé entre 13 et 35 régions différentiellement méthylées (DMRs). Aucun impact de la plante hôte sur la liste des DMRs n'est apparu. Certaines de ces DMRs ciblaient des gènes qui ont été identifiés comme étant différentiellement exprimés entre les clones évolués et le clone ancestral. Ce résultat supporte l'hypothèse que les modifications épigénétiques régulent l'expression des gènes et pourraient jouer un rôle majeur dans l'adaptation de RSSC à de nouvelles plantes hôtes
The Ralstonia solanacearum species complex (RSSC) is a destructive plant pathogen that infects more than 250-plant species including tomato, potato, pelargonium, ginger and banana. In addition, this multihost pathogen is known for rapid adaptation to new plant species and new environments. In order to overcome this pathogen, it is important to understand the molecular mechanisms that govern host adaptation. The objectives of this thesis were (1) to decipher the genetic bases of adaptation of a RSSC strain to a resistant cultivar, (2) to investigate the potential role of epigenetic modifications in host adaptation and (3) to analyze to impact of the plant species on genetic, transcriptomic and epigenetic modifications in RSSC adapted clones. This study was conducted on clones generated by experimental evolution of GMI1000 RSSC strain after 300 generation of serial passages on the resistant tomato ‘Hawaii 7996’ plant, the susceptible eggplant ‘Zebrina’ and the tolerant plant Bean ‘Blanc precoce’. Competitive experiments with the GMI1000 ancestral clone demonstrated that 95% of the clones evolved on Hawaii 7996 were better adapted to the growth into this tomato plant than the ancestral clone. Genomic sequence analysis of these adapted clones found between 0 and 2 mutations per clone and we demonstrated that they were adaptive mutations. Transcriptome analysis of the Hawaii, Zebrina and Bean evolved clones revealed a convergence towards a global rewiring of the virulence regulatory network as evidenced by largely overlapping gene expression profiles. Two transcription regulators, HrpB, the activator of the type 3 secretion system regulon and EfpR, a global regulator of virulence and metabolic functions, emerged as key nodes of this regulatory network that were frequently targeted by either genetic or potential epigenetic modification affecting their expression. Significant transcriptomic variations were also detected in evolved clones showing no mutation, suggesting a potential role of epigenetic modifications in adaptation. Comparison of the DNA methylation profiles between the evolved clones and the ancestral clone revealed between 13 and 35 differentially methylated regions (DMRs). No impact of the host plant on the list of DMRs appeared. Some of these DMRs targeted genes that were identified to be differentially expressed between the evolved clones and the ancestral clone. This result supported the hypothesis that epigenetic modifications regulate gene expression and could play a major role in RSSC adaptation to new host plants

La bactérie phytopathogène R. Solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien. Les effecteurs de type III sont des protéines injectées par la bactérie dans le cytoplasme végétal et essentielles au pouvoir pathogène mais certains peuvent être reconnus par les plantes ce qui conduit à la résistance végétale. Nous avons identifié deux effecteurs, AvrA et PopP1 qui limitent le spectre d'hôte de R. Solanacearum GMI1000 sur trois espèces de tabac. Nous avons aussi pu démontrer l'activité enzymatique tréhalose-6-phosphate synthase (TPS) de l'effecteur RipTPS (pour Ralstonia injected protein TPS). Le tréhalose-6-phosphate étant une molécule signal qui régule notamment le métabolisme des sucres chez les plantes, il est possible que RipTPS altère le métabolisme végétal au cours de l'infection
The plant pathogenic bacterium R. Solanacearum is the causal agent of bacterial wilt. The type III effector proteins that are delivered by the bacteria into plant cells manipulate the host cell physiology in a way that favors bacterial multiplication, but recognition of these effectors by the plant immune system can also lead to resistance against the pathogen. We have identified two effectors, AvrA and PopP1, which determine host specificity of strain GMI1000 on three tobacco species. We have also demonstrated that an effector, called RipTPS (Ralstonia injected protein TPS), possesses a trehalose-6-phosphate synthase (TPS) activity. Since trehalose-6-phosphate is a key signal molecule controlling sugar metabolism in plants, it is hypothesized that RipTPS specifically alters the plant cell metabolism during infection

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum possède, parmi son répertoire d'effecteurs de type III, une famille de sept protéines nommées GALA. Les GALA sont collectivement requises pour le pouvoir pathogène de R. Solanacearum sur différentes plantes hôtes. De plus, les GALA sont homologues à des protéines à domaine F-box, impliquées dans le système ubiquitine-protéasome des eucaryotes. Les GALA pourraient donc permettre à la bactérie de manipuler la stabilité de certaines protéines végétales lors de l'infection. Au cours de ce travail, nous avons montré que les membres de la famille GALA ont subi une divergence fonctionnelle au cours de l'évolution. En intégrant des analyses bioinformatiques avec des données expérimentales, nous avons montré que les GALA possédaient des spécificités fonctionnelles, notamment dans leur contribution au pouvoir pathogène sur différents hôtes. Cette divergence fonctionnelle a sans doute permis la conservation de cette famille d'effecteurs dans les différentes souches de R. Solanacearum. Nous avons ensuite analysé la fonction de virulence de GALA7 qui est un facteur de spécificité d'hôte sur Medicago truncatula. Une analyse structure-fonction a été initiée dans le but d'identifier les acides aminés nécessaires à la fonction de cet effecteur au cours de l'infection. En parallèle, l'étude de plantes transgéniques exprimant GALA7 indique que cet effecteur semble posséder une activité E3-ubiquitine ligase dans les cellules végétales. Enfin, des interacteurs potentiels des GALA ont été identifiés lors d'un crible double-hybride chez la levure. Notre travail fournit ainsi de nouvelles perspectives sur les forces sélectives agissant au cours de l'évolution des effecteurs de type III et contribue à une meilleure compréhension de la fonction des GALA lors de l'infection
The plant pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum possesses a large repertoire of type III effectors, among which a family of seven proteins called GALAs. GALAs are collectively required for the virulence of R. Solanacearum on different host plants. Interestingly, GALAs are homologous to plant F-box proteins which are involved in the eukaryotic ubiquitine-proteasome system. Thus GALAs could enable R. Solanacearum to manipulate the stability of some plant proteins during infection. Through this work, we demonstrated that the GALA family members underwent functional divergence during evolution. Integrating bioinformatics studies along with experimental data, we showed that GALA proteins display functional specificities and show differential requirement for pathogenicity on different hosts. This functional divergence likely contributed to the remarkable conservation of the GALA family among R. Solanacearum strains. We then analyzed more specifically the virulence function of GALA7 which had been shown to be a host specificity factor on Medicago truncatula. A structure-function analysis was initiated in order to identify the amino-acids which are required for GALA7 function during infection. Using transgenic plants expressing GALA7, we showed that this effector is probably an active E3-ubiquitine ligase enzyme within plant cells. Finally, using a yeast two-hybrid screen, we identified several putative GALA interactors. Our work thus provides new insights into the selective forces driving the evolution of type III effectors and contributes to a better understanding of GALA functions during infection

Recemment la resistance au fletrissement bacterien cause par la bacterie r. Solanacearum a ete identifiee chez des varietes locales d'aubergine chinoise. Cependant les meilleures ressources genetiques proviennent d'especes sauvages apparentees : s. Torvum, s. Aethiopicum et s. Sisymbriifolium presentant de hauts niveaux de resistance a r. Solanacearum. La tres faible compatibilite sexuelle de ces especes avec l'aubergine et l'absence de connaissance sur le determinisme genetique de la resistance a r. Solanacearum dans le complexe aubergine sont des freins a l'efficacite d'une amelioration genetique. Cette etude a donc eu pour objets de mieux comprendre le determinisme de la resistance dans ce complexe d'especes et d'analyser les potentiels transferts de resistance a cette maladie par fusions somatiques interspecifiques. L'analyse de la resistance a r. Solanacearum au sein de croisements realises entre des genotypes d'aubergine sensibles et resistants laisse supposer que le determinisme genetique de la resistance a r. Solanacearum chez l'aubergine impliquerait un ou plusieurs qtl. La sequence homologue a rrs1 trouvee chez laubergine pourrait etre un des constituants de ce determinisme. Parmi les especes etudies, s. Torvum constitue une ressource genetique d'interet pour ameliorer la resistance au fletrissement chez l'aubergine et represente un modele pour l'etude des genes de resistance a r. Solanacearum dans ce complexe l'obtention d'hybrides entre l'aubergine et s. Torvum ainsi que s. Sisymbriifolium montre que l'hybridation somatique asymetrique est une bonne strategie pour transferer des resistances aux maladies tout en maintenant la fertilite des hybrides
Recently, resistance to bacterial wilt caused by r. Solanacearum was identified in local variety of chinese eggplant. However, the best genetic resources for eggplant improvement are wild related species such as s. Torvum, s. Aethiopicum and s. Sisymbriifolium which present high levels of resistance to r. Solanacearum. The sexual incompatibility of these species with eggplant and the lake of knowledge on genetic determinism of resistance in eggplant complex are brakes in the efficiency of genetic improvement this study had for objects to better understand the resistance determinism in this complex and to analyze the potential transfers of resistance to this disease by interspecific somatic fusion. The analysis of the resistance to r. Solanacearum within crossings realized between sensitive and resistant eggplant genotypes let suppose that the genetic determinism of the resistance to r. Solanacearum in eggplant would imply one or several qtl. The equivalent sequence to rrs1 found in eggplant could be one of the constituents of this determinism. Among the wild species, s. Torvum constitutes a genetic resource of interest to improve the resistance to bacterial wilt in eggplant and represents a model for study of the resistance genes to r. Solanacearum in this complex. The obtaining of hybrids between eggplant and s. Torvum as well as s. Sisymbriifolium shows that the asymmetric somatic hybridization is a efficient strategy to transfer resistances to diseases while maintaining the fertility of hybrids

A la différence des mammifères, les plantes ne possèdent pas de cellules spécialisées dans la défense face aux pathogènes. Chaque cellule végétale peut déclencher une réponse immunitaire. Pour interagir avec succès avec la plante, les pathogènes doivent alors supprimer ou contourner les défenses de l’hôte. Afin d’y parvenir, les bactéries pathogènes disposent des effecteurs, des protéines qui peuvent être injectées dans la cellule végétale. De nombreux effecteurs sont connus pour cibler les organites lors de l’infection, confirmant l’importance du chloroplaste et de la mitochondrie dans les mécanismes de défense des cellules végétales. Dans ces conditions, il demeure vital pour la plante de garder la main sur l’expression des gènes des organites afin d’assurer une réponse proportionnée au risque encouru sans pénaliser la croissance de façon disproportionnée. A la différence de l’expression des gènes nucléaires, la régulation de l’expression des gènes des organites se fait principalement lors d’étapes très complexes de maturation post-transcriptionnelle. Parmi les protéines impliquées dans ces étapes de maturation, on trouve les protéines pentatricopeptide repeat (PPR). Les protéines PPR sont impliquées dans de nombreuses étapes de maturation des ARN des organites, comme l’édition C vers U ou l’épissage. Elles sont également présentes chez d’autres eucaryotes, mais n’ont jamais été étudiées chez les bactéries. L’hypothèse testée dans le cadre de la thèse est que ces protéines PPR, qu’elles soient d’origine exogène ou endogène, sont impliquées dans des modifications de l’expression des gènes des organites en condition de stress biotique. Afin de tester notre hypothèse, nous nous sommes intéressés à PGN (Pentatricopeptide repeat protein for Germination on NaCl) chez la plante modèle A. thaliana. Caractérisée par Laluk et al. (2011), le mutant KO montre une sensibilité accrue au nécrotrophe Botrytis cinerea, et l’expression du gène codant pour cette protéine est induite après infection. Nous avons mis en évidence des défauts d’édition dans la séquence non codante en amont de nad6 et dans cox2, deux gènes mitochondriaux. Leur édition ne varie cependant pas en condition d’infection par Botrytis cinerea. Dans la même optique, à la suite d’un crible bio-informatique, nous nous sommes intéressés à deux protéines PPR bactériennes que nous avons trouvées chez les phytopathogènes Erwinia amylovora et Ralstonia solanacearum. Probablement obtenues par les bactéries par transfert horizontal de gènes, il s’agit de la première caractérisation de PPR bactériennes à notre connaissance. Ces protéines possèdent des caractéristiques d’effecteurs, c’est—dire des protéines injectées par la bactérie dans la plante durant l’infection. Si nous n’avons pas vu de modification du transcriptome des organites de la plante provoqué par la surexpression de ces protéines PPR exogènes, nous avons cependant mis en évidence une baisse significative du taux d’incidence de la maladie provoquée par E. amylovora en l’absence d’un gène fonctionnel codant pour sa PPR chez la plante hôte Malus domestica « Golden delicious ». Pour la PPR d’E. amylovora comme celle de R. solanacearum, nous avons également trouvés plusieurs interactants en double hybride levure chez A. thaliana, représentant de nombreuses cibles putatives à étudier. Afin de réaliser ces expérimentations et d’obtenir ces résultats, nous avons eu besoins d’outils particuliers. Nous avons donc développé un pipeline spécifique d’analyse de données de séquençage d’ARN ainsi qu’une méthode améliorée de prédiction des zones de fixation des protéines PPR, ouvrant la voie à une caractérisation simplifiée de nombreuses protéines
Compared to mammals, plants do not have highly specialized cells involved in defense against pathogens. Each plant cell is able to start an immune response. To interact successfully with plants, pathogens have to block or bypass host defenses. To do so, phytopathogenic bacteria can use effectors, which are basically bacterial proteins injected in the plant cell during infection. Several effectors are known to target organelles during infection, supporting the idea that chloroplasts and mitochondria are key players in plant cell defense. As a reason, it remains necessary for the plant to keep organellar gene expression under control in order to ensure a response in proportion to the risk, without penalizing growth. Unlike nuclear gene expression, organellar gene expression regulation goes through highly complex post-transcriptional maturation steps. Among proteins involved in these events, PPR proteins (for pentatricopeptide repeat) are known to be very important. PPR proteins are involved in several RNA maturation steps in organelles, like C to U editing or splicing. They are studied in several eukaryotes, but not in bacteria. During my PhD studies, the hypothesis is exogenous or endogenous PPR proteins are involved in organellar gene expression modifications during biotic stress. To test our hypothesis, we work on PGN (Pentatricopeptide repeat protein for Germination on NaCl) in plant model A. thaliana. Characterized by Laluk et al. (2011), the KO mutant displays an enhanced sensitivity to the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea, and PGN gene expression is induced after infection. We find two editing defects for the KO mutant, in nad6 5’ non coding sequence and in cox2 coding sequence. However, editing at these two sites does not vary in wild type plants during Botrytis cinerea infection.Using a bioinformatic screen, we find several bacterial PPR proteins. Two of them are encoded by bacterial plant pathogens: Erwinia amylovora and Ralstonia solanacearum. To our knowledge, these proteins, putatively obtained through horizontal gene transfer, are the first bacterial PPR proteins to be characterized. They also share similarities with bacterial effectors. If overexpression of these bacterial PPR proteins in A. thaliana does not unveil organellar transcriptome modifications, we show a decrease of the incidence rate of the disease caused by E. amylovora in the host plant Malus domestica “Golden delicious” without a functional gene coding for the PPR protein. For both Erwinia and Ralstonia PPR, we find several interactants in A. thaliana using Yeast Two Hybrid, each of them representing a potential target that could be studied. In order to perform these experiments and obtain these results, we needed very specific tools. During the PhD studies, we develop an RNAseq analysis pipeline and an enhanced method to predict PPR binding sites, opening the way to an easier characterization of several PPR proteins

La rhizosphère est peuplée de nombreux microorganismes pouvant être bénéfiques ou au contraire néfastes pour les plantes. La légumineuse modèle M. Truncatula permet d'étudier les associations symbiotiques avec la bactérie fixatrice d'azote Sinorhizobium meliloti, mais aussi les interactions avec la bactérie pathogène racinaire Ralstonia solanacearum. Les interactions symbiotiques fixatrices d'azote nécessitent la formation d'un nouvel organe racinaire, appelé nodosité, au sein duquel les bactéries différenciées fixent l'azote atmosphérique au bénéfice de la plante hôte. L'organogenèse nodulaire s'accompagne d'une phase de différenciation des cellules végétales, dont le contrôle est mal connu, au cours de laquelle le facteur de transcription MtEFD (M. Truncatula ethylene response factor required for nodule differentiation) joue un rôle important. Durant ma thèse, nous avons montré que MtEFD pourrait contrôler la différenciation nodulaire via la régulation de gènes hautement spécifiques des nodosités, et qu'une mutation dans MtEFD impacte sur un processus clé de la différenciation, l'endoréduplication, plus précisément le nombre d'endocycles (cycle cellulaire sans mitose) des cellules végétales et bactériennes. De plus, nous avons observé une similitude dans le profil d'expression de MtEFD au cours du développement nodulaire et racinaire et montré que MtEFD a un effet à la fois sur la formation des racines latérales et la synthèse d'ADN dans les extrémités racinaires. Enfin, nous avons démontré que MtEFD joue également un rôle positif dans le développement de la maladie causée par R. Solanacearum. Dans la recherche de mécanismes communs à ces différents processus, nous avons porté une attention particulière aux cytokinines (CK), phytohormones dont MtEFD contrôle un régulateur négatif, le gène MtRR4 (M. Truncatula response regulator 4)
The rhizosphere is composed of microorganisms which are beneficial or pathogenic for the plants. The model legume M. Truncatula is used to study the symbiotic interaction with the nitrogen-fixing bacteria Sinorhizobium meliloti, but also the pathogenic interaction with the telluric bacteria Ralstonia solanacearum. The nitrogen-fixing symbiotic associations involve the formation of a new root organ, called nodule, in which differentiated bacteria are able to fix atmospheric nitrogen to benefit the host plant. The nodule organogenesis is associated with a stage of plant cell differentiation, whose control is poorly understood, and during which the transcription factor MtEFD (M. Truncatula ethylene response factor required for nodule differentiation) plays an important role. During my thesis, we showed that MtEFD could control the nodule differentiation via the regulation of highly nodule specific genes, and a mutation in MtEFD impacts a key process of the differentiation, the endoreduplication, more precisely the number of endocycles (cell cycle without mitosis) of plant cells and bacteria. Moreover, we observed a similarity in the MtEFD expression pattern during nodule and root development, and we showed that MtEFD has an impact in both the lateral root formation and the DNA synthesis in the root tips. Finally, we also proved that MtEFD was positively involved in the disease development induced by R. Solanacearum. In the search of common mechanism in these different processes, we paid particular attention to cytokinins (CK), as MtEFD controls a CK negative regulator, the MtRR4 (M. Truncatula response regulator 4) gene

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien des solanées. Les gènes hrp codent pour un appareil de sécrétion de protéines, dit de type III, qui permet l'injection d'effecteurs du pouvoir pathogène à l'intérieur des cellules végétales hôtes. Le gène régulateur hrpB contrôle l'expression des composants de la machinerie Hrp et des substrats qui l'empruntent. La caractérisation du mécanisme d'action de HrpB a permis de définir un motif cis-opérateur conservé, la boite hrpII, indispensable à l'activité des promoteurs du régulon. Une liste de 114 gènes candidats a été constituée suite à la recherche de ce motif sur la séquence du génome de R. Solanacearum GMI1000. Dans un deuxième temps, l'analyse fonctionnelle des candidats identifiés par les approches in silico a été entreprise : 48 de ces gènes font partie du régulon hrpB. Neuf brg (gènes hrpB-régulés) sont homologues à des effecteurs de type III précédemment décrits chez d'autres bactéries phytopathogènes. Les 31 brg restants codent pour des protéines originales qui arborent un signal d'injection potentiel. La translocation hrp-dépendante de cinq protéines candidates dans des cellules végétales a été confirmée. L'étude du pouvoir pathogène des mutants d'insertion générés vis-à-vis de deux espèces hôtes indique que l'interaction n'est modifiée que pour un petit nombre d'entre eux. Finalement, nous avons caractérisé le gène avrA, qui conditionne l'aptitude de la bactérie à déclencher une réponse hypersensible sur différentes espèces de Nicotiana. L'ensemble de ces travaux suggère que le génome de R. Solanacearum héberge un répertoire d'effecteurs de type III considérable (50 à 70). La compréhension de leur contribution respective au pouvoir pathogène de R. Solanaceraum nécessitera l'élucidation de leur activité moléculaire sur le métabolisme de la cellule végétale
Ralstonia solanacearum is the causal agent of bacterial wilt disease. Hrp genes encode a type III protein secretion apparatus that allows virulence effectors injection into the host plant cell. The regulatory gene hrpB controls expression of the structural components of the secretion machinery as well as its substrates. Characterization of the mode of action of HrpB allowed the definition of the hrpII box, a conserved cis-operator motif required for activity of the promoters belonging to this regulon. A search for this motif on R. Solanacearum GMI1000 genome sequence produced a list of 114 candidate genes. The next step involved the functional analysis of a group of these candidate genes : 48 of them were shown to belong to the hrpB regulon. Nine brg (hrpB-regulated genes) are homologous to known type III effectors from other plant pathogenic bacteria. The remaining 31 brg encode unknown or hypothetical proteins harbouring a putative type III-translocation signal. Hrp-dependent translocation into plant cells was confirmed for five candidate proteins. Only a few of the insertion mutants generated displayed an altered virulence when tested onto two host species. Finally, we identified and characterized the avrA gene which is necessary for elicitation of the hypersensitive response on some Nicotiana species. Altogether, these data suggest that R. Solanacearum genome contains a large type III effector repertory (50 to 70). Understanding their relative contribution to R. Solanacearum pathogenicity will await future elucidation of their molecular activity on the plant cell metabolism

Nous présentons l’étude de l’interaction entre la bactérie pathogène racinaire Ralstonia solanacearum et la légumineuse modèle Medicago truncatula. Un pathosystème avec les lignées A17 et F83005.5, respectivement sensible et résistante à la souche GMI1000, a été mis en place avec une procédure d’inoculation sur racines intactes. Ce dispositif expérimental nous a permis de suivre le processus infectieux, de la pénétration de la bactérie par l’extrémité racinaire au développement des symptômes foliaires. L’analyse des étapes précoces de l’interaction a permis de décrire l’apparition de symptômes racinaires qui se mettent en place rapidement après l’infection, que les lignées soient résistantes ou sensibles à la bactérie. Un arrêt de croissance de la racine s'observe dès 24 heures post-inoculation, ainsi qu’une mortalité de l’épiderme de l’extrémité racinaire. Ces phénotypes sont notés suite à des inoculations avec de faibles concentrations bactériennes, et ce sur plusieurs espèces hôtes ou non-hôtes testées. La mise en place des symptômes racinaires est dépendante de l’appareil de sécrétion de type III. Un crible de mutants d’effecteurs de type III de la souche GMI1000, basé sur l’apparition des symptômes racinaires, a permis de montrer que des pools différents d’effecteurs interviennent chez A17 et F83005.5. Chez la lignée sensible A17, deux effecteurs sont principalement impliqués, Gala7 et AvrA. L’étude de la colonisation de cette lignée a montré que le mutant gala7 ne pénètre pas la plante et n’induit pas de symptômes de flétrissement. Le mutant avrA s’est révélé capable d’induire la maladie chez la lignée A17 mais de manière nettement réduite par rapport à la souche sauvage. L’analyse des extrémités racinaires des lignées sensible et résistante infectées par la souche GMI1000 a révélé qu’au niveau des parois de l’endoderme, la présence de lignine est induite de manière plus précoce chez la lignée résistante. Des phénomènes de division cellulaire ont été identifiés autour du cylindre central et semblent également liés à une restriction de la propagation bactérienne. Au niveau du contenu cellulaire, une autofluorescence et une production de ROS semblent liés à une phase nécrotrophe de la bactérie lors de sa propagation dans la zone corticale de l’extrémité racinaire. L’étude de la colonisation bactérienne en s’affranchissant de l’étape de pénétration a révélé que des mécanismes de résistances peuvent intervenir au niveau de collet chez la lignée F83005.5 et lors de la colonisation racinaire des vaisseaux conducteurs suite à une inoculation avec le mutant gala7
Manquant

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est l'agent responsable du flétrissement bactérien sur plus de 200 espèces végétales, dont des espèces agronomiques, faisant de cette bactériose une des plus importantes dans le monde. Le pouvoir pathogène de la bactérie repose en grande partie sur sa capacité à injecter des protéines, appelées effecteurs de type III (ET3s), via le système de sécrétion de type III (SST3). La dernière décennie a été notamment marquée par la découverte chez les bactéries pathogènes de nombreuses protéines impliquées dans le contrôle du processus de sécrétion de type III. Chez R. Solanacearum, ces mécanismes de contrôle de la sécrétion restent méconnus, contrairement aux mécanismes de régulation transcriptionnelle. Au cours de ces travaux, nous nous sommes attachés à caractériser les fonctions des protéines HpaB (RSp0853), HpaD (RSp0848) et FliT-like (RSc2897) pour lesquelles plusieurs éléments suggèrent un potentiel rôle comme chaperonnes de type III (CT3s), ainsi que de la protéine HpaP (RSp0862) qui présente un domaine T3S4 (Type III Secretion Substrate Specificity Switch). Nous avons pu mettre en évidence la capacité de certaines CT3s à interagir entre elles et, pour HpaB et HpaD, à interagir avec de nombreux ET3s. De plus, les trois CT3s putatives semblent impliquées dans le pouvoir pathogène de R. Solanacearum, HpaB s'avérant même indispensable à la virulence de la bactérie. D'autre part, nos travaux mettent en exergue l'importance de la protéine HpaP pour le pouvoir pathogène de la bactérie et son implication dans le contrôle de la sécrétion de substrats du SST3. Les résultats suggèrent notamment que HpaP promeut la sécrétion de l'ET3 PopP1 en interagissant physiquement avec ce dernier. Finalement, la caractérisation de séquences conservées du domaine T3S4 révèle l'importance de cette région pour la fonction de la protéine HpaP. L'ensemble de ces travaux suggère l'implication de plusieurs protéines de R. Solanacearum dans le contrôle du processus de sécrétion de type III et souligne la diversité des mécanismes mis en jeu impliquant les protéines de type T3S4 chez les bactéries pathogènes
The plant pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum is the causative agent of the bacterial wilt on more than 200 plant species, including agronomic species, making it one of the most important bacterial disease in the world. The pathogenicity of the bacteria is largely based on its ability to inject proteins, called type III effectors (T3Es) via the type III secretion system (T3SS). The last decade has been particularly marked by the discovery of many proteins involved in the control of the type III secretion process in pathogenic bacteria. In R. Solanacearum , these control mechanisms remain unknown , unlike the transcriptional regulatory mechanisms. In this work, we focused on the functional characterization of the proteins HpaB (Rsp0853), HpaD (RSp0848) and FliT-like (RSc2897) for which several elements suggest a potential role as type III chaperones (T3Cs). We also focused on the HpaP protein (Rsp0862) which harbors a T3S4 domain (Type III Secretion Substrate Specificity Switch). We showed the ability of some CT3s to interact with each other and, concerning HpaB and HpaD, to interact with many T3Es. In addition, the three putative T3Cs seem to be involved in the pathogenicity of R. Solanacearum, HpaB being even strictly required for bacterial virulence. Furthermore, our work highlights the importance of HpaP in pathogenicity and its involvement in the control of the secretion of T3SS substrates. The results suggest in particular that HpaP promotes the secretion of the T3E PopP1 by physically interacting with the latter. Finally, the characterization of conserved sequences in the T3S4 domain reveals the importance of this region for the function of the HpaP protein. On the whole, this work suggests the involvement of several proteins of R. Solanacearum in the control of the type III secretion process and highlights the diversity of mechanisms in which T3S4 proteins are involved in pathogenic bacteria

Ralstonia solanaearum, a soil borne pathogen infects several important crops causing wilting. In 2000-2001, two eucalyptus isolates, BCCF 401 and BCCF 402 were isolated from plantations in Kwa-Zulu Natal and the Democratic Republic of Congo, respectively. Arabidopsis has been recognised as a host for R. solanacearum and as such has been adopted as a model to understand the plant defence response against this pathogen. The aim of this study was to use microarray expression profiling techniques to elucidate the plant defence response and to identify candidate genes possibly contributing towards resistance against the pathogen. As a means to optimise microarray expression profiling, the differential expression in an Arabidopsis mutant, cir1 (constitutively induced resistance 1) and wild-type plants was investigated using a custom 500-probe microarray. Several genes were found to be induced in cir1 at a significance threshold of –log10(p) equal to 3 (p< 0.001) using a mixed model ANOVA approach. The genes AtACP1 (sodium inducible calcium binding protein), AtP2CHA (protein phosphatase 2C), AtGSTF7 (glutathione S transferase), tryptophan synthase betalike and AtPAL1 (phenylalanine ammonia lyase 1), AtEREBP-4 (ethylene response element binding protein 4) and HFR1 (long hypocotyl in far-red 1) were further identified as possible candidate genes which may contribute to disease resistance in cir1 against Pseudomonas syringae pv. tomato. A similar transcript profiling approach, using the optimised protocols, was adopted to investigate the compatible interaction between Arabidopsis ecotype Col-5 and the R. solanacearum isolate BCCF 401. A screen of 5000 Arabidopsis ESTs revealed approximately 120 genes differentially regulated by R. solanacearum infection at a significance threshold of p<0.03 (Bonferroni corrected). Subsequent bioinformatic comparisons revealed that abscisic acid responses appear to be induced in Col-5 in response to the pathogen and that R. solanacearum induces an expression profile consistent with a necrotroph. The basal defence responses in Col-5 against R. solanacearum infection were investigated by comparing the expression data to that during treatment with the pathogen associated molecular patterns (PAMPs) flg22 and lipopolysaccharide, and the Type Three Secretion System deficient Pst hrp- mutant. Expression patterns for a subset of these genes were suggestive of host basal defences manipulated by the pathogen. It is hypothesised that genetic engineering to alter the expression of these “pathogen-manipulated” genes could contribute to resistance against R. solanacearum in the host. Copyright 2008, University of Pretoria. All rights reserved. The copyright in this work vests in the University of Pretoria. No part of this work may be reproduced or transmitted in any form or by any means, without the prior written permission of the University of Pretoria. Please cite as follows: Naidoo, S 2008, Microarray expression studies in the model plant Arabidopsis thaliana infected with the bacterial pathogen Ralstonia solanacearum, PhD thesis, University of Pretoria, Pretoria, viewed yymmdd < http://upetd.up.ac.za/thesis/available/etd-11182008-092625 / > D559/gm
Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2008.
Plant Science
unrestricted

M.Sc.
Field grown plants are constantly challenged with a variety of stressful factors, such as high temperatures, drought and pathogen infection that adversely affect crop production and quality. These stresses seldom occur as single entities in plants and in warm climates, heat stress is often a common dominator in combinatorial stress. The heat shock (HS) response in plants has priority over other stress responses, including the pathogen-induced stress response. Activation of the HS response prevents the normal plant defence strategy, leaving the plant vulnerable to pathogen attack. However, prior exposure to elevated temperatures confers protection from subsequent, otherwise lethal, temperatures (thermotolerance) and a variety of other stress conditions including heavy-metals, chilling injury and certain pathogens (cross tolerance). In general, litterature supports a central role for heat shock proteins (HSP), in particular the 70 kDa HSP (Hsp70), in thermotolerance. Incompatible host-pathogen interactions lead to the activation of an array of defence mechanisms, including the promotion of phenylpropanoid metabolism. Phenylalanine ammonia-lyase is a key regulator of this metabolic pathway, influencing the production of salicylic acid, lignin and phytoalexins among other essential defence products. In this study it was hypothesised that prior exposure to non-lethal HS confers protection from subsequent heat-related suppression of the phenylpropanoid pathway, induced as a defence mechanism during an incompatible plant-pathogen interaction. This hypothesis was verified by analysing the effect of thermotolerance on pathogen-related stimulation of PAL promoter activity, enzyme activity and lignin deposition. The tomato, Lycopersicon esculentum cultivar UC82B and Ralstonia solanacearum, the causative agent of bacterial wilt, were used as host-pathogen model. Specific objectives in the study were: (1) Development of PAL promoter-GUS reporter transformed Lycopersicon esculentum. (2) Establishment of a thermotolerance protocol that ensures optimal Hsp70 levels at subsequent HS. (3) Evaluation of the influence of prior heat treatment on phenylpropanoid metabolism after exposure to HS in combination with Ralstonia solanacearum. Results obtained support the hypothesis indicating that thermotolerance protects phenylpropanoid metabolism, in particular PAL promoter and enzyme activity, and to a certain extent lignin production, induced by avirulent Ralstonia solanacearum during a second severe HS. In contrast, HS without a prior heat treatment, suppressed phenylpropanoid metabolism. The protective potential of prior heat treatment during subsequent infection under hyperthermic conditions support the application of HSP in the development of novel plant protection strategies.

M.Sc.
Plants are in constant conflict with pathogens and have evolved intricate mechanisms to protect themselves against pathogens. The gene-for-gene response is regarded as the first line of defence when plant and pathogen meet. This interaction leads to the induction of defence proteins such as PR proteins that protect the plant from invading pathogens. A seemingly unrelated topic to plants and pathogens is heat shock proteins (HSP). HSP are a highly conserved group of defence proteins induced in all organisms in response to a variety of environmental stresses to provide protection from, and adaptation to cellular stress. HSP are in general not considered to be part of the defence response classically induced by avirulent pathogens and whether they are induced and play a role in plant-pathogen interactions is controversial. The protective chaperoning capacity of HSP makes them ideal proteins to exploit to target as endogenous defence proteins in the search for new strategies in the management of infectious diseases. In humans, HSP induction during infection is a complex phenomenon depending on the pathogen, whether the infection is acute or chronic, the host cell type and its differentiative state as well as environmental factors. In this investigation the expression of the inducible and constitutive isoforms of the 70kDa HSP (Hsp70/Hsc70) was investigated in tomato, Lycopersicon esculentum in response to virulent and avirulent strains of Ralstonia solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Expression of Hsp70 was studied in conjunction with the accumulation of PR-la and host cell viability. A quick, non-toxic, tetrazolium-based assay was developed from the Alamar Blue assay, commonly used in mammalian cells, and applied for the evaluation of host cell viability. The results shown suggest Hsp70/Hsc70 is significantly induced in tomato cell suspensions during an incompatible interaction 24h to 48 h following co-cultivation with the avirulent R. solanacearum strain compared to normal levels at this interval in cells exposed to the virulent strain. In both compatible and incompatible interactions Hsp70/Hsc70 levels eventually (72 h) accumulated correlating significantly with decreased viability. PR-la accumulation was significantly induced from 6 h to 18 h by the virulent as well as the avirulent R. solanacearum strains. In general, comparable results were obtained using leaf discs as an in vivo model. Based upon the differential induction of Hsp70/Hsc70 by virulent and avirulent pathogens it is proposed that HSP may play an important role in determining the outcome of the interaction between tomato and R. solanacearum. Successful defence may not only involve a limited number of defence genes but may result from a concerted action of a large number of defence genes.