Dissertationen zum Thema „Pancréas – Tumeurs – Thérapeutique“

Cette thèse est une exploration complète de la prise en charge multidisciplinaire des tumeurs hépato-biliopancréatiques (HBP), et de la manière dont cette approche peut améliorer les résultats oncologiques pour le patient. Ce travail est développé en trois chapitres, chacun couvrant un domaine spécifique de cette discipline. Chaque chapitre révèle également une collaboration importante entre chirurgiens, oncologues, chercheurs et diverses personnalités médicales, ouvrant la voie à l'avancement de la prise en charge des tumeurs HBP. Les stratégies de traitement affinées et les approches de médecine personnalisée décrites dans cette thèse ne sont pas des constructions théoriques mais des outils prêts à être intégrés dans les soins aux patients. L'esprit de collaboration soutenu tout au long de ce travail résonne dans l'amélioration des soins aux patients atteints de tumeurs HBP, garantissant que les progrès de la recherche se traduisent par des améliorations cliniques tangibles
This thesis is a comprehensive exploration of the multidisciplinary management of hepatobiliarypancreatic tumors (HBP), and how this approach can improve oncological outcomes for the patient.This work is developed in three chapters, each covering a specific domain of this discipline. Each chapter also reveals significant collaboration between surgeons, oncologists, researchers, and various medical personalities, paving the way for the advancement of HBP tumor management. The refined treatment strategies and personalized medicine approaches described in this thesis are not theoretical constructs but tools ready to be integrated into patient care. The spirit of collaboration sustained throughout this work resonates in the improvement of care for patients with HBP tumors, ensuring that research advancements translate into tangible clinical improvements

Ces travaux concernent la caracterisation de produits de secretion de cellules tumorales endocrines (rint#3). Une technique d'immuno-transfert adaptee a la detection des peptides somatostatine a ete mise au point. Elle associe une separation electrophoretique suivie d'electrotransfert et une immunodetection. Cette methode confirme l'exportation dans le milieu de culture, de composes de haut poids moleculaire, en particulier une prosomatostatine de 15 kilodaltons. Une faible partie de ce precurseur est retrouvee sous une forme de 29 kd convertible en 15 kd par reduction. La predominance de proformes dans le milieu extracellulaire suggere un defaut dans les processus de maturation post-traductionnels. Cette alteration pouvant etre liee a une modification de la structure primaire du precurseur, sa purification a ete abordee en vue de son sequencage. Pour cela, apres tamisage moleculaire, les modes de separation par echange d'ions et polarite de phase inverse, utilises en chromatographie liquide haute performance ont ete combines. Ils ont permis de separer plusieurs especes immunoreactives, la proforme de 15 kd etant localisee dans les eluats par immuno-transfert. Cependant la necessite d'un enrichissement en materiel immunoreactif a conduit a des etudes de secretion en milieu minimum. Une concentration en calcium extracellulaire de 5 mm stimule de facon maximale la secretion de somatostatine. De meme, l'action du tpa accelere cette secretion d'un facteur 2,5, tandis que la cck et la forskoline n'ont qu'un faible effet

Le cancer du pancréas exocrine, un des plus agressifs, présente un diagnostic tardif et reste peu sensible aux traitements conventionnels. Il est donc essentiel de développer de nouvelles approches thérapeutiques de ce cancer. Nous avons mis en évidence la présence d’un antigène glycosylé associé à la tumeur portant le glycotope 16D10, reconnu par l’anticorps monoclonal mAb16D10 à la surface des cellules tumorales du pancréas humain. Ce glycotope de surface est porté par une glyco isoforme de la Lipase Sels Biliaires Dépendante (BSDL), exprimée lors des cancers du pancréas. Par ailleurs, le mAb16D10 inhibe la croissance de cellules humaines pancréatiques tumorales SOJ-6 transplantées chez les souris Nude. L’ensemble de ces données nous a permis d’envisager des approches d’immunothérapies des cancers pancréatiques fondées sur l’utilisation du mAb16D10. Nous avons déterminé la spécificité du mAb16D10 sur différents tissus et différentes cellules et étudié in vitro les mécanismes moléculaires impliqués dans la diminution de la croissance tumorale induite par le mAb16D10. Nous avons montré que le mAb16D10 reconnaît spécifiquement des foyers de cellules néoplasiques alors qu’aucune réaction n’est observée, ni dans la zone « normale » des tissus pancréatiques tumoraux, ni dans les tissus humains normaux. Le mAb16D10 inhibe la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines exprimant l’antigène 16D10 localisé dans les radeaux lipidiques de la membrane plasmique. Le mAb16D10 induit l’expression de la p53 et l’apoptose via la voie intrinsèque. Cet anticorps entraîne l’activation de la GSK-3β, ce qui provoque la dégradation de la β-caténine et la diminution de l’expression de la cycline D1 résultant à l’arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S. Le traitement des cellules tumorales avec le mAb16D10 s’accompagne de l’expression de la E-cadhérine. L’antigène 16D10 associé aux radeaux lipidiques et à la β-caténine pourrait constituer une plateforme de signalisation, reconnue par le mAb16D10 permettant le recrutement de la E-cadhérine et l’induction de la mort cellulaire. Nous avons également montré l’efficacité thérapeutique in vitro du mAb16D10, associé aux drogues conventionnelles telles que la gemcitabine et le cisplatine. Le mAb16D10 se révèle être un outil thérapeutique prometteur pour le traitement des adénocarcinomes pancréatiques.

Cette etude porte sur la regulation de la proliferation de cellules pancreatiques. Son objectif est l'analyse de quelques mecanismes moleculaires impliques dans les premieres etapes d'un effet proliferatif induit par des peptides gastro-intestinaux et par des facteurs de croissance. La voie metabolique des polyamines et l'enzyme cle de leur biosynthese l'ornithine decarboxylase (odc) sont fondamentales dans la proliferation cellulaire. La regulation de cette enzyme par la cholecystokinine (cck) et la gastrine d'une part et par les facteurs de croissance de l'epiderne (egf) et des fibroblastes (fgf) d'autre part a ete etudiee dans un modele de cellules tumorales pancreatiques de rat. L'activite catalytique et les niveaux d'acide ribonucleique messager (arnm) de l'odc ont ete mesures apres stimulation par les differents peptides mitogeniques. L'analyse des courbes dose-reponse realisees avec les peptides de la famille cck/gastrine met en evidence que la stimulation de l'activite odc est mediee par un recepteur de type gastrine; ce resultat est confirme par l'utilisation d'antagonistes. L'occupation des recepteurs egf et fgf induit d'une maniere dose-dependante la stimulation de cette activite, le fgf etant le peptide le plus efficace (ec50=20 pmoles). L'utilisation d'un ester de phorbol activateur de la proteine kinase c met en evidence une relation directe entre cette kinase et l'activite odc. La cck et l'egf d'une part et la gastrine et le fgf d'autre part semblent emprunter des voies intracellulaires partiellement differentes pour stimuler l'activite odc. Le fgf augmente l'arnm de l'odc d'un facteur 2 a 3, visualise par hybridation d'une sonde radioactive d'adn complementaire de l'odc de rat. Ceci suggere un effet transcriptionnel de ce peptide sur l'expression du gene odc. L'ensemble de ces resultats, couples aux effets de ces peptides sur la croissance cellulaire, montre que la stimulation de l'od

L'antiport na/h est un mecanisme de transport membranaire, echangeant un ion na pour un proton. L'activation de cet echange par la cck et la gastrine conduit a une augmentation du ph intracellulaire. L'effet de la cck est medie par le recepteur cck et semble impliquer la stimulation de la kinase c. L'activation de l'antiport par la gastrine ne passe pas par le recepteur cck a. L'antiport na/h est egalement present au niveau de la lignee cellulaire ar4-2j, derivee d'un cancer pancreatique de rat et presente les memes caracteristiques pharmacologiques: dependance vis-a-vis des concentrations externes en na, inhibition par l'amiloride. L'activation de l'echange na/h et la stimulation de la proliferation cellulaire par le serum de veau ftal sont correlees. L'amiloride et ses analogues inhibent echange na/h et proliferation cellulaire aux memes concentrations, temoignant du role de l'antiport dans le controle de la proliferation de cette lignee cellulaire. D'autres agents sont capables de stimuler l'echange na/h sans etre des facteurs de croissances, indiquant que d'autres processus metaboliques sont controles par l'activation de l'antiport na/h, notamment des phenomenes d'hypertrophie cellulaire

Dans le but d'etudier le mecanisme d'action de la somatostatine implique dans son effet antiproliferatif nous avons demontre que sur la lignee tumorale pancreatique d'origine acinaire de rat ar4-2j l'analogue stable de la somatostatine la sms 201-995 (sms) inhibe la croissance des cellules cultivees en presence de serum et antagonise l'effet proliferatif de l'egf sur ces cellules. Cet effet inhibiteur de la sms n'est pas modifie en presence de la toxine pertussique. Il semble donc ne pas faire intervenir de proteine gtp-dependante. Le recepteur a egf possedant une activite tyrosine kinase implique dans son effet mitogene nous avons pose l'hypothese d'une stimulation par la somatostatine d'une activite phosphotyrosine phosphatase (ptp) impliquee dans son effet antiproliferatif. A l'aide du substrat (32) poly(glu, tyr), nous avons caracterise une activite enzymatique membranaire possedant les caracteristiques biochimiques des ptp: inhibition par le vanadate et le zinc, stimulation par l'edta. Son poids moleculaire apparent est de 35000. Cette ptp membranaire semble intervenir dans le controle de la proliferation des cellules ar4-2j: son activite etant modulee pendant la croissance. Sur les cellules ar4-2j cultivees en presence de svf et traitees par la sms, l'activite ptp membranaire est stimulee de maniere dos-dependante. Le pretraitement par l'egf des cellules cultivees en milieu deprive en serum, induit une inhibition de la ptp membranaire. Cette inhibition est levee par l'addition de la sms. En conclusion, une ptp serait mise en jeu dans l'effet antiproliferatif de la somatostatine et serait implique dans la regulation de la croissance cellulaire

Etude à l'aide des outils de transcriptomique de 17 cultures primaires, maintenues à l'état vivant par xénogreffes et cultures cellulaires, et issues de patients ayant présenté un adénocarcinome pancréatique. Par clustering hiérarchique basée sur l'ensemble des gènes du transcriptome tumoral, 5 patients avec dénomination anonyme se sont fortement distingués des autres patients et présentaient de façon similaire des tumeurs peu différenciées sur le plan histologique et une survie péjorative de moins de 8 mois. Dans cette population de « courts survivants », un total de 942 gènes exprimés de façon significativement différentielle a été retrouvé. Parmi ces gènes, 439 gènes sont apparus significativement sous exprimés et 505 gènes significativement surexprimés (fold change ≥2). L'analyse par GO a montré que parmi ces 942 gènes différentiellement exprimés, nous avons retrouvé un enrichissement important chez les courts survivants, des gènes impliqués dans le cycle cellulaire et l'activité mitotique, la réponse cellulaire au stress, le métabolisme cellulaire ainsi que le métabolisme de l'ADN et l'organisation chromosomique. Par ailleurs, nous avons choisi parmi les 17 cultures primaires, les 3 lignées cellulaires les plus sensibles et les 3 les plus résistantes aux drogues selon les résultats des tests de « Chimiogramme ». Plusieurs gènes ont été identifiés comme spécifiquement surexprimés ou sous-exprimés en relation avec une sensibilité ou une résistance particulières des cellules aux drogues utilisées. Nous avons identifié 671 gènes associés à la gemcitabine, 1107 à l'oxaliplatine, 308 au 5-FU et seulement 34 et 46 au docétaxel et au SN38 respectivement
We developed an efficient strategy in which PDAC samples from 17 consecutive patients were collected by Endoscopic Ultrasound-Guided Fine-Needle Aspiration (EUS-FNA) or surgery and preserved, by an original approach, as breathing tumors by xenografting and as a primary culture of epithelial cells. Transcriptomic analysis was performed from breathing tumors by an Affymetrix approach. We observed a significant heterogeneity in the RNA expression profile of tumors. However, the bioinformatic analysis of this data was able to discriminate between patients with long- and short-term survival corresponding to patients carrying poorly-differentiated PDAC tumors respectively. We identified 942 genes with statically different expression. Among these genes, 439 were under-expressed and 505 genes over-expressed (fold change ≥2) in short survivors. Primary culture of cells allowed us to analyze their relative sensitivity to anticancer drugs in vitro by a "Chemogram", by similarity with the antibiogram for microorganisms, establishing an individual profile of drug sensitivity. As expected, the response was patient-dependent. Interestingly, we also found that the transcriptome analysis predict the sensitivity of cells to the five anticancer drugs the most frequently used to treating patients with PDAC. In conclusion, using this approach, we found that the transcriptomic analysis could predict the sensitivity to anticancer drugs and the clinical outcome of patients with PDAC

Différents cancers sont associés à une augmentation d'expression du facteur d'initiation de la traduction eIF4E et une perte d'activité de son inhibiteur 4E-BP1. La surexpression de eIF4E dans différentes lignées cellulaires facilite la transformation maligne et la progression tumorale dans des modèles expérimentaux, un phénomène inversé par 4E-BP1. Notre travail a montré qu'au cours de la tumorigenèse pancréatique, 4E-BP1 présente un profil d'expression biphasique parfaitement corrélé à celui de smad4 (effecteur de la voie du TGF-ß), à savoir une augmentation d'expression dans les stades prénéoplasiques et une perte dans les stades plus agressifs du cancer pancréatique. Cela a été expliqué par une interaction de smad4 sur un élément de réponse présent sur l'exon1 de 4E-BP1. La diminution d'expression de 4E-BP1 par des siARN stimule la prolifération cellulaire, la progression tumorale et rend les cellules résistantes à l'effet antiprolifératif du TGF-ß. Ainsi, 4E-BP1 est une molécule critique pour la voie TGF-ß/Smad4 au cours de la tumorigenèse pancréatique. Ensuite, nous avons remarqué que l'inactivation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) après expression du récepteur 2 de somatostatine (sst2) dans les cellules cancéreuses pancréatiques augmente l'expression de la forme active de 4E-BP1 par modulation de sa transcription et sa phosphorylation. De plus, l'utilisation d'un inhibiteur chimique, un dominant négatif ou un dominant positif de la PI3K régule l'expression de 4E-BP1 et l'activité de son promoteur. Ainsi, la PI3K inactive 4E-BP1 par répression de sa transcription en plus de son hyperphosphorylation
Induction of the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) is frequently observed in cancers and enhanced eIF4E activity drives cellular transformation and tumorigenesis in experimental models. One mechanism that exacerbates eIF4E function in cancers is the inactivation of the translation inhibitory protein 4E-BP1. First, we show that 4E-BP1 protein is overexpressed in precancerous pancreatic dysplasias, but becomes nearly undetectable in more aggressive lesions such as the tumor suppressor Smad4, a transcription factor critical for TGFß-signaling. TGFß enhances 4E-BP1 transcription via Smad4 binding to a conserved element in 4E-BP1 exon1 sequence. Silencing 4E-BP1 protein stimulates pancreatic cancer cell proliferation, accelerates tumor formation, and precludes the anti-proliferative effect of TGFß. Thus, 4E-BP1 gene appears critical for TGFß/Smad4-signaling pathway in pancreatic cancer. Furthermore, we show that inactivation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) consequent to stable expression of the antiproliferative somatostatin receptor 2 (sst2) in pancreatic cancer cells leads to transcriptional accumulation of the hypophosphorylated forms of 4E-BP1 protein. In cancer cells, while 4E-BP1 gene promoter is maintained repressed in a PI3K-dependent mechanism, sst2-dependent inactivation of the PI3K/Akt pathway releases 4E-BP1 gene transcription. The use of a pharmacological inhibitor and dominant negative or positive mutants of PI3K all affect 4EBP1 protein expression and promoter activity in different cell lines. Thus, in addition to inactivation of 4E-BP1 via hyperphosphorylation, signaling through the PI3K pathway silences 4E-BP1 gene transcription

AXL est un récepteur tyrosine kinase (RTK) impliqué dans de nombreux mécanismes cellulaires tels que la migration, l'invasion, l'angiogenèse et la prolifération des cellules. Sa surexpression a été observée dans de nombreux cancers et est souvent liée à un mauvais pronostic vital pour le patient. De plus, ce récepteur semble agir dans un mécanisme important dans la formation de métastases et la résistance aux thérapies anticancéreuses : la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Nous avons dans un premier temps généré des anticorps monoclonaux murins spécifiques du récepteur AXL. Deux de ces anticorps ont ensuite été sélectionnés pour leurs propriétés inhibitrices de l'expression d'AXL à la surface et de l'activation de ce récepteur par son ligand GAS6. En effet ces deux anticorps, le 20G7D9 et le 3E3E8, entraine l'internalisation et la dégradation lysosomale d'AXL.Nous avons dans un deuxième temps étudié l'expression et le rôle de ce récepteur dans le cancer du pancréas qui possède un manque cruel de solutions thérapeutiques aujourd'hui et dont le taux de survie reste très faible (moins 5% des patients survivent 5 ans après son diagnostic). Nous avons ainsi observé une expression d'AXL dans une majorité des tumeurs de patients (76%), notamment au niveau du front invasif de ces tumeurs. Le ciblage d'AXL par nos deux anticorps inhibe sa signalisation et permet une réduction in vitro et in vivo de la croissance tumorale.Enfin, l'importante expression d'AXL dans le front invasif des tumeurs nous a incité à étudier le rôle d'AXL au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse. Nous avons ainsi démontré que le couple AXL/GAS6 induit l'EMT dans des modèles invasifs de cancer du sein triple négatifs. De plus, l'expression du récepteur dans des tumeurs de cancer du sein de type basal-like est corrélée à celle de différents marqueurs importants dans l'EMT. L'application de nos anticorps anti-AXL dans ce type de cancer permet d'inhiber l'induction de l'EMT par le récepteur ainsi que l'invasion cellulaire in vitro et in vivo.Cette thèse a ainsi permis de démontrer l'importance du récepteur tyrosine kinase AXL dans des mécanismes oncogéniques clés et l'efficacité de son ciblage par des anticorps monoclonaux dans des modèles précliniques de cancer
The Tyrosine Kinase Receptor (TKR) AXL is implicated in various cellular mechanisms (migration, invasion, angiogenesis and cell proliferation). Its overexpression has been observed in many cancers and is often correlated with poor prognosis. Moreover, this receptor seems to be important in Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT), a mechanism related to metastasis formation and resistance to anticancer therapies.We have generated several AXL specific murine monoclonal antibodies. Two of them, 20G7D9 and 3E3E8, have been selected for their inhibition properties in AXL expression and activation by its ligand GAS6. In fact, both antibodies induce internalization and lysosomal degradation of AXL.Then we decided to study AXL expression and role in pancreatic cancer, which is characterized by a dramatic overall survival (<5%, 5 years after diagnosis) and a lack of efficient therapeutic solutions. We observed an ectopic expression of AXL in a majority of patient' pancreatic tumors (76%), notably in the invasive front of the tumor. Targeting AXL with both 20G7D9 and 3E3E8 inhibits its signaling and decreases tumor growth in vitro and in vivo.As AXL is mainly expressed in the invasive front of tumors, we analyzed its role during EMT. We observed that AXL/GAS6 signaling induces EMT in triple negative breast cancer cell lines. Furthermore, its expression is correlated with well-defined EMT markers in basal-like breast cancer tumors. In vitro and in vivo application of our antibodies inhibits AXL-dependant EMT signaling and cellular migration and invasion.In conclusion, this thesis demonstrates the importance of AXL Tyrosine Kinase Receptor in oncogenic processes and the efficacy of targeting this receptor with monoclonal antibodies in cancer preclinical models

Le cancer du pancréas représente la cinquième cause de mort par cancer dans les pays occidentaux. Les thérapeutiques actuelles n'améliorant pas la survie des patients, le pronostic reste très péjoratif. La thérapie génique apparaît comme une alternative innovante dans le traitement de ce cancer chez l'Homme. Nous avons donc proposé deux approches originales de thérapie génique par transfert in vivo de gènes spécifiques du cancer pancréatique dans un modèle transplantable de cancer du pancréas établi chez le hamster. La première est basée sur le transfert du gène sst2 codant pour le récepteur 2 de somatostatine possédant des propriétés anti-oncogéniques et dont l'expression est perdue dans les tumeurs pancréatiques humaines. La seconde envisage l'expression de gènes suicides, créés par la Société Cayla, qui possèdent une action sensibilisante à la chimiothérapie. Ce travail démontre l'efficacité du transfert de ces deux nouveaux gènes dans une approche préclinique de thérapie génique anticancéreuse du cancer pancréatique. L'effet antitumoral du transfert de l'anti-oncogène sst2 et des gènes chimiosensibilisants permet de concevoir une stratégie combinatoire efficace pour l'adénocarcinome pancréatique humain. .
Adenocarcinoma of the pancreas is the fifth cause of death attributable to cancer. It continues to be devasting as it is often unresectable at the time of the diagnosis and actual treatments are ineffective. Consequently, prognosis is extremely poor. Clearly, a more effective treatment is urgently needed and gene therapy appears as a new therapeutic strategy for pancreatic carcinoma in humans. Two original gene therapy approaches have so been proposed, based on the in vivo transfer of pancreatic cancer specific genes in the transplantable model of pancreatic carcinoma established in hamsters. The first one is performed in order to express the sst2 gene encoding for the somatostatin G-coupled protein receptor subtype 2, which expression is selectively lost in most of pancreatic cancers and which displays antioncogenic properties in tumor cells. The second one is based on the transfer of new suicide genes, engineered by Cayla Company, which display sensitizing action to chemotherapy

L'hétérogénéité de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (ADCP) est l'obstacle majeur au traitement efficace des patients. En effet, les caractéristiques cliniques et la sensibilité aux traitements sont associés à un phénotype donné et sont plutôt régis à un niveau transcriptomique. Nous avons donc analysé le transcriptome de xénogreffes provenant des patients (Patients Derived Xenografts : PDX) lors des biopsies de tumeurs ou de pièces chirurgicales. Après extraction d’ARN, nous avons trouvé une signature moléculaire capable de diviser les patients en deux groupes, en fonction de leur survie. Nous avons également montré que la réponse autraitement pouvait être prédite par l‘analyse transcriptomique. Nous avons ensuite analysé les tumeurs et leurs stromas, et mis en évidence deux soustypesde stromas et deux sous-types de tumeurs, définis par la transcriptomique basée sur l'ARN, ou la méthylation de l'ADN. Nous avons étudié la réponse aux traitements administrés seuls ou en combinaison avec des chimiothérapies de routine. Nous avons mis en évidence des sous-groupes de patients plus chimiosensibles à certains traitements. Tous ces résultats sont encourageants,mais pas encore applicables en pratique clinique. Nous développons maintenant les organoïdes, véritable représentation de la tumeur en 3dimensions. Contrairement aux PDX, les organoïdes nous permettent d'obtenir des résultats rapidement exploitables. Nous pensons que dans un avenir proche, le traitement des cancers du pancréas sera précédé d'une caractérisation moléculaire étendue afin de sélectionner les traitements les plus appropriés et de pouvoir enfin proposer une médecine personnalisée
Heterogeneity of Pancreatic Ductal AdenoCarcinoma (PDAC) has become the majorimpediment to the effective treatment of patients. Clinical outcome and sensitivity to treatments are associated with a given phenotype and associated at a transcriptomic level. Recent data indicate that studying the expressionof a selected gene set could inform selection of the most appropriate treatments.We areoptimizing this approach by analysing transcriptome of Patient-Derived Xenografts (PDX)from surgical as well as endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration (EUS-FNA)biopsies of tumors, as a source of RNA. We have found a molecularsignature capable of dividing patients into two groups, function of theirsurvival.Independently, we have shown that treatment response pattern can also be foundat a transcriptomic level. We thenanalysed tumors and their stromas, and have found two sub-types of stromas and two sub-types of tumors. These wereindinstinctly defined by RNAseq-based transcriptomics, or DNA methylation. We also studied response to treatments administered alone or incombination to routine chemotherapies. All these results are encouraging, but not yetapplicable in clinical pratice. We are now developing the PDAC Biopsy DerivedPancreatic Cancer Organoids (BDPCO): BDPCO culture represents an excellent source of “exvivo” material. Unlike PDX, which take many months to grow, BDPCO allow us to obtainexploitable material rapidly useful for clinical application. We are convinced that in the near future, the treatment ofpancreatic cancers will be preceded by an extensive molecular characterization of cancercells in order to select the most appropriate treatments

Le cancer du Pancréas est un cancer extrêmement agressif avec un taux de survie à 5 ans ne dépassant pas les 5%. La détection tardive, le manque de biomarqueur et de thérapie efficace en sont les principales causes. Ce cancer est caractérisé par un microenvironnement très dense composé majoritairement de fibroblastes associés au cancer (CAF). Ce stroma est en constante communication avec la tumeur via la production de facteurs de croissance et métabolites, ce qui favorise le développement tumoral. Notre projet consiste à perturber ce dialogue en ciblant par des anticorps monoclonaux, la Neuréguline 1 (NRG1), ligand du récepteur HER3. Sa surexpression a été montrée dans des tumeurs pancréatiques, par les cellules tumorales et par les CAF. Nous avons confirmé l’implication de la NRG1 dans la croissance des tumeurs pancréatiques puis nous avons généré un anticorps monoclonal (7E3) murin spécifique de ce ligand. Cet anticorps a été caractérisé au niveau de sa spécificité, son affinité ainsi que son épitope sur la NRG1. Nous avons ensuite étudié son effet thérapeutique dans différents modèles de cellules pancréatiques seules ou en co-culture avec des fibroblastes activés provenant de tumeurs humaines. Le ciblage de la NRG1 par le 7E3 inhibe la signalisation de HER3 et la croissance cellulaire in vitro en 2D et en 3D. De plus, son efficacité sur le ralentissement de la croissance tumorale a été montrée dans des modèles originaux de greffes orthotopiques de cellules tumorales seules ou mélangées à des CAF chez la souris nude.Dans le but d’étudier plus précisément l’effet de notre anticorps sur le microenvironnement tumoral ainsi que la toxicité de notre stratégie, un second anticorps ciblant la NRG1 murine et humaine a été produit par phage display et est en cours de caractérisation in vitro et in vivo. Des combinaisons du 7E3 avec la chimiothérapie (Gemciatbine ou Folfirinox) ou d’autres thérapies ciblées sont envisagées.Cette thèse propose une nouvelle solution thérapeutique pour les patients atteints de cancer du Pancréas. Nous avons démontré l’importance de perturber le dialogue entre les cellules tumorales et les CAF en validant l’efficacité d’un tel ciblage par des anticorps monoclonaux
Pancreatic cancer is an extremely aggressive cancer with a 5-year survival rate of no more than 5%. Late detection, lack of biomarker and effective therapy are the main causes. This cancer is characterized by a very dense microenvironment composed of cancer-associated fibroblasts (CAFs). This stroma is in constant communication with the tumor via the production of growth factors and metabolites, which promotes tumor development. Our project consists in disrupting this crosstalk with monoclonal antibodies targeting Neuregulin 1 (NRG1), ligand of the HER3 receptor. Its overexpression has been shown in pancreatic tumor cells and CAFs. We confirmed the involvement of NRG1 in the pancreatic tumors growth and then we generated a monoclonal antibody (7E3 mAb) specific for this ligand. This antibody has been characterized in terms of its specificity, its affinity and its epitope on NRG1. We then studied its therapeutic effect in different models of pancreatic cells alone or in co-culture with CAFs coming from human samples. The anti NRG1 antibody inhibits HER3 signaling as well as cell growth in 2D and 3D culture. In addition, its efficacy on tumor growth was shown in orthoptic xenograft models of tumor cells mixed with CAFs.In order to study more specifically the antibody effect on tumor microenvironment as well as its toxicity, a second mAb targeting murine and human NRG1 was produced by phage display. Its in vitro and in vivo characterization is ongoing. Combinations of 7E3 with chemotherapy (gemciatbine or Folfirinox) or other targeted therapies are being considered.This thesis proposes a new therapeutic solution for patients with pancreatic cancer. We demonstrated the importance of disrupting the crosstalk between tumor cells and CAF by validating the efficacy of targeting NRG1 by monoclonal antibody

L’adénocarcinome pancréatique (ADKP) est l’un des cinq cancers les plus mortels avec un taux de survie à 5 ans de 8,2% et une médiane de survie de 6 mois. En raison de l’absence de symptômes précoces et de traitements efficaces, 85% des patients sont diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. La détermination du profil métabolique de l’ADKP, que nous avons précédemment défini, a mis en exergue leur forte dépendance au cholestérol satisfaite en augmentant l'internalisation des lipoprotéines de faible densité (LDL), via les récepteurs aux LDL (LDLR) qui sont sur-représentés à la surface des cellules tumorales d’ADKP. Par conséquent, le LDLR constitue une voie prometteuse par laquelle les agents cytotoxiques et/ou d'imagerie seraient spécifiquement délivrés à l’ADKP.Nous avons créé des cellules tumorales pancréatiques Ldlr+/+ et Ldlr-/-, originellement issues d’ADKP de souris KIC (LSL-KRasG12D ; Ink4a/Arffl/fl ; Pdx1-Cre) et un conjugué fluorescent ciblant le LDLR (Fc(A680)-VH4127). In vitro, nous avons montré que ce conjugué cible spécifiquement le LDLR et qu’il est internalisé et adressé aux lysosomes, comme les LDL. Ensuite, nous avons montré que ce conjugué permet de discriminer les ADKP Ldlr+/+ sous-cutanés des autres tissus sains (pancréas, foie et glandes surrénales). Enfin, des résultats similaires ont été obtenus chez les souris KIC, présentant fidèlement les caractéristiques des ADKP humains, et injectées avec le conjugué Fc(A680)-VH4127. Ainsi, l'utilisation en clinique de ce conjugué améliorerait 1/ le diagnostic de l’ADKP (marges de résection, volume tumoral) et 2 / le suivi de la réponse thérapeutique et la détection des récidives chez les patients opérés
Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is one of the five deadliest cancers, with a 5-year survival rate of 8.2% and a median survival of 6 months. Due to lack of early symptoms and effective treatments, 85% of the patients have an advanced disease at the time of diagnosis. In our previous work, aiming to decipher the metabolic reprogramming of PDAC, we showed its high dependence on cholesterol which it satisfies by increasing the low-density lipoprotein (LDL) internalization, through over-represented LDL receptors (LDLR) on pancreatic tumor cell surface. Therefore, LDLR could be a promising route for tumor-targeted delivery of cytotoxic and/or imaging agents. In this study, we generated Ldlr+/+ and Ldlr-/- pancreatic tumor cells derived from spontaneous PDAC mice model (KIC mice: LSL-KRasG12D ; Ink4a/Arffl/fl ; Pdx1-Cre) and used fluorescent labelled-vector cargo conjugate targeting LDLR extracellular domain (Fc(A680)-VH4127). In vitro, we showed that the conjugate specifically targets LDLR and is internalized and addressed to lysosomes, as the LDLR natural ligand. Then, we demonstrated that this conjugate specifically targets subcutaneous Ldlr+/+ pancreatic tumors and not healthy tissues (pancreas, liver, adrenal glands). Finally, similar results were obtained in KIC mice, faithfully presenting human PDAC features, injected with Fc(A680)-VH4127 conjugate. Hence, using this LDLR-targeting conjugate in clinic could improve 1/ PDAC diagnosis (resection margins, tumor volume) and thus increase the number of patients that could benefit from curative surgery and 2/ therapeutic response monitoring and recurrence detection in operated PDAC patients

Nous et d’autres équipes avons montré, qu’une augmentation de la prévalence des lymphocytes T régulateurs (Treg), favorisait la progression de la tumeur, en inhibant notamment la réponse immune anti-tumorale. Dans ce contexte, le laboratoire a développé une nouvelle stratégie d’immunothérapie active visant à inhiber spécifiquement l'activité suppressive des lymphocytes T régulateurs naturels humains (CD4+ CD25high FoxP3+ CD127-/Low). Celle-ci consiste en l’utilisation d’un anticorps (Ac) monoclonal (Brevet WO2015185875) ciblant la Galectine-9 (Gal-9) produite par les Treg et celle portée par les exosomes tumoraux. De façon très intéressante, il a été récemment montré dans un modèle murin de cancer pancréatique (ADKP), une augmentation significative de la Gal-9 intra-tumorale. Par ailleurs, une augmentation de la prévalence périphérique et intra-tumorale des Treg a également été décrite dans ce cancer. Ainsi, le cancer du pancréas parait être une cible privilégiée pour une immunothérapie ciblant la Galectine-9. Dans ce contexte, notre objectif a été d’évaluer in vitro et in vivo l’efficacité de notre Ac anti-Gal-9 dans différents modèles d’ADKP. Dans un premier temps, en collaboration avec le Dr Isabelle Van Seuningen (JPARC, Lille) nous avons évalué l’expression de la Gal-9 et la prévalence des Treg dès les stades les plus précoces de la carcinogenèse pancréatique dans un modèle murin transgénique et évaluer l’efficacité de notre Ac anti-Gal-9 sur ces lésions précoces. Nos données établissent que la neutralisation de la Gal-9 est parvenue à limiter l’infiltration en Treg et la progression des lésions néoplasiques dans ce modèle. Par ailleurs, afin d’anticiper l’utilisation d’une immunothérapie anti-Gal-9 chez l’homme, nous avons validé dans 4 lignées différentes de cancers pancréatiques humaines (Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1), l’expression génique (RT-QPCR) et protéique de la Gal-9 (IF, WB et cytométrie). Nous avons également montré que ces lignées étaient capables de sécréter la Gal-9 notamment via des exosmes (ELISA). Nos résultats suggèrent également que l’utilisation de l’Ac anti-Gal-9 permet de neutraliser les exosomes tumoraux d’ADKP et de limiter la croissance tumorale dans un modèle murin humanisé d’ADKPEn parallèle de ces travaux, nous avons initié un programme de recherche visant à évaluer une nouvelle stratégie dans l’ADKP : la Thérapie Photodynamique (PDT). Cette photothérapie basée sur l’utilisation d’un photosensibilisateur (PS) et d’une lumière de longueur d’onde spécifique, a déjà fait ses preuves en oncologie. De plus, il existe un rationnel pour penser que la PDT pourrait impacter la réponse immunitaire, en faveur d’une immunoactivation. Au laboratoire, nous disposons d’un nouveau PS (PS-FOL/PS2), protégé par un brevet récemment publié (WO2019 016397-A1). Ce PS2 est associé à une molécule d’acide folique ciblant le récepteur folate 1 (FOLR1) avec une forte affinité. Or, FOLR1 est exprimé dans 100% des ADKP, voire surexprimé dans 30 % des cas. Dans ce contexte, l’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de la PDT au PS2 sur 4 lignées humaines d’ADKP : Capan-1, Capan-2, MiaPaca-2 et Panc-1. Nous avons pu, ainsi, valider l’expression génique et protéique de FOLR1 sur ces 4 lignées, puis nous avons confirmé l’efficacité de la PDT couplée au PS2, sur ces lignées d’ADKP. Nos travaux montrent entre autres que les milieux conditionnés de ces cellules traitées par la PS2-PDT avaient un effet prolifératif sur le système immunitaire humain. Enfin, nous avons montré que la PS2-PDT semblait limiter la croissance tumorale dans un modèle in vivo de souris immunodéprimées (SCID) humanisées par transplantation sous-cutanée de cellules MIAPaCa-2.En conclusion, nos investigations suggèrent non seulement que la PS2-PDT est une thérapie ciblée efficace dans le traitement de l’ADKP mais aussi qu’elle permet d’activer le système immunitaire et de jouer le rôle d’une véritable vaccination adjuvante anti-cancéreuse
Recently, other and our team have demonstrated that a high regulatory T lymphocytes (Treg) prevalence promotes tumor progression by inhibiting anti-tumor immune response. This was further substantiated by other studies on various cancer models. Using this knowledge, our laboratory has developed a new immunotherapy strategy targeting immunosuppressive activity of human natural Treg (CD4+ CD25high FoxP3+ CD127-/Low). This strategy targets Galectin-9 (Gal-9) produced and secreted by Treg cells using an anti Gal-9 monoclonal antibody (Patent WO2015185875). Thus, for the first time, we demonstrated that an anti-Gal-9 immunotherapy can significantly limit tumor growth in a humanized mouse model of nasopharyngeal carcinoma. In parallel, it have been shown a high Gal-9 expression in a mouse model of pancreatic cancer (PDAC), and a high prevalence of circulating and infiltrating Treg in PDAC patients. Thus, PDAC appears to be a privileged target for our anti-Gal-9 immunotherapy. In this context, our main objective was to evaluate the in vitro and in vivo efficacy of our anti-Gal-9 immunotherapy in PDAC. In close collaboration, with Dr. Isabelle Vanseuningen (JPARC, Lille), we were first able to evaluate the expression of Gal-9 and the prevalence of Treg from the earliest stages of pancreatic carcinogenesis in a transgenic mouse model. We have also evaluated the efficiency of anti-Gal9 treatment on tumor pancreatic progression. Our data demonstrated that the neutralization of Gal-9 was successful in limiting Treg infiltration along with neoplastic lesion progression. In a second time, in order to anticipate the use of this immunotherapy in humans, we also validated Gal-9 expression (RT-qPCR, Immunofluorescence, Western blot and cytometry) in 4 different human pancreatic cancer lines (Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1). Interestingly, we showed that these lines secrets Gal-9 in particular via exosomes (ELISA, Western-Blot). Finally, in vivo results suggested that our anti-Gal-9 antibody limits not only exosomes immunosuppressive impact, but also the tumor growth in a humanized mouse model of PDAC.Furthermore, we have initiated a novel study to evaluate a new therapeutic strategy for PDAC: The Photodynamic Therapy (PDT). PDT is based on the use of a non-toxic photosensitizer (PS) and a light excitation. Upon accumulation in the neoplasm and subsequent photo-excitation, the PS generates reactive oxygen species to elicit tumoral cytotoxicity. In the recent years, PDT has already proved its worth in the field of oncology. There is indeed a rationale to think that PDT could impact the immune response, in favor of immunoactivation against the tumor. In the laboratory, we have a new folate-coupled PS (PS2), protected by a recently published patent (WO2019 016397-A1, January 24, 2019), which binds with folate receptor 1 (FOLR1). FOLR1 is expressed in 100% of ADKPs, and even over-expressed in 30%. In this context, the objective was to evaluate the efficacy of PDT on 4 human PDAC lines: Capan-1, Capan-2, MiaPaca-2 and Panc-1. We validated the genomic and proteomic expression of FOLR1 on the 4 PDAC cell lines. Subsequently, we confirmed the efficacy of PS2 mediated PDT our 4 tumor cell lines. Our results also demonstrated that PDT affects the cytokine secretion of cancer cell lines and the conditioned media of these PS2-PDT-treated cells had a proliferative effect on the human immune system. Finally, we showed that PS2-PDT limits the tumor growth of our immunocompromised humanized mice (SCID) model with subcutaneously transplanted MIAPaCa-2 cells.In conclusion, our investigations suggest not only that PS2-PDT is an effective targeted therapy in the treatment of ADKP but also that it activates the immune system and plays the role of a real adjuvant anti-cancer vaccination

L’Adénocarcinome Canalaire Pancréatique (ACP), la forme majeure de cancer du pancréas, est un des cancers les plus mortels du fait de son agressivité d’invasion locale et de dissémination vasculaire et de l’absence de méthode de détection précoce de la maladie. Nous avons développé un nouveau modèle d’invasion in vivo, sur la membrane chorio-allantoïdienne de l’embryon de poulet, permettant d’analyser les mécanismes d’interactions entre les cellules tumorales pancréatiques et leur microenvironnement. Nous avons montré que dans ce modèle les gènes codant pour les protéines sécrétées nétrine-1 et CXCL4L1/PF4v1 sont surexprimés dans les cellules tumorales au cours du processus d’invasion et que cette surexpression est également retrouvée dans les échantillons de patients humains. Nos études fonctionnelles ont indiqué que la nétrine-1 et CXCL4L1 pourrait jouer le rôle de régulateurs de la progression tumorale selon le modèle suivant : a) la chimiokine CXCL4L1 exercerait de façon paracrine une activité angiostatique sur les cellules endothéliales de l’ACP alors que b) la nétrine-1 aurait une activité pro-tumorale en agissant à la fois sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales. Ces résultats ont permis d’une part de valider notre modèle en confirmant que les gènes surexprimés sélectionnés peuvent être impliqués dans la progression tumorale chez les patients. D’autre part, notre étude a permis de démontrer que les protéines CXCL4L1 et nétrine-1 constituent de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques potentielles pour le cancer du pancréas
Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC), the major form of pancreatic cancer, is one of the deadliest cancers because of its propensity for local invasion and vascular dissemination and the lack of early diagnostic strategy. We have developed a new in vivo invasion model, on the chick embryo chorioallantoic membrane, allowing the analyze of mechanisms governing interactions between pancreatic tumor cells and their host microenvironment. We showed in its model that the genes encoding netrin-1 and CXCL4L1/PF4v1 secreted proteins are up-regulated in tumor cells in the course of the invasion process and we confirmed these up-regulation was also observed in human patients. Our functional studies indicated that netrin-1 and CXCL4L1 may play regulator roles in tumor progression according to the following model: a) CXCL4L1 chimiokine may have an angiostatic activity on endothelial cells by a paracrine mechanism of action whereas b) netrin-1 may have a pro-tumoral activity by acting on both endothelial and tumor cells. These results allowed in one hand to validate our model by showing that selected up-regulated genes may be involved in PDAC progression in human patients. On the other hand, our work provided evidence that CXCL4L1 and netrin-1 constitute new potential therapeutic and/or diagnostic targets for pancreatic cancer