Dissertationen zum Thema „Neurosecretion“

The hypothalamic supraoptic nucleus (SON) contains both vasopressin-secreting (AVP) and oxytocin-secreting (OT) magnocellular neurons which release their respective hormones from the posterior pituitary gland into the systemic circulation. A direct relationship has been demonstrated in earlier physiological studies between the excitability of SON neurons and hormone release from the neurohypophysis. Catecholamines have been shown to activate SON neurons, thereby increasing the action potential frequency to the neural lobe. The present study examined the ability of catecholamines to evoke release of vasopressin and/or oxytocin from the neural lobe of an intraarterially perfused preparation of rat hypothalamo-neurohypophysis.<br>Experiments were carried out on male Long-Evans rats. Drugs (noradrenaline, dopamine, D1 and D2 dopamine receptor agonists) were delivered both into the perfusion medium and directly over the SON. Fractions of effluent medium were collected from the area of the neurohypophysis and tested for hormone release using a selective radioimmunoassay. Noradrenaline (NA) in concentrations of 10$ sp{-5}$ to 10$ sp{-4}$ M stimulated AVP release from neural lobe. The $ alpha sb1$-adrenergic receptor antagonist, prazosin (50 nM in perfusion experiments; 1$ mu$M in local injection experiments) blocked the noradrenaline-stimulated release. Dopamine (10$ sp{-4}$ to 10$ sp{-3}$ M), D1 (SKF 38393, 0.5 mM) and D2 (QNP 0.5 mM) dopamine receptor agonists also increased the release of AVP. In the presence of prazosin, DA, QNP and SKF 38393 still evoked AVP release. Therefore, it is proposed that both noradrenaline and dopamine stimulate the release of AVP in this preparation; the responses to dopamine appear to be mediated by both D1 and D2 dopamine receptors, presumably located at the level of the cell somata/dendrites, possibly also on axon terminals in the neural lobe.

La neurosecrétion nécessite une coopération entre différents acteurs protéiques pour orchestrer le transport, la fusion et le recyclage de vésicules sécrétrices. Cependant les lipides, composants majeurs des membranes cellulaires, ont été moins étudiées lors de ce processus, principalement à cause d’un manque d’outils. Ainsi lors de ma thèse, j’ai implémenté deux approches pour étudier les fonction pléïotropiques d’un lipide de signalisation : l’acide phosphatidique (PA). L’utilisation d’analogues du PA modifié chimiquement m’a permis d’établir leur dynamique ainsi que leurs interactomes directement dans des cellules neurosécrétrices. Une seconde approche optogénétique permet de moduler les niveaux intracellulaires de PA avec une résolution spatiale et temporelle sans précédent pour établir les fonctions non-redondantes de différents pools de PA subcellulaires. Ainsi, grâce à cette nouvelle boite à outil moléculaire, j’ai pu approfondir notre compréhension des rôles du PA dans la neurosécrétion<br>Neurosecretion requires multiple proteins acting together to orchestrate transport, fusion and recycling of secretory vesicles. However, contribution of lipids, main components of cellular membranes, have been much less studied in these processes, primarily because of a lack of adequate tools. Hence, during my thesis, I implemented two novel approaches to study the pleiotropic functions of a peculiar signaling lipid: phosphatidic acid (PA). The use of chemically modified PA click-analogues enabled me to establish their dynamics as well as to characterize their interactome directly within neurosecretory cells. A second approach based on the optogenetic targeting of enzymes involved in the PA metabolism modulated its cellular levels with an unprecedented spatial and temporal resolution. This work allowed to unravel the non-redundant functions of various subcellular PA pools. Our novel molecular toolbox for PA, represents a breakthrough in lipid biology that will greatly improve our understanding of the roles of PA in the neurosecretory process

Chez les mammifères, la reproduction est regulée par des neurones spécifiques qui sécrètent le neuropeptide GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone). Ces cellules naissent au stade prénatal dans la placode nasale et migrent dans l'hypothalamus, le long des nerfs olfactifs voméro-nasaux, pour devenir des membres à part entière de l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. Un certain nombre de pathologies de la reproduction humaine sont associées à la perturbation soit de la migration neuronale des cellules à GnRH ou soit de la sécrétion de la GnRH.L'objectif général de ma thèse était d'identifier de nouveaux facteurs moléculaires régulant la migration des cellules à GnRH, leur ciblage axonale à l'éminence médiane, mais aussi leur neurosécrétion au cours de la vie reproductive.Les événements complexes du développement correcte du système à GnRH sont strictement régulés par l'expression spatio-temporelles des molecules de guidage et des molécules de la matrice extracellulaire, dont les fonctions, sont en partie médiées par leur liaison avec la &#946;1-intégrine (Itgb1). La première partie de mon travail a été d’étudier le rôle biologique de ces protéines de surface dans la reproduction. La technologie Cre/loxP a été utilisée pour générer des souris conditionnelles GnRH spécifiques KO pour la &#946;1-intégrine (GnRH-Itgb1-/-). La perte d’activité de la &#946;1-intégrine altére la migration des neurones à GnRH, leur extension axonale à l’eminence mediane et la fertilité de ces souris. Ces résultats mettent en évidence que la &#946;1-intégrine joue un rôle important dans le développement normal du système GnRH et dans l'acquisition de compétences reproductives normales chez les rongeurs.Dans la deuxième partie de ma thèse de doctorat, j'ai identifié de nouveaux facteurs moléculaires qui pourraient être responsables de l'apparition du syndrôme des ovaires polykystiques (SOPK). Cette maladie est présente chez près de 10 % des femmes. Il s’agit d’une hyperandrogénie associée à une oligo-anovulation chronique, une morphologie ovarienne polykystique et d'autres situations cliniques de transition d'un état endocrinien à un autre. Chez les patientes atteintes du SOPK, le niveau d'hormone antimüllérienne (AMH) est élevé et indique clairement que l'AMH pourrait est un marqueur possible dans le diagnostic et le traitement du SOPK. Une autre manifestation du syndrome est une élévation des sécrétions du GnRH provoquant une augmentation des taux de LH et un rapport LH/FSH élevés, qui stimulent la production d'androgènes ovariens. Toutefois, jusqu'à présent cette maladie a été considérée principalement comme une pathologie gonadique et des régulations possibles plus élevées au niveau du système nerveux central ou des interactions avec ce dernier n'ont pas été étudiées. En particulier, des informations concernant les effets extra-ovariens possibles de l'AMH sur l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique manquent actuellement. Mon projet de recherche a été d’étudier le rôle encore méconnu de l'AMH dans la régulation de la physiologie du système à GnRH. Mes études ont permis d’identifier un nouveau rôle extra-ovarien pour l'AMH, et notamment comme un puissant activateur de la neurosécrétion de la GnRH<br>During aging, oxidative stress occurs characterized by an imbalance between the production reactive oxygen species and antioxidant capacity. It’s well recognized that acute exercise induces oxidative stress which response may be affected by aging. Only few studies have focused on the response of oxidative stress parameters to an acute exercise in relation with aging and they were not made in humans. The first aim of this work was to investigate the response of oxidative stress parameters to acute exercise in young and older subjects. Our results showed that aging has no effects on oxidative stress parameters at rest. However, in response to an acute physical exercise, our results showed that aging is characterized by an antioxidant defenses deficiency and an increase in free radical damage markers. On the other hand, regular physical activity is considered as an effective way to reduce free radical attacks and enhance the antioxidant defense. These adaptations to regular physical activity are often related to the level of physical activity and this has been shown in young subjects. The second aim of this work was to study oxidative stress parameters in elderly subjects with different physical activity levels. Our results showed a positive correlation between physical activity level and antioxidant potential. However, physical activity at high level increases free radical damage in older adults. In view of changes in oxidative stress parameters with aging, adaptations of those to regular physical activity could also be affected by aging phenomena. The aim of the third study of this work was to investigate the effects of aging and physical activity level on oxidative stress parameters responses to an acute exercise. To do so, we compared these parameters in two young subjects groups (active and sedentary) and two older adults groups (active and sedentary) before and after an acute exercise. Our results showed that, benefits of regular physical activity on the oxidative parameters stress were more pronounced in younger age groups compared to older groups. On the other hand, the effects of aging on oxidative stress parameters in the active groups were lower than those noted in the sedentary groups

Includes bibliographical references (leaves 183-207) A local intradermal technique using colchicine to estimate cell division rate in wool follicles is refined and used throughout the thesis. Statistical methods used to analyse data obtained with this method are described and discussed. The implications of the findings are of great significance to research into the influence of physiological changes on wool production, and suggest experiments should be conducted under controlled environmental conditions, with a minimum of stress imposed on the animals.

A central concept in the physiology of neurosecretion is that a rise in cytosolic [Ca2+] in the vicinity of plasmalemmal Ca2+ channels due to Ca2+ influx, elicits exocytosis. This dissertation examines the effect on both spontaneous and elicited exocytosis of a rise in focal cytosolic [Ca2+] in the vicinity of ryanodine receptors (RYRs) due to release from internal stores in the form of Ca2+ syntillas. Ca2+ syntillas are focal cytosolic transients mediated by RYRs, which we first found in hypothalamic magnocellular neuronal terminals. (Scintilla, Latin for spark, found in nerve terminals, normally synaptic structures.) We have also observed Ca2+ syntillas in mouse adrenal chromaffin cells (ACCs). Here the effect of Ca2+syntillas on exocytosis is examined in ACCs, which are widely used as model cells for the study of neurosecretion. Elicited exocytosis employs two sources of Ca2+, one due to influx from the cell exterior through voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs) and another due to release from intracellular stores. To eliminate complications arising from Ca2+ influx, the first part of this dissertation examines spontaneous exocytosis where influx is not activated. We report that decreasing syntillas leads to an increase in spontaneous exocytosis measured amperometrically. Two independent lines of experimentation each lead to this conclusion. In one case release from stores was blocked by ryanodine; in another, stores were partially emptied using thapsigargin plus caffeine after which syntillas were decreased. We conclude that Ca2+syntillas act to inhibit spontaneous exocytosis, and we propose a simple model to account quantitatively for this action of syntillas. The second part of this dissertation examines the role of syntillas in elicited exocytosis whereby Ca2+ influx is activated by physiologically relevant levels of stimulation. Catecholamine and neuropeptide release from ACCs into the circulation is controlled by the sympathetic division of the Autonomic Nervous System. To ensure proper homeostasis tightly controlled exocytic mechanisms must exist both in resting conditions, where minimal output is desirable and under stress, where maximal, but not total release is necessary. It is thought that sympathetic discharge accomplishes this task by regulating the frequency of Ca2+ influx through VGCCs, which serves as a direct trigger for exocytosis. But our studies on spontaneous release in ACCs revealed the presence of Ca2+ syntillas, which had the opposite effect of inhibiting release. Therefore, assuming Ca2+-induced Ca2+ release (CICR) via RYRs due to Ca2+ influx through VGCCs, we are confronted with a contradiction. Sympathetic discharge should increase syntilla frequency and that in turn should decreaseexocytosis, a paradox. A simple “explanation” might be that the increase in syntillas would act as a brake to prevent an overly great exocytic release. But upon investigation of this question a different finding emerged. We examined the role of syntillas under varying levels of physiologic stimulation in ACCs using simulated action potentials (sAPs) designed to mimic native input at frequencies associated with stress, 15 Hz, and the basal sympathetic tone, 0.5 Hz. Surprisingly, we found that sAPs delivered at 15 Hz or 0.5 Hz were able to completely abolish Ca2+ syntillas within a time frame of two minutes. This was not expected. Further, a single sAP is all that was necessary to initiate suppression of syntillas. Syntillas remained inhibited after 0.5 Hz stimulation but were only temporarily suppressed (for 2 minutes) by 15 Hz stimulation, where global [Ca2+]i was raised to 1 – 2 μM. Thus we propose that CICR, if present in these cells, is overridden by other processes. Hence it appears that inhibition of syntillas by action potentials in ACCs is due to a new process which is the opposite of CICR. This process needs to be investigated, and that will be one of the very next steps in the future. Finally we conclude that syntilla suppression by action potentials is part of the mechanism for elicited exocytosis, resolving the paradox. In the last chapter speculation is discussed into the mechanisms by which physiologic input in the form of an action potential can inhibit Ca2+ syntillas and furthermore, how the Ca2+ syntilla can inhibit exocytic output.

Les cellules du lobe intermédiaire sécrètent l'alpha-MSH, une hormone impliquée dans le processus d'homochromie chez les amphibiens. Ces cellules sont soumises à un contrôle hypothalamique complexe. Nous avons recherché les mécanismes intracellulaires impliqués dans la libération d'α-MSH en réponse à la TRH, à la dopamine et au GABA. Chez la grenouille, la TRH est sans effet sur le système adénylate-cyclasique mais induit simultanément une augmentation rapide du taux d'IP3 et une réduction du taux de PIP2 indiquant que les récepteurs de la TRH présents au niveau des cellules mélanotropes sont couplés positivement à la phospholipase C. L'effet de la dopamine sur la sécrétion d'α-MSH est médié par la fermeture de canaux calciques voltage-dépendants et une réduction de l'activité adénylate-cyclasique. De plus, la dopamine provoque une diminution de la production d'IP3 qui participe au maintien de l'effet inhibiteur. L'action du GABA sur la libération d'α-MSH met en jeu principalement des récepteurs [GABA]A dont l'activité est modulée par l'AMPc. Par ailleurs, le GABA stimule des récepteurs [GABA]B négativement couplés à l'adénylate-cyclase ce qui suggère une interaction possible entre les 2 types de récepteurs GABA ergiques. Les agonistes [GABA]A provoquent également une augmentation de la [Ca2+]i médié par l'ouverture de canaux calciques voltage-dépendants de type L; ce phénomène est responsable de l'augmentation transitoire de la sécrétion d'α-MSH produite par le GABA. Le TEA prolonge l'augmentation de la [Ca2+]i induite par les agonistes [GABA]A, suggérant l'intervention de canaux K+ dans l'inhibition de la sécrétion d'α-MSH. Chez le xénope, un traitement de 2 h par la dopamine ou le GABA provoque un blanchiment de la peau et une diminution du taux d'α-MSH circulant sans que les taux des inositols phosphates ne soient modifiés. En revanche, un traitement de 3 jours par l'apomorphine inhibe la production des inositols phosphates suggérant que l'inhibition du turnover des phospholipides inositols induite par la dopamine modulerait la synthèse plus que la libération d'α-MSH. En conclusion, nous montrons que la TRH, la dopamine et le GABA agissent via des récepteurs couplés simultanément à plusieurs mécanismes de transduction. Nos résultats indiquent que l'intégration de l'information au niveau de la cellule mélanotrope ne peut se concevoir comme la simple somme algébrique des effets stimulateurs et inhibiteurs

Les inclusions des cellules gliales et des neurones des ganglions cérébroïdes de crépidule et cérépleuraux de la moule ont été examinés. Une première approche a permis de distinguer les granules de neurosécretion de type neuroendocrine des inclusions pigmentées. L'ultrastructure de ces inclusions permet de les caracteriser avec précision. L'étude biochimique révèle la présence de carotènes et de différentes xanthophylles. On précise enfin le rôle de ces inclusions dans des conditions d'hypoxie et d'anoxie du milieu

Chez la moule, la gametogenese et le metabolisme du tissu de reserve sont controles par les ganglions nerveux. L'utilisation de suspensions de cellules dissociees enzymatiquement permet d'etudier la regulation des mitoses goniales. La quantification de la mitose goniale a ete effectuee par 1)l'incorporation de thymidise marquee, 2)la mesure de l'activite specifique de l'aspartate transcarbamylase. L'association de ces techniques a permis la caracterisation partielle du facteur mitogene: petite molecule, acide soluble, hydrophobe, peptide. Les cellules de ce facteur sont immunocreatrices face a l'anti-somatostative. L'utilisation immunocytochimique de cet anticorps a permis de reveler un nouveau type de cellule des tubules gonadiques. L'effet mitogene revele un nouveau type de cellule des tubules gonadiques.

Le pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) est un neuropeptide dont la structure primaire a été conservée au cours de l'évolution des amphibiens jusqu'aux mammifères. Le but du présent travail visait d'une part à déterminer la cartographie du PACAP et de ses récepteurs dans le cerveau de grenouille et rechercher le rôle du peptide dans la régulation du lobe antérieur de l'hypophyse et d'autre part de mettre en évidence la présence du PACAP dans la glande surrénale et d'examiner le mécanisme d'action du peptide sur la stéroïdogénèse surrénalienne. Par immunohistochimie nous avons montré que le PACAP est principalement localisé dans l'hypothalamus. Les études de liaison ont révélé la présence de récepteurs spécifiques et de haute affinité pour le PACAP dans l'hypothalamus et nous avons démontré que ceux-ci étaient positivement couplés à l'adénylate cyclase. Un réseau de fibres à PACAP parcourant l'infundibulum se termine au contact du système porté hypothalamo-hypophysaire. Par ailleurs, le PACAP stimule la biosynthèse d'AMPc à partir de fragments d'adénohypophyse. Ces résultats indiquent que dans le cerveau des amphibiens, le PACAP pourrait agir à la fois comme un neurotransmetteur ou un neuromodulateur et un neuropeptide hypophysiotrope. Une immunoréactivité de type PACAP a été observée dans des fibres innervant le parenchyme surrénalien et l'analyse par HPLC a révélé que l'immunoréactivité correspondait principalement au PACAP38 de grenouille (fPACAP38). Par la technique de périfusion nous avons montré que le fPACAP38 stimule de façon dose-dépendante la steroïdogénèse. Les études de liaison à partir de cellules surrénaliennes en culture primaire ont permis de mettre en évidence l'expression de récepteurs spécifiques et de haute affinité pour le PACAP à la fois sur les cellules stéroïdogènes et sur les cellules chromaffines. L'étude du mécanisme d'action du PACAP a montré que le peptide induit une élévation des concentrations de calcium cytosolique dans les deux types de cellules surrénaliennes. Parallèlement, le PACAP provoque une stimulation dose-dépendante de la synthèse d'AMPc par des tranches de surrénales. Ces données suggèrent que le PACAP, libéré à partir de terminaisons nerveuses au sein du tissu surrénalien, participe à la régulation de la stéroïdogénèse. L'effet stimulant du peptide sur les cellules adrénocorticales est médié par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques et met en jeu l'activation du système adényl cyclasique et la mobilisation du calcium intracellulaire. Par ailleurs, le PACAP est susceptible d'agir sur la sécrétion des corticostéroïdes par un mécanisme paracrine faisant intervenir les paraneurones chromaffines

Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular) apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia de Coimbra<br>As células da retina do embrião de pinto em cultura foram utilizadas neste estudo com o objectivo de caracterizar as alterações na actividade e na expressão de diferentes subunidades dos receptores ionotrópicos do glutamato durante o desenvolvimento. Estudámos também a importância que a activação dos receptores ionotrópicos do glutamato tem na libertação de aminoácidos neurotransmissores, em retinosferóides e usámos culturas de células da retina do embrião de pinto em monocamada, onde seguimos a expressão da subunidade GluR4 do receptor do tipo AMPA, durante o desenvolvimento, e a possível contribuição destes receptores para a entrada de Ca2+ nas células após a sua activação. Observamos que a expressão das subunidades dos receptores de NMDA e AMPA/cainato nestas culturas primárias mimetiza a expressão das mesmas subunidades na retina de pinto em desenvolvimento no embrião. Também determinamos as alterações no conteúdo total e a libertação de vários aminoácidos após a estimulação dos receptores ionotrópicos do glutamato, em células da retina cultivadas na forma de retinosferóides. Os resultados obtidos indicam que os aminoácidos poderão actuar como moléculas sinalizadoras durante o desenvolvimento, provavelmente estimulando o comprimento e a densidade das neurites, podendo ainda estar envolvidos na propagação de ondas eléctricas nas células da retina, mesmo para aquelas células que não possuem "gap-junctions" nos retinosferóides de pinto, durante o desenvolvimentoin vitro. Determinamos também se os receptores do tipo AMPA, em células de retina do embrião de pinto em culturas de monocamada, podem contribuir para uma entrada de Ca2+ nas células e se estes dados se relacionam com a com a expressão da subunidade GluR4 dos receptores AMPA. Os resultados obtidos mostraram que a localização de GluR4 se correlaciona muito bem com a entrada de Co2+, uma vez que a área celular mais marcada com Co2+ é a região perinuclear, que é também a região que marca duma forma mais intensa para GluR4, só mais tarde, e com um estímulo muito forte, as células reagem duma forma positiva.<br>We used chick retinas and chick embryo retina cells cultured as retinospheroids to characterise the changes in the activity and expression of ionotropic glutamate receptor subunits during development. We also studied the influence of ionotropic glutamate receptor activation on the release of amino acid neurotransmitters in retinospheroids, and used chick retina cells cultured as monolayers to follow the expression of GluR4 a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) receptor subunit during development and the possible contribution of AMPA receptors for Ca2+ entry in the cells upon activation. We found that the NMDA and AMPA/kainate receptor subunits expression in the primary cultures mimics their expression in the developing chick retina. We have also determined the total content and the release of various amino acids stimulated by glutamate ionotropic glutamate receptor agonists in retinospheroids. We found, that amino acids may act as signalling molecules during development, by stimulating the length and density of neurites, and that they may be involved in electric wave propagation in retina cells, during developmentin vitro The functionality of AMPA receptors in chick embryo retina cells during development in vitro, was determined by using Co2+ uptake, and these data were correlated with the expression of the AMPA receptor subunit GluR4. We showed that the localisation of GluR4 is well correlated with the Co2+ entry, since the most stained area of the cell with Co2+ is the perinuclear area, which is also the most labelled with GluR4 and only later on, and with strong stimuli, the cells became Co2+ positive at the neuritis.

Includes bibliographical references (leaves 183-207)<br>ix, 207 leaves : ill. (some col.) ; 30 cm.<br>A local intradermal technique using colchicine to estimate cell division rate in wool follicles is refined and used throughout the thesis. Statistical methods used to analyse data obtained with this method are described and discussed. The implications of the findings are of great significance to research into the influence of physiological changes on wool production, and suggest experiments should be conducted under controlled environmental conditions, with a minimum of stress imposed on the animals.<br>Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Animal Sciences, 1992