Dissertationen zum Thema „Négatif dominant“

Chez les cellules eucaryotes, le calcium est l'un des éléments de transduction le plus employé. La mobilisation calcique à l'intérieur de la cellule est d'ailleurs un événement essentiel à l'établissement d'une vaste gamme de processus physiologiques. Les TRPCs (T[barbelow]ransient R[barbelow]eceptor P[barbelow]otential C[barbelow]anonical), comptent parmi les entités moléculaires responsables de la mobilisation calcique membranaire à la suite de l'activation d'un G q PCR ou d'un récepteur tyrosine kinase. Bien que des efforts intenses aient été déployés jusqu'à maintenant, l'élucidation du rôle physiologique de ces protéines reste encore aujourd'hui d'une grande importance. Dans l'objectif d'approfondir nos connaissances sur le rôle des TRPCs, nous avons tenté de développer un mutant dominant négatif de la protéine TRPC6 par mutation d'acides aminés hautement conservés chez tous les TRPCs et chez TRPV1, que nous avons nommé TRPC6dn1. Nous démontrons que TRPC6dn1 est exprimé correctement et de façon stable dans le temps."--résumé abrégé par UMI.

Le gène Ikaros ou Lyf1 code pour le facteur de transcription Ikaros dont les multiples isoformes sont obtenues après épissage alternatif : certaines d’entre elles, comme Ikaros 6, sont dépourvues d’un domaine de liaison à l’ADN fonctionnel et possèdent un rôle de dominant-négatif. L’absence d’Ikaros chez la souris, entraîne des défauts de la lymphopoïèse, la myélopoïèse et l’érythropoïèse, cependant les étapes régulées par ce facteur sont encore largement méconnues. Afin d’approfondir les connaissances du rôle d’Ikaros au cours de l’érythropoïèse, nous avons surexprimé un dominant-négatif d’Ikaros, Ikaros 6, à l’aide d’un vecteur lentiviral. Ces vecteurs, dérivés du virus du HIV-1, permettent d’augmenter l’efficacité du transfert de gènes dans les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sans modifier leur propriété de multipotence. Nous avons élaboré un vecteur comportant deux gènes sous le contrôle de deux promoteurs distincts, afin de pouvoir détecter les HSC humaines transduites. Cependant, cette construction n’est pas fonctionnelle dans notre système expérimental. La surexpression du dominant-négatif d’Ikaros, Ikaros 6, à l’aide d’un vecteur lentiviral à une unité transcriptionnelle, entraîne un défaut du nombre de cellules en culture associé à une augmentation de la mort cellulaire. Le blocage de la fonction d’Ikaros influence également l’expression des gènes érythrocytaires ainsi que l’hémoglobinisation. Par cette étude, nous avons donc pu mettre en évidence un rôle important d’Ikaros au cours de l’érythropoïèse humaine
Hematopoiesis is a complex process which is regulated by expression of many transcription factors, such as Ikaros. This gene encodes several isoformes by alternative splicing : some of them without functional DNA binding act as dominant-negative. Lack of Ikaros induced defects of lymphopoiesis, myelopoiesis and erythropoiesis, however, critical steps regulated by Ikaros are largely unknown. To study further Ikaros involvement in erythropoiesis, we overexpressed a dominant-negative isoform, Ikaros 6, using lentiviral vector. This type of vector, derived from HIV-1, is main tool to tranfer gene into hematopoietic stem cells without alter multipotence properties. We developed a lentiviral vector containing two genes controlled by two different promoters to detect transduced HSC. However, problems of gene expression showed unfunctionally construct in our experimental system. Study of Ikaros in human erythropoiesis will be realised with basal lentiviral vector. Overexpression of dominant-negatif, Ikaros 6, displayed a defect of erythroid cell number and an increase of cell death. Inhibited function of Ikaros also induced a decrease of erythroid gene expression and hemoglobinisation. This work underlined important role of Ikaros in human erythropoiesis by regulating of erythroid gene expression

P53 est un gène suppresseur de tumeur ubiquitaire qui empêche la prolifération de cellules malignes chez l’humain. En réponse à des dommages à l’ADN ou à des stress cellulaires, p53 entraine l’arrêt du cycle cellulaire et initie la réparation des lésions du génome. Si ces réparations échouent, p53 déclenche alors la mort de la cellule endommagée par apoptose. De plus, p53 présente une forte homologie avec deux autres gènes suppresseurs de tumeur : p63 et p73. Ces trois protéines forment une famille de facteurs de transcription qui protège l’organisme contre le développement de tumeurs. Ce système de défense est enrichi par les multiples isoformes de p53, p63 et p73 dont les rôles sont encore mal décrits. La neutralisation de la fonction de suppression de tumeur de p53, p63 et p73 est un mécanisme clef du développement tumoral auquel participent les mutants hotspots de p53 ainsi que certaines isoformes de p53, p63 et p73 par un effet dominant-négatif. Toutefois, de nombreuses zones d’ombre limitent notre compréhension de ce phénomène. Tout d’abord, l’identification des membres de la famille de p53 impliqués dans l’effet dominant-négatif reste incomplète. Ensuite, les mécanismes responsables de l’effet dominant-négatif sont débattus, suite notamment à l’émergence d’une nouvelle hypothèse impliquant un mécanisme de type prion. Enfin, l’effet dominant-négatif de la famille de p53 pourrait également être mis en cause dans d’autres types de pathologies comme les syndromes développementaux associés à des mutations de p63. Au cours de cette thèse, j’ai étudié l’impact fonctionnel des mutations hotspots de p53 ainsi que celui des principales isoformes de la famille de p53 sur l’activité transcriptionnelle des isoformes actives de p53, p63 et p73. En utilisant comme modèle d’étude un eucaryote simple, la levure S. cerevisiae, nous avons pu démontrer que l’effet dominant-négatif des mutants et isoformes de la famille de p53 repose sur la formation d’hétéro-tétramères entre formes actives et inactives de ces protéines et n’implique pas de mécanisme de type prion. De plus nos travaux ont montré que certains mutants de p53 interfèrent avec les isoformes actives de p63 et p73 par un mécanisme partiellement basé sur la tétramérisation. En outre, nos résultats préliminaires suggèrent que les mutants de p63 impliqués dans les syndromes développementaux EEC, ADULT et NSCL1 exercent également un effet dominant-négatif similaire à celui des mutants de p53. L’identification des mécanismes de l’effet dominant-négatif observé au sein de la famille de p53 permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques tant dans les cancers que dans certaines maladies rares du développement humain
P53 is a ubiquitous tumor suppressor gene that prevents damaged cells from proliferating. Following DNA damage or cellular stress, p53 induces a cell cycle arrest and initiates an attempt to repair the lesions. If the repair fails, p53 triggers the apoptosis of the cell. p53 shares a high homology with two other tumor suppressor genes: p63 and p73. Together they form a family of transcription factors, which are actively protecting the organism from tumor development. This defense network is enriched by multiple N-terminal and C-terminal isoforms of p53, p63 and p73. The loss of p53, p63 and p73 tumor suppression function is a key step of cancer progression. Mutants of p53 and isoforms of p53, p63 and p73 often exhibit a dominant-negative behavior resulting in the loss of p53 tumor suppression activity. However, the extent of the dominant-negative effect within p53 family remains unclear. The mechanisms behind the dominant-negative effect are also debated due to the recent emergence of a prion-like hypothesis. Finally, the dominant-negative effect of p53 family members could be involved in other pathologies such as p63-related developmental syndromes During this PhD, I studied the functional consequences of hotspot mutations of p53 and of the main isoforms of the p53 family on the transcriptional activity of p53, p63 and p73. Using the naïve eukaryotic model S. cerevisiae we have demonstrated that the dominant-negative effect of mutants and isoforms of the p53 family relies on the formation of hetero-tetramers between functional and non-functional members of the family but not on a prion-like mechanism. In addition, certain p53 mutants are able to interfere with p63 and p73 isoforms though a mechanism that is only partially based on tetramerization. Of note, we obtained preliminary results suggesting that mutants of p63, which are involved in EEC, ADULT and NSCL1 developmental syndromes, behave like dominant-negative hotspot mutants of p53. The identification of the mechanisms of the dominant-negative effect occurring within p53 family could lead to new therapeutic targets both in cancer and in rare developmental syndromes.1 EEC : ectrodactyly, ectodermal dysplasia and cleft lip/palate syndrome, ADULT : acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth syndrome, NSCL : non-syndromic cleft lip

À ce jour, STAT3 est le seul gène pour lequel des mutations dans les régions codantes sont à l'origine du syndrome hyper-immunoglobuline E autosomique dominant (AD-HIES). Cependant, l'étiologie génétique de 5% des individus répondant aux critères cliniques pour l'AD-HIES reste inconnue. En combinant le séquençage de l'exome entier et l'analyse de liaison génétique, nous avons identifié la première mutation hétérozygote STAT3 intronique, c.1282-89C>T, causant l'AD-HIES chez sept patients de la même famille. Cette mutation crée un nouvel exon au niveau de l'ADNc de STAT3 (D427ins17). Nous avons également identifié deux nouvelles mutations STAT3 non-sens; c.1552C>T conduisant à une protéine tronquée avec un codon stop dans le domaine de liaison de STAT3 (R518*) chez un patient souffrant de l'AD-HIES, et c.2091delT conduisant à une protéine tronquée avec un codon stop entraînant un décalage du cadre de lecture dans le domaine de transactivation de STAT3 (D698Tfs*9) chez deux apparentés atteints de la tuberculose. Dans un système de surexpression, les trois protéines STAT3 mutantes sont perte de fonction en terme de phosphorylation de la tyrosine, de liaison à l'ADN et d'activité transcriptionnelle. Dans les lymphocytes B des patients, les deux allèles non-sens ne sont pas exprimés alors que nous avons trouvé par spectrométrie de masse que l'allèle D427ins17 ne représente que 5 à 20% du STAT3 total dans les cellules du patient. L'activation des leucocytes du patient a démontré une faible réponse aux cytokines STAT3-dépendantes, comme d'autres patients avec l'AD-HIES. Dans un système de surexpression, nous avons montré que les allèles D427ins17 et D698Tfs*9 sont également dominants-négatifs, alors que l'allèle R518* est neutre. Ce travail démontre l'importance du séquençage des introns dans l'établissement du diagnostic génétique pour l'AD-HIES. De plus, l'étude de l'allèle D427ins17 suggère que les mutations provoquant l'AD-HIES peuvent exercer un effet dominant-négatif même lorsqu'elles sont exprimées à des niveaux significativement inférieurs à ceux de la protéine de type sauvage. En revanche, l'étude de l'allèle R518* suggère l'haploinsuffisance comme étant un autre mécanisme susceptible d'entraîner l'AD-HIES; cependant, l'identification et la caractérisation d'un plus grand nombre de mutations non-sens sont nécessaires avant de pouvoir tirer des conclusions définitives
To date STAT3 is the only gene in which variants in coding regions are known to cause Autosomal Dominant Hyper-Immunoglobulin E Syndrome (AD-HIES). Yet, the genetic etiology of 5% of individuals meeting the clinical criteria for AD-HIES remains unknown. Combining whole exome sequencing and genetic linkage analysis, we identified the first deep intronic heterozygous STAT3 mutation, c.1282-89C>T, causing AD-HIES in seven relatives. This mutation creates a new exon in the STAT3 cDNA (D427ins17). We also identified two novel nonsense STAT3 mutation; c.1552C>T leading to a truncated protein with a stop codon in the STAT3 linker domain (R518*) in a patient with AD-HIES, and c.2091delT leading to a truncated protein with a stop codon with a frameshift in STAT3 transactivation domain (D698Tfs*9) in two relatives with tuberculosis. Upon over-expression, the three mutant STAT3 proteins are loss of function in terms of tyrosine phosphorylation, DNA-binding, and transcriptional activity. In patient's B cells, R518* and D698Tfs*9 alleles are not expressed whereas we found by mass spectrometry that the D427ins17 allele only represents 5 to 20% of total STAT3 in the patient's cells. Activation of patient's leucocytes demonstrated a poor respond to STAT3-dependent cytokines, like other patients with AD-HIES. Upon overexpression, we show that D427ins17 and D698Tfs*9 are equally dominant-negative alleles, whereas R518* allele is neutral. This work emphasis the importance of intron sequencing in the establishment of genetic diagnostics in AD-HIES. Moreover, the study of the D427ins17 allele suggests that AD-HIES-causing mutations can exert their negative-dominance even when expressed at significantly lower levels than the wild-type protein. On the other hand, the study of R518* allele shed the light on haploinsufficiency as another possible mechanism causing AD-HIES; however, the identification and characterization of more nonsense mutations is necessary before drawing any firm conclusions

Les adénomes hypophysaires humains sont des tumeurs développées à partir d’un des cinq types cellulaires constituant l’antéhypophyse. Parmi ces adénomes, on retrouve les adénomes somatotropes, lactotropes, gonadotropes, corticotropes et thyréotropes. Ces tumeurs sont souvent à l’origine d’une hypersécrétion hormonale parfois responsable de complications cardiaques et respiratoires à l’origine d’une augmentation de la mortalité. Pour les adénomes non-fonctionnels (Non Functioning Pituitary Adenoma, NFPA), le plus souvent d’origine gonadotrope, il n’y a pas d’hypersécrétion hormonale et la découverte repose alors sur des signes de compressions des structures avoisinantes. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux adénomes les plus fréquents, les adénomes lactotropes, somatotropes et les NFPA. Si la chirurgie est efficace pour réduire le volume tumoral, elle permet plus rarement une guérison complète. Pour les adénomes somatotropes et lactotropes des traitements pharmacologiques (les analogues de la somatostatine et les analogues de la dopamine) permettent d’inhiber l’hypersécrétion hormonale et parfois de réduire le volume tumoral, mais une proportion non négligeable de patients reste résistante à ces thérapeutiques pharmacologiques. Pour les NFPA, il n’existe aucune thérapeutique spécifique. Dans ce contexte, de nouvelles modalités de traitement semblent nécessaires. La thérapie génique pourrait alors représenter une nouvelle approche thérapeutique pour ce type de tumeur. Le facteur de transcription Pitx2 est surexprimé dans les adénomes gonadotropes (NFPA) et impliqué dans une voie de prolifération cellulaire. Pour obtenir un ciblage spécifique des adénomes non-fonctionnels, notre première stratégie a été d’utiliser un dominant négatif du facteur de transcription Pitx2 (R91P) et des siRNA dirigés contre Pitx2 dans le but de transduire et d’inhiber la viabilité cellulaire des NFPA. Ainsi, nous avons mis en évidence un effet apoptotique caspase dépendant de R91P et des siRNA sur une lignée gonadotrope murine et sur des NFPA humains in vitro. Le récepteur somatostatinergique sst2 est fortement impliqué dans l’inhibition de la sécrétion de GH et l’absence de ce récepteur dans les adénomes somatotropes est responsable de la résistance pharmacologique. Notre deuxième stratégie a donc été d’utiliser le récepteur somatostatinergique sst2 dans le but de réinduire son expression dans des adénomes somatotropes et lactotropes et de restaurer ainsi la sensibilité de ces tumeurs aux traitements médicaux. Suite à un transfert du gène sst2 in vitro, nous avons réussi pour la première fois à rétablir une sensibilité pharmacologique des adénomes somatotropes et lactotropes résistants aux analogues actuels. Notre étude met aussi en évidence un effet apoptotique caspase dépendant de sst2 lui même et une inhibition par sst2 de la sécrétion mais aussi de l’expression de la GH et de la PRL, indépendamment de l’activation par un ligand. Ces effets ligands indépendants suggèrent une activité constitutive de ce récepteur. A côté de cet objectif thérapeutique, cette étude sur le transfert de gènes nous a également permis de mieux comprendre le rôle de la surexpression de Pitx2 et de la perte d’expression du récepteur sst2 dans la tumorigénèse hypophysaire. Ces deux stratégies de transfert de gènes, l’une privilégiant la spécificité (Pitx2), l’autre l’amélioration des traitements actuels semblent prometteuses, mais nécessitent une validation sur des modèles précliniques.

Le gliome chordoïde (ChG) est une tumeur cérébrale rare de bas grade, caractérisée par une nouvelle mutation ponctuelle récurrente PRKCA p.D463H, une substitution dans le domaine kinase de la protéine kinase C alpha (PKCα). Cette étude démontre le rôle de cette kinase mutée dans le développement des ChG. Ici, nous montrons l'inactivation et l'effet négatif dominant de PKCαD463H via des tests d'activité in vitro et in cellulo. Nos résultats montrent que la mutation affecte la structure tertiaire, ce qui entraîne une protéine ouverte et instable. Les données de spectrométrie de masse phosphoprotéomique et de co-immunoprécipitation des cellules HEK surexprimant PKC⍺D463H montrent une diminution de phosphorylation et interaction avec les protéines impliquées dans l'adhésion cellulaire. Nous confirmons génétiquement par le RNAseq à noyau unique que les ChG dérivent de tanycytes spécialisés. En comprenant le contexte cellulaire de la tumorigenèse ainsi que les changements fonctionnels de cette mutation sur l'activité et l'interactome de PKCα, nous avons élaboré un modèle de développement des ChGs parallèlement à l'identification d'une approche thérapeutique
Chordoid glioma (ChG) is a rare low-grade brain tumor, characterised by a novel recurrent point mutation PRKCA p.D463H, a substitution in the kinase domain of Protein kinase C alpha (PKCα). This study demonstrates the role of this mutated kinase in the development of ChGs. Here we show the inactivation and dominant negative effect of PKCαD463H via in vitro and In cellulo activity assays. Our results show the mutation affects the tertiary structure, resulting in an open, unstable protein. Phosphoproteomic and Co-Immunoprecipitation mass spectrometry data from HEK cells overexpressing PKC⍺D463H show decreased phosphorylation and interaction with proteins involved in cell adhesion. We confirm genetically through single nuclei RNAseq that ChGs derive from specialised tanycytes. By understanding the cell context of tumorigenesis alongside the functional changes of this mutation on the activity and interactome of PKCα, we elaborated a model of the development of ChGs alongside the identification of a therapeutic approach

Le ligand, le promoteur et la lignée cellulaire influencent les capacités transactivatrices des récepteurs aux œstrogènes (ER) a et b. Le contexte cellulaire (expression/acétylation de ER/des corégulateurs) module l’activité suppressive de ERb, dépendante de son AF1, envers ERa. Trois approches anticancéreuses ont été testées : l’anti-œstrogène pur RU 58668 induit la dégradation protéasomale de ERa, réduit sa capacité de transactivation mais affecte peu ERb, facteur de bon pronostic. Les inhibiteurs d’histone-déacétylases, agents pro-apoptotiques et cytostatiques, provoquent la dégradation de ERa mais stabilisent ERb. L’association de ces deux agents anticancéreux augmente les effets antiprolifératifs et pro﷓apoptotiques observés sur des cellules MCF-7 ERa+ERb+ avec ces molécules seules. Enfin, les inhibiteurs de la hsp90, chaperon de ER, provoquent sa dégradation protéasomale, inhibent son activité transcriptionnelle, induisent l’apoptose des cellules et bloquent leur prolifération
The transactivation capacity of estrogen receptor (ER) a and b was influenced by the ligand, the promoter and the cell line. The cellular background (expression/acetylation of ER/coregulators) modulated the AF-1-dependent suppressive activity of ERb against ERa. Three therapeutic strategies were tested: the pure antiestrogen RU 58668 induced a proteasome-mediated ERa degradation, decreased its transactivation capacity without affecting ERb associated to a good prognostic. Histone deacetylase inhibitors exerted pro-apoptotic and anti-proliferative activities, induced a proteasome-mediated ERa-degradation but stabilized ERb. The association of these two drugs increased the anti-proliferative and pro-apoptotic effects of this agents alone on MCF-7 cells transiently expressing ERb. Finally, inhibitors of the ER chaperone hsp90 induced apoptosis and growth arrest of breast cancer cells associated with proteasomal degradation of both ERs and inhibition of their transcriptional activities

Le syndrome de Brugada (SBr) est une arythmie cardiaque héréditaire à pénétrance partielle. Cette pathologie est caractérisée par une élévation du segment ST dans les dérivations précordiales droites (V1 à V3) sur l'ECG et un risque important de mort subite et de syncope par fibrillation ventriculaire. Les mutations dans le gène SCN5A, qui code le canal sodique cardiaque Nav1.5, sont mises en cause dans 20% des cas. Le canal sodique cardiaque est responsable de l'initiation et de la propagation du potentiel d'action dans le myocarde. Ainsi, la perte de fonction de ce canal joue un rôle important dans le SBr. Ce travail permet de mieux comprendre les conséquences des mutations de la région N-terminale très conservée au cours de l'évolution, dans le SBr et le rôle de cette dernière dans la fonction du canal Nav1.5. Nous avons montré que certaine mutation de la région la région N-terminale mène à la rétention du canal mutant dans le réticulum endoplasmique précédant sa dégradation par le protéasome. En conséquence ces mutations semblent bien être responsables du SBr. Par ailleurs, cette région joue un rôle important dans la capacité d'ouverture du canal sodique cardiaque. Nous avons mis en évidence que la présence de canaux mutants peut altérer le transport à la membrane du canal sauvage menant à un effet dominant négatif. Mais aussi la capacité du canal non fonctionnel R878C-Nav1.5, qui est capable d'atteindre la membrane plasmique, à restaurer partiellement le courant sodique de mutants retenus dans des compartiments intracellulaires. Ce phénomène de transcomplémentation montre que les canaux sodiques sont capables de coopérer.

L'hormone anti-Müllérienne (AMH) appartient à la famille du Transforming Growth Factor β (TGFβ). Son rôle principal est d'entraîner, chez le fœtus mâle, la régression des canaux de Müller, ébauches de l'utérus et des trompes. Une déficience dans la voie de transduction de l'AMH cause une forme rare de pseudohermaphrodisme masculin caractérisée par une persistance des canaux de Müller (PMDS) chez des garçons normalement virilisés. Au début de ma thèse, le récepteur de type II était le seul élément connu de la voie de signalisation de l'AMH. On distingue deux formes de PMDS en fonction des taux d'AMH circulante estimés par dosage ELISA chez ces patients. Les patients dits « AMH négatif» ayant des taux d'AMH indétectables ou nuls ont généralement une anomalie du gène de l'AMH alors que pour les patients AMH positif» qui ont des taux d'AMR normaux, on suspecte une mutation du gène de son récepteur. La recherche systématique de mutations responsable du PMDS que nous avons effectué nous a permis de corréler les taux d'AMH sérique à des mutations des gènes de l'AMH ou de son récepteur. Nous avons également mis en évidence une délétion de 27pb au niveau du domaine kinase responsable de 25% des cas de PMDS et dont la détection aisée constitue maintenant la première étape de l'étude des patients« AMH positif». Nous avons ensuite réalisé une des premières études structure/fonction de mutations naturelles des récepteurs de la famille du TGFplus particulièrement l'étude de mutations analogue aux mutations dominante-négatives des récepteurs de la famille du TGFβ. L'une génère un récepteur tronqué de son domaine kinase et l'autre est une mutation faux-sens touchant un résidu clé du domaine kinase. La surexpression de ces récepteurs mutants entraîne un effet dominant-négatif in vitro sur deux gènes cibles de l'AMH. Cette étude dose-réponse nous a permis d'expliquer la discordance entre les effets de ces mutations in vivo et ceux obtenus in vitro
The anti-Müllerian hormone (AMH) belongs to the Transforming Growth Factor β(TGFβ) family. In male fetuses, AMH is responsible for the early regression of Müllerian ducts, the anlagen of uterus and Fallopian tubes. A deficiency in the signaling pathway of AMH is responsible for a rare form of male pseudohermaphrodism characterized by a persistence of Müllerian ducts (PMDS) in males otherwise normally virilized. At the beginnig of my work, AMHR-II was the only known component ofthe AMH signalling pathway. Two forms of PMDS are distinguished by the level of circulating AMH, assessed by ELISA. « Negative AMH » patients with serum AMH low or undetectable generaly have a mutation in the AMH gene while « positive AMH » patients which present normal values of serum AMH have probably a mutation of AMHR-II. By systematic research of mutations causing PMDS, we have correlated_AMH serum concentration with mutations of the AMH or receptor gene. We have also find a 27bp deletion in the kinase domain wich accounts for 25% of PMDS cases and which easy detection is now the first step for the « positive AMH » patient's study. We have also realized one of the first functionnal study of natural mutations of receptors of the TGFβ family and more precisely the study of mutations similar to dominant-negative mutations of receptors of the TGF β family. One causing receptor truncation after the transmembrane domain and the other is a missense mutation in a key residu of the kinase domain. Overexpression of these mutant receptors exert a dominant-negative activity in vitro upon two AMH target genes. This dose-response study let us to explain this discrepancy between in vivo and in vitro results

La trans-différenciation des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) vers un phénotype migratoire, prolifératif et sécrétoire joue un rôle clé dans la progression des lésions athéromateuses et l’hyperplasie intimale qui sous-tend la resténose post-angioplastie. Nos travaux suggèrent que la transition phénotypique des CMLV implique, chez le rat, la souris et l’Homme, l’expression de novo de l’Adénylyl Cyclase 8 (AC8), une enzyme catalysant la synthèse de l’AMP cyclique (AMPc) (Clément et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; résultats non publiés). Ce travail de thèse avait pour objectif d’appréhender le rôle de l’AC8 dans la trans-différenciation des CMLV en évaluant son impact sur la signalisation AMPc. L’étude des dynamiques de production du second messager avec le biosenseur T-Epac-VV montre que l’AC8 inhibe les hausses d’AMPc dans les CMLV trans-différenciées à l’Interleukine-1β. Cette fonction non canonique est assurée par de nouvelles isoformes d’AC8 que nous avons identifiées et clonées, les AC8E1 à 4, qui partagent une délétion des cinq premiers domaines transmembranaires. Des dosages de l’accumulation d’AMPc couplés à des expériences de co-immunoprécipitation et d’immunocytochimie révèlent que les AC8E exprimées de façon hétérologue dans des cellules HEK s’hétéro-dimérisent avec les AC en transit dans le réticulum, suppriment leur activité enzymatique et préviennent leur adressage à la membrane plasmique. L’induction des AC8E dans les CMLV trans-différenciées pourrait prévenir les effets vasculoprotecteurs de l’AMPc (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010), favorisant ainsi l’acquisition et/ou le maintien du phénotype synthétique
The phenotypic switch of vascular smooth muscle cells (VSMC) towards a migratory, proliferative and secretory state plays a key role in atherosclerotic plaque expansion and intimal hyperplasia leading to post-angioplasty restenosis. Our previous results suggest that the trans-differentiation of rat, mouse and human VSMC involves the de novo expression of the Adenylyl Cyclase 8 (AC8), an enzyme that catalyzes the synthesis of cyclic AMP (cAMP) (Clement et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; unpublished results). The main goal of my PhD was to decipher the impact of AC8 expression on cAMP signaling in trans-differentiated VSMC. Using the FRET-based biosensor T-Epac-VV, we showed that the de novo expression of AC8 limits increases in cellular cAMP. This non-canonical function relies on a new family of AC8 isoforms that we have identified and cloned: the AC8E1 to 4. They share a common deletion of the first five transmembrane domains. The biochemical characterization of AC8E over-expressed in HEK cells allowed us to elucidate their functioning. cAMP accumulation assays, co-immunoprecipitation experiments and immunocytochemistry revealed that AC8E hetero-dimerize with functional AC during their maturation in the reticulum, suppress their enzymatic activity and prevent their traffic to the plasma membrane. Numerous studies have shown that increases in cAMP concentration within trans-differentiated VSMC antagonize pathological vascular remodeling (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010). Thus, the induction of AC8E in trans-differentiated VSMC could prevent the vasculoprotective effects of cAMP and promote the acquisition of a synthetic phenotype

Chez la souris, la létalité à la mi-gestation que provoque l'invalidation par recombinaison homologue de plusieurs composants de la voie de signalisation du Transforming Growth Factor-beta (TGFß) souligne son importance cruciale dans le développement. Mais l'étude des rôles tissu-spécifiques des trois isoformes du TGFß, relayés par leurs récepteurs de type I et II (TßRI et TßRII), à des stades de développement tardifs ou chez l'adulte, requiert d'autres approches. En particulier, les rôles qu'exercent le TGFß sur la différenciation des cellules des muscles striés, sur l'organogénèse et le remodelage cardiaque restent controversés. Pour tenter de répondre à ces questions, nous avons choisi de surexprimer un mutant dominant négatif du TßRII sous le contrôle du promoteur de la chaîne lourde ß de la myosine (ßMHC), in vitro dans les cellules Sol 8 et en transgénèse chez la souris. In vitro, les myoblastes Sol 8, issus d'un muscle squelettique à fibres lentes, se différencient en myotubes et expriment la ßMHC lorsqu'ils sont cultivés en milieu de différenciation. Le TGFß1 exogène ajouté aux cellules Sol 8 bloque complètement leur différenciation. Nous montrons que les TGFß endogènes sécrétés par les cellules Sol 8 freinent partiellement leur différenciation. Dans les cellules Sol 8 surexprimant le TßRII muté dominant négatif, la simultanéité d'activation des deux promoteurs de la ßMHC (transfecté et endogène) permet d'affirmer que le frein partiel exercé par les TGFß endogènes sur la différenciation des cellules Sol 8 et la mise en route de l'expression de la ßMHC sont deux évènements concomitants. In vivo, le promoteur de la ßMHC est actif dès 7,5 jours après fécondation dans l'ébauche cardiaque. Par transgénèse, nous avons obtenu des souris avec surexpression tissu-spécifique, sous le contrôle du promoteur de la ßMHC, d'un gène rapporteur, l'EGFP. Notre incapacité à produire des souris surexprimant le TßRII muté sous le contrôle du même promoteur accrédite l'idée que l'invalidation précoce de la voie de signalisation des TGFß dans le myocarde ventriculaire est précocement létale. L'utilisation de systèmes d'expression inductible par la tétracycline ciblant les cardiomyocytes auriculaires ou ventriculaires est en cours et devrait apporter une réponse à la question toujours débattue de l'implication des TGFß dans l'organogénèse du cœur

Pour étudier les fonctions de la GTPase Rap1, nous avons généré par une méthode originale, de nouveaux mutants dominants négatifs de Rap1. Nos résultats suggèrent que des mutants dominants négatifs peuvent inhiber sélectivement certaines voies d'activation de Rap1. Ainsi, le mutant Rap1[G15D] inhibe l'activation de Rap1 par C3G mais pas par Epac1 tandis que le mutant Rap1[S17A] bloque l'activation de Rapl par ces 2 activateurs. D'autre part, le mutant Rap1[S17A] est particulièrement efficace puisque son expression reproduit chez la drosophile, la léthalité du mutant nul de Rap1. Par l'utilisation de ce mutant dominant négatif et du mutant constitutivement actif, nous démontrons que Rap1 régule la dynamique cellulaire qui survient lors de la mitose : l'expression de Rap1[S17A] inhibe l'étalement cellulaire post-mitotique, tandis que l'expression du mutant Rap1[Q63E] inhibe la rétraction cellulaire pré-mitotique
To decipher the biological fonctions of the Rapl GTPase, we developed an original method to generale novel dominant negative mutants of Rap1. Our results suggest that some of those mutants could be selective for activation pathways. For instance, Rap1[G15D] inhibits the activation of Rap1 induced by physiological stimulation of the Rap1 activator CSG but not Epac, whereas Rap1[S17A] inhibits the activation of Rap1 via both pathways. Moreover, Rap1[S17A] is a powerfull dominant negative mutant since its expression was sufficient to reproduce in Drosophila the pupal death observed in Rapl null mutants. In the second part of this work, we investigated the function of Rap1 in the cellular dynamics that occurs during mitosis. Indeed, the expression of dominant negative mutant Rap1[S17A] inhibits post-mitotic cell spreading, and conversely, the constitutively active Rap1[Q63E] mutant inhibits the cell retraction that occurs at the beginning of mitosis. In depth characterisation of the associated phenotypes indicates that Rapl modulates the dynamics of adhesion complexes during mitosis

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) confère un phénotype agressif aux cancers du sein avec la perte de leurs jonctions épithéliales intercellulaires, leur polarité et identité, et l’acquisition des caractéristiques mésenchymateuses accompagnées de l’invasion et la résistance à la chimiothérapie. Cependant, les mécanismes et les signaux associés qui régissent ces dysfonctionnements au cours de l’EMT des cancers du sein demeurent encore mal connus. Dans cette étude, nous avons entrepris de comparer deux modèles génétiques des cellules MCF-7 du cancer du sein en EMT induite par l’expression constitutive de Snail ou l’invalidation de WISP-2. Nous avons trouvé que les répresseurs des E-cadhérines tels que Slug, Zeb1/2, Twist et Snail étaient surexprimés dans les cellules en EMT avec l’induction d’un phénotype triple-négatif (TN), la perte du récepteur aux oestrogènes, GPR30, et le gain du pouvoir invasif dans le collagène de type I. De plus,l’expression ectopique de Snail dans les cellules transfectées supprime aussi les transcrits de WISP-2. L’EMT est accompagnée de la dominance de plusieurs voies de signalisation proinvasives impliquant les protéines GαGβγ, PKCα, AKT et l’induction de c-Jun. Nous avons mis en évidence l’activation du cycle cellulaire et l’inhibition de l’axe p27/cyclindependent kinase CDK3 responsable de la promotion de la croissance cellulaire. De manière intéressante, le traitement des cellules en EMT avec les inhibiteurs des GαGβγ (BIM-46187, Gallein), PKCα (Gö6976, MT477, sh-RNAs) et de la cascade de signalisation PI3K/AKT (wortmannin) réduit leur potentiel invasif. Par contre, les inhibiteurs sélectifs des récepteurs HER et des voies de signalisation MAPK/SAPK n’ont aucun effet sur les deux modèles d’EMT signant leur indépendance à ces voies oncogéniques. L’ensemble de nos résultats suggèrent que les protagonistes de signalisation représentés par les GαGβγ, PKCα et PI3K/AKT peuvent être considérés comme de potentiels biomarqueurs prédictifs et des cibles thérapeutiques dans la prise en charge des cancers du sein TN en EMT
The epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) confers an aggressive subtype to breast cancers (BC) following disruption of intercellular junctions, epithelial cell polarity, induction of mesenchymal traits, invasive growth and chemotherapy resistance. However, the mechanisms underlying the EMT and its associated signaling dysfunctions in BC are still poorly understood. Here, we have undertaken a comparative study in two genetic models of MCF-7 breast cancer cells induced to EMT by WISP-2 silencing and Snail transformation.We report that the E-cadherin repressors Slug, Zeb1/2 and Twist were overexpressed in these EMT cells. They induced a triple negative phenotype (loss of estrogen ERα and progesterone PRA/PRB receptors, no HER2 amplification), combined with loss of the GPR30 ER and promotion of invasive growth in collagen gels. Ectopic Snail expression suppressed WISP-2 transcripts and down-regulated WISP-2 gene promoter expression in transfected cells. The EMT caused dominance of several proinvasive pathways including GαGβγ subunits, PKCα, AKT and c-Jun induction, coupled with growth responses (more cells at S and G2/M phases of the cell cycle), in line with inhibition of the p27kip1/cyclin-dependent kinase CDK3 cascade. RNA interference or selective inhibitors targeting GαGβγ subunits (BIM-46187, gallein), PKCα (Gö6976, MT477, sh-RNAs) and PI3K-AKT (wortmannin) alleviated the invasive phenotype. In contrast, MCF-7 cells in EMT showed signalingindependence to inhibitors of HER family tyrosine kinases and the mitogen- and stressactivated protein kinases. Our study suggests that the signaling protagonists GαGβγ, PKCα and PI3K-AKT are promising candidates as predictive molecular biomarkers and therapeutic targets in the management of clinical BC in EMT

Les maladies à prions sont des maladies neurodégénératives qui touchent l'homme et l'animal, et dont l'issue est fatale. Ces maladies sont provoquées par l'accumulation dans le cerveau de la PrPSc, l'isoforme mal repliée de la protéine prion cellulaire. L'apparition de nouveaux risques de transmission de ces maladies et l'absence de traitement efficace, nous ont incité à explorer de nouvelles stratégies et cibles thérapeutiques. Nous avons développé deux approches thérapeutiques innovantes. La première à consister à rechercher des molécules capables de piéger les formes préamyloïdes de la PrPSc (dimères et trimères), décrites comme éléments essentiels du cycle de réplication des prions. Une technique de criblage de drogues in silico et in cellulo nous a permis de mettre en évidence des composés thiényl pyrimidiques et thiényl azines capables d'oligomériser spécifiquement la PrPSc. Ces oligomères de PrPSc réduisent l'infectiosité des prions in vivo, soulignant le potentiel thérapeutique de ces composés. Notre deuxième stratégie est une stratégie de thérapie génique utilisant les propriétés dominantes négatives de certains polymorphismes de la protéine prion, comme les mutants Q218K et Q167R. Notre objectif a été d'évaluer le potentiel thérapeutique de vecteurs lentiviraux portant les mutants PrPQ218K et PrPQ167R, chez des souris au stade tardif de la maladie. Nous avons réussi à prolonger significativement la durée de vie des souris de 20% grâce à 2 injections chroniques de vecteurs lentiviraux portant le mutant PrPQ167R. Nos résultats ouvre la voie sur de nouvelles perspespectives thérapeutiques pour les maladies à prions et autres maladies neurodégénératives
Prion diseases are fatal neurodegenerative disorders that affect both humans and animals. These diseases are induced by the accumulation in the brain of the misfolded isoform of the normal cellular prion protein: PrPSc. The emergence of new risks of transmission for these diseases and the lack of efficient treatments, prompt us to search for new therapeutic strategies and targets. We developed two innovative therapeutic approaches. The first one consisted in searching for molecules able to trap preamyloid forms of PrPSc (dimers and trimers), known as key elements in the replication cycle of prions. A drugs screening approach, in silico and in cellulo, allowed us to discover thienyl pyrimidine and thienyl azine compounds able to specifically oligomerize PrPSc molecules. These PrPSc oligomers decrease prions infectivity in vivo, highlighting the therapeutic potential of these compounds. Our second strategie is a gene therapy approach using the dominant negative properties of certain polymorphisms of the prion protein, such as the Q218K and Q167R mutants. Our objective was to evaluate the therapeutic potential of lentiviral vectors carrying the PrPQ218K and PrPQ167R mutants, in mice, at the terminal stage of the disease. We succeeded in significantly prolonging the survival time of mice of 20%, with two intracerebrally chronic injections of lentiviral vectors carrying the PrPQ167R mutant. All our results not only open the way for new therapeutic strategies against prion diseases but also will benefit for therapies of other neurodegenerative disorders

Les gènes codant pour les canaux sodiques potentiel-dépendants (Nav) présents dans le système nerveux central sont la cible de mutations conduisant à divers phénotypes. L’objectif de mon travail de thèse est de comprendre pourquoi des mutations d’un même gène peuvent conduire à des pathologies distinctes afin d’envisager le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le gène SCN1A codant pour le canal Nav1.1, exprimé principalement dans les interneurones GABAergiques (IN GABA), est la cible de mutations responsables de syndromes épileptiques et de la migraine hémiplégique familiale (MHF-3), une forme rare de migraine avec aura. Il a été montré que les mutations responsables de l’épilepsie induisent une perte de fonction du canal, ce qui conduit à une hypoexcitabilité des IN GABA dont résulte une hyperexcitabilité du réseau neuronal. L’analyse fonctionnelle de mutations responsables de la MHF-3 a montré qu’elles induisent un gain de fonction du canal et une hyperexcitabilité des IN GABA pouvant être à l’origine d’une dépression corticale envahissante, un mécanisme pathologique de la migraine. En particulier, l’étude de la mutation L1649Q a montré qu’elle induit une réduction importante de la densité de courant des canaux Nav1.1 (défaut d’expression des canaux). L’analyse des propriétés biophysiques des canaux mutés après récupération de la densité de courant a mis en évidence que l’effet de la mutation correspond à un gain de fonction allant dans le sens d’une hyperexcitabilité des IN GABA (Cestèle et al.2013 PNAS). Afin d’identifier si d’autres mutations MHF-3 possèdent le même mécanisme (perte/gain de fonction), la 1ère partie de ma thèse a consisté en la caractérisation fonctionnelle d’une nouvelle mutation responsable de la MHF-3, L1670W. Cette mutation conduit à un défaut d’expression des canaux Nav1.1 (perte de fonction) cependant, après récupération de la densité de courant, la mutation induit un gain de fonction des canaux Nav1.1. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que la mutation L1670W induit un défaut d’expression des canaux à la membrane et un gain de fonction renforçant ainsi l’hypothèse selon laquelle ce mécanisme pourrait être généralisé à d’autres mutations MHF-3. Le gène SCN2A codant pour le canal Nav1.2, exprimé principalement dans les neurones excitateurs, est la cible de mutations responsables de différentes pathologies telles que les épilepsies bénignes, les encéphalopathies épileptiques et les troubles du spectre de l’autisme (TSA). A ce jour, les mécanismes responsables de ces pathologies restent flous. Dans le but d’élucider la relation génotype/phénotype, nous avons étudié les effets fonctionnels de 23 mutants SCN2A responsables de ces différentes pathologies. Nos résultats montrent que toutes les mutations responsables de TSA induisent une perte presque totale de densité de courant tandis que pour les autres pathologies les effets sont hétérogènes. Dans le but de reproduire les conditions hétérozygotes, nous avons étudié la co-expression des canaux wild-type (WT) avec chaque canal muté. Nos résultats ont mis en évidence une réduction de la densité de courant des canaux WT uniquement en présence de canaux porteurs de mutations responsables de TSA. Par conséquent, seules les mutations responsables de TSA induisent un phénomène de dominance négative sur les canaux WT. Afin de déterminer si ce mécanisme de dominance négative est dû à l’interaction de 2 sous-unités α décrite récemment (Clatot et coll., 2018 Nat Commun), nous avons utilisé différentes stratégies pour inhiber cette interaction. Les résultats obtenus ont montré que l'effet de dominance négative des mutants responsables de TSA n’est plus observé lorsque α-α est inhibée. Par conséquent, nos résultats permettent de décrire pour la 1ère fois que les mutations des canaux Na+ responsables de TSA agissent par un mécanisme de dominance négative, lequel est médié par l’interaction entre les canaux WT et mutés
The genes encoding for the voltage-gated sodium channels (Nav) expressed in the central nervous system are the target of numerous mutations leading to various phenotypes. The aim of my work is to understand why mutations in the same gene can lead to distinct pathologies in order to consider the development of new therapeutic approaches. The SCN1A gene encoding for the Nav1.1 channels, mainly expressed in GABAergic interneurons (GABA IN), is the target of mutations responsible for epileptic syndromes and familial hemiplegic migraine (FHM-3), a rare form of migraine with aura. The mutations responsible for epilepsy have been shown to cause a loss of function, which leads to hypoexcitability of GABA IN and subsequently to the network hyperexcitability. At the opposite, the mutations responsible for MHF-3 showed a gain of function and hyperexcitability of GABA IN which can lead to the cortical spreading depression, a pathological mechanism of migarine. In particular, the functional study of the L1649Q mutation showed that the mutation leads to an important decrease of the current density (loss of function). Analysis of the biophysical properties of the mutated channels after partial recovery of the current density showed that the overall effect of the mutation is a gain of function, consistent with an hyperexcitability of GABA IN (Cestele and al. 2013 PNAS). In order to identify if other FHM-3 mutations share the same mechanism (loss / gain of function), the first part of my thesis aimed to characterize a new mutation responsible for MHF-3, L1670W. This mutation leads to a defect in the Nav1.1 channels expression at the membrane but after partial recovery of the current density, the mutation induces a clear gain of function of Nav1.1 channels. These results showed that the L1670W mutation, like the L1649Q mutation, leads to a defect in the Nav1.1 channels expression at the membrane and a gain in function, thus reinforcing the hypothesis that this mechanism could be generalized to other mutations responsible for MHF-3. The SCN2A gene encodes for the α subunit of Nav1.2 channels mainly expressed in excitatory neurons. Mutations in the SCN2A gene are responsible for different pathologies such as benign epilepsies, epileptic encephalopathies and autism spectrum disorder (ASD). To date, the detailed mechanisms responsible for these different pathologies remain unclear. In order to elucidate the genotype/phenotype relationship, we studied the functional effects of 23 SCN2A mutants responsible for these different pathologies. Our results show that all the mutations responsible for ASD induce an important decrease (almost complete) of the current density while for the other pathologies the effects are heterogeneous. In order to reproduce the heterozygous conditions, we studied the co-expression of wild-type (WT) channels with each mutated channel. Our results showed a reduction in the WT channels current density only in the presence of channels carrying mutations responsible for ASD. Consequently, only the mutations responsible for ASD induce a negative dominance on WT channels. To determine whether this negative dominance mechanism is due to the interaction of α subunits described recently (Clatot et al., 2018 Nat Commun), we used different strategies to inhibit this interaction. The results obtained showed that the negative dominance effect of the mutants responsible for ASD is no longer observed when the interaction between the α subunits is inhibited. Therefore, our results allow us to describe for the first time that mutations in Na+ channels responsible for ASD act by a negative dominance mechanism, which is mediated by the interaction between WT and mutated channels

L'existence de la masse négative a un sens parfaitement physique du moment que les conditions d'énergie dominante sont satisfaites par le tenseur énergie-impulsion correspondant. Jusqu'à maintenant, seules des configurations de masses négatives avaient été trouvées. On démontre l'existence de bulles de masse négative stables dans un espace-temps qui s'approche asymptotiquement d'un espace-temps de de Sitter. Les bulles sont des solutions aux équations d'Einstein qui correspondent à une région intérieure qui contient une distribution de masse spécifique séparée par une coquille mince de l'espace-temps à masse négative de Schwarzschild-de Sitter à l'extérieur. Ensuite, on applique les conditions de jonction d'Israel à la frontière de la bulle ce qui impose la conservation d'énergie-impulsion à travers la surface. Les conditions de jonction donnent une équation pour un potentiel pour le rayon de la bulle qui dépend de la distribution de masse à l'intérieur, ou vice versa. Finalement, on trouve un potentiel qui aboutit à une solution stable, statique et non-singulière, ce qui crée une distribution de masse interne qui satisfait les conditions d'énergie dominante partout à l'intérieur. Cependant, la bulle ne satisfait pas ces conditions. De plus, on trouve une solution stable, statique et non-singulière pour une géométrie interne de de Sitter pure. La solution est fondamentalement différente: elle requiert que la densité d'énergie de la bulle change avec le rayon. La condition d'énergie dominante est satisfaite partout.
Negative mass makes perfect physical sense as long as the dominant energy condition is satisfied by the corresponding energy-momentum tensor. Until now, only configurations of negative mass have been found. We demonstrate the existence of stable, negative-mass bubbles in an asymptotic de Sitter space-time. The bubbles are solutions of the Einstein equations which correspond to an interior region of space-time containing a specific distribution of mass separated by a thin wall from the exact, negative mass Schwarzschild-de Sitter space-time in the exterior. Then, we apply the Israel junction conditions at the wall which impose the conservation of energy and momentum across the wall. The junction conditions give rise to an effective potential for the radius of the wall that depends on the interior mass distribution, or vice versa. Finally, we find a potential that gives rise to stable, non-singular, static solutions, which yields an interior mass distribution that everywhere satisfies the dominant energy condition. However, the energy momentum of the wall does not satisfy the dominant energy condition. Moreover, we find a stable, non-singular, static solution for a pure de Sitter geometry inside the bubble. The solution is fundamentally different: the energy density of the bubble is no longer a constant, but now varies with the radius. The dominant energy condition is everywhere satisfied.