Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Myotonie atrophique – Génétique“

MON TRAVAIL DE THESE A PORTE SUR UNE ANALYSE DE LA REGULATION POST-TRANSCRIPTIONNELLE CHEZ LA DROSOPHILE. IL COMPORTE ESSENTIELLEMENT DEUX PARTIES. J'AI MONTRE, DANS UN PREMIER TEMPS, QU'IL Y A CONSERVATION ENTRE LA DROSIPHILE ET LE XENOPE DU MECANISME DE REPRESSION TRADUCTIONNELLE DES ARNm MATERNELS DEPENDANT DE L'ELEMENT EDEN (CONSTITUE DE REPETITIONS UG/UA). J'AI, DANS UNE DEUXIEME PARTIE DE CE TRAVAIL, IDENTIFIE UN FACTEUR DE DROSOPHILE QUI FIXE L'ELEMENT EDEN. CE FACTEUR, COMME LE FACTEUR DE XENOPE EDEN-BP ET LE FACTEUR HUMAIN CUG-BP AVEC LESQUELS IL PARTAGE UNE FORTE HOMOLOGIE, FIXE EGALEMENT DES REPETITIONS CUG. COMPTE-TENU DE LA CONSERVATION DE LA CUG-BP ET DE SON ROLE DANS LA DYSTROPHIE MYOTONIQUE DE STEINERT (DM1) NOUS NOUS SOMMES PROPOSES D'ETABLIR LA DROSOPHILE COMME MODELE POUR LA DM1. DANS LE CADRE DE CETTE THESE, SEULES LES EXPERIENCES PRELIMINAIRES ONT PU ETRE REALISEES.

LA REGULATION TRADUCTIONNELLE JOUE UN ROLE ESSENTIEL DANS LE CONTROLE DE L'EXPRESSION GENIQUE, EN PARTICULIER DANS L'OVOCYTE ET L'OEUF. LE TRAVAIL REALISE AU COURS DE MA THESE S'INSCRIT DANS UNE ANALYSE D'UN MECANISME DE REGULATION TRADUCTIONNELLE DES ARN MESSAGERS MATERNELS CONSERVE ENTRE LA DROSOPHILE ET LE XENOPE. CE MECANISME A D'ABORD ETE DECRIT CHEZ LE XENOPE POUR UNE CLASSE D'ARNm MATERNELS, DONT L'ARNm DU PROTO-ONCOGENE C-MOS DONT LA TRADUCTION EST CRITIQUE POUR LA MATURATION MEIOTIQUE. CES ARNm PORTENT UN ELEMENT DANS LEUR 3'UTR QUI JOUE UN ROLE ESSENTIEL DANS LEUR REPRESSION TRADUCTIONNELLE APRES FECONDATION. IL S'AGIT DE L'ELEMENT EDEN (EMBRYONIC DEADENYLATION ELEMENT) SUR LEQUEL SE FIXE UN FACTEUR PROTEIQUE AGISSANT EN TRANS, LE FACTEUR EDEN-BP. NOTRE EQUIPE A MONTRE QUE L'ELEMENT EDEN EST FONCTIONNEL CHEZ LA DROSOPHILE COMME ELEMENT DE REPRESSION TRADUCTIONNELLE (EZZEDDINE ET AL. , 2002). MON TRAVAIL A PORTE PRECISEMENT SUR L'IDENTIFICATION DU FACTEUR TRANS DE DROSOPHILE HOMOLOGUE AU FACTEUR EDEN-BP DE XENOPE, PAR UNE COMBINAISON D'APPROCHES EXPERIMENTALES ET BIOINFORMATIQUES. LE FACTEUR BRU3 QUE J'AI IDENTIFIE ET DONT J'AI MENE L'ANALYSE, PRESENTE DES PROPRIETES STRUCTURALES QU'ON RETROUVE EN PARTICULIER DANS LA PROTEINE EDEN-BP DE XENOPE ET SON HOMOLOGUE HUMAIN, LA CUG-BP, IMPLIQUEE DANS LA DYSTROPHIE MYOTONIQUE DE STEINERT. DE PLUS, IL PRESENTE LA MEME SPECIFICITE DE LIAISON AUX ARN QUE LES PROTEINES EDEN-BP ET CUG-BP.

Protocole d'entente entre l'Université Laval et l'Université du Québec à Chicoutimi
Le but de cette investigation vise à analyser l’impact du génotype de l’ACTN3 sur la conservation et l’évolution de la force musculaire chez les individus atteints de DM1. Cette étude se veut une recherche longitudinale, les patients ayant été évalués sur deux périodes séparées de 9 ans (temps 1 et temps 2). L’analyse de l’impact du génotype de l’ACTN3 comporte deux volets. Le premier volet a pour objectif d’identifier si l’absence de protéine alpha-actinine 3 (génotype 577XX) provoque chez les personnes atteintes de DM1 un niveau de force musculaire global plus faible que chez l’individu des deux autres génotypes, en l’occurrence 577RX et 577RR. Le deuxième volet, quant à lui, a pour objet la comparaison de la perte de force musculaire entre le temps 1 et le temps 2 des trois génotypes. Les patients ont été recrutés dans le registre de la clinique neuromusculaire du Saguenay. Les personnes invitées à participer à cette étude devaient avoir été testées par une analyse génétique confirmant la présence de la maladie (phénotype adulte et tardif) et être âgées de 18 ans ou plus. Un total de 113 participants, soit 42 hommes et 71 femmes, a été en mesure de compléter cette étude longitudinale. Ces derniers ont été évalués à l’aide de 17 tests musculaires. Les résultats du temps 2 ont montré que l’absence de la protéine alpha-actinine 3 chez les hommes atteints de DM1 induisait un niveau de force musculaire global plus faible que chez ceux de génotype 577RX. En effet, le sexe masculin de génotype 577XX a vu sa force décroître plus rapidement au fil des années. Somme toute, si l’encadrement le permet, connaître le profil génotypique associé au gène ACTN3 chez les hommes atteints de DM1 est un élément important à prendre en considération afin de ralentir la progression de la maladie et d’optimiser les stratégies de réadaptation
The purpose of this investigation was to analyze the impact of the genotype of ACTN3 on the conservation and evolution of muscle strength in individuals with DM1. This study was a longitudinal study, the patients having been evaluated on two different occasions with 9 years in between (time 1 and time 2). The analysis of the impact of the ACTN3 genotype had two components. The first part aimed at identifying whether the absence of alpha-actinin 3 protein (genotype 577XX) caused a lower level of overall muscular strength in people with DM1 when compared to the other two genotypes, in this case 577RX and 577RR. The second part aimed at comparing the loss of muscle strength between time 1 and time 2 for the three genotypes. Patients were recruited from the Saguenay Neuromuscular Clinic Registry. Those invited to participate in this study had been previously tested by a genetic analysis confirming the presence of the disease (adult and late phenotype) and be 18 years of age or older. A total of 113 participants, 42 men and 71 women, were able to complete this longitudinal study. These were assessed using 17 muscle tests. At time 2, results showed that the absence of alpha-actinin 3 protein in men with DM1 induced a lower level of overall muscle strength than men with 577RX genotype. Indeed, the male genotype 577XX had a more rapid decrease in strength over the years. In light of these results, knowing the genotype profile associated with the ACTN3 gene in men with DM1 is an important element to consider in order to optimize rehabilitation strategies.

L’objectif de cette étude était de décrire les habitudes alimentaires et les apports nutritionnels des patients atteints de dystrophie myotonique de type 1 (DM1). Au total, 32 femmes et 20 hommes souffrant de DM1 et suivis à la Clinique des maladies neuromusculaires de Jonquière, ont complété un journal alimentaire de 3 jours non consécutifs (2 jours de semaine et 1 jour de fin de semaine). Parmi ces patients, 13,5 % étaient en sous-poids alors que 51,9 % présentaient de l’embonpoint ou de l’obésité. Les apports moyens en lipides et en glucides ne respectaient pas l’étendue des valeurs acceptables pour ces macronutriments. Les apports moyens étaient également insuffisants pour la majorité des micronutriments. Finalement, la consommation d’aliments des quatre groupes du Guide alimentaire canadien était inférieure aux recommandations. Les résultats démontrent qu’une proportion importante des patients avec DM1 présente une alimentation inadéquate. The aim of this study was to describe the eating habits and the dietary nutritional intakes of patients affected by myotonic dystrophy type 1 (DM1). The participants, 32 women and 20 men suffering from DM1 and followed at the Clinique des maladies neuromusculaires de Jonquière completed a three days food journal (2 week days and 1 week-end day). Among these patients, 13.5% were underweight and 51.9% were overweight or obese. The mean carbohydrate and lipid intakes did not respect the acceptable macronutrient distribution range. In addition, the mean intakes were insufficient for most of the micronutrients. The consumption of foods from the four food groups was generally inferior to Canada’s recommendations. Results demonstrated that many individuals suffering from DM1 have an inadequate diet.

Les dystrophies myotoniques (DM) sont les dystrophies musculaires de l’adulte les plus fréquentes. Elles sont caractérisées par un vaste tableau clinique pour lequel il n’existe pas de thérapie globale à l’heure actuelle. Les DM sont causées par la présence aberrante d’agrégats nucléaires formés d’ARNs enrichis en répétitions CUG (formes DM1 et congénitale) ou CCUG (forme DM2, la moins sévère de toutes). Ces agrégats séquestrent le facteur d’épissage MBNL1, conduisant à des défauts de l’épissage d’exons spécifiques, alors responsables de certains symptômes (myotonie, résistance à l’insuline). J’ai identifié un nouvel événement d’épissage altéré (exon 11 de Bin1) dans les cellules musculaires de patients DM par puces exons. Notre étude fonctionnelle et physiopathologique suggère que la diminution d’expression de l’exon 11 de Bin1 est un événement primaire dans la pathogenèse des DM et contribuerait à la faiblesse musculaire des patients DM. J’ai identifié deux nouvelles protéines composant les agrégats de répétitions CCUG, les facteurs d’épissage Fox1 et Fox2. Nous proposons un modèle original d’après lequel la présence de Fox1 et Fox2 dans ces agrégats pourrait diminuer le taux de séquestration de MBNL1. Fox1 et Fox2 pourraient ainsi atténuer les défauts de l’épissage régulé par MBNL1 et de ce fait, contribuer à la moindre sévérité de la DM2. Enfin, j’ai mis au point un système cellulaire modèle de la DM1 qui reproduit l’altération de l’épissage de l’exon 5 de la troponine T cardiaque caractéristique des patients DM. Ce modèle pourrait être appliqué à un criblage pharmacologique destiné à identifier des composés au potentiel thérapeutique pour les patients DM
Myotonic dystrophies (DM) are the most common muscle dystrophies in adults. DM patients display a wide range of features, but there is currently no available cure to treat all of them. DM are caused by aberrant nuclear aggregates made of RNAs enriched in CUG repeats (DM1 and congenital forms) or CCUG repeats (DM2 form, the less severe one). These ggregates sequester the MBNL1 splicing factor, thus leading to an aberrant splicing of specific exons, ultimatly resulting in specific symptoms (myotonia, insulin resistance). I identified a novel misspliced event (aberrant splicing of Bin1 exon 11) in muscle cells of DM patients using exon arrays. Our functionnal and pathological studies suggest that the decrease in exon 11 expression is a primary event in the DM pathogenesis and may contribute to muscle weakness. I identified two novel protein components of the CCUG aggregates, the splicing factors Fox1 and Fox2. We propose an original model according to which Fox1 and Fox2 co-localizing with those aggregates may decrease MBNL1 sequestration. Thus, Fox1 and Fox2 would help to diminish the degree of splicing alterations of targets regulated by MBNL1, and would contribute to explain the lesser severity of DM2. Finally, I set up a cellular system mimicking DM1 that reproduces cardiac troponin T exon 5 missplicing observed in DM patients. This model may be useful to a high-throuput screening of chemical compounds aimed at identifying putative therapeutic molecules for DM patients

La dystrophie myotonique (DM) est considérée comme l'une des maladies neuromusculaires les plus complexes. Bien que les travaux de recherche de ces 30 dernières années aient permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents, la nature de l'anomalie génétique hors norme, son expression multisystémique et son large spectre clinique ne permettent pas, à l'heure actuelle, une prise en charge optimale des patients. Mon travail a eu pour but d'approfondir les connaissances et de préciser l'histoire naturelle de cette maladie rare. La première partie du manuscrit est consacrée à la présentation de l'observatoire DM-Scope, sur lequel s'appuie tout mon travail de thèse. Après la description du concept, du fonctionnement et de la plateforme de recueil, les caractéristiques de la cohorte DM1, à partir de laquelle les analyses ont été réalisées, sont présentées : spectre clinique couvert, atteinte multisystémique, corrélations génotype/phénotype, interrelations entre les symptômes et comparaison à la dystrophie myotonique de type II (DM2). Ensuite, dans une deuxième partie, nous abordons les avancées majeures obtenues dans les DM grâce à DM-Scope et aux analyses réalisées pendant ma thèse : (i) précision de l'histoire naturelle de la maladie, notamment avec la proposition d'une nouvelle classification ; (ii) mise en exergue de facteurs déterminants du phénotype comme le genre, la taille de la mutation ou les interrelations entre les symptômes. Ces travaux ont conduit à des recommandations de soins, notamment pour la transition enfants-adultes mais aussi la validation de critères d'inclusion importants pour les essais cliniques comme le genre. DM-Scope permet d'accéder à des échantillons biologiques pour des études de recherche fondamentale et valider de nouvelles approches thérapeutiques. Il est aujourd'hui un leader à l'international et un outil incontournable dans la recherche translationnelle dans la DM. Ce concept transférable à n'importe quelle autre population, peut être utilisé pour la prise en charge d’autres maladies rares. Enfin, le développement d'un modèle de survie construit à partir de la cohorte DM de l'observatoire est présenté. Ce modèle a trois spécificités : (i) il est applicable en grande dimension, à des cas comme DM-Scope, où l'on a un nombre important de variables; (ii) il prend en compte les risques compétitifs, lorsque les patients sont exposés simultanément à plusieurs évènements. Dans notre observatoire, l'étude des décès de cause respiratoire est biaisée sans la prise en compte des évènements concurrents tels que le décès de cause cardiaque; (iii) il modélise l'hétérogénéité entre les groupes de patients (effets centres), potentiellement due à une prise en charge différente. L'analyse des données de DM-Scope nécessite cette spécificité issue des modèles à fragilité car l'observatoire est multicentrique (55 centres). Le modèle est transférable et applicable à d'autres données car de plus en plus de bases sont de grandes dimensions, la majorité des analyses de survie ont une censure liée à la survenue de l'événement d'intérêt et les études multicentriques sont de plus en plus communes
Myotonic dystrophy (DM) is considered one of the most complex neuromuscular diseases. Although research work over the past 30 years has permitted a better understanding of its underlying molecular mechanisms, the unusual nature of its genetic anomalies, its multisystemic expression and its broad clinical spectrum do not allow, at the moment, optimal patient management. The purpose of my work was to deepen our knowledge of this rare disease and to clarify its natural history. The first part of my manuscript is dedicated to the presentation of the DM-Scope Registry, on which all my thesis work is based. After the description of the concept, the functioning and the data collection platform, the manuscript features the characteristics of the DM1 cohort, from which our analyses were conducted : the clinical spectrum covered, multisystemic impairment, genotype/phenotype correlations, interrelations between symptoms and comparison to myotonic dystrophy type II (DM2). In the second part, we focus on the major progress achieved through the existence of DM-Scope and the analyses conducted during my thesis: (i) detailing the natural history of the disease, in particular proposing a new classification; (ii) highlighting the phenotype’s determining factors such as gender, mutation size, interrelations between symptoms. This work has led to recommendations for care, in particular for the transition from child to adult, but also the validation of important inclusion criteria for clinical trials such as gender. DM-Scope provides access to available biological samples for basic research studies and validates new therapeutic approaches. DM-Scope is now a worldwide leader and an essential tool in translational research in DM. The DM-Scope concept can be transferred to any other population and can be used for care management in other rare diseases. Finally, we present the development of a survival model built from the DM-Scope cohort. This model has three specificities: (i) it is applicable to high dimensional data, in such cases as DM-Scope, where there is a large number of measurements; (ii) it takes into account competitive risks, when patients are simultaneously exposed to several events. In our registry, the study of respiratory-related deaths is biased if competing events such as heart disease deaths are not taken into account ; (iii) it models the heterogeneity between patient groups probably due to divergent care, called \og centres effects \fg{}. DM-Scope data analysis requires such specificity of frailty models due to its multicentric coverage (55 centres). This model can be transferred and applied to other data, considering the following : more and more large-scaled registries are being used ; a majority of survival analyses includes censorship caused by the occurrence of the event of interest ; multicentre studies have become increasingly common

Les Dystrophies Myotoniques de type 1 (DM1) et (DM2) sont des maladies multisystémiques autosomiques dominantes avec une forte composante neuromusculaire. Ces pathologies se caractérisent essentiellement par une myotonie, une faiblesse musculaire progressives, des déficiences cognitives, et des défauts de conduction cardiaque. Ces maladies sont causées par une amplification anormale de séquences répétées C(C)TG situées respectivement dans la région 3’UTR du gène de la DMPK et dans l’intron du gène CNBP. Ces séquences contenant les expansions sont transcrites et retenues dans le noyau des cellules sous forme d’agrégats riboprotéiques. La présence de ces ARN-C(C)UG toxiques induisent la séquestration des protéines de liaisons à l’ARN de la famille MBNL conduisant à leur perte de fonction et à la dérégulation d’évènements d'épissages alternatifs dont plusieurs ont été associés à des symptômes cliniques chez les patients. A jour ce jour, il n’existe aucun traitement pour la DM. Dans ce travail de thèse, j’ai développé un outil de thérapie génique basé sur une modification de la protéine MBNL1. Ce dérivé de MBNL tronqué dans sa partie C-terminale (MBNLΔ), agit comme leurre pour libérer les protéines MBNL endogènes séquestrées par les ARN mutés. Notre approche été validée dans des cellules musculaires issue de patient DM1 et dans un modèle murin de la maladie après injection de virus AAV. Le traitement par le MBNLΔ permet la délocalisation des protéines MBNL endogènes des foci, modifie la dynamique des foci, corrige le transcriptome ainsi que la myotonie, et ce 1 an après injection
Myotonie dystrophy types 1(DM1) and 2 (DM2) are autosomal dominant multisystem diseases with a strong neuromuscular component. They are characterized by progressive myotonia, muscle weakness, cognitive impairment, and cardiac conduction defects. These diseases are caused by abnormal amplification of C(C)TG repeat sequences located in the 3'UTR region of the DMPK gene and in the intron of the CNBP gene, respectively. These expansion-containing sequences are transcribed and retained in the nucleus as riboprotein aggregates. The presence of these toxic C(C)UG RNAs induces sequestration of the MBNL family of RNA-binding proteins, leading to their loss of function and deregulation of alternative splicing events, many ofv/hich are associated with clinical symptoms in patients. There is currently no1reatment for DM. In this thesis, I have developed a gene therapy tool based on a modification of the MBNL1 protein. This C- terminal truncated MBNL derivative (MBNLΔ) acts as a decoy to release endogenous MBNL proteins sequestered by mutant RNAs. Our approach was validated in muscle cells from DM1 patients and in a mouse model of the disease after AAV virus injection. Treatment with MBNLΔ allows the delocalisation of endogenous MBNL proteins from the foci, modifies the foci dynamics, corrects the transcriptome and myotonia, which is maintained 1 year after injection

Les microsatellites sont des répétitions en tandem d’un motif compris entre une et neuf paires de bases. Ces répétitions retrouvées dans tous les organismes de façon ubiquitaire, sont particulièrement abondantes dans les organismes eucaryotes. Toutes ces répétitions sont capables de former des structures secondaires in vitro et possiblement in vivo. Certains microsatellites sont enclins à une expansion, conduisant à de nombreuses maladies neurodégénératives chez l’homme telle que la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), maladie neurodégénérative la plus fréquemment transmise. L’apparition et la sévérité des symptômes sont positivement corrélée avec le nombre de répétitions, localisées dans le 3’UTR du gène DMPK. Dans des travaux précédents du laboratoire, une TALE nucléase (TALEN) a été élaborée dans le but d’introduire une cassure double-brin au sein d’un microsatellite (CTG)n provenant d’un patient DM1. La compréhension des mécanismes conduisant à la contraction des répétitions chez la levure est nécessaire si l’on souhaite en comprendre les mécanismes chez l’homme. Ainsi, des expériences ont été menées dans des cellules dont les systèmes de réparation des CDB ont été altérés, montrant que RAD51, POL32 et DNL4 n’étaient pas nécessaires à la réparation des CDB au sein des microsatellites. Seul RAD50 et RAD52 semblent nécessaires, indiquant que la cellule répare les CDB dans les régions répétées par single-strand annealing. L’objectif de cette thèse a été d’étudier le rôle de plusieurs gènes (MRE11, EXO1, SGS1, DNA2, SAE2, RIF1 et RIF2), impliqués dans la résection et la réparation d’une unique CDB au sein d’une région répétée CTG, chez la levure
Microsatellites are tandem repeats of a motif between one and nine base pairs. These repeats are found ubiquitously in all organisms and are particularly abundant in eukaryotic organisms. All these repeats are capable of forming secondary structures in vitro and possibly in vivo. Some microsatellites are prone to expansion, leading to many neurodegenerative diseases in humans such as myotonic dystrophy type 1 (DM1), the most frequently transmitted neurodegenerative disease. The onset and severity of symptoms are positively correlated with the number of repeats located in the 3'UTR of the DMPK gene. In previous work in the laboratory, a TALE nuclease (TALEN) was developed to introduce a double-strand break into a microsatellite (GTC)n from a DM1 patient. Understanding the mechanisms leading to repeat contraction in yeast is necessary to understand the mechanisms in humans. Thus, experiments were conducted in cells with altered CBD repair systems showing that RAD51, POL32 and DNL4 were not required for CBD repair within microsatellites. Only RAD50 and RAD52 appear to be required, indicating that the cell repairs CBDs in repeated regions by single-strand annealing. The objective of this thesis was to study the role of several genes (MRE11, EXO1, SGS1, DNA2, SAE2, RIF1 and RIF2), involved in the resection and repair of a single CBD within a CTG repeat region, in yeast

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique caractérisée par une dégénérescence des muscles squelettiques accompagnée d’une myotonie. Cette maladie est due à une expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. L’accumulation des ARNm DMPK mutés au sein de foci nucléaires conduit à la séquestration du facteur d’épissage MBNL1 et à des altérations de l’épissage alternatif de nombreux ARNm. En particulier, l’inclusion de l’exon 5 au sein du pré-ARNm de la troponine T cardiaque (hcTNT) est renforcée chez les patients DM1. Cette inclusion anormale participe aux anomalies cardiaques présentées par les patients. Les travaux de l’équipe, menés en collaboration avec l’équipe de Nicolas Sergeant à Lille, sur la régulation de l’épissage de l’ARNm hcTNT avaient établi l’existence de 8 sites MBNL1, dont 6 nouveaux, situés de part et d’autre de l’exon 5 et la présence de régions activatrices et inhibitrices de l’inclusion fixant des facteurs d’épissage dont l’identité n’était pas connue. L’un des objectifs de ma thèse était d’étudier l’importance fonctionnelle in cellulo de chacun des 8 sites MBNL1. J’ai ainsi pu montrer que chacun des 6 nouveaux sites participe à l’inhibition de l’inclusion de l’exon 5 par MBNL1. Les données obtenues nous ont amené à proposer un modèle dans lequel MBNL1 s’associe avec les triplets de sites MBNL1 situés de part et autre de l’exon 5 et entraine la formation d’une structure à longue distance via des interactions protéiques MBNL1-MBNL1. Cette structure isolerait l’exon 5 dans une boucle et limiterait la fixation du spliceosome. Par ailleurs, j’ai mis en œuvre une approche de purification de RNP formées en extrait nucléaire pour identifier d’autres facteurs régulant l’inclusion de l’exon 5. La protéine hnRNP H a ainsi pu être identifiée. Sa capacité à activer l’inclusion de l’exon 5 in cellulo et à entrer en compétition avec MBNL1 pour la régulation de l’inclusion de l’exon 5 via sa fixation sur des sites localisés dans l’exon 5 et en aval de cet exon a pu être confirmée. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de l’effet d’un stress oxydatif généré par 500 µM d’H2O2 sur le profil global d’épissage alternatif des pré-ARNm de cellules HeLa. Lors de ce travail, j’ai pu établir que la réponse des cellules HeLa au stress oxydatif implique deux phases de réponse : une phase précoce (1h-8h) caractérisée par un fort taux de mortalité associé à une forte augmentation du taux de d’entités oxygénées réactives (ROS) intracellulaire et une phase tardive (16h-24h) corrélée à une diminution du taux de ROS intracellulaires et une surexpression des ARN satellite III. Sur la base de ces données, une analyse globale du transcriptome par emploi de puces à exons (Affymetrix) a été réalisée à partir d’ARN totaux isolés 1h, 2h, 4h et 24h après le début du stress. Nous avons ainsi identifié des modulations d’expression et d’épissage spécifiques de chacune des deux phases. L’analyse des données par des outils bio-informatiques a permis de mettre en évidence des fonctions cellulaires bien définies qui sont plus particulièrement affectées lors d’un stress oxydant. Enfin, pour comprendre l’origine des variations d’épissage observées lors d’un stress oxydant, j’ai entrepris d’analyser les effets de ce stress sur le niveau d’expression et la localisation cellulaire des composants du spliceosome ou des facteurs qui s’associent pour réguler son activité
Myotonic distrophy of type 1 (DM1) is a genetic disease characterized by skeletal muscle degeneration associated to myotonia. DM1 results from the instable expansion of CTG repeats within the 3’ untranslated region of the DMPK gene. The accumulation of mutated DMPK mRNAs within nuclear foci leads to the sequestration of the MBNL1 splicing factor and causes splicing misregulation of numerous pre-mRNAs. Among altered events the increase of the inclusion of exon 5 in the human cardiac troponin T (hcTNT) mRNA is of particular importance, since it contributes to the cardiac symptoms presented by the patients. Through collaborative work with N. Sergeant’s team from Lille, the team has studied the molecular bases of hcTNT exon 5 inclusion regulation and mapped 8 MBNL1 binding sites, including 6 new ones, within intronic regions surrounding exon 5. They also identified positive and negative splicing regulatory elements of which protein partners remain unidentified. The first objective of my PhD thesis was to test the functional importance of each individual MBNL1 binding site. The obtained results established that the 6 newly identified MBNL1 binding sites are involved in splicing regulation by MBNL1 and lead us to propose a new regulation model in which MBNL1 binds on triplets of MBNL1 sites present on each side of exon 5 and form a long distance structure via MBNL1-MBNL1 protein interaction. The formation of this looping-structure is expected to isolate exon 5 and limit its recognition by the spliceosome. In addition I searched for protein partners of the identified regulatory elements by affinity chromatography. By this way, I identified hnRNP H as a positive regulator of exon 5 inclusion. Its capacity to compete with MBNL1 to regulate splicing in cellulo by binding on exonic and intronic binding sites was further confirmed. The second part of my PhD work corresponds to the study of the global impact of oxidative stress, generated by exposition of HeLa cells to 500 µM of H2O2, on alternative splicing. This allows us to establish that the response of HeLa cells to oxidative stress involve two distincts phases: an early one (1h-8h) characterized by poor survival rate and high intracellular ROS content and a late phase (16-24h), associated with a decrease of the intracellular ROS level and the overexpression of the long non coding sat III RNAs. Based on this observation, we performed a transcriptome global analysis by using exon arrays from Affymetrix on RNA samples isolated 1, 2, 4 or 24 hours after the induction of the oxidative stress. We identified changes of the gene expression level or mRNA splicing pattern specific of each of the response phases. Data computing by bio-informatic tools identified the most affected cellular processes and functions during the cell response to oxidative stress. In order to better understand the mechanisms underlying alternative splicing modulation during oxidative stress, I started to study the impact of oxidative stress on the expression level and the cellular localization of spliceosome components and most common splicing regulation factors