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Dissertationen zum Thema „Myopathie pseudo-hypertrophique de Duchenne – Thérapie génique“
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Goyenvalle, Aurélie. „Développement d'une stratégie thérapeutique pour la dystrophie musculaire de Duchenne : Restauration du cadre de lecture par saut d'exon“. Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077104.
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La plupart des cas de Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) sont causés par des mutations dans le gène de la dystrophine qui interrompent le cadre de lecture de l'ARNm. Dans certains cas, l'exclusion artificielle d'un exon permet de restaurer ce cadre de lecture, donnant naissance à une dystrophine plus courte, mais tout de même fonctionnelle. L'objectif de ce travail a été de produire in situ à partir de vecteurs viraux, des molécules d'ARN ciblant les sites spécifiques d'épissage du gène de la dystrophine, pour induire le saut des exons associés à la maladie pendant l'épissage du pré-ARNm. Pour cela, nous avons choisi d'utiliser le petit ARN nucléaire U7 (U7snRNA) comme « navette » et avons dans un premier temps construit un vecteur AAV spécifique du gène de la dystrophine murine, permettant un saut très efficace de l'exon ciblé. Ce saut d'exon induit ainsi une restauration massive et stable de dystrophine, associée à une amélioration significative du phénotype dystrophique chez la souris. En parallèle de ces travaux sur le modèle murin mdx, nous avons développé cette approche sur le modèle canin GRMD de la dystrophie musculaire de Duchenne, et mis en évidence l'efficacité du saut d'exons multiples permettant une restauration importante de dystrophine. Ces résultats très prometteurs obtenus chez la souris mdx et chez le chien GRMD, nous ont conduit à appliquer cette stratégie sur le gène humain de la dystrophine et en particulier sur l'exon 51 pour lequel nous avons pu mettre en évidence un saut d'exon très efficace. L'ensemble de ces résultats indique l'efficacité de l'approche du saut d'exon médiée par U7snRNA, qui pourrait concerner près de 80% des patients DMDMost cases of Duchenne muscular dystrophy (DMD) are caused by dystrophin gene mutations that disrupt the mRNA reading frame. In some cases, forced exclusion of a single exon can restore the reading frame, given rise to a shorter, but still functional dystrophin protein. Our objective in this work was to produce antisense sequences targeting splice junctions of dystrophin gene to induce removal of disease-associated exons during pre-mRNA processing. To achieve this exon-skipping, we proposed to use the U7 small nuclear RNA as carrier and we first developed AAV vectors harboring chimeric U7snRNA carrying antisense sequences able to promote skipping of exon 23 of the murine dystrophine gene. After intramuscular or intra-arterial injection in mdx mice, we detected efficient skipping of the exon 23 and a long term rescue of dystrophin expression. We next evaluated this strategy in the canine GRMD model and showed the possibility to skip several exons, leading to a very large restoration of dystrophin in injected muscles. These promising results obtained on the mouse and canine models led us to develop the strategy on the human dystrophin gene and especially on the exon 51. We confirmed the skipping of the exon 51 both in vitro in patient myoblasts after transduction with the lentiviral vector and in vivo after intramuscular injection of an AAV-U7ex51 vector in the transgenic hDMD mouse. This study provides evidence on the efficiency of the U7snRNA mediated exon skipping strategy for Duchenne muscular dystrophy, that could concern more than 80% of patients and offers very promising tools for clinical treatment of DMD
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Vincent, Lacaze Nathalie. „Expression du gène de la dystrophine et perspectives thérapeutiques des dystrophines musculaires de Duchenne et de Becker“. Paris 5, 1996. http://www.theses.fr/1996PA05CD12.
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Le gène de la dystrophine dont l'atteinte est responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) code pour un transcrit musculaire de 14 kilobases et pour une famille de transcrits issus de promoteurs et/ou d'épissages alternatifs. Il existe une hétérogénéité des manifestations cliniques associées à la présence de mutations dans le gène de la dystrophine qui incitent à rechercher un ou plusieurs autres gènes non encore caractérisés tout entiers contenus dans une des introns de ce gène, ou intriqués avec lui. Nous avons caractérisé différents transcrits initiés à partir d'un promoteur alternatif localisé dans l'intron 62. Le criblage de banques d' ADNc de foie et de lymphocytes humains ne nous a pas permis de mettre en évidence de nouveaux transcrits alternatifs. Afin d'élargir la recherche à des transcrits totalement distincts de ceux déjà connus, nous avons entrepris d'utiliser la sélection d' ADNc par hybridation sur des chromosomes artificiels de levures (YAC). Nous avons utilisé des fragments de PCR-Alu obtenus à partir d'un YAC couvrant la région génomique correspondant aux exons 1 à 25 de la dystrophine pour sélectionner dans une banque de cœur d'éventuels ADNc issus du locus DMD. Nous avons isolé un clone de 270 bases, dont nous avons localisé l'origine dans l'intron 2 du gène. La deuxième partie de ce travail a été consacrée à une collaboration avec le laboratoire de Michel Perricaudet (Villejuif), portant sur le transfert d'un minigène de dystrophine médié par un vecteur adénoviral dans le muscle de souris mdx. Nous avons démontré l'efficacité de cette approche chez des souris nouveau-nées, en obtenant une expression dans 5 à 60% des fibres musculaires et une correction à long terme (6 mois) des anomalies histologiques observées chez ces mutants dépourvus de dystrophine. Nous avons testé l'effet de la dose injectée, et de l'âge des animaux au moment de l'injection. Ceci a permis de mettre en évidence, en même temps que d'autres équipes, l'existence d'une réaction immunologique chez les animaux lorsqu'ils ne sont pas injectés dans les premiers jours de vie, ainsi qu'une baisse nette du nombre de fibres infectées à partir de l'âge de 25 jours.
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Rouger, Karl. „Analyse de l'expression de gènes chez la souris déficiente en dystrophine (mdx), au moyen des puces à ADN“. Nantes, 2001. http://www.theses.fr/2001NANT03VS.
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Afin d'appréhender les conséquences à l'échelle moléculaire de l'absence de dystrophine chez la souris mdx, nous avons entrepris d'étudier comparativement l'expression d'un ensemble de 1082 clones d' ADNc, au cours du développement post-natal des muscles périphériques et du diaphragme des souris C57BVIO et mdx. Pour cela, nous avons utilisé les puces à ADN (DNA chips) qui permettent de suivre simultanément le niveau, d' expression de plusieurs centaines de gènes. Nous avons pu montrer que le défaut génétique unique de la dystrophine induit une modification profonde de l' expression de nombreux gènes et identifier ainsi 221 gènes différentiellement exprimés. Cette altération peut avoir des conséquences distinctes dans deux tissus appartenant pourtant à la même famille fonctionnelle. En effet, si la pathologie modifie pour un tiers de ces gènes l' expression de la même façon dans les muscles périphériques et le diaphragme, les deux autres tiers en revanche présentent, par rapport aux muscles contrôles correspondant, un profil d' expression différent soit dans le diaphragme, soit dans les muscles périphériques soit encore entre les deux types de muscle. Nous avons montré que ces 221 gènes affectent toutes les fonctions de la cellule musculaire. Les deux éléments les plus frappants chez la souris mdx sont la surexpression dans le diaphragme des gènes codant des composants du sarcomère et la sous expression dans les muscles périphériques des gènes codant des molécules impliquées dans le métabolisme énergétique et notamment dans l'activité mitochondriale. Ainsi, nous avons isolé des gènes qui pourraient être partiellement responsables de la différence de progression et d'atteinte de la pathologie dans ces muscles. Dans un second temps, nous avons analysé selon une approche similaire les modulations d' expression génique engendrées consécutivement à deux types de traitement pharmacologique réalisés chez les souris C57BVlO et mdx. Ces derniers correspondent à l'administration du deflazacort, un corticoïde dérivé de la prednisone et de la L-arginine, le substrat de la NO synthase, lesquels se sont avérés avoir des effets bénéfiques sur la pathologie. Ainsi, nous avons pu préciser leur mode d' action à l'échelle moléculaire, en montrant notamment un effet de correction sur le taux d' expression de plusieurs gènes identifiés comme différentiels lors de la première étude et impliqués dans le métabolisme et la structure des fibres musculaires.
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Léger, Adrien. „Pharmacologie moléculaire des vecteurs adéno-associés in situ dans le muscle squelettique : implications de la régulation épigénétique endogène sur l'expression du génome recombinant“. Nantes, 2012. https://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show/show?id=1a1c348c-0066-4b62-9b03-7a811ea7abfb.
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Les vecteurs AAVr jouissent d'une popularité croissante dans le domaine de la thérapie génique et promettent d'apporter un traitement pour de nombreuses maladies dont la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Bien qu'ils soient parmi les vecteurs les plus efficaces pour le transfert de gène in vivo, l'optimisation du niveau d'expression du transgène est un défi qu'il faudra relever dans les années à venir pour atteindre un niveau thérapeutique sans avoir à augmenter les doses administrées. Chez les mammifères, l'expression des gènes est contrôlée par des mécanismes épigénétiques dont la méthylation de l'ADN et les modifications post-traductionnelles des histones (HPTM). Dans les muscles des patients atteints de la DMD, une altération sévère de ces mécanismes a été décrite. Plusieurs vecteurs utilisés en thérapie génique peuvent être ciblés par des modifications épigénétiques répressives aboutissant à une diminution de l'efficacité thérapeutique, très peu d'informations sont disponibles en ce qui concerne les vecteurs AAVr. Nous avons décidé de caractériser l'implication des mécanismes épigénétiques sur l'efficacité d'expression d'un transgène apporté par un AAVr dans le muscle de primates et de souris. Par la suite, nous nous sommes intéressés à l'impact des perturbations de ces mécanismes sur l'efficacité du transfert de gène dans le muscle déficient en dystrophine d'un modèle murin de la DMD. Les résultats obtenus suggèrent que les HPTM entraînent probablement une restriction partielle de la transcription du transgène in vivo et que cet effet semble être exacerbé dans le muscle dystrophynopathe. A terme, nous projetons d'utiliser des modificateurs chromatiniens adaptés pour contrebalancer cette répressionRecombinant AAV vectors have become increasingly popular in the field of gene therapy and promise to provide a treatment to numerous diseases including the Duchenne muscular dystrophy (DMD). Although they are among the most efficient vectors for in vivo gene transfer, improving transgene expression level will be a challenge to be face to achieve a therapeutic level without increasing the administered doses. In mammals, gene expression is widely controlled by epigenetic mechanisms, including promoter DNA methylation and histones post-translational modifications (HPTM). Interestingly, severe perturbations of these 2 mechanisms were described in muscles of DMD patients. Though it was reported that a transgene carried by gene therapy vectors can be targeted by repressive epigenetic modifications leading eventually to a reduced therapeutic benefit, there is virtually no information regarding epigenetic regulations of rAAV genome. First, we decided to determine if the efficiency of rAAV mediated gene expression is negatively impacted by epigenetic mechanisms in the muscle of primate and mouse. Second, we investigated the potential involvement of these mechanisms in the dystrophin deficient muscle by comparing healthy and DMD mice model. We obtained results suggesting an involvement of repressive HPTM in a partial restriction of rAAV mediated gene expression in vivo. This effect seems to be exacerbated in the dystrophynopathic muscle. Ultimately, we plan to counteract this repression using suitable chromatin modifying drugs
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Monceau, Alexandra. „Effet de l'exercice physique, combiné ou non à une thérapie génique, sur la fonction musculaire de modèles murins de dystrophie musculaire de Duchenne“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2021. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2021SORUS172.pdf.
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La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire causée par des mutations du gène DMD codant la dystrophine. Son absence engendre une fragilité musculaire accrue, et une faiblesse musculaire extrême. Il n’existe pas encore de traitement curatif, mais l’utilisation de plusieurs approches thérapeutiques combinées semble prometteuse. Nous avons testé l’idée que l’activité physique régulière pourrait être un moyen de diminuer les symptômes dystrophiques du muscle squelettique, dans des modèles murins de DMD. Tout d’abord, nous avons évalué l’effet d’un exercice physique chronique d’endurance lorsqu'il est associé à la surexpression de Prox1, un facteur de transcription connu pour favoriser des fibres plus lentes dans un muscle sain, celles-ci étant moins atteintes dans la DMD. Nous avons mis en évidence que cette combinaison permettait de diminuer la fragilité musculaire, chez la souris mdx, le modèle murin classique de la DMD, et avait donc le potentiel d’arrêter la progression de la pathologie. Par la suite, nous avons regardé l’effet de l’exercice physique chronique d’endurance lorsqu’il est combiné à une thérapie génique, qui restaure l’expression de la dystrophine, chez la souris D2-mdx, un modèle sévère de DMD. Nous avons montré que l’exercice chronique d’endurance diminuait l’efficacité de la thérapie génique, en diminuant la restauration de la dystrophine. Enfin, nous avons caractérisé les effets de l’exercice physique chronique de résistance chez la souris D2-mdx. Nos résultats indiquent une amélioration très importante de la fonction musculaire en réponse à la surcharge mécanique, sans dommages musculaires évidents dans ce modèle sévèreDuchenne muscular dystrophy (DMD) is a neuromuscular disease caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin, a protein essential for the integrity of the skeletal muscle fiber. Its absence causes increased muscle fragility, and extreme muscle weakness. Currently, there is no curative treatment, but the use of several combined therapeutic approaches seems promising. We tested the idea that regular physical activity could be a way to decrease dystrophic symptoms of skeletal muscle, especially those related to muscle function, in mice models of DMD. First, we evaluated the effect of chronic endurance exercise when combined with overexpression of Prox1, a transcription factor known to promote slower fibers in healthy muscle, which are less affected in DMD. We demonstrated that this combination allowed to decrease muscle fragility in mdx mice, the classical mouse model of DMD, and thus had the potential to stop the progression of the disease. Subsequently, we were interested in the effect of chronic endurance exercise when combined with gene therapy, which restores dystrophin expression, in D2-mdx mouse, a severe model of DMD. We showed that chronic endurance exercise decreased the efficiency of the gene therapy, by decreasing the restoration of dystrophin. Finally, we characterized the effects of chronic resistance exercise in D2-mdx mice. Our results indicate an incredibly significant improvement in muscle function in response to mechanical overload, without obvious muscle damage in this severe model
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Dupont, Jean-Baptiste. „Pharmacologie moléculaire des vecteurs adéno-associés recombinants dans le muscle squelettique déficient en dystrophine“. Nantes, 2015. https://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show/show?id=74cd08ba-0755-4c2f-857d-e2219afdd24c.
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La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire héréditaire causée par des mutations dans le gène codant pour la Dystrophine. L'absence de cette protéine dans les cellules musculaires entraîne un ensemble de perturbations mécaniques et métaboliques menant à leur dégénérescence progressive. En l'absence de traitement curatif, la thérapie génique s'est imposée récemment comme une stratégie prometteuse, notamment grâce à l'utilisation de vecteurs recombinants dérivés du virus Adéno-Associé (AAVr). Toutefois, les bénéfices à long terme d'une telle stratégie demeurent inconnus, et certaines études menées chez des modèles animaux de la DMD suggèrent que l'expression du transgène n'est que transitoire. En parallèle, le devenir moléculaire de ces vecteurs une fois administrés in vivo dans les muscles déficients en Dystrophine reste un domaine encore relativement inexploré. Il pourrait toutefois être profondément modifié compte-tenu du remodelage cellulaire et tissulaire s'opérant dans les muscles dystrophiques. La première étape de ce travail a consisté à quantifier la baisse d'efficacité des vecteurs AAVr dans le muscle murin déficient en Dystrophine. Dans un second temps, nous avons identifié les facteurs susceptibles d'agir négativement sur la stabilité des génomes et des ARNm transgéniques. Enfin, nous avons exploré une stratégie alternative combinant la thérapie génique à un traitement pharmacologique pertinent pour tenter de contourner ces facteurs de restriction. À terme, une telle approche pourrait permettre d'optimiser les protocoles de thérapie génique utilisant des vecteurs AAVr, qui seront prochainement appliqués chez les patients DMDDuchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a neuromuscular disease caused by mutations in the gene encoding the Dystrophin protein. In the absence of Dystrophin, muscle cells endure a variety of mechanical and metabolic perturbations, progressively leading to their degeneration. With no curative treatment to date, gene therapy emerged recently as a promising strategy, notably thanks to the use of recombinant vectors derived from the Adeno-Associated Virus (rAAV). Nonetheless, the long term benefits of this strategy are controversial, and recent studies conducted in DMD animal models suggest that transgene expression is only transient. In parallel, rAAV vector molecular fate following administration in Dystrophin-deficient muscles remains almost entirely unexplored. However, it could be deeply modified given the cell and tissue remodeling observed in dystrophic muscles. The work presented in this PhD manuscript aims to decipher the consequences of the absence of Dystrophin on rAAV vector efficiency and long term persistence. In the first place, this work consisted in the quantification of rAAV vector efficiency in murine Dystrophin-deficient muscles. Then, we identified restriction factors with potential negative impacts on the stability of rAAV vector genomes and transgene mRNA. Finally, we explored an alternative strategy combining gene therapy with a relevant pharmacological treatment with the aim to counteract these restriction factors. In the end, this kind of approach may help optimize future rAAV-mediated gene therapy protocols to be subsequently applied in DMD patients
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Vulin, Adeline. „Restauration de la dystrophine par saut d'exons chez le modèle canin GRMD ; Augmentation de la masse musculaire par inhibition de la myostatine : rationnel thérapeutique pour DMD ?“ Paris 12, 2005. https://athena.u-pec.fr/primo-explore/search?query=any,exact,990003942550204611&vid=upec.
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La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie progressive et sévère qui demeure incurable malgré le développement de différentes stratégies thérapeutiques. Nous avons décidé de travailler sur deux approches innovantes. Notre premier objectif était de mettre au point des outils moléculaires pour une correction post-transcriptionnelle du gène de la dystrophine. La technique du saut d'exon permet de restaurer le cadre de lecture dans le cas de nombreuses mutations et d'obtenir une protéine plus courte mais fonctionnelle. Nous avons obtenu un saut d'exon(s) efficace et stable après une seule administration du vecteur AAV exprimant les séquences anti-sens liées à un petit ARN nucléaire U7. Nos résultats montrent une restauration de la dystrophine fonctionnelle chez le modèle canin GRMD et localement la correction de la dystrophie musculaire. Notre second objectif était d'améliorer le phénotype DMD en augmentant la masse musculaire grâce à la sous-expression de la myostatine et de vérifier une possible amélioration de la régénération musculaire. Nous avons démontré que le propeptide de la myostatine était un agent efficace pour l'accroissement de la masse musculaire et le bénéfice fonctionnel reste à établir dans les modèles dystrophiques murin et caninDuchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a progressive devastating disorder that remains incurable in spite of development of different therapeutic strategies. We decided to work on two original approaches. Our first aim was to setup molecular tools for post-transcriptional correction by targeting exon skipping of frequent out-of-frame deletions in the dystrophin gene and obtain a shorter but functional protein. We have achieved persistent exon skipping by a single administration of an AAV vector expressing antisense sequences linked to a modified U7 small nuclear RNA. Our results show the sustained production of functional dystrophin at physiological levels in injected muscles of GRMD dog model and the correction of the muscular dystrophy. Our second aim was to improve the DMD phenotype by increasing the skeletal muscle mass thanks to the down-regulation of myostatin and verify a possible improvement of the muscular regeneration. We have demonstrated that the propeptide of myostatin is an effective agent for increasing muscle mass and the functional benefit continue to be established in dystrophic mouse and dog models
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Dias, Florencio Leite Gabriella. „Recombinant Adeno-Associated Viruses : process development and gene transfer application for muscular dystrophy“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLV051/document.
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L'intérêt de l’utilisation des vecteurs viraux comme le Adeno-Associated Virus recombinant (rAAV) dans la recherche pour le traitement des maladies génétiques a conduit à une évolution rapide des méthodes de production d'AAV au cours des deux dernières décennies (Ayuso et al., 2010). Leur large biodisponibilité in vivo et leur efficacité à long terme dans les tissus postmitotiques en font de bons candidats pour de nombreuses applications de transfert de gènes. En plus, la spécificité du traitement peut être augmentée lorsque le sérotype correct est choisi pour cibler un tissu spécifique. Parmi les méthodes de production actuellement utilisées, la tri-transfection de cellules embryonnaires humaines rénales 293 (HEK293) reste la plus populaire pour l'échelle de recherche; Et la production de rAAV médiée par des baculovirus pour des échelles plus importantes. L'importance croissante des vecteurs viraux dans l'application pratique de la thérapie génique exige l'amélioration des processus de production, en particulier en ce qui concerne les rendements et la pureté du produit final. Mon travail au cours de ces quatre années a été axé sur deux points principaux: (1) améliorer les processus biotechnologiques employés dans la production de rAAV pour la recherche et les échelles d'étude préclinique et (2) tester in vitro et in vivo les applications pour le rAAV dans le l’édition de genome. L'édition de gènes médiée par des nucléases spécialement conçues offre de nouveaux espoirs pour le traitement de plusieurs maladies héréditaires monogéniques. Récemment découvert, le système CRISPR Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) fournit des outils importants nécessaires pour corriger les mutations par homologie. Notre modèle canonique est la souris mdx, un modèle animal naturel de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Les mutations DMD, qui conduisent à l'absence de protéine dystrophine, entraînent une myopathie progressive et fatale. Plusieurs stratégies, allant des stratégies pharmacologiques aux stratégies de saut-d’éxon, ont tenté de renverser le phénotype et ralentisser la progression de la maladie, mais les résultats ne sont pas encore satisfaisants. Ce nouvel et puissant outil d'édition de génome peut être vectorisé par rAAV. Les résultats de la première partie ont été publiés en 2015 et 2016 et seront présentés sous la forme d'articles et pour la deuxième partie, je présenterai les résultats préliminaires et les perspectives du travail qui se poursuivra dans le laboratoireThe interest of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) vectors for research and clinical purposes in the treatment of genetic diseases have led to the rapid evolution of methods for AAV production in the last two decades (Ayuso et al., 2010). Their broad in vivo biodistribution and long-term efficacy in postmitotic tissues make them good candidates for numerous gene transfer applications. In addition, the specificity of the treatment can be increased when the right serotype is chosen to target a specific tissue. Among the production methods currently in use, tri-transfection of human embryonic kidney 293 (HEK293) cells remains the most popular for research scale; and rAAV production mediated by baculoviruses for larger scales. The increasing importance of viral vectors in the practical application of gene therapy demands the improvement of production processes, especially when it concerns the yields and purity of the final product. My work during these four years was focused in two main points: (1) improve biotechnological processes employed in rAAV production for research and pre-clinical study scales and (2) test in vitro and in vivo the applications for rAAV in the field of genome editing. Gene-editing mediated by engineered nucleases offers new hopes for the treatment of several monogenic inherited diseases. Recently discovered, the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9 system provides important tools needed to correct by homology-directed repair mutations. Our canonical model is the mdx mouse, a naturally occurring animal model of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). DMD mutations, which lead to the absence of the protein dystrophin, results in a progressive and fatal myopathy. Several strategies, from pharmacological to exon-skipping strategies, have attempt to revert the phenotype and slow down the disease progress, however results are not yet satisfactory. This new and powerful genome editing tool can be vectorized by rAAV. Results for the first part were published in 2015 and 2016 and will be presented in the form of articles and for the second part I will present preliminary results and perspectives for the work that will be continued in the lab
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Bensalah, Mona. „Fibrose musculaire : acteurs cellulaires et stratégies thérapeutiques“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2019SORUS031.pdf.
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La fibrose est une accumulation excessive de protéines de la matrice extracellulaire qui remplace le tissu et en altèrent la fonction. Dans le muscle squelettique c’est une caractéristique pathologique commune à plusieurs dystrophies dont la dystrophie musculaire oculopharyngée et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Dans de nombreux tissus, les cellules résidentes appelées fibroblastes semblent avoir un rôle clé dans l’établissement et le maintien de la fibrose, cependant, la nature exacte et le rôle de ces cellules dans la fibrose musculaire humaine sont peu connus. Nous avons caractérisé les populations cellulaires non-myogéniques (CD56-) de muscles contrôles et fibrotiques et montré que les cellules CD56- de muscles fibrotiques ont un phénotype différent des cellules de muscles contrôles (capacité proliférative, sensibilité au TGFβ, sécrétion, impact sur la fusion et la régénération). Notre étude met en évidence l’importance de la communication entre types cellulaires au sein du muscle, en particulier du muscle fibrotique et dystrophique. Actuellement, de nombreuses stratégies anti-fibrotiques se développent mais aucune n’a encore été capable de réduire une fibrose pré-existante. Nous avons comparé 10 sérotypes d’AAV par injection intramusculaire afin d’évaluer si un sérotype était capable de transduire les fibroblastes in vivo et si la fibrose gênait la transduction des fibres musculaires. Puis, nous avons testé le potentiel anti-fibrotique d’un AAV-Relaxine sur des souris DBA/2-mdx, modèle pour DMD. L’ensemble de ce travail permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes en jeu dans la fibrose musculaire et de développer des thérapies efficacesFibrosis is described as an excessive accumulation of extracellular matrix proteins that replace tissue and alter its function. In skeletal muscle, fibrosis is a pathological feature common to many dystrophies including Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD) and Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). In many tissues, resident cells called fibroblasts seem to have a key role in establishing and maintaining fibrosis, however, the exact nature and role of these cells in human muscle fibrosis are still very poorly defined. In this context, we characterized the non-myogenic cell population (CD56- cells) of control and fibrotic muscles and showed that CD56- fibrotic muscle cells have a different phenotype than control muscle cells (proliferative capacity, sensitivity to TGF-β, secretion, impact on fusion and regeneration). Our study highlights the importance of the cross-talk between cell types within the muscle, especially fibrotic and dystrophic muscle. Currently, many anti-fibrotic gene therapy strategies are being developed but while most of them prevent the apparition of fibrosis, none has yet been able to revert pre-existing fibrosis. In this context, we first compared 10 serotypes of AAV by intramuscular injection to evaluate whether one of these serotype was able to transduce fibroblasts in vivo and whether fibrosis impair the transduction of muscle fibers. Then we tested the anti-fibrotic therapeutic potential of AAV-Relaxin (RLN) on DBA/2-mdx mice, model for DMD. Altogether these studies will allow us to improve our understanding of the pathophysiological mechanisms involved in muscle fibrosis and to develop effective anti-fibrotic strategies
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Chassagne, Julie. „Mécanismes moléculaires impliqués dans l’efficacité de transduction des vecteurs AAV dans le muscle dystrophique“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2019SORUS514.pdf.
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La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique causée par l’absence de dystrophine et provoquant une dégénérescence musculaire sévère. Aucun traitement curatif n’existe aujourd’hui mais la thérapie génique par vecteur AAV est l’une des stratégies les plus prometteuses pour traiter la DMD. Malgré l’efficacité bien établie de l’AAV de sérotype 8 (AAV8) pour le transfert de gène dans le muscle, de fortes doses de vecteurs sont nécessaires pour obtenir une efficacité thérapeutique dans des modèles animaux de la DMD. Dans ce contexte, j’ai étudié les mécanismes qui peuvent limiter l’efficacité de transduction du vecteur AAV8 dans le muscle dystrophique. Pour cela, j’ai étudié le devenir du vecteur AAV dans le muscle DMD puis caractérisé le système endosomal, essentiel au transport et la maturation des vecteurs AAV, dans différents modèles de la DMD. Mes résultats ont montré que l’efficacité de transduction de l’AAV8 est plus faible dans les cellules musculaires DMD comparées aux contrôles. De plus, la dérégulation du système endosomal dans la DMD peut impacter le transfert de gène par vecteur AAV dans ces cellules. Par ailleurs, l'amélioration de l'efficacité des vecteurs AAV en thérapie génique nécessite aussi une meilleure connaissance des protéines cellulaires qui interagissent avec le génome viral et qui régulent son expression. Dans ce contexte, nous avons montré que les facteurs de transcription RFX1 et RFX3 sont capables d’interagir avec la région ITR du génome viral et de moduler l’expression des vecteurs AAVDuchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a genetic disorder caused by the absence of dystrophin and causing severe muscle degeneration. No curative treatment exists today but AAV-based gene therapy is one of the most promising strategies for treating DMD. Despite the well-established efficacy of AAV serotype 8 (AAV8) for gene transfer into muscle, high doses of vectors are required to achieve therapeutic efficacy in DMD animal models. In this context, I aimed at investigating the mechanisms that may limit the transduction efficiency of the AAV8 vector in dystrophic muscle. For this, I studied the fate of the AAV vector in the DMD muscle and then characterized the endosomal system, essential for the transport and maturation of AAV vectors, in different models of DMD. We have shown that the transduction efficiency of AAV8 is lower in DMD muscle cells compared to controls. The dysfunction of the endosomal system identified in this study may impact AAV vector gene transfer into these cells. Moreover, improving the efficiency of AAV vectors in gene therapy also requires a better understanding of cellular proteins that interact with the viral genome and regulate its expression. In this context, we have shown that the transcription factors RFX1 and RFX3 are able to interact with the ITR region of the viral genome and to modulate the expression of AAV vectors
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Perronnet, Caroline. „Etude de thérapies génique et pharmacologique visant à restaurer les capacités cognitives d’un modèle murin de la Dystrophie musculaire de Duchenne“. Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112009.
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L’objectif était d’évaluer l’efficacité de thérapies développées pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD, due à des mutations du gène de la dystrophine) dans la restauration de déficits cognitifs associés à ce syndrome. Deux pistes thérapeutiques visant à compenser les altérations cérébrales liées à la perte de dystrophine ont été explorées chez les souris mdx, modèle de DMD. Une approche pharmacologique basée sur la surexpression de l’utrophine, homologue de la dystrophine, n’améliore pas les déficits comportementaux des souris mdx. Par contre, une intervention génique basée sur l’épissage de l’exon muté conduit à la restauration d’une dystrophine endogène et une récupération d’altérations cérébrales comme l’agrégation des récepteurs GABAA et la plasticité synaptique hippocampique. Ceci suggère un rôle de la dystrophine dans la plasticité du cerveau adulte et l’applicabilité de cette approche de thérapie génique au traitement des altérations cognitives de la DMDTherapies have been developed to treat Duchenne muscular dystrophy (DMD, due to mutation in the dystrophin gene), but their ability to restore the cognitive deficits associated with this syndrome has not been yet studied. We explored two therapeutic approaches to compensate for the brain alterations resulting from the loss of dystrophin in the mdx mouse, a model of DMD. A pharmacological approach based on the overexpression of utrophin, a dystrophin homologue, does not alleviate the behavioural deficits in these mice. In contrast, a genetic intervention based on the splicing of the mutated exon leads to the restoration of endogenous dystrophin and a recovery of brain alterations such as the clustering of GABAA receptors and hippocampal synaptic plasticity in mdx mice. These results suggest a role for dystrophin in adult brain plasticity and indicate that this gene therapy approach is applicable to the treatment of cognitive impairments in DMD
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Messaoud, Khelifi Mouna. „Etude de séquences cis-régulatrices d'épissage dans le gène DMD : rôle dans la régulation des pseudoexons et intérêt pour le saut d'exon thérapeutique“. Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON13521/document.
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L'épissage des ARN pré-messagers est une étape essentielle pour l'expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. La reconnaissance des exons par la machinerie d'épissage est réalisée grâce à différents éléments cis-régulateurs incluant les séquences consensus d'épissage et les séquences auxiliaires activatrices ou inhibitrices d'épissage. Le pré-ARNm représente une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement des maladies génétiques. L'approche du saut d'exon thérapeutique, destinée à restaurer l'expression d'une protéine totalement ou partiellement fonctionnelle en interférant avec le processus d'épissage, suscite un grand intérêt notamment pour la dystrophie musculaire de Duchenne où la modification du transcrit permettrait d'obtenir une forme modérée de la maladie, la Dystrophie musculaire de Becker. Des oligonucléotides antisens sont utilisés pour masquer les signaux d'épissage de reconnaissance d'un exon par le spliceosome, et induire son excision (ou saut) du transcrit mature. La détermination de la meilleure séquence cible des AONs est une difficulté majeure de cette approche. Pour le gène DMD, nous avons pu établir grâce à des analyses bioinformatiques et statistiques combinées avec des tests fonctionnels utilisant des minigènes rapporteurs d'épissage, que le ciblage de motifs exoniques qui fixent le facteur d'épissage SF2/ASF permettait d'obtenir la meilleure efficacité des AONs. Par ailleurs, nous avons exploré la régulation de l'épissage des pseudoexons dans le gène DMD, et notamment les mécanismes conduisant à l'inclusion de ces séquences introniques dans le transcrit mature en condition pathologique. L'étude de deux cas exceptionnels d'activation de pseudoexons associée à des remaniements introniques rares (double délétion, inversion) élargit le spectre des mutations à l'origine de ces défauts d'épissage, et illustre le rôle encore mal connu des remaniements introniques en pathologie humaineSplicing of pre-messenger RNAs to mature transcripts is a crucial step in eukaryotic gene expression. The recognition of exon by the splicing machinery involves different cis-regulatory elements, including the splice site motifs and auxiliary sequences, which can act by stimulating or repressing splicing. The pre-mRNA represents a new therapeutic target for the treatment of genetic diseases. Notably, the exon skipping strategy is currently one of the most promising therapeutic approaches for the Duchenne muscular dystrophy. It intends to restore the expression of a partially functional protein by interfering with the splicing process, and converts the severe DMD phenotype into the moderate form of the disease, Becker muscular Dystrophy (BMD). Antisense oligonucleotides are used to mask the splicing signals involved in exon recognition by the spliceosome to induce its skipping from the mature transcript and restore an open reading frame. The determination of the best target sequence of the AONs is one of the major hurdles to overcome. For the DMD gene, a bioinformatic and statistical analysis combined with minigenes studies allowed us to establish that targeting binding sites for the splicing factor SF2/ASF maximizes the AONs efficiency. In a second part of this work, we investigated the splicing regulation of pseudoexons in the DMD gene, in particular the mechanisms leading to the inclusion of these intronic sequences in the mature transcript in pathological conditions. The study of two exceptional cases of pseudoexons activation associated with rare intronic rearrangements (double-deletions, inversion) expands the spectrum of missplicing mutations, and demonstrates the potential role of pure intronic rearrangements in human pathology
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Escriou, Catherine. „Étude préclinique de deux stratégies thérapeutiques systémiques de la myopathie de Duchenne dans le modèle canin GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy) : surexpression de l'utrophine par la voie du monoxyde d'azote, thérapie cellulaire médiée par la greffe de moelle osseuse“. Paris 12, 2004. http://www.theses.fr/2004PA120006.
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La myopathie de Duchenne est une affection musculaire létale de l'enfant causée par le déficit d'une protéine, la dystrophine. Parmi les modèles animaux spontanés, le chien dystrophique est considéré comme la meilleure " phénocopie " de la maladie humaine et se place comme un modèle " préclinique " incontournable dans l'évaluation de stratégies thérapeutiques. Le but de ce travail fut de tester, chez le chien dystrophique, l'intérêt clinique de deux voies thérapeutiques prometteuses élaborées dans le modèle murin. A. Surexpression d'utrophine par la voie du monoxyde d'azote. Une faible mais significative surexpression d'utrophine a pu être montrée dans le muscle des chiens sains traités par la L-arginine ou la molsidomine mais non dans le muscle dystrophique du fait d'une très forte surexpression spontanée préexistante. L'analyse de paramètres cliniques, biochimiques et histologiques n' a pas permis de déceler de bénéfice biologique. Cette piste métabolique demeure prometteuse mais l'étude réalisée sur le chien GRMD justifie le développement préalable à toute application thérapeutique de molécules produisant une surexpression particulièrement élevée d'utrophine. B. Thérapie cellulaire et greffe de moelle osseuse. Nous avons démontré les potentialités myogéniques des cellules souches lors de greffe de moelle osseuse chez le chien dystrophique mais n'avons pu mettre en évidence de bénéfice clinique. Cette étude confirme le caractère prometteur de la greffe de cellules souches mais le faible nombre de fibres dystrophine positives observées au sein du muscle interdit toute application thérapeutique immédiate. Il est donc nécessaire de trouver un moyen de mobiliser ces cellules et de les attirer au sein du muscle pour atteindre un seuil thérapeutiqueDuchenne Muscular Dystrophy is a lethal X-linked childhood myopathy caused by mutations that abolish the expression of dystrophin in muscle. Among natural models of DMD, the canine model offers the best phenocopy for human disease, and is considered a high benchmark for preclinical studies. In this work, dystrophic dogs were used to evaluate the clinical relevance of two promising systemic therapeutical strategy elaborated in the murine model. A. Utrophin overexpression and the NO way. If we observed a slight but significant utrophin overexpression in the muscle of normal control dog treated by L-arginin or Molsidomin, we couldn't discriminate the same modification in GRMD muscle as it exhibits spontaneous strong utrophin overexpression. Using a combination of clinical, biochemical, and histological evaluation, we couldn't neither demonstrate a therapeutic benefit. In conclusion, the NO way to induce utrophin overexpression remains pertinent but very efficient molecules need to be developed as a very high utrophin amount seems a prerequisite to obtain therapeutic benefit. B. Cell therapy and bone marrow transplantation. The myogenic participation of stem cells was evaluated in normal bone marrow engrafted dystrophic dogs. Although clinical investigations showed no obvious improvement of the dystrophic phenotype, significant increased of dystrophin positive fibers (DPF) number in dystrophic muscles were detected. This study confirmed the promising potential of stem cell transplantation, however the low level of DPF observed limit their therapeutic relevance and impose further studies to mobilize these cells out of the bone marrow compartment and attract them into the damaged muscle
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Fornasari, Benoît. „Les cellules souches dérivées du muscle (MDSC) : isolement dans deux modèles gros animaux et évaluation comme candidates à la thérapie de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)“. Nantes, 2008. https://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show/show?id=3d5cd2fe-7068-4cd9-8e37-7618e6017684.
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Les approches thérapeutiques de la DMD basées sur la transplantation de myoblastes se sont heurtées à un faible taux de survie cellulaire et une dispersion limitée des cellules. L'identification de cellules souches au sein de tissus adultes et la définition de leur potentiel myogénique ont ouvert de nouvelles perspectives. Dans un 1er temps, nous avons utilisé les propriétés d'adhérence des cellules dérivées du muscle afin d'isoler dans un modèle aviaire des cellules progénitrices résidantes du muscle distinctes des myoblastes, les LAC (late adherent cells). En utilisant la technique de préplating, nous avons montré, comme cela avait été démontré chez la souris, qu'une fraction marginale de cellules présente un défaut initial d'adhérence à une matrice collagénique et que celle-ci se compose de cellules immatures ou peu engagées dans le programme myogénique. De plus, nous avons démontré que ce défaut ne peut être attribué à la méthodologie employée et que ces cellules ne sont pas générées in vitro. Dans un 2nd temps, nous avons mis en évidence dans un modèle canin que les propriétés de quiescence, de forte capacité de prolifération, de faible capacité de fusion in vitro, de phénotype et de multipotence faisaient des LAC des cellules souches musculaires : les MDSC (Muscle Derived Stem Cells). Après injection intramusculaire chez le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), modèle cliniquement relevant de la DMD, les MDSC participent à la formation de fibres musculaires, permettent une restauration de la dystrophine, et génèrent des cellules satellites. L'ensemble de ces caractéristiques positionne les MDSC comme des candidates intéressantes pour la thérapie de la DMDTherapeutic approaches for Duchenne Muscular Dystrophy by myoblast transplantation have been hindered by poor survival rates and the limited spread of the injected cells. Stem cell identification in adult tissues and the definition of their myogenic potential have open new prospects. First, we used the muscle-derived cell’s adhesion properties in an avian model to isolate progenitor cells residing in skeletal muscle and that are distinct from myoblasts: the LAC (Late-Adherent Cells). Using the preplating technique, we showed that a marginal cell fraction displays an initial adhesion defect to collagen matrix and that it is composed of cells poorly committed in myogenic program and immature progenitor cells, as this has been previously described in mice model. Also, we demonstrated that this defect could not be attributed to the methodological approach and that the LAC are not generated in vitro by myoblasts. Second, we showed in canine model that the LAC are characterized by an initial quiescent status, a high in vitro proliferation rate as well as a low fusion ability, a phenotype and a multi-lineage differentiation potential that defined them as muscle stem cells: the MDSC (Muscle Derived Stem Cells). After intramuscular injection in dystrophic GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy) dogs that represent clinically relevant animal model for DMD, we established that MDSC are able to participate in muscle fiber formation, to allow recovery of dystrophin expression and to generate satellite cells. Collectively, these results qualify MDSC as potential candidates for future cell therapy for DMD
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Mauduit, David. „Thérapie cellulaire dans un modèle préclinique de Dystrophie Musculaire de Duchenne : Développement par édition génomique de cellules thérapeutiques et traçables in vivo par imagerie médicale“. Thesis, Paris Est, 2016. http://www.theses.fr/2016PESC0085.
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La dystrophie musculaire de Duchenne de Boulogne (DMD) est une myopathie héréditaire liée au chromosome X et causée par une mutation du gène de la dystrophine. Affectant un garçon sur 5000, cette maladie entraine une dégénérescence progressive des muscles striés squelettiques et cardiaques. A ce jour, la DMD demeure une maladie invalidante, incurable et les personnes atteintes ont une espérance de vie de 30 ans. Parmi les thérapies innovantes en cours de développement, la thérapie cellulaire est une stratégie prometteuse. Cependant elle présente plusieurs limitations notamment liées à l’efficacité des types cellulaires utilisés et le devenir des cellules après injection in vivo. Le premier objectif de cette thèse est le développement d’une méthode d’imagerie pour étudier à l’échelle de l’organisme et de façon non invasive la biodistribution et la survie des cellules suite à leur injection systémique dans un modèle préclinique pertinent, le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), un modèle animal reproduisant fidèlement le phénotype DMD. Notre attention s’est portée sur l’utilisation du symporteur sodium iode (NIS) pour le suivi non invasif des cellules. Nous avons obtenu des cellules myogéniques exprimant le NIS, autorisant leur visualisation par scintigraphie grâce à la propriété d’absorption du technétium 99m conférée par ce symporteur. Nous avons montré in vitro que le NIS est fonctionnel pour la capture de radioactivité même après une différentiation avancée des cellules. En parallèle, nous nous sommes intéressés au type cellulaire. Les cellules primaires ayant une capacité de renouvellement limitée, cela restreint leur utilisation en thérapie et leur modification génomique. Afin de contourner cette limitation, plusieurs protocoles visant à obtenir des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) dérivées de cellules canines ont été utilisés. De plus, pour ne plus être dépendant de l’immunosuppression imposée par les greffes allogéniques, nous avons utilisé le système d’édition génomique CRISPR/Cas9 pour mettre au point une correction des cellules GRMD afin de permettre la réalisation de greffes autologues. Nous avons également utilisé le système CRISPR/Cas9 pour réaliser l’insertion ciblée du gène NIS dans un site précis du génome des cellules. Les résultats obtenus autorisent le développement de programmes comparant le potentiel thérapeutique de cellules dans un modèle préclinique de la DMDDuchenne muscular dystrophy (DMD), an X-linked recessive myopathy, is caused by mutations in the dystrophin gene. One boy out of 5000 is affected by this disease, which induces a progressive loss of skeletal striated and cardiac muscles. To date, DMD remains an invalidating disease and there is no cure for it. People suffering from DMD usually die in their 30’s. Among the innovative therapies currently under development, cell therapy is a promising strategy. However, it has some limitations related notably to a low efficiency of tested therapeutic cells and their tracking in vivo after injection. The first aim of this thesis is to develop an imaging method allowing non-invasive monitoring of biodistribution and survival of cells at the scale of a large organism, following systemic injection in the GRMD dog (Golden retriever muscular Dystrophy, a relevant animal model of DMD, as it replicates finely the DMD phenotype). We took interest in the sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter. We induced the expression of the NIS in myogenic cells to allow visualization of the cells by scintigraphy thanks to its ability to uptake technetium 99m. We showed that NIS is functional in the cells and they maintain their ability to differentiate. Primary cells have a limited self-renewal capability restraining their use in human cell therapy and gene editing. To overcome this limitation, we used several protocols to derive induced pluripotent stem cells (iPSCs) from adult canine cells. Furthermore, to avoid immune suppression protocols, we used the CRISPR/Cas9 gene editing tools to design a correction strategy of the GRMD mutation for future autologous injections. We also used CRISPR/Cas9 to perform a targeted integration of the NIS gene in a safe harbor locus. Results allow us to develop protocols to compare the therapeutic potential of candidate cells in a preclinical model of DMD
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Etienne, Jessy. „Caractérisation des progéniteurs cellulaires exprimant les aldéhydes déshydrogénases (ALDH) dans des modèles sains et dystrophiques“. Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2016. http://www.theses.fr/2016PA066721.
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La thérapie cellulaire est une envisagée pour traiter des pathologies cardiaques ou squelettiques basée sur la médecine régénérative. Les progéniteurs cellulaires classiquement utilisés (myoblastes ou cellules mésenchymateuses) n'ont démontré qu'une efficacité limitée. Dans ce contexte, notre laboratoire a identifié une nouvelle catégorie de progéniteurs, sur la base de leur activité enzymatique aldéhyde déshydrogénase (ALDH) mise en évidence par un substrat fluorescent, l'Aldéfluor, et en association avec le marqueur CD34. Les ALDH sont impliquées dans le métabolisme et la détoxification des aldéhydes, et constituent un nouveau marqueur des cellules souches. Ce travail de thèse a permis de mieux caractériser les progéniteurs myogéniques (ALDH+/CD34-) et non myogéniques (ALDH+/CD34+), dans différents contextes physiopathologiques. Leur présence dans différents muscles de primates humains ou non humains, leur persistance au cours du vieillissement naturel ou lors d'atteinte par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) chez l'Homme et dans des modèles animaux, suggèrent une utilisation possible des cellules ALDH+/CD34- pour des développements thérapeutiques ultérieurs. L'étude phénotypique révèle que des marqueurs transmembranaires sont associés à des sous-populations de cellules ALDH myogéniques ou non myogéniques dont la comparaison permettra de proposer de meilleurs candidats de thérapie cellulaire. En parallèle, les caractérisations histologiques et cytologiques ont identifié des sous-populations exprimant des isoenzymes et les analyses d'expressiongénique réalisées ex vivo et en culture suggèrent que certaines sont impliquées dans l'homéostasie musculairesCell therapy is a regenerative medicine strategy considered for the treatment of cardiac or skeletal muscle diseases. The cellular progenitors used to date (myoblasts or mesenchymal stem cells) provided mitigated success, thus mandating the identification and characterization of new categories of progenitors. Our laboratory has identified new populations of progenitors, based on their Aldehyde Deshydrogenase activity (ALDH) detectable using the fluorescent substrate Aldefluor, associated with the expression of the CD34 marker. ALDH are involved in metabolism and detoxification of aldehydes, they play important roles in cell survival and differentiation and are considered a new marker of stem cells. The present project allowed characterizing extensively the myogenic (ALDH+/CD34-) and non myogenic (ALDH+/CD34+) progenitors, in several physiopathological contexts and animal models. The presence of ALDH+/CD34- cells in distinct muscle groups in Human and non-human Primates, their persistence through natural ageing and despite the ongoing degenerative process observed in Duchenne muscular dystrophy in Human patients and animal models suggest their future use for therapeutic applications. The phenotypic characterization indicated that membrane markers are associated to myogenic or non myogenic sub-populations of ALDH cells. The comparison on their efficacies in vito and in vivo will allow proposing new candidates for cell therapy. In parallele, histological and cytological analysis identified cell populations expressing isoenzymes The analysis of gene expressions suggested that, at least, some of them are involved in muscle homeostasis in situ or in vitro
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Ding, Can. „The influence of Notch over-stimulation on muscle stem cell quiescence versus proliferation, and on muscle regeneration“. Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066399.
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La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCsMuscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies
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Etienne, Jessy. „Caractérisation des progéniteurs cellulaires exprimant les aldéhydes déshydrogénases (ALDH) dans des modèles sains et dystrophiques“. Thesis, Paris 6, 2016. http://www.theses.fr/2016PA066721/document.
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La thérapie cellulaire est une envisagée pour traiter des pathologies cardiaques ou squelettiques basée sur la médecine régénérative. Les progéniteurs cellulaires classiquement utilisés (myoblastes ou cellules mésenchymateuses) n'ont démontré qu'une efficacité limitée. Dans ce contexte, notre laboratoire a identifié une nouvelle catégorie de progéniteurs, sur la base de leur activité enzymatique aldéhyde déshydrogénase (ALDH) mise en évidence par un substrat fluorescent, l'Aldéfluor, et en association avec le marqueur CD34. Les ALDH sont impliquées dans le métabolisme et la détoxification des aldéhydes, et constituent un nouveau marqueur des cellules souches. Ce travail de thèse a permis de mieux caractériser les progéniteurs myogéniques (ALDH+/CD34-) et non myogéniques (ALDH+/CD34+), dans différents contextes physiopathologiques. Leur présence dans différents muscles de primates humains ou non humains, leur persistance au cours du vieillissement naturel ou lors d'atteinte par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) chez l'Homme et dans des modèles animaux, suggèrent une utilisation possible des cellules ALDH+/CD34- pour des développements thérapeutiques ultérieurs. L'étude phénotypique révèle que des marqueurs transmembranaires sont associés à des sous-populations de cellules ALDH myogéniques ou non myogéniques dont la comparaison permettra de proposer de meilleurs candidats de thérapie cellulaire. En parallèle, les caractérisations histologiques et cytologiques ont identifié des sous-populations exprimant des isoenzymes et les analyses d'expressiongénique réalisées ex vivo et en culture suggèrent que certaines sont impliquées dans l'homéostasie musculairesCell therapy is a regenerative medicine strategy considered for the treatment of cardiac or skeletal muscle diseases. The cellular progenitors used to date (myoblasts or mesenchymal stem cells) provided mitigated success, thus mandating the identification and characterization of new categories of progenitors. Our laboratory has identified new populations of progenitors, based on their Aldehyde Deshydrogenase activity (ALDH) detectable using the fluorescent substrate Aldefluor, associated with the expression of the CD34 marker. ALDH are involved in metabolism and detoxification of aldehydes, they play important roles in cell survival and differentiation and are considered a new marker of stem cells. The present project allowed characterizing extensively the myogenic (ALDH+/CD34-) and non myogenic (ALDH+/CD34+) progenitors, in several physiopathological contexts and animal models. The presence of ALDH+/CD34- cells in distinct muscle groups in Human and non-human Primates, their persistence through natural ageing and despite the ongoing degenerative process observed in Duchenne muscular dystrophy in Human patients and animal models suggest their future use for therapeutic applications. The phenotypic characterization indicated that membrane markers are associated to myogenic or non myogenic sub-populations of ALDH cells. The comparison on their efficacies in vito and in vivo will allow proposing new candidates for cell therapy. In parallele, histological and cytological analysis identified cell populations expressing isoenzymes The analysis of gene expressions suggested that, at least, some of them are involved in muscle homeostasis in situ or in vitro
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Ding, Can. „The influence of Notch over-stimulation on muscle stem cell quiescence versus proliferation, and on muscle regeneration“. Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066399/document.
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La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCsMuscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies
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Gonzalez-Hilarion, Sara Sofia. „Identification d’inhibiteurs du nonsense-mediated mRNA decay (NMD) et utilisation comme approche thérapeutique dans certaines maladies génétiques“. Thesis, Lille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011LIL2S049/document.
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Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d’empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n’existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu’un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d’une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu’une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n’est pas exprimé du fait de l’intervention du NMD sur l’ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d’inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l’efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d’un luminomètre. A partir d’un premier criblage d’environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d’inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d’induire la synthèse de protéines entières à partir d’un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l’inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l’apparition d’une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d’inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosqueletteMRNAs harboring a premature termination codon are rapidly degraded by a mechanism called nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD is a surveillance pathway that prevents the synthesis of truncated proteins that could be harmful for the cell or simply be non-functional. However in some cases, depending on the position of the premature stop codon, the truncated protein that would be synthesized if there were no NMD would be partially or fully as functional as the wild-type protein. It is noteworthy that premature termination codons are found in approximately one-third of inherited genetic disorders and several forms of cancer. In most of cases the disease arises not because a non-functional or unstable truncated protein is synthesized, but instead because the degradation of the transcript by NMD leads to complete loss of protein production. Therefore, NMD inhibition could be an interesting therapeutic approach in some cases of nonsense-related genetic diseases in which functional truncated proteins can restore the clinical phenotype. We decided to search for NMD inhibitors among thousands of small molecules. We developed a cell-based screening method which couples NMD efficiency into the cell to a luciferase activity that can be measured directly into cells by a luminometer. From a screening of approximately 1500 compounds, we have identified one molecule capable of efficiently inhibit NMD. Interestingly, this compound is also able to induce the synthesis of full-length proteins from an mRNA bearing a premature termination codon. We evaluated the therapeutic potential of this compound in different cellular models of genetic disorders such as Duchenne’s muscular dystrophy, cystic fibrosis and cancer. Our results demonstrate that NMD inhibition in general can be considered as an useful therapeutic approach to rescue PTC consequences in genetic diseases provoked by the apparition of a nonsense mutation. We have also identified another compound that inhibits NMD and uncovers a relationship between the NMD efficiency and the integrity of the cytoskeleton