Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Myopathie pseudo-hypertrophique de Duchenne – Thérapie génique“

La plupart des cas de Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) sont causés par des mutations dans le gène de la dystrophine qui interrompent le cadre de lecture de l'ARNm. Dans certains cas, l'exclusion artificielle d'un exon permet de restaurer ce cadre de lecture, donnant naissance à une dystrophine plus courte, mais tout de même fonctionnelle. L'objectif de ce travail a été de produire in situ à partir de vecteurs viraux, des molécules d'ARN ciblant les sites spécifiques d'épissage du gène de la dystrophine, pour induire le saut des exons associés à la maladie pendant l'épissage du pré-ARNm. Pour cela, nous avons choisi d'utiliser le petit ARN nucléaire U7 (U7snRNA) comme « navette » et avons dans un premier temps construit un vecteur AAV spécifique du gène de la dystrophine murine, permettant un saut très efficace de l'exon ciblé. Ce saut d'exon induit ainsi une restauration massive et stable de dystrophine, associée à une amélioration significative du phénotype dystrophique chez la souris. En parallèle de ces travaux sur le modèle murin mdx, nous avons développé cette approche sur le modèle canin GRMD de la dystrophie musculaire de Duchenne, et mis en évidence l'efficacité du saut d'exons multiples permettant une restauration importante de dystrophine. Ces résultats très prometteurs obtenus chez la souris mdx et chez le chien GRMD, nous ont conduit à appliquer cette stratégie sur le gène humain de la dystrophine et en particulier sur l'exon 51 pour lequel nous avons pu mettre en évidence un saut d'exon très efficace. L'ensemble de ces résultats indique l'efficacité de l'approche du saut d'exon médiée par U7snRNA, qui pourrait concerner près de 80% des patients DMD
Most cases of Duchenne muscular dystrophy (DMD) are caused by dystrophin gene mutations that disrupt the mRNA reading frame. In some cases, forced exclusion of a single exon can restore the reading frame, given rise to a shorter, but still functional dystrophin protein. Our objective in this work was to produce antisense sequences targeting splice junctions of dystrophin gene to induce removal of disease-associated exons during pre-mRNA processing. To achieve this exon-skipping, we proposed to use the U7 small nuclear RNA as carrier and we first developed AAV vectors harboring chimeric U7snRNA carrying antisense sequences able to promote skipping of exon 23 of the murine dystrophine gene. After intramuscular or intra-arterial injection in mdx mice, we detected efficient skipping of the exon 23 and a long term rescue of dystrophin expression. We next evaluated this strategy in the canine GRMD model and showed the possibility to skip several exons, leading to a very large restoration of dystrophin in injected muscles. These promising results obtained on the mouse and canine models led us to develop the strategy on the human dystrophin gene and especially on the exon 51. We confirmed the skipping of the exon 51 both in vitro in patient myoblasts after transduction with the lentiviral vector and in vivo after intramuscular injection of an AAV-U7ex51 vector in the transgenic hDMD mouse. This study provides evidence on the efficiency of the U7snRNA mediated exon skipping strategy for Duchenne muscular dystrophy, that could concern more than 80% of patients and offers very promising tools for clinical treatment of DMD

Le gène de la dystrophine dont l'atteinte est responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) code pour un transcrit musculaire de 14 kilobases et pour une famille de transcrits issus de promoteurs et/ou d'épissages alternatifs. Il existe une hétérogénéité des manifestations cliniques associées à la présence de mutations dans le gène de la dystrophine qui incitent à rechercher un ou plusieurs autres gènes non encore caractérisés tout entiers contenus dans une des introns de ce gène, ou intriqués avec lui. Nous avons caractérisé différents transcrits initiés à partir d'un promoteur alternatif localisé dans l'intron 62. Le criblage de banques d' ADNc de foie et de lymphocytes humains ne nous a pas permis de mettre en évidence de nouveaux transcrits alternatifs. Afin d'élargir la recherche à des transcrits totalement distincts de ceux déjà connus, nous avons entrepris d'utiliser la sélection d' ADNc par hybridation sur des chromosomes artificiels de levures (YAC). Nous avons utilisé des fragments de PCR-Alu obtenus à partir d'un YAC couvrant la région génomique correspondant aux exons 1 à 25 de la dystrophine pour sélectionner dans une banque de cœur d'éventuels ADNc issus du locus DMD. Nous avons isolé un clone de 270 bases, dont nous avons localisé l'origine dans l'intron 2 du gène. La deuxième partie de ce travail a été consacrée à une collaboration avec le laboratoire de Michel Perricaudet (Villejuif), portant sur le transfert d'un minigène de dystrophine médié par un vecteur adénoviral dans le muscle de souris mdx. Nous avons démontré l'efficacité de cette approche chez des souris nouveau-nées, en obtenant une expression dans 5 à 60% des fibres musculaires et une correction à long terme (6 mois) des anomalies histologiques observées chez ces mutants dépourvus de dystrophine. Nous avons testé l'effet de la dose injectée, et de l'âge des animaux au moment de l'injection. Ceci a permis de mettre en évidence, en même temps que d'autres équipes, l'existence d'une réaction immunologique chez les animaux lorsqu'ils ne sont pas injectés dans les premiers jours de vie, ainsi qu'une baisse nette du nombre de fibres infectées à partir de l'âge de 25 jours.

Afin d'appréhender les conséquences à l'échelle moléculaire de l'absence de dystrophine chez la souris mdx, nous avons entrepris d'étudier comparativement l'expression d'un ensemble de 1082 clones d' ADNc, au cours du développement post-natal des muscles périphériques et du diaphragme des souris C57BVIO et mdx. Pour cela, nous avons utilisé les puces à ADN (DNA chips) qui permettent de suivre simultanément le niveau, d' expression de plusieurs centaines de gènes. Nous avons pu montrer que le défaut génétique unique de la dystrophine induit une modification profonde de l' expression de nombreux gènes et identifier ainsi 221 gènes différentiellement exprimés. Cette altération peut avoir des conséquences distinctes dans deux tissus appartenant pourtant à la même famille fonctionnelle. En effet, si la pathologie modifie pour un tiers de ces gènes l' expression de la même façon dans les muscles périphériques et le diaphragme, les deux autres tiers en revanche présentent, par rapport aux muscles contrôles correspondant, un profil d' expression différent soit dans le diaphragme, soit dans les muscles périphériques soit encore entre les deux types de muscle. Nous avons montré que ces 221 gènes affectent toutes les fonctions de la cellule musculaire. Les deux éléments les plus frappants chez la souris mdx sont la surexpression dans le diaphragme des gènes codant des composants du sarcomère et la sous expression dans les muscles périphériques des gènes codant des molécules impliquées dans le métabolisme énergétique et notamment dans l'activité mitochondriale. Ainsi, nous avons isolé des gènes qui pourraient être partiellement responsables de la différence de progression et d'atteinte de la pathologie dans ces muscles. Dans un second temps, nous avons analysé selon une approche similaire les modulations d' expression génique engendrées consécutivement à deux types de traitement pharmacologique réalisés chez les souris C57BVlO et mdx. Ces derniers correspondent à l'administration du deflazacort, un corticoïde dérivé de la prednisone et de la L-arginine, le substrat de la NO synthase, lesquels se sont avérés avoir des effets bénéfiques sur la pathologie. Ainsi, nous avons pu préciser leur mode d' action à l'échelle moléculaire, en montrant notamment un effet de correction sur le taux d' expression de plusieurs gènes identifiés comme différentiels lors de la première étude et impliqués dans le métabolisme et la structure des fibres musculaires.

Les vecteurs AAVr jouissent d'une popularité croissante dans le domaine de la thérapie génique et promettent d'apporter un traitement pour de nombreuses maladies dont la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Bien qu'ils soient parmi les vecteurs les plus efficaces pour le transfert de gène in vivo, l'optimisation du niveau d'expression du transgène est un défi qu'il faudra relever dans les années à venir pour atteindre un niveau thérapeutique sans avoir à augmenter les doses administrées. Chez les mammifères, l'expression des gènes est contrôlée par des mécanismes épigénétiques dont la méthylation de l'ADN et les modifications post-traductionnelles des histones (HPTM). Dans les muscles des patients atteints de la DMD, une altération sévère de ces mécanismes a été décrite. Plusieurs vecteurs utilisés en thérapie génique peuvent être ciblés par des modifications épigénétiques répressives aboutissant à une diminution de l'efficacité thérapeutique, très peu d'informations sont disponibles en ce qui concerne les vecteurs AAVr. Nous avons décidé de caractériser l'implication des mécanismes épigénétiques sur l'efficacité d'expression d'un transgène apporté par un AAVr dans le muscle de primates et de souris. Par la suite, nous nous sommes intéressés à l'impact des perturbations de ces mécanismes sur l'efficacité du transfert de gène dans le muscle déficient en dystrophine d'un modèle murin de la DMD. Les résultats obtenus suggèrent que les HPTM entraînent probablement une restriction partielle de la transcription du transgène in vivo et que cet effet semble être exacerbé dans le muscle dystrophynopathe. A terme, nous projetons d'utiliser des modificateurs chromatiniens adaptés pour contrebalancer cette répression
Recombinant AAV vectors have become increasingly popular in the field of gene therapy and promise to provide a treatment to numerous diseases including the Duchenne muscular dystrophy (DMD). Although they are among the most efficient vectors for in vivo gene transfer, improving transgene expression level will be a challenge to be face to achieve a therapeutic level without increasing the administered doses. In mammals, gene expression is widely controlled by epigenetic mechanisms, including promoter DNA methylation and histones post-translational modifications (HPTM). Interestingly, severe perturbations of these 2 mechanisms were described in muscles of DMD patients. Though it was reported that a transgene carried by gene therapy vectors can be targeted by repressive epigenetic modifications leading eventually to a reduced therapeutic benefit, there is virtually no information regarding epigenetic regulations of rAAV genome. First, we decided to determine if the efficiency of rAAV mediated gene expression is negatively impacted by epigenetic mechanisms in the muscle of primate and mouse. Second, we investigated the potential involvement of these mechanisms in the dystrophin deficient muscle by comparing healthy and DMD mice model. We obtained results suggesting an involvement of repressive HPTM in a partial restriction of rAAV mediated gene expression in vivo. This effect seems to be exacerbated in the dystrophynopathic muscle. Ultimately, we plan to counteract this repression using suitable chromatin modifying drugs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire causée par des mutations du gène DMD codant la dystrophine. Son absence engendre une fragilité musculaire accrue, et une faiblesse musculaire extrême. Il n’existe pas encore de traitement curatif, mais l’utilisation de plusieurs approches thérapeutiques combinées semble prometteuse. Nous avons testé l’idée que l’activité physique régulière pourrait être un moyen de diminuer les symptômes dystrophiques du muscle squelettique, dans des modèles murins de DMD. Tout d’abord, nous avons évalué l’effet d’un exercice physique chronique d’endurance lorsqu'il est associé à la surexpression de Prox1, un facteur de transcription connu pour favoriser des fibres plus lentes dans un muscle sain, celles-ci étant moins atteintes dans la DMD. Nous avons mis en évidence que cette combinaison permettait de diminuer la fragilité musculaire, chez la souris mdx, le modèle murin classique de la DMD, et avait donc le potentiel d’arrêter la progression de la pathologie. Par la suite, nous avons regardé l’effet de l’exercice physique chronique d’endurance lorsqu’il est combiné à une thérapie génique, qui restaure l’expression de la dystrophine, chez la souris D2-mdx, un modèle sévère de DMD. Nous avons montré que l’exercice chronique d’endurance diminuait l’efficacité de la thérapie génique, en diminuant la restauration de la dystrophine. Enfin, nous avons caractérisé les effets de l’exercice physique chronique de résistance chez la souris D2-mdx. Nos résultats indiquent une amélioration très importante de la fonction musculaire en réponse à la surcharge mécanique, sans dommages musculaires évidents dans ce modèle sévère
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a neuromuscular disease caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin, a protein essential for the integrity of the skeletal muscle fiber. Its absence causes increased muscle fragility, and extreme muscle weakness. Currently, there is no curative treatment, but the use of several combined therapeutic approaches seems promising. We tested the idea that regular physical activity could be a way to decrease dystrophic symptoms of skeletal muscle, especially those related to muscle function, in mice models of DMD. First, we evaluated the effect of chronic endurance exercise when combined with overexpression of Prox1, a transcription factor known to promote slower fibers in healthy muscle, which are less affected in DMD. We demonstrated that this combination allowed to decrease muscle fragility in mdx mice, the classical mouse model of DMD, and thus had the potential to stop the progression of the disease. Subsequently, we were interested in the effect of chronic endurance exercise when combined with gene therapy, which restores dystrophin expression, in D2-mdx mouse, a severe model of DMD. We showed that chronic endurance exercise decreased the efficiency of the gene therapy, by decreasing the restoration of dystrophin. Finally, we characterized the effects of chronic resistance exercise in D2-mdx mice. Our results indicate an incredibly significant improvement in muscle function in response to mechanical overload, without obvious muscle damage in this severe model

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire héréditaire causée par des mutations dans le gène codant pour la Dystrophine. L'absence de cette protéine dans les cellules musculaires entraîne un ensemble de perturbations mécaniques et métaboliques menant à leur dégénérescence progressive. En l'absence de traitement curatif, la thérapie génique s'est imposée récemment comme une stratégie prometteuse, notamment grâce à l'utilisation de vecteurs recombinants dérivés du virus Adéno-Associé (AAVr). Toutefois, les bénéfices à long terme d'une telle stratégie demeurent inconnus, et certaines études menées chez des modèles animaux de la DMD suggèrent que l'expression du transgène n'est que transitoire. En parallèle, le devenir moléculaire de ces vecteurs une fois administrés in vivo dans les muscles déficients en Dystrophine reste un domaine encore relativement inexploré. Il pourrait toutefois être profondément modifié compte-tenu du remodelage cellulaire et tissulaire s'opérant dans les muscles dystrophiques. La première étape de ce travail a consisté à quantifier la baisse d'efficacité des vecteurs AAVr dans le muscle murin déficient en Dystrophine. Dans un second temps, nous avons identifié les facteurs susceptibles d'agir négativement sur la stabilité des génomes et des ARNm transgéniques. Enfin, nous avons exploré une stratégie alternative combinant la thérapie génique à un traitement pharmacologique pertinent pour tenter de contourner ces facteurs de restriction. À terme, une telle approche pourrait permettre d'optimiser les protocoles de thérapie génique utilisant des vecteurs AAVr, qui seront prochainement appliqués chez les patients DMD
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a neuromuscular disease caused by mutations in the gene encoding the Dystrophin protein. In the absence of Dystrophin, muscle cells endure a variety of mechanical and metabolic perturbations, progressively leading to their degeneration. With no curative treatment to date, gene therapy emerged recently as a promising strategy, notably thanks to the use of recombinant vectors derived from the Adeno-Associated Virus (rAAV). Nonetheless, the long term benefits of this strategy are controversial, and recent studies conducted in DMD animal models suggest that transgene expression is only transient. In parallel, rAAV vector molecular fate following administration in Dystrophin-deficient muscles remains almost entirely unexplored. However, it could be deeply modified given the cell and tissue remodeling observed in dystrophic muscles. The work presented in this PhD manuscript aims to decipher the consequences of the absence of Dystrophin on rAAV vector efficiency and long term persistence. In the first place, this work consisted in the quantification of rAAV vector efficiency in murine Dystrophin-deficient muscles. Then, we identified restriction factors with potential negative impacts on the stability of rAAV vector genomes and transgene mRNA. Finally, we explored an alternative strategy combining gene therapy with a relevant pharmacological treatment with the aim to counteract these restriction factors. In the end, this kind of approach may help optimize future rAAV-mediated gene therapy protocols to be subsequently applied in DMD patients

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie progressive et sévère qui demeure incurable malgré le développement de différentes stratégies thérapeutiques. Nous avons décidé de travailler sur deux approches innovantes. Notre premier objectif était de mettre au point des outils moléculaires pour une correction post-transcriptionnelle du gène de la dystrophine. La technique du saut d'exon permet de restaurer le cadre de lecture dans le cas de nombreuses mutations et d'obtenir une protéine plus courte mais fonctionnelle. Nous avons obtenu un saut d'exon(s) efficace et stable après une seule administration du vecteur AAV exprimant les séquences anti-sens liées à un petit ARN nucléaire U7. Nos résultats montrent une restauration de la dystrophine fonctionnelle chez le modèle canin GRMD et localement la correction de la dystrophie musculaire. Notre second objectif était d'améliorer le phénotype DMD en augmentant la masse musculaire grâce à la sous-expression de la myostatine et de vérifier une possible amélioration de la régénération musculaire. Nous avons démontré que le propeptide de la myostatine était un agent efficace pour l'accroissement de la masse musculaire et le bénéfice fonctionnel reste à établir dans les modèles dystrophiques murin et canin
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a progressive devastating disorder that remains incurable in spite of development of different therapeutic strategies. We decided to work on two original approaches. Our first aim was to setup molecular tools for post-transcriptional correction by targeting exon skipping of frequent out-of-frame deletions in the dystrophin gene and obtain a shorter but functional protein. We have achieved persistent exon skipping by a single administration of an AAV vector expressing antisense sequences linked to a modified U7 small nuclear RNA. Our results show the sustained production of functional dystrophin at physiological levels in injected muscles of GRMD dog model and the correction of the muscular dystrophy. Our second aim was to improve the DMD phenotype by increasing the skeletal muscle mass thanks to the down-regulation of myostatin and verify a possible improvement of the muscular regeneration. We have demonstrated that the propeptide of myostatin is an effective agent for increasing muscle mass and the functional benefit continue to be established in dystrophic mouse and dog models

L'intérêt de l’utilisation des vecteurs viraux comme le Adeno-Associated Virus recombinant (rAAV) dans la recherche pour le traitement des maladies génétiques a conduit à une évolution rapide des méthodes de production d'AAV au cours des deux dernières décennies (Ayuso et al., 2010). Leur large biodisponibilité in vivo et leur efficacité à long terme dans les tissus postmitotiques en font de bons candidats pour de nombreuses applications de transfert de gènes. En plus, la spécificité du traitement peut être augmentée lorsque le sérotype correct est choisi pour cibler un tissu spécifique. Parmi les méthodes de production actuellement utilisées, la tri-transfection de cellules embryonnaires humaines rénales 293 (HEK293) reste la plus populaire pour l'échelle de recherche; Et la production de rAAV médiée par des baculovirus pour des échelles plus importantes. L'importance croissante des vecteurs viraux dans l'application pratique de la thérapie génique exige l'amélioration des processus de production, en particulier en ce qui concerne les rendements et la pureté du produit final. Mon travail au cours de ces quatre années a été axé sur deux points principaux: (1) améliorer les processus biotechnologiques employés dans la production de rAAV pour la recherche et les échelles d'étude préclinique et (2) tester in vitro et in vivo les applications pour le rAAV dans le l’édition de genome. L'édition de gènes médiée par des nucléases spécialement conçues offre de nouveaux espoirs pour le traitement de plusieurs maladies héréditaires monogéniques. Récemment découvert, le système CRISPR Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) fournit des outils importants nécessaires pour corriger les mutations par homologie. Notre modèle canonique est la souris mdx, un modèle animal naturel de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Les mutations DMD, qui conduisent à l'absence de protéine dystrophine, entraînent une myopathie progressive et fatale. Plusieurs stratégies, allant des stratégies pharmacologiques aux stratégies de saut-d’éxon, ont tenté de renverser le phénotype et ralentisser la progression de la maladie, mais les résultats ne sont pas encore satisfaisants. Ce nouvel et puissant outil d'édition de génome peut être vectorisé par rAAV. Les résultats de la première partie ont été publiés en 2015 et 2016 et seront présentés sous la forme d'articles et pour la deuxième partie, je présenterai les résultats préliminaires et les perspectives du travail qui se poursuivra dans le laboratoire
The interest of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) vectors for research and clinical purposes in the treatment of genetic diseases have led to the rapid evolution of methods for AAV production in the last two decades (Ayuso et al., 2010). Their broad in vivo biodistribution and long-term efficacy in postmitotic tissues make them good candidates for numerous gene transfer applications. In addition, the specificity of the treatment can be increased when the right serotype is chosen to target a specific tissue. Among the production methods currently in use, tri-transfection of human embryonic kidney 293 (HEK293) cells remains the most popular for research scale; and rAAV production mediated by baculoviruses for larger scales. The increasing importance of viral vectors in the practical application of gene therapy demands the improvement of production processes, especially when it concerns the yields and purity of the final product. My work during these four years was focused in two main points: (1) improve biotechnological processes employed in rAAV production for research and pre-clinical study scales and (2) test in vitro and in vivo the applications for rAAV in the field of genome editing. Gene-editing mediated by engineered nucleases offers new hopes for the treatment of several monogenic inherited diseases. Recently discovered, the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9 system provides important tools needed to correct by homology-directed repair mutations. Our canonical model is the mdx mouse, a naturally occurring animal model of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). DMD mutations, which lead to the absence of the protein dystrophin, results in a progressive and fatal myopathy. Several strategies, from pharmacological to exon-skipping strategies, have attempt to revert the phenotype and slow down the disease progress, however results are not yet satisfactory. This new and powerful genome editing tool can be vectorized by rAAV. Results for the first part were published in 2015 and 2016 and will be presented in the form of articles and for the second part I will present preliminary results and perspectives for the work that will be continued in the lab

La fibrose est une accumulation excessive de protéines de la matrice extracellulaire qui remplace le tissu et en altèrent la fonction. Dans le muscle squelettique c’est une caractéristique pathologique commune à plusieurs dystrophies dont la dystrophie musculaire oculopharyngée et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Dans de nombreux tissus, les cellules résidentes appelées fibroblastes semblent avoir un rôle clé dans l’établissement et le maintien de la fibrose, cependant, la nature exacte et le rôle de ces cellules dans la fibrose musculaire humaine sont peu connus. Nous avons caractérisé les populations cellulaires non-myogéniques (CD56-) de muscles contrôles et fibrotiques et montré que les cellules CD56- de muscles fibrotiques ont un phénotype différent des cellules de muscles contrôles (capacité proliférative, sensibilité au TGFβ, sécrétion, impact sur la fusion et la régénération). Notre étude met en évidence l’importance de la communication entre types cellulaires au sein du muscle, en particulier du muscle fibrotique et dystrophique. Actuellement, de nombreuses stratégies anti-fibrotiques se développent mais aucune n’a encore été capable de réduire une fibrose pré-existante. Nous avons comparé 10 sérotypes d’AAV par injection intramusculaire afin d’évaluer si un sérotype était capable de transduire les fibroblastes in vivo et si la fibrose gênait la transduction des fibres musculaires. Puis, nous avons testé le potentiel anti-fibrotique d’un AAV-Relaxine sur des souris DBA/2-mdx, modèle pour DMD. L’ensemble de ce travail permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes en jeu dans la fibrose musculaire et de développer des thérapies efficaces
Fibrosis is described as an excessive accumulation of extracellular matrix proteins that replace tissue and alter its function. In skeletal muscle, fibrosis is a pathological feature common to many dystrophies including Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD) and Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). In many tissues, resident cells called fibroblasts seem to have a key role in establishing and maintaining fibrosis, however, the exact nature and role of these cells in human muscle fibrosis are still very poorly defined. In this context, we characterized the non-myogenic cell population (CD56- cells) of control and fibrotic muscles and showed that CD56- fibrotic muscle cells have a different phenotype than control muscle cells (proliferative capacity, sensitivity to TGF-β, secretion, impact on fusion and regeneration). Our study highlights the importance of the cross-talk between cell types within the muscle, especially fibrotic and dystrophic muscle. Currently, many anti-fibrotic gene therapy strategies are being developed but while most of them prevent the apparition of fibrosis, none has yet been able to revert pre-existing fibrosis. In this context, we first compared 10 serotypes of AAV by intramuscular injection to evaluate whether one of these serotype was able to transduce fibroblasts in vivo and whether fibrosis impair the transduction of muscle fibers. Then we tested the anti-fibrotic therapeutic potential of AAV-Relaxin (RLN) on DBA/2-mdx mice, model for DMD. Altogether these studies will allow us to improve our understanding of the pathophysiological mechanisms involved in muscle fibrosis and to develop effective anti-fibrotic strategies

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique causée par l’absence de dystrophine et provoquant une dégénérescence musculaire sévère. Aucun traitement curatif n’existe aujourd’hui mais la thérapie génique par vecteur AAV est l’une des stratégies les plus prometteuses pour traiter la DMD. Malgré l’efficacité bien établie de l’AAV de sérotype 8 (AAV8) pour le transfert de gène dans le muscle, de fortes doses de vecteurs sont nécessaires pour obtenir une efficacité thérapeutique dans des modèles animaux de la DMD. Dans ce contexte, j’ai étudié les mécanismes qui peuvent limiter l’efficacité de transduction du vecteur AAV8 dans le muscle dystrophique. Pour cela, j’ai étudié le devenir du vecteur AAV dans le muscle DMD puis caractérisé le système endosomal, essentiel au transport et la maturation des vecteurs AAV, dans différents modèles de la DMD. Mes résultats ont montré que l’efficacité de transduction de l’AAV8 est plus faible dans les cellules musculaires DMD comparées aux contrôles. De plus, la dérégulation du système endosomal dans la DMD peut impacter le transfert de gène par vecteur AAV dans ces cellules. Par ailleurs, l'amélioration de l'efficacité des vecteurs AAV en thérapie génique nécessite aussi une meilleure connaissance des protéines cellulaires qui interagissent avec le génome viral et qui régulent son expression. Dans ce contexte, nous avons montré que les facteurs de transcription RFX1 et RFX3 sont capables d’interagir avec la région ITR du génome viral et de moduler l’expression des vecteurs AAV
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a genetic disorder caused by the absence of dystrophin and causing severe muscle degeneration. No curative treatment exists today but AAV-based gene therapy is one of the most promising strategies for treating DMD. Despite the well-established efficacy of AAV serotype 8 (AAV8) for gene transfer into muscle, high doses of vectors are required to achieve therapeutic efficacy in DMD animal models. In this context, I aimed at investigating the mechanisms that may limit the transduction efficiency of the AAV8 vector in dystrophic muscle. For this, I studied the fate of the AAV vector in the DMD muscle and then characterized the endosomal system, essential for the transport and maturation of AAV vectors, in different models of DMD. We have shown that the transduction efficiency of AAV8 is lower in DMD muscle cells compared to controls. The dysfunction of the endosomal system identified in this study may impact AAV vector gene transfer into these cells. Moreover, improving the efficiency of AAV vectors in gene therapy also requires a better understanding of cellular proteins that interact with the viral genome and regulate its expression. In this context, we have shown that the transcription factors RFX1 and RFX3 are able to interact with the ITR region of the viral genome and to modulate the expression of AAV vectors