Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Mycobacterium tuberculosis – Résistance aux antibiotiques“

Mycobacterium abscessus est une bactérie non tuberculeuse, environnementale, à croissance rapide, qui est responsable d’infections pulmonaires sévères, notamment chez les patients atteints de mucoviscidose. Le traitement actuel combine l’utilisation d’une b-lactamine et d’un aminoglycoside associés à un macrolide. Cette bactérie est polyrésistante à la plupart des antibiotiques utilisés en clinique. Les mécanismes de résistance, innés ou acquis, qu’elle a développés, conduisent fréquemment à des échecs thérapeutiques, ce qui limite considérablement les moyens de lutte disponibles pour le clinicien. Une compréhension globale des mécanismes de résistance de cette bactérie s’avère ainsi nécessaire pour contrer les infections pulmonaires qu’elle provoque.

Context and objective : In endemic regions such as the Democratic Republic of the Congo, children are likely to be exposed to tuberculosis (TB) through close contact. Failure to diagnose can have devastating consequences. The objective of the present study was to determine the frequency of TB and the primary resistance of Mycobacterium tuberculosis strains to antituberculosis drugs as well as genetic variants. Methods. The study is cross-sectional and descriptive carried out between June 2011 and December 2017 in Kinshasa among children presumed to have TB. Were included, children with the suggestive signs of TB appearing in the age group of 0-14 years. Samples were examined by Ziehl-Neelsen and cultured on Löwenstein-Jensens medium. The strains were tested for anti-tuberculosis drugs by the technique of proportions and typed by the technique of spoligotyping. The difference in frequency distribution was carried out by the chi-square test. Results. Forty-eight strains of M. tuberculosis (15.4 %) out of 312 cultures launched were isolated. Ten strains (20.8 %) out of 48 isolated were resistant to at least one antituberculosis drug, most frequently isoniazid (INH). Among the isolated strains, 2 (4.2%) were resistant to rifampicin including 1 MR-TB and 1 preXDR strain. Two genotypic strains were observed, namely, LAM (66, 7%) and Haarlem (33, 3%). Conclusion. Active search confirms that childhood TB is relatively common and resistant to at least one anti-tuberculosis drug (especially INH) Contexte et objectif. Dans les régions endémiques y compris la République Démocratique du Congo, les enfants sont susceptibles d’être exposés à la tuberculose (TB) par un contact dans l’entourage. L’absence de diagnostic peut avoir des conséquences dévastatrices. L’objectif de la présente étude était de déterminer la fréquence de TB, la résistance primaire des souches de Mycobacterium tuberculosis aux antituberculeux ainsi que des variants génétiques. Méthodes. Cette étude transversale et descriptive a été réalisée, entre juin 2011 et décembre 2017, à Kinshasa chez les enfants présumés TB. Les enfants ayant les signes évocateurs de TB figurant dans la tranche d’âge de 0-14 ans étaient inclus. Les échantillons ont été examinés par le Ziehl et mis en culture sur le milieu de Löwenstein-Jensens. Les souches étaient testées aux antituberculeux par la technique des proportions et typées par Spoligotyping. La comparaison des proportions a été faite à l’aide du test de chi-carré de Pearson. Résultats. Quarante-huit souches de Mycobacterium tuberculosis (15,4 %) ont été isolées. Dix souches (20,8%) étaient résistantes à au moins un antituberculeux plus fréquemment à l’INH. Le génotype LAM (66,7 %) et Haarlem (33,3%) était observé. Conclusion. La recherche active de TB infantile confirme qu’elle est relativement fréquente et est résistante à au moins un antituberculeux (surtout à l’INH).

Mon projet visait à décrire et caractériser l'émergence chez Mycobacterium tuberculosis de la résistance à la bédaquiline (BDQ). Dans une première étude, nous avons réalisé un test de fluctuation in vitro et adapté celui-ci pour la première fois in vivo dans des souris immunocompétentes et des souris immunodéprimées. Nous avons mis en évidence que l’immunodépression semblait augmenter le risque d’émergence de résistance mais cette augmentation ne serait pas due à une augmentation du taux de mutation mais à une hétérogénéité plus grande au sein de cette population avec des individus s’éloignant beaucoup des valeurs moyennes et hébergeant de grandes quantités de mutants. Dans un second travail, nous avons décrit le premier cas européen de sélection de résistance à la BDQ par mutation atpE. Enfin, nous avons réalisé une étude rétrospective de la sensibilité à la BDQ parmi toutes les souches MDR isolées en France entre 2018 et 2020. Une analyse génotypique et phénotypique a permis de mettre en évidence que des souches mutées sont classées phénotypiquement sensibles selon les critères actuels de l’OMS et que ces souches sont un mélange de souches sans augmentation de la CMI et de souches avec une minime augmentation de la CMI ne faisant pas classer la souche comme résistante. Pour conclure, nous avons montré que les travaux classiquement réalisés in vitro pour mesurer le taux de mutation ne donnent qu’une idée simplifiée de la complexité de l’émergence de la résistance in vivo. Nos travaux ont aussi montré qu’il est difficile avec les outils génotypiques et phénotypiques actuels de distinguer les souches de Mycobacterium tuberculosis sensibles des souches résistantes à la BDQ
The aim of my project was to describe and characterise the emergence of bedaquiline (BDQ) resistance in Mycobacterium tuberculosis. In a first study, we performed an in vitro fluctuation test and adapted it for the first time in vivo in immunocompetent and immunosuppressed mice. We found that immunosuppression appeared to increase the risk of resistance emergence, but this increase was not due to an increase in the mutation rate but to greater heterogeneity in this population, with individuals deviating significantly from the mean values and harbouring large numbers of mutants. In a second work, we described the first European case of selection for BDQ resistance by atpE mutation. Finally, we performed a retrospective study of BDQ susceptibility among all MDR strains isolated in France between 2018 and 2020. Genotypic and phenotypic analysis showed that mutated strains are classified as phenotypically susceptible according to the current WHO criteria and that these strains are a mixture of strains with no increase in MIC and strains with a minimal increase in MIC that do not classify the strain as resistant. In conclusion, we have shown that the work classically performed in vitro to measure mutation rate only gives a simplified idea of the complexity of the emergence of resistance in vivo. Our work has also shown that it is difficult with current genotypic and phenotypic tools to distinguish between Mycobacterium tuberculosis strains that are susceptible and those that are resistant to BDQ

La tuberculose (TB) est, hors COVID, la première cause de décès lié à un agent infectieux. La détermination rapide du profil de résistance complet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est essentielle pour démarrer un traitement adapté dans les cas de TB multirésistante (MDR) et ainsi limiter l’acquisition de résistances supplémentaires, augmenter les chances de succès thérapeutique et réduire la transmission de ces souches. Il existe 9 lignées principales au sein du complexe M. tuberculosis, dont 2 sont largement répandues dans le monde (L2 et L4). Au sein de la lignée 2, le clone W148 (ou complexe clonal CC 100-32) a diffusé récemment en Europe et en Asie. Cette diffusion pourrait s'expliquer par des mutations spécifiques au sein du génome.En premier lieu, nous avons étudié la technologie Deeplex Myc-TB pour détecter rapidement le génotype et la résistance des souches cliniques de Mtb MDR. Cette technologie, basée sur une PCR multiplex et un séquençage haut débit, détermine à la fois l’espèce (hsp65), le génotype (spoligotype) et la résistance à 13 antituberculeux de première et seconde ligne (18 cibles). Le travail d’évaluation a inclus 112 prélèvements et 94 souches adressés au Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). Nous avons observé que le test Deeplex Myc-TB fonctionne sur prélèvement positif à l’examen microscopique et sur souche. Les profils de résistance obtenus sont concordants à 85,4% avec les résultats de la méthode phénotypique de référence. L'utilisation de Deeplex Myc-TB fournit des résultats en une dizaine de jours, soit environ 6 semaines avant ceux de l’antibiogramme phénotypique. Deeplex Myc-TB permet donc d’adapter l’antibiothérapie bien avant que ce qui était fait jusqu’à présent, pour le bénéfice des patients. Nous avons ainsi pu valider cet outil maintenant utilisé en routine au CNR MyRMA. Nous avons ensuite étudié les mutations spécifiques du CC 100-32 MDR. L’analyse du génome complet de 36 souches reçues au CNR MyRMA a permis d’identifier 30 mutations non synonymes et petites délétions spécifiques. Parmi elles, nous avons choisi d’étudier celles présentes dans kdpD et whiB6, car des données de la littérature semblent montrer un impact de ces gènes sur la virulence de la souche. KdpDE est un système à deux composants régulant l’expression du système de transport du potassium inductible KdpFABC. La mutation présente dans le complexe CC 100-32 MDR est une délétion de 2 nucléotides à la fin du gène kdpD entraînant une protéine de fusion KdpDE. Nous avons donc construit un tel mutant chez Mtb H37Rv en supprimant les deux gènes kdpD et kdpE avant de le complémenter avec la forme sauvage ou mutée de kdpDE. Nous n’avons pas observé de différence de croissance in vitro des différentes souches, y compris en l’absence de potassium, suggérant que KdpDE n’est pas essentiel pour le fitness de la bactérie en présence et absence de potassium. L’étude de l’impact de la délétion sur l’activité transcriptionnelle et la virulence est en cours. D’autre part, WhiB6 est un facteur de transcription qui régule le système ESX-1, nécessaire à la virulence. Des travaux du laboratoire ont permis d'obtenir le mutant ∆whiB6 et les souches complémentées WT et mutée (T51P) et leur ré-analyse indique que la souche mutée T51P entraîne une production d’ESAT-6 et de cytokines pro-inflammatoires plus faible que la souche sauvage ; nous réalisons actuellement une analyse du transcriptome. Les premiers résultats obtenus semblent indiquer que la mutation T51P dans WhiB6 entraîne moins de virulence et d’inflammation. Ce travail a permis de valider un outil maintenant indispensable au diagnostic des TB MDR en routine au CNR MyRMA et d’étudier la diffusion d’un clone MDR à travers les fonctions de deux facteurs de transcription impliqués dans la virulence
Tuberculosis (TB) is, excluding COVID, the leading cause of death linked to an infectious agent. Rapid determination of the full resistance profile of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is essential to initiate appropriate treatment of multidrug resistant (MDR) cases, thereby limiting the acquisition of additional resistance, increasing the chances of therapeutic success and reducing transmission of these strains. There are 9 main lineages within the M. tuberculosis complex, 2 of which are widespread throughout the world (L2 and L4). Within lineage 2, the clone W148 (or clonal complex CC 100-32) has recently spread to Europe and Asia. This spread could be explained by specific mutations within the genome.First, we investigated the Deeplex Myc-TB tool for rapid detection of genotype and resistance in clinical Mtb MDR strains. The Deeplex Myc-TB technology, based on multiplex PCR and high-throughput sequencing, determines species (hsp65), genotype (spoligotype) and resistance to 13 first- and second-line anti-tuberculosis drugs (18 targets). Our evaluation included 112 samples and 94 strains sent to the Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). We have observed that the Deeplex Myc-TB test is efficient on microscopically positive samples and strains. The resistance profiles obtained are 85.4% concordant with the results of the phenotypic reference method. The use of Deeplex Myc-TB provides results within ten days, and around 6 weeks before those of the phenotypic antibiogram. Deeplex Myc-TB can therefore be used to adapt antibiotic therapy much earlier than was previously possible, to the patient benefit. We were thus able to validate this tool, which is now routinely used at CNR MyRMA. We next studied mutations specific to CC 100-32 MDR. Genome-wide analysis of 36 strains received at CNR MyRMA identified 30 non-synonymous mutations and small deletions specific to CC 100-32 MDR strains. Among these, we chose to study mutations present in kdpD and whiB6, as data in the literature indicated an impact of these genes on the virulence of the strain. On the one hand, KdpDE is a two-component system regulating expression of the inducible potassium transport system KdpFABC. The mutation present in the CC 100-32 MDR complex is a 2-nucleotides deletion at the end of the kdpD gene, resulting in a KdpDE fusion protein. We therefore constructed such a mutant in Mtb H37Rv by deleting both the kdpD and kdpE genes before complementing it with the wild-type or mutated form of kdpDE. We observed no difference in the in vitro growth of the different strains, even in the absence of potassium, suggesting that KdpDE is not essential for bacterial fitness in presence or absence of potassium. The impact of the deletion on transcriptional activity and virulence is currently being studied. On the other hand, WhiB6 is a transcription factor that regulates the ESX-1 system, necessary for virulence. Work from the laboratory generated a ∆whiB6 mutant and the complemented WT and mutated (T51P) strains and their re-analysis indicated that T51P mutant strain produces less ESAT-6 and pro-inflammatory cytokines than the wild-type strain. Our transcriptome analysis of these strains is currently underway. Initial results suggest that the T51P mutation in WhiB6 results in less virulence and inflammation. This work has validated a tool that is now essential for routine diagnosis of MDR TB at CNR MyRMA, and to study the spread of an MDR clone through the function of two transcription factors involved in virulence

La polymérase d'A.R.N. la protéine obligatoire (le RbpA) est l'activateur transcriptional global (mondial) de l'espèce actinomycetes qui est essentielle pour la croissance et qu'augmente la tolérance de bactéries aux antibiotiques. RbpA de la tuberculose Mycobacterium (Mtb) stimule spécifiquement la transcription par la polymérase d'A.R.N. (RNAP) contenant σA ou les sous-unités σB, mais aucune de la 11 autre alternative σ des facteurs. Il a été rapporté que le fonctionnement de RbpA est dépendant de promoteur et c'est indispensable pour le déroulement de promoteur du promoteur sigAP constitutif.Pour déchiffrer la nature de spécificité de promoteur de RbpA, nous avons utilisé des essais biochimiques, mutagensis et des approches de génomique. Nous avons identifié ce remplacement 'TG' le motif entre-14 à-17 positions (postes) dans le promoteur sauvage-type sigAP fait la transcription indépendante de RbpA. Aussi, nous avons montré que la capacité d'augmentations de RbpA de RNAP pour fondre le promoteur sigAP aux températures sous-optimales et stabilise des complexes de promoteur. Mutational l'analyse de résidus d'acide aminé H166 et E169 dans la région σB 3.0 (σR3.0) a démontré une implication de σR3.0 dans la stabilisation RbpA-servie-d'intermédiaire de complexes de promoteur RNAP. Plus loin, la substitution à RbpA au résidu d'acide aminé R79 a affecté la stabilité complexe de promoteur, tandis que les substitutions à RbpA resdiues K73, K74 a affecté l'initiation de transcription. Cependant, aucun des mutants RbpA n'a étudié l'ouverture ici affectée de l'ADN de promoteur par RNAP. Les rôles différentiels joués par ces résidus RbpA dans la stabilisation de complexe de promoteur et l'initiation de transcription ensemble avec l'effet produit par les mutations σB suggèrent l'implication de R3.0 σB dans l'action de RbpA. Ensuite, nous avons exécuté la large de génome cartographie des gènes RbpA-dépendants du σB regulon en utilisant une Analyse de Puce à ADN de Finale(d'Écoulement) in vitro (des ROMS). L'analyse ROM a montré la preuve claire de 15 augmentation de pli du nombre de gènes activés par σB-RNAP en présence de RbpA. L'analyse de bio-informatique de 140 gènes contrôlés par la paire de RbpA-σB nous a permis d'identifier la signature caractéristique dans le-10 consensus ('TANNNT') spécifique à la sous-unité σB.Notre étude sur l'impact d'échelle de génome de RbpA, ensemble avec le déchiffrement du mécanisme moléculaire d'action de RbpA, souligne une importance de l'interaction entre σR3.0 et RbpA dans la transcription Mtb. Basé sur nos résultats nous proposons que RbpA puisse jouer un rôle du remplacement(remplaçant) fonctionnel pour-10 motifs prolongés(étendus) dans l'espèce mycobacterium
RNA polymerase binding protein A (RbpA) is global transcriptional activator from actinomycetes species which is essential for growth and which increases tolerance of bacteria to antibiotics. RbpA from Mycobacterium tuberculosis (Mtb) specifically stimulates transcription by RNA polymerase (RNAP) containing either the σA or σB subunits but none of the other 11 alternative σ factors. It has been reported that the functioning of RbpA is promoter-dependent and it is indispensible for promoter unwinding of the constitutive sigAP promoter. To decipher the nature of promoter specificity of RbpA, we used biochemical assays, mutagensis and genomics approaches. We found that placing ‘TG-motif' between -14 to -17 positions in sigAP wild-type promoter makes transcription independent of RbpA. Also, we have shown that RbpA increases ability of RNAP to melt sigAP promoter at sub-optimal temperatures and stabilises promoter complexes. Mutational analysis of amino acid residues H166 and E169 in the σB region 3.0 (σR3.0), interacting with TG-motif, demonstrated an implication of σR3.0 in RbpA-mediated stabilisation of RNAP promoter complexes. Substitution in RbpA at amino acid residue R79 affected the promoter-complex stability, while the substitutions at RbpA resdiues K73, K74 affected the transcription initiation. However, none of the RbpA mutants studied here affected opening of the promoter DNA. The differential roles played by these RbpA residues in promoter complex stabilization and transcription initiation together with the effect produced by the σB mutations suggest the implication of σR3.0 in RbpA action. Next, we performed genome-wide cartography of the RbpA-dependent genes from the σB regulon by using an in vitro RunOff Microarray Analysis (ROMA). ROMA analysis has shown clear evidence of 15 fold increase in the number of genes activated by σB-RNAP in the presence of RbpA. Bioinformatics analysis of 140 genes controlled by RbpA-σB pair allowed us to identify characteristic signature in the -10 consensus (‘TANNNT’) specific to σB subunit. Our study underlines an importance of the interplay between σR3.0 and RbpA in Mtb transcription. Based on our results we propose that RbpA may play a role of functional replacement for TG-motif of the extended -10 elements in mycobacterium species

Le phénomène émergent de la tuberculose multirésistante et ultrarésistante est un problème de santé publique à l’échelle mondiale. Dans les pays en développement, ce problème est accru du fait que les laboratoires de diagnostic de la tuberculose manquent d’équipement et d’outils de diagnostics pour identifier ces cas pour prescrire une chimiothérapie adaptée. La première partie de ce travail de doctorat a permis à travers le séquençage du locus pncA, de mettre en évidence que la résistance au Pyrazinamide survient généralement et de manière significative lorsque la souche est multirésistante, c’est-à-dire après l’acquisition de la résistance à la Rifampicine et à l’Isoniazide. Le pourcentage des souches résistantes au PZA est même plus élevé chez les souches MDR résistantes aux FQs. Dans la seconde partie de l’étude, nous proposons une méthode alternative à la culture de bacilles dans un environnement confiné de type P3. À partir d’échantillons cliniques non cultivés (expectoration) et grâce au GeneXpert MTB/RIF, au séquençage de gènes et au spoligotypage, nous avons pu identifier 19 souches multirésistantes, une transmission active de souches sensibles appartenant aux clades LAM10, T1, MANU, H3 et enfin une épidémie sous-jacente de 5 souches Beijing multirésistantes
The emerging phenomenon of the MDR and XDR-TB is a worldwide public health issue. In developing countries, this problem is amplified due to the fact that TB diagnostic laboratories lack equipment and diagnostic tools to identify these cases and therefore prescribe appropriate chemotherapy. In the first part of this doctoral work, the sequencing of the pncA gene allowed us to show that the resistance to Pyrazinamide occurs significantly when the strain is MDR, corresponding to the acquisition of resistance to Rifampicin and Isoniazid; and that after the acquisition of Fluoroquinolones and to injectable antibiotics of second line (Amykacine, Kanamycine, Capreomycine) resistance by MDR strains, this rate increases even more. In the second part of the study, we propose an alternative method to the culture of bacilli in a BSL3 confined environment. From uncultivated clinical samples (sputum) and through GeneXpert MTB/RIF, sequencing of genes and spoligotyping, we identified 19 MDR strains, active transmission of sensitive strains belonging to clades LAM10, T1, MANU, H3 and finally as well as an underlying epidemic of 5 Beijing MDR strains.In the first study, 272 retrospective samples of Mycobacterium tuberculosis isolates were selected from two large cosmopolitan cities: Northern Paris (Bichat-Claude Bernard Hospital, 101 strains) and Southwest of Shanghai (Songjiang district, 171 Strains). These strains were selected according to their known phenotypic sensitivity to Rifampicin (RIF) and Isoniazid (INH). These phenotypic resistances were confirmed by the HAIN genotype analysis tools MTBDRplus and by the sequencing of the rpoB and katG/inhA genes. To determine the extensively drug resistance strains (XDR), we sequenced the gyrA/gyrB and rrs genes to identify genetic mutations associated with resistance to Fluoroquinolones (FQs) and second-line injectable antibiotics: Amikacin (AMK)-Kanamycin ( KAN)-Capreomycin (CAP), respectively. Finally, we sequenced the pncA gene of all isolates to identify the genetic mutations associated with resistance to Pyrazinamide (PZA). The strains were genotyped by spoligotyping and MIRU-VNTR.In the second study, from October 2014 to February 2015, 159 morning sputum samples with smear-positive smear after Ziehl-Neelsen staining were collected at the three main diagnostic laboratories for tuberculosis in Libreville, Gabon. These clinical samples were transported to the National Laboratory of Public Health in Libreville for analysis with the GeneXpert MTB/RIF automaton to confirm the microscopic diagnosis and to determine the resistance of bacilli to Rifampicin. Of the 159 samples, 29 samples had a sputum volume less than 1 ml, the minimum required according to the manufacturer's recommendations. For the 130 sputum samples analyzed by the GeneXpert automaton, 375 μl of the remaining GeneXpert solution not introduced into the cartridge was introduced into a 50 ml conical tube containing 25 ml of phosphate buffer (autoclaved solution) to neutralize the pH of the GeneXpert solution. The conical tube is centrifuged for 15 minutes at 4,500 rpm, the pellet is taken up in 100 μl of TE and then transferred to a 100 μl microtube which is subsequently heated for 30 minutes at 90°C. After a cycle of freezing (-40 ° C. for 1 h)-defrosting, the microtube is briefly centrifuged and the supernatant is transferred to a new microtube. From this new microtube we amplified by PCR and then sequenced the rpoB, katG/inhA, pncA, gyrA, rrs and rpsL genes to identify mutations associated with resistance to Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamide, Fluoroquinolones, Antibiotics in second lines: Amikacin-Kanamycin-Capreomycin and Streptomycin (SM), respectively. All the samples were genotyped by the multiplexed spoligotyping applied to the Luminex MagPix

Malgré la disponibilité d’un traitement curatif et un vaccin largement utilisé, l’OMS estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l’agent étiologique de la tuberculose, et qu’environ 2 millions de personnes en meurent chaque année. La compréhension de l’épidémiologie de la tuberculose et les actions de contrôle de la maladie ont été, récemment, compliquées par l’émergence de bacilles tuberculeux résistants aux antibiotiques et par la synergie fournie par la co-infection avec le VIH. Une tendance alarmante pour la santé publique est l’émergence de souches résistantes à plusieurs antibiotiques (multi-résistantes, MDR), définies comme des isolats résistants au moins à l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), les deux agents anti-tuberculeux les plus puissants.

La sélection de mutants résistants se produit chez le patient lorsque les taux d’antibiotiques présents dans le corps sont sub-thérapeutiques ou lorsque la thérapie est inappropriée. Un des facteurs favorisant est l’exceptionnelle durée de la chémothérapie. Le besoin de maintenir des taux élevés d’antibiotiques pendant des mois, combiné avec la toxicité inhérente des agents, résultent en une observance incomplète du traitement par le patient et le risque d’acquérir des résistances. La résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis résulte d’altérations dans des gènes chromosomiques spécifiques. Les causes génétiques de la résistance ont été définies pour certains antibiotiques bien que plusieurs inconnues persistent.

Le présent travail a consisté en l’étude du problème de la résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux par différentes approches :l’analyse génétique des mécanismes de résistance, l’évaluation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules et la caractérisation du profil de résistance de souches cliniques.

L’acide p-aminosalicylique (PAS) est un antibiotique bactériostatique de deuxième ligne dont le mécanisme d'action sur le bacille tuberculeux est incompris. Récemment, en utilisant la mutagenèse par transposon, la résistance au PAS fut associée à des mutations de la thymidylate synthase encodée par le gène thyA. Suite à cette découverte, nous avons entrepris une étude moléculaire de souches cliniques et de mutants spontanés résistants au PAS. Des mutations du gène thyA furent identifiées chez seulement 37% des souches. En tout, vingt-quatre mutations différentes furent identifiées dans le gène thyA. Les séquences nucléotidiques de cinq autres gènes de la voie de synthèse du folate et de la thymine (dfrA, folC, folP1, folP2, et thyX) ainsi que de 3 gènes encodant des N-acétyltransférases (nhoA, aac1 et aac2) furent également analysées mais aucune mutation associée à la résistance au PAS n’a pu être mise en évidence. L’utilisation de techniques bioinformatiques de prédiction structurelle révèle que les mutations identifiées affectent soit la structure soit le site fonctionnel de ThyA. L’étude des profils de croissance des organismes résistants au PAS nous permit de constater que les organismes porteurs d’une mutation de la protéine ThyA présentent un profil de croissance constant en présence de concentrations croissantes de PAS. Les organismes résistants au PAS possédant une protéine ThyA sauvage répondent, quant à eux, aux concentrations croissantes de PAS de façon dose-dépendante, indiquant que le(s) mécanisme(s) alternatif(s) de résistance au PAS est (sont) dose-dépendant(s).

La thymidylate synthase est également une des cibles du 5-fluorouracil (5-FU), l’agent chimiothérapeutique le plus largement utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé. Etant donné l’augmentation du nombre de souches résistantes de M. tuberculosis, de nouveaux composés anti-tuberculeux sont nécessaires de façon urgente. Ici, nous avons évalué l’efficacité in vitro et in vivo du 5-FU sur M. tuberculosis. La concentration minimale inhibitrice du 5-FU fut déterminée sur une collection de souches cliniques sensibles et multi-résistantes ainsi que sur des mutants spontanés résistants au PAS. Tous les isolats montrèrent une sensibilité au 5-FU à des concentrations allant de 0.4 à 1.8 µg/ml, et ce indépendamment de leur profil de sensibilité/résistance aux agents anti-tuberculeux actuels. Les études in vivo du 5-FU (sur un modèle murin de tuberculose active) montrèrent une efficacité de celui-ci durant les deux premières semaines de traitement puis une perte d’activité à la troisième semaine, vraisemblablement engendrée par les effets secondaires du 5-FU.

L’éthionamide (ETH) est un autre antibiotique de deuxième ligne dont l’utilisation est limitée aux tuberculoses multi-résistantes étant donné les effets secondaires qu’il engendre. Ces dernières années, les études ont montré que l’ETH est un pro-médicament, transformé en forme active par l’enzyme monooxygénase EthA dont l’expression est contrôlée par le répresseur transcriptionnel EthR. Notre étude décrit l’élaboration d’inhibiteur d’EthR capable d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’ETH suite à l’amélioration de son activation. Les composés synthétisés et sélectionnés pour leur capacité à inhiber l’interaction EthR-ADN furent co-cristallisés avec EthR. Les structures tridimensionnelles des complexes furent utilisées pour la synthèse d’analogues capables d’améliorer la puissance de l’ETH en culture. Les molécules les plus prometteuses furent testées sur un modèle murin de tuberculose. Pour un des inhibiteurs d’EthR testés, nous avons montré que sa co-administration avec l’ETH permet une réduction de la dose d’ETH utilisée de 3 fois, pour l’obtention d’une même réduction de charge mycobactérienne pulmonaire. Ce travail démontre la possibilité d’augmenter l’index thérapeutique de l’éthionamide en agissant pharmacologiquement sur le mécanisme régulateur de son activation.

Dans certaines régions du monde, le problème de la multi-résistance devient très présent. Nous avons étudié l’état de la situation à Mourmansk (Fédération russe), une région à haute incidence de tuberculose. La résistance aux antibiotiques et l’épidémiologie moléculaire de la tuberculose furent étudiées sur des isolats collectés en 2003 et 2004 dans cette région. Une extrêmement haute prévalence de tuberculose multi-résistante (MDR-TB) fut constatée à la fois pour les nouveaux cas (primaires) (26%) et les cas précédemment traités (72.9%). Le typage des souches MDR primaires révèle une appartenance au génotype Beijing pour la plupart des isolats (79.8%) et l’homogénéité génétique des souches suggère une transmission active au sein de la population. L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans la résistance à l’INH et à la RIF montre la présence des mutations katG codon 315 et rpoB codon 531 chez, respectivement, 98,2% et 76,3% des isolats MDR-TB primaires. La haute fréquence de ces mutations « communes » suggère la possible utilisation de tests moléculaires ciblant spécifiquement ces mutations pour détecter rapidement la plupart des cas de MDR-TB.

Nos travaux illustrent les différentes voies à suivre pour maitriser le problème de la résistance aux antibiotiques :l’élucidation des mécanismes de résistance, le développement de nouveaux médicaments et la détection rapide des cas de résistance.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Ce manuscrit décrit la distribution géographique des génotypes de Mycobacterium tuberculosis dans une large partie de la Chine, et l'étude d'une éventuelle corrélation avec la vaccination BCG et la résistance aux antibiotiques. La prévalence de la résistance a été analysée dans 10 provinces, et les mutations responsables de la résistance à la rifampicin et à l'INH ont été recherchées. La distribution des différents génotypes a été analysée par spoligotypage, par l'identification de délétions génomiques et par l'analyse du polymorphisme de répétitions en tandem (MLVA). Le génotype Beijing représente 55 à 93% des souches dans les provinces étudiées, avec un gradient allant du Sud vers le Nord de la Chine. Plusieurs autres familles sont identifiées, toutes appartenant à la clade dite " Moderne ". Les familles " Chine 2 " et " Chine 3 " qui représentent l'essentiel des autres souches sont rares en dehors de la Chine. Quelques souches de la famille CAS (Central Asia) sont également rencontrées dans une province et un ancêtre possible de la lignée Beijing dans une autre. La prévalence de la résistance aux antibiotiques a été mesurée parmi plus de 2000 isolats de 10 provinces. Le pourcentage de souches résistantes à au moins une drogue est de 45% et celui des souches multirésistantes est d'environ 29%. En Chine, à la différence d'autres pays, aucune corrélation n'est observée entre le génotype Beijing et la vaccination BCG. La distribution des mutations du gène rpoB a été déterminée ainsi que les mutations responsables de la résistance à l'INH. Aucune mutation n'est observée dans les gènes oxyR et ahpC. Cette étude est la première étude de grande envergure effectuée en Chine sur la diversité génétique de M. tuberculosis et sur les mécanismes de résistance aux antibiotiques.

La tuberculose est une maladie provoquée par Mycobacterium tuberculosis habituellement traitée par l’association de rifampicine, d’isoniazide, de pirazinamide et d’éthambutol pendant 6 mois. Des problèmes d’observances ont favorisé l’émergence de souches ultra résistantes (XDR). Les bêta-lactamines n’ont jamais été utilisées contre M. Tuberculosis à cause de la production par la bactérie d’une bêta-lactamase de classe A, BlaC. Nous avons montré que BlaC est capable d’hydrolyser toutes les classes de bêta-lactamines, analysé l’inhibition de BlaC par l’acide clavulanique, le tazobactam et le sulbactam, et montré que l’acide clavulanique est un inhibiteur irréversible de l’enzyme. Nous avons évalué l’efficacité d’une association d’acide clavulanique et de -lactamines contre des souches sensibles et XDR. Le méropénème, en combinaison avec l’acide clavulanique, est bactéricide sur les bacilles en réplication active ainsi que dans un modèle de dormance. La cible du méropénème pourrait être une L,D-transpeptidase, l’enzyme clé d’une nouvelle voie de synthèse du peptidoglycane que nous avons caractérisé chez Enterococcus faecium. Cette voie implique l’activation d’une métallo enzyme qui fournit le substrat d’une L,D transpeptidase (Ldtfm), responsable de la formation de ponts interpeptidiques de type 3-3 dans le peptidoglycane. Nous avons montré que cette enzyme était inactivée par les carbapénèmes. Comme le peptidoglycane de M. Tuberculosis est majoritairement constitué de ponts 3-3 et que cinq paralogues de la famille des L,D-transpeptidases sont présent dans son génome, ces enzymes pourraient être la cible du méropénème.

La tuberculose humaine demeure un problème majeur de santé publique. L'un des aspects les plus alarmants concernant la tuberculose, est l'émergence et la dissémination de souches M. Tuberculosis résistantes aux médicaments, en particulier les souches multi-résistantes (MDR) qui sont de graves menaces pour la lutte contre la tuberculose. La détection précoce de la résistance aux médicaments de M. Tuberculosis dans les isolats cliniques est essentielle pour un traitement approprié afin d'éviter la propagation des souches résistantes. La première partie de ce travail a comparé des tests moléculaires pour la détection de la résistance à la rifampicine (RIF) et à l'isoniazide (INH) par rapport au test conventionnel de sensibilité aux médicaments et le séquençage. Le test Génotype MTBDRplus semble être un outil fiable pour la détection d'INH et de RIF résistance dans des souches. En outre, ce travail a également confirmé que le spoligotype T2 est commun parmi les isolats MDR circulant en République Centrafricaine (RCA). Dans la deuxième partie, nous avons montré que contrairement à la souche de référence (H37Rv), les souches T2 induisent une réponse inflammatoire moins importante et nous avons observé que ces souches semblent toutes provenir d'un ancêtre commun. Enfin, nous avons évalué l'aspiration à l'aiguille fine (FNA) dans le diagnostic des adénopathies tuberculeuses chez les enfants. Cet outil a permis la détection de 67,2% des cas de tuberculose. Il s'agit d'une technique simple et non invasive capable de fournir des échantillons pour la confirmation bactériologique ou moléculaire de la tuberculose
Human tuberculosis remains a major public health problem. One of the most alarming trends concerning tuberculosis is the emergence and spread of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, especially multidrug-resistant (MDR) strains, which are serious threats to the control of tuberculosis. Early detection of M. Tuberculosis drug resistance in clinical isolates is crucial for appropriate treatment to prevent the development of further résistance and the spread of resistant strains. The first part of our study compare molecular tests for the detection of rifampin (RIF) and isoniazid (INH) resistant strains to conventional drug susceptibility testing (DST) and sequencing. Génotype MTBDRplus testing seems to be reliable tool for the detection of INH and RIF résistance in various strains. In addition, our work has also confirmed that T2 spoligotype is common among MDR isolates circulating in Central African Republic (CAR). Second, we studied the innate immune response by infecting in vitro human macrophages with T2 and other M. Tuberculosis strains. Our results show that, compared to reference strains (H37Rv), T2 strains induce a less inflammatory response. Sequencing identified SNPs carried by ail T2 strains suggesting a phylogenetic link. These preliminary results give an important information on chacteristics and pathogenicity of MDR strains in CAR. Finally, we assessed Fine-needle aspiration (FNA) in the diagnosis of tuberculous adenopathy in children. FNA allowed detection of 67. 2»% of TB cases. This tool is simple, cost-effective and non-invasive that provides samples that could be used for bacteriological or molecular confirmation of TB

Chez les patients traités par un régime posologique, La concentration sérique moyenne et l'écart type de la concentration SMX était 161,01 ± 69,154 mg/L et de 5,788 ± 2,74 mg/L pour le TMP. La concentration minimale inhibitrice 90% (CMI 90) était de 10 mg/L pour le cotrimoxazole et la sulfadiazine contre Mycobacterium tuberculosis. Toutes les mycobactéries étaient inhibées par 20 mg/L de cotrimoxazole et de sulfadiazine. Les CMI de l'ivermectine contre 13 souches complexe M. tuberculosis ont varié entre 10 et 40 mg/L. En outre, tous isoler M. tuberculosis étaient résistants à la squalamine avec CMI > 100 mg/L. Dans une autre partie nous avons montré que tous les isolats du complexe Mycobacterium avium étaient résistants au triméthoprime avec une CMI > 200 mg/mL. Le cotrimoxazole, le sulfaméthoxazole et la sulfadiazine ont montré une CMI respectivement de 10 mg/L, 25 mg/L et 20 mg/L, à l'exception de Mycobacterium chimaera qui présentait une CMI de 10 mg/L pour ces molécules. La comparaison de la séquence du gène de la dihydroptéroate synthase de M. intracellulare et M. chimaera a montré seulement quatre changements d'acides aminés
Firstly, we measured the serum concentration of Sulfamethoxazole (SMX)-Trimethoprim (TMP) in patients treated with high dosage regimen. The mean values and standard deviation for SMX concentration was 161.01± 69.154 mg/L and of 5.788 ± 2.74 mg/L for TMP. Susceptibility testing yielded a minimum inhibitory concentration 90% (MIC90) of 10 mg/L for cotrimoxazole and sulfadiazine. All M. tuberculosis complex mycobacteria (MTC) were inhibited by 20 mg/L cotrimoxazole and sulfadiazine. Also, the MICs of ivermectin varied between 10 and 40 mg/L, against 13 MTC mycobacteria. Moreover, all M. tuberculosis isolate were resistant to squalamine with MIC > 100 mg/L. Also, all Mycobacterium avium complex (MAC) isolates were resistant to trimethoprim with MIC > 200 mg/L. Cotrimoxazole, sulfamethoxazole and sulfadiazine exhibited MIC of 10 mg/L, 25 mg/L and 20 mg/L, respectively against all tested MAC isolates except for Mycobacterium chimaera which exhibited MICs of 10 mg/L for these molecules. Comparing the DHPS gene sequence in M. intracellulare and M. chimaera type strains and clinical isolates yielded only four amino acid changes