Dissertationen zum Thema „Modifications N-terminales des protéines“

Les modifications co- et post-traductionnelles affectant le N-terminal des protéines, conditionnent fortement leur capacité à réaliser leur activité biologique. Quatre modifications de ce type sont au centre de ce projet. : l’excision de la première méthionine des protéines (NME), la N-myristoylation (MYR), la N--acétylation (NAA) et la S-palmitoylation. Dans un premier temps l’exploitation de données expérimentales couvrant différents organismes et différents Règnes a permis d’élaborer des motifs de prédiction de la NME et la NAA. En parallèle, des analyses expérimentales concernant la MYR ont été menées avec deux NMTs d’origine animale et végétale sur un jeu de 288 peptides modèles. Environ 30% de ces peptides sont potentiellement positifs à la MYR. Mes données indiquent des différences de spécificité de substrat entre ces deux enzymes. Ces données n’ont pas permis d’aboutir à une prédiction plus fine de la MYR que celle utilisant des motifs. Enfin, des observations de l’impact de certains de ces peptides sur la localisation subcellulaire de la GFP, ont été effectuées. Ces analyses confirment que la MYR de la plupart des peptides efficacement modifiés in vitro se concrétise par une localisation à membrane de la protéine in vivo. Cette étude conforte mon approche in vitro et permet de mieux cerner les seuils relatifs à la capacité de telle ou telle protéine de subir ou non la MYR. L’ensemble de ces études de spécificité des quatre familles d’enzymes m’a permis d’élaborer une plateforme de prédiction : TermiNator (http://www. Isv. Cnrs-gif. Fr/terminator3/) permettant à tout protéome d’e��tre annoté aisément pour chacune de ces quatre modifications N-terminales
Co- and post-translational modifications strongly affect proteins final functionality. Among those, the most frequents are early modifications affecting the N-terminus of the protein. This work deals with four such : N-terminal methionine excision (NME), N-myristoylation (MYR), N--acetylation (NAA) and S-palmitoylation. On one side, my work consisted in managing some experimental data for different organisms coming from different kingdoms and elaborating predictive patterns for NME and NAA. On the other side, I performed experiments about MYR with two NMTs originating from the animal and plant kingdom on a 288 peptides set expected to sample the proteome diversity. About 30% were identified as potential MYR substrates. My data reveal specificity differences between the two enzymes. In the end, it was not possible to elaborate a more accurate predictive motif than the one already elaborated. In order to complete this work, I investigated the MYR impact on the subcellular localisation of some of those peptides. It could confirm that efficient MYR as evidenced in vitro induce in vivo localisation of the the protein in the membranes. Those in vivo results reinforce the significance of our in vitro analyse and help understanding myristoylation status of our different peptides. Specificity features of each of those modifications were used to elaborate the predictive platform TermiNator (http://www. Isv. Cnrs-gif. Fr/terminator3/). TermiNator is available for all the scientist community. Any proteome can be annotated for those four N-terminal modifications with this unique tool

Dans ce travail de thèse, nous avons développé et optimisé une stratégie originale pour la caractérisation des extrémités N-terminales des protéines et des sites de clivages protéolytiques. Elle s'appuie sur la dérivation chimique spécifique des amines N-terminales et nous l'avons adapté à différents types d'échantillons biologiques. L'application de cette stratégie dans des études en biologie nous a permis d'apporter plusieurs éléments de réponse à différentes problématiques. Nous avons ainsi caractérisé les peptides de transit des protéines mitochondriales humaines et ainsi validé/corrigé expérimentalement leurs prédictions dans les banques de données. Nous avons aussi appliqué cette stratégie à l'étude du protéome du parasite P. falciparum. La mise au point de la dérivation N-terminale de protéines immobilisées dans un gel SDS PAGE nous a permis d'étudier le mécanisme d'export des protéines de ce parasite vers sa cellule hôte et de déterminer le rôle des acides aminés impliqués dans cet export. Un réactif de dérivation marqué aux isotopes stables permet d'effectuer des études différentielles des processus protéolytiques que subissent les protéines. Cette stratégie quantitative a été appliquée à l'étude du protéome hépatique du rat soumis au jeûne expérimental. D'autres applications de l'analyse protéomique en biologie sont aussi présentées dans ce manuscrit.

L'étude des modifications post-traductionnelles a connu au cours des dernières années un regain d'intérêt notable. Tout d'abord car elle s'effectue aujourd'hui au travers d'approches basées sur la spectrométrie de masse, technique qui pendant cette période a connu de profonds bouleversements, conduisant à des études plus aisées et systématiques.Mais aussi car tant par leur variété que par le rôle qu'elles jouent dans la vie et la régulation cellulaire, ces modifications ne peuvent plus être négligées. Par ailleurs au cours de ces quinze dernières années, nous avons assisté concernant les procaryotes à un changement total de paradigme. En effet à la fin des années 90, l'idée dominante était que ces modifications pouvaient exister chez ceux-ci mais de façon très partielle et/ou très particulière.Dans ce travail, les divers degrés d'iodation de la tyrosine ont été sondés par une approche de type «shotgun » sur un organe entier, la thyroïde de souris. L'efficacité de ce type d'approche démontrée, les modifications post-traductionnelles potentiellement présentes dans des organismes modèles radiorésistants, la bactérie Deinococcus deserti et l'archée Thermococcus gammatolerans ont été analysées. Dans le premier cas, les données de protéomique montrent que de nombreuses acétylations N-terminales portent sur un motif spécifique (essentiellement des thréonines et sérines), cas très atypique pour une bactérie. Chez Thermococcus gammatolerans les acétylations N-terminales sont rares, mais la présence d'acétylations sur les chaînes latérales des lysines est notable. La présence de phosphorylations sur ces mêmes protéines, laisse entrevoir un possible phénomène de « cross talk » entre les lysines acétylées et les sérines et/ou thréonines phosphorylées.Ici, nous démontrons que la complexité du protéome chez les procaryotes par le biais des MPT est bien réelle et que de possibles interdépendances entre MPT mériteraient un regard nouveau
Recently, the study of post-translational modifications has greatly evolved, mainly because of crucial progresses in mass spectrometry methodology which have allowed high-throughput, high resolution analysis. Their variety and their role in the regulation of key molecular mechanisms are increasingly documented. In this work, the different degrees of iodination of tyrosine were probed with a "shotgun" approach carried out from an entire organ, the mice thyroid. Post-translational modifications present in two radioresistant organism models, the bacterium Deinococcus deserti and the archaeon Thermococcus gammatolerans, were analyzed. The large scale exploration of N-terminal acetylation in D. deserti indicates a specific pattern of this modification on serine and threonine, as well as an atypical, high propension to acetylation with 50% of modified N-termini. In T. gammatolerans, N-terminal acetylation is rare, but the presence of acetylation on lysine side chains is significant. The presence of phosphorylation on these proteins suggests a potential "cross talk" between the acetylated lysine and phosphorylated serine or threonine residues. This work demonstrates that the complexity of the proteome in prokaryotes through post-translational modifications is higher than expected when extremophiles are scrutinized compared to classical prokaryote models. Interdependencies between post-translational modifications definitively deserve a fresher look

Lors de la photosynthèse, l’assimilation sous formes de glucides du dioxyde de carbone atmosphérique (CO₂), le principal gaz à effet de serre anthropique, est catalysée par l'enzyme Rubisco, la protéine la plus abondante sur terre. La grande sous-unité de la Rubisco (RbcL) subit une voie de maturation unique conduisant à des modifications N-terminales inhabituelles. Ce mécanisme conservé chez les plantes, résulte en une proline acétylée N-terminale en position 3. Décrypter la voie de maturation de Rubisco est donc une question clé pour la fixation du CO₂ dans le contexte des changements climatiques et du réchauffement climatique. Mon projet de doctorat visait à découvrir la machinerie à l'acétylation de Pro3 et à comprendre la pertinence fonctionnelle associée. Tout d'abord, deux cadres de lecture ouverts (ORFs) chez Arabidopsis thaliana ont été identifiés comme candidats potentiels pouvant contribuer au rocessus. Les fonctions de deux aminopeptidases conservées ont été testées in vitro et dans des lignées d'Arabidopsis thaliana mutantes dépourvues d’activité. Je démontre que l’une est spécifiquement responsable du clivage du résidu 2, alors qu'e l’autre ne contribue pas à la maturation des protéines N-terminales du plaste. Par ailleurs, mes données démontrent que l'acétylation de Pro3 est catalysée par une seule des isoformes d’acétyltransférases présentes dans le plaste. Ainsi, la machinerie de modification N-terminale unique impliquée dans le traitement de RbcL repose sur deux enzymes dédiées à la maturation de RbcL. J'ai pu aussi reconstituer cette voie de maturation chez E. coli. Enfin, j'ai étudié comment ces modifications RbcL affectent l'assemblage, l'activité et l'accumulation de la Rubisco
During photosynthesis, atmospheric carbon dioxide (CO₂), the prevalent anthropogenic greenhouse gas, is assimilated into carbohydrates by the enzyme Rubisco, the most abundant protein on earth. The large subunit of Rubisco (RbcL) undergoes a unique maturation pathway leading to unusual N-terminal modifications. This mechanism is conserved in plants, resulting in an N-terminal acetylated proline at position 3. Unravelling the maturation pathway of Rubisco is therefore a key challenge for CO₂ fixation in the context of climate change and global warming. My PhD project aimed at discovering the machinery leading to Pro3 acetylation and unmasking the associated functional relevance. First, two open reading frames (ORFs) in Arabidopsis thaliana were identified as putative candidates that might contribute to the proteolytic part of this process. The functions of two conserved aminopeptidases were challenged in vitro assay and in knockout Arabidopsis thaliana lines. I showed that one protease is specifically in charge of residue 2 release, while the second does not contribute to N-terminal protein maturation in the plastid. In addition, my data demonstrates that Pro3 acetylation is catalysed by only one acetyltransferase isoform occurring in the plastid. Together, the unique N-terminal modification machinery involved in RbcL processing relies on two enzymes that are dedicated to RbcL processing. I could reconstitute the maturation pathway in E. coli. Finally, I have investigated how the N-terminal modifications of RbcL affect Rubisco assembly, activity, and accumulation

Les mitochondries sont des organites complexes impliquant un millier de protéines, la plupart codées dans le génome nucléaire. Leur biogenèse a nécessité au cours de l’évolution la mise en place de systèmes efficaces d’adressage et d’import protéique, et des défaillances de ces systèmes sont associées à des pathologies graves, neuropathies, troubles cardiovasculaires, myopathies, maladies neurodégénératives ainsi que cancers. De nombreuses protéines mitochondriales possèdent en N-terminal une séquence d’adressage appelée MTS (Mitochondrial Targeting sequence) qui forme une hélice alpha amphiphile essentielle pour leur import mitochondrial. La séquence des divers MTSs est néanmoins très variables et leur caractéristiques critiques ne sont pas encore bien comprises. Le point de départ de ma thèse est la découverte, chez les levures, d’une surreprésentation en position 2 des séquences MTSs de 4 acides aminés hydrophobes (F, L, I, W). Au cours de mes années de thèse, j’ai pu confirmer, par des expériences de mutagenèse dirigée, le rôle critique de la nature du résidu en position 2 des MTSs. En effet, grâce au développement d’un système novateur de criblage des défauts d’import basé sur le sauvetage fonctionnel de la toxicité d’une protéine mitochondriale, j’ai pu observer que seuls les résidus surreprésentés en position 2 des protéines mitochondriales permettaient un import efficace. Mon travail a ainsi démontré l'existence de fortes contraintes évolutives s’exerçant au niveau de la position 2 des MTSs dont la compréhension pourrait à terme être utile pour optimiser l’adressage mitochondrial de protéines thérapeutiques chez des patients atteints de maladies mitochondriales
Mitochondria are complex organelles involving a thousand proteins, most of which are encoded in the nuclear genome. Their biogenesis has required the evolutionary development of efficient protein addressing and import systems, and failures of these systems are associated with serious pathologies, neuropathies, cardiovascular disorders, myopathies, neurodegenerative diseases and cancers.Many mitochondrial proteins have an N-terminal addressing sequence called MTS (Mitochondrial Targeting Sequence) which forms an amphiphilic alpha helix essential for their mitochondrial import. However, the sequence of the various MTSs is highly variable and their critical characteristics are not yet well understood. The starting point of my thesis was the discovery in yeast of an overrepresentation of 4 hydrophobic amino acids (F, L, I, W) at position 2 of the MTSs sequences. During my thesis, I was able to confirm the critical role of the nature of the residue in position 2 of the MTSs through directed mutagenesis experiments. Indeed, thanks to the development of an innovative system for screening import defects based on the functional rescue of the toxicity of a mitochondrial protein, I was able to observe that only residues overrepresented at position 2 of mitochondrial proteins allowed efficient import. My work has thus demonstrated the existence of strong evolutionary constraints at position 2 of MTSs, the understanding of which could ultimately be useful for optimising the mitochondrial addressing of therapeutic proteins in patients suffering from mitochondrial diseases

La O-N-acétylglucosaminylation ou O-GlcNAc, est une glycosylation cytosolique et nucléaire correspondant à l'addition d'un motif O-GlcNAc sur des résidus sérine et thréonine des protéines. Cette glycosylation dynamique et réversible est impliquée dans de nombreux processus cellulaires comme la transcription, le cycle cellulaire, la signalisation intracellulaire ... mais également dans des pathologies comme le cancer, les maladies neurodégénératives et le diabète. Peu de travaux se sont intéressés au rôle que la O-GlcNAc pourrait jouer dans le muscle strié. Pourtant, le muscle squelettique est un modèle intéressant pour l'étude de la O-GlcNAc, puisque son métabolisme dépend fortement du glucose, que de nombreux processus musculaires, tels que la contraction, dépendent de la phosphorylation et qu'il peut adapter son métabolisme énergétique aux conditions physiologiques. Or, la O-GlcNAc est à la fois dépendante du taux de glucose mais peut également interférer avec la phosphorylation par l'intermédiaire d'une balance phosphorylation/ O-N-acétylglucosaminylation. Nous avons identifié un grand nombre de protéines modifiées par la O-GlcNAc, en particulier les chaînes lourdes et légères de myosine, l'actine et la tropomyosine. L'analyse du rôle de la O-GlcNAc sur l'activité contractile, et en particulier sur la sensibilité calcique des fibres musculaires, démontre que cette glycosylation pourrait jouer un rôle modulateur dans l'activité contractile des fibres musculaires via des interactions protéine-protéine mais également des motifs qui ne sont pas engagés dans des interactions. Nous avons identifié plusieurs sites O-GlcNAc sur deux protéines clés de la machinerie contractile du muscle squelettique, l'actine et la myosine. Un site a été localisé sur la séquence 198-207 de l'actine et quatre autres ont été identifiés dans la partie hélicoïdale de la région carboxy-terminale de la myosine et correspondent aux séquences 1094-1106; 1295-1303; 1701-1712; 1913-1922. Ces sites pourraient être impliqués dans des interactions protéine-protéine, dans polymérisation des protéines et également jouer un rôle dans la modulation des propriétés contractiles du muscle squelettique. Enfin, nous mettons en évidence la possible implication de la O-GlcNAc dans un modèle d'atrophie fonctionnelle (Bed-rest) chez l'humain. En premier lieu, nous avons démontré l'existence d'une balance phosphorylation/O-GlcNAc de la MLC2 au cours de l'atrophie musculaire. Cette balance pourrait moduler l'activité ou les propriétés de cette protéine au rôle important dans la modulation de la force de contraction. En outre, l'analyse du taux global de O-GlcNAc suggère que le taux de O-GlcNAc est lié au développement de l'atrophie musculaire. L'ensemble de ces résultats démontre que la O-GlcNAc joue un rôle qui pourrait être tout autant important dans la physiologie musculaire que la phosphorylation
The O-linked N-acetylglucosaminylation termed O-GlcNAc is a dynamic cytosolic and nuclear glycosylation on serine and threonine residus. This dynamic and reversible glycosylation is involved in many physiological as weIl as pathological processes such as diabetes, neurodegenerative diseases, cancer or cardiac ischemia. Only few studies have been performed about the role of O-GlcNAc in skeletal muscle. However, the skeletal muscle is an interesting model to study the O-GlcNAc since i) its metabolism depends on glucose, ii) many muscular processes such as contraction are dependent on phosphorylation, and iii) there is a plasticity of the muscle metabolism depending on the physiological conditions. O-GlcNAc is dependent also on the level of glucose and can interfere with phosphorylation through a phosphorylation/glycosylation balance. We clearly demonstrated that a number of key contractile proteins i.e myosin heavy and light chains and actin are O-GlcNAc modified. The role of this post-translational modification in the contractile properties was investigated by establishing T/pCa curves on skinned fibers. This study demonstrated that O-GlcNAc moieties involved in protein-protein interactions or not could modulate calcium activation properties and therefore that O-GlcNAc motifs could be involved in the modulation of contractile force. Using a mass spectrometry-based method, we determined the localization of one O-GlcNAc site in the suddomain 4 of actin (séquence 198-207) and four O-GleNAc sites in the light meromyosin region of myosin heavy chains (séquences 1094-1106; 1295-1303; 1701-1712; 1913-1922). These sites might be involved in protein-protein interactions or in the polymerization of MHC or could modulate the contractile properties of skeletal muscle. Finally, we studied the implication of O-GlcNAc in a human model of muscle atrophy (Bed-Rest). We demonstrated the existence of a phosphorylation/O-GleNAc balance for MLC2 that could modulate the activity and properties of this protein which bas a key role in the modulation of force. Moreover, our data suggested that O-GlcNAc level might be involved in the control of protein homeostasis and muscular atrophy in human as in rat. AlI these data demonstrate that O-GlcNAc is an important post-translational modification in the muscle physiology

La structuration sarcomérique, essentielle au muscle squelettique, est remarquablement organisée par de nombreuses protéines myofilamentaires interagissant entre elles. Plusieurs de ces protéines sont modifiées par une glycosylation atypique, la O-N-acétyl-β-D-glucosaminylation (O-GlcNAcylation), similaire en certains aspects à la phosphorylation et connue pour être un modulateur de l’activité contractile. Cependant à ce jour, son rôle dans l’organisation sarcomérique n’a pas été caractérisé. Lors de cette thèse, des traitements pharmacologiques appliqués sur des myotubes C2C12 ont permis de moduler de manière sensible et dynamique le taux de O-GlcNAcylation du myofilament, associé à des changements de la morphométrie du sarcomère et à des remaniements de certains complexes protéiques incluant des protéines structurales clé du sarcomère. En particulier, l’interaction entre la desmine et son chaperon moléculaire, l’αB-cristalline, était modulée dépendamment de la O-GlcNAcylation dans un dialogue étroit et complexe avec la phosphorylation. De plus, certains sites de O-GlcNAcylation ont été localisés sur des protéines myofilamentaires telles que la desmine au niveau d’un site connu pour être muté dans les desminopathies, l’αB-cristalline dans un domaine d’interaction avec la desmine, et la titine où plusieurs sites ont été identifiés en cluster dans un domaine d’interaction essentiel. L’ensemble de ces résultats démontrent que la O-GlcNAcylation est impliquée dans la structure du sarcomère et de son interactome, et amènent de nouvelles données quant à la compréhension de la physiopathologie de certaines maladies musculaires caractérisées par une désorganisation du sarcomère
The sarcomere structure, essential for skeletal muscle, is strikingly organized by several protein-protein interactions between myofilament proteins. Many of them are modified by an atypical glycosylation, the O-linked N-acetyl-glucosaminylation (O-GlcNAcylation), similar in some aspects to phosphorylation, and known to be a modulator of the contractile activity. However to date, its role in sarcomeric organization remains to be considered. In this Ph.D, some pharmacological treatments applied to C2C12 myotubes have modulated the global O-GlcNAc level of the myofilament-enriched fraction in a dynamic and sensitive manner, associated to changes of the sarcomeric morphometry and of some protein complexes including key structural proteins of the sarcomere. Notably, the interaction between desmin and its molecular chaperone, αB-crystallin, have been modulated depending on the O-GlcNAcylation within an extensive crosstalk and interplay with phosphorylation. Moreover, some O-GlcNAc sites have been located in myofilament proteins, such as desmin in a site known to be mutated in desminopathy, αB-crystallin within a desmin binding domain, and titin where some O-GlcNAc sites have been identified in cluster within an essential interaction domain. Taken together, the results suggested that O-GlcNAcylation is involved in sarcomeric structure and its interactome. This work provide new insights in the understanding of the physiopathology of some muscular diseases where the sarcomere is disorganized

Discipline récente, la chimie supramoléculaire est l'un des domaines les plus fertiles de la recherche chimique. Motivé par le défi que représente la reconnaissance moléculaire sur mesure d'édifices complexes, un grand intérêt est apparu pour la conception et la synthèse des récepteurs macrocycliques polyfonctionnalisés. Nous avons récemment décrit une nouvelle classe de récepteurs moléculaires accessibles et polyvalents: les Dyn[n]arenes. Cette nouvelle classe est obtenue à partir de briques moléculaires 1,4-dithiophénols fonctionnalisés en position ortho assemblées par des liaisons disulfures. Cette stratégie de macrocyclisation contrôlée thermodynamiquement permet de produire de grandes quantités de produit final avec un moindre coût synthétique. Des récepteurs sur-mesure pour la reconnaissance d'anions, de cations et de zwitterions ont été obtenus par cette approche polyvalente. En particulier, le Dyn[4]arene octacarboxylate a montré la capacité de reconnaître sélectivement des dérivés de la lysine par via un ajustement induit asymétrique du récepteur lors de l'association. L'utilisation de ce récepteur pour reconnaître des peptides et protéines portant en position N-terminale une lysine a été étudiée. Enfin, la post-fonctionnalisation de ces Dyn[4]arenes a été explorée afin d'améliorer leur solubilité et leur propriétés de reconnaissance vis-à-vis de cibles biologiquement actives, ainsi que pour étudier la possibilité de leur greffage sur phase solide et leur utilisation en chromatographie d'affinité
As a recent discipline, supramolecular chemistry is one of the most active and fast-growing fields of chemical research. Driven by the challenge that tailored molecular recognition of complex molecules represents, a large interest has grown for the design and synthesis of multi-functionalized macrocyclic receptors. We recently described a new class of accessible and versatile molecular receptors: Dyn[n]arenes. This new class is obtained from 1,4-dithiophenols units functionalized in ortho position and assembled by disulfide linkages. This strategy of thermodynamically controlled macrocyclization allows producing large amounts of final product with a low synthetic cost. On demand receptors for anions, cations and zwitterions were obtained by this versatile approach. Particularly, the octacarboxylate-bearing dyn[4]arene showed the ability to selectively recognize Lysine derivatives via an asymmetric induced adjustment of the receptor upon the complexation. The use of this receptor to recognize N-terminal Lysine tagged peptides and proteins have been investigated. Finally, post-functionalization of Dyn[4]arenes have been explored to improve their solubility and recognition properties toward biologically active target and to investigate their solid phase grafting to be implemented in affinity chromatography

La production de protéines d'intérêt thérapeutique dans des plantes transgéniques suppose que la cellule végétale soit capable d'effectuer les modifications post-traductionnelles, en particulier la N-glycosylation, indispensables à la biosynthèse d'une protéine biologiquement active et stable. Les données actuelles relatives à la N-glycosylation des protéines végétales étant encore parcellaires, nous avons cherché à réaliser une analyse comparée de la biosynthèse et la maturation des N-glycannes dans différents systèmes constitutifs du règne végétal et au sein de différents organes d'une même plante. Nous avons pour cela exprimé de façon recombinante une glycoprotéine modèle végétale, la phytohémagglutinine de haricot (PHa) dans différents systèmes végétaux. Cette étude a nécessité préalablement la mise au point d'un ensemble de stratégies permettant d'établir de façon qualitative et quantitative la N-glycosylation d'une glycoprotéine végétale. Ainsi, après expression de la PHa dans un système végétal transformé (plante, cellules en culture) via Agrobacterium tumefaciens, la PHa recombinante est isolée par chromatographie d'affinité, puis analysée sur empreinte au moyen de sondes spécifiques. Ensuite les N-glycannes sont libérés et analysés par chromatographie et spectrométrie. Cette étude a permis d'établir que les processus de glycosylation d'une glycoprotéine vacuolaire sont conservés dans les différents systèmes végétaux étudiés et au sein des différents organes d'une plante. Par ailleurs, cette stratégie d'analyse a été appliquée à l'ensemble des N-glycannes associés aux protéines d'Arabidopsis thaliana, plante de référence dans le domaine végétal et chez un mutant d'A. Thaliana affecté dans les processus de glycosylation. Cette étude a permis de démontrer les potentialités des stratégies développées au cours de cette thèse pour l'étude de mutants végétaux.

L'inter-conversion du tachyzoïte virulent en bradyzoïte quiescent est au centre de la pathogenèse et de la pérennité du parasite protozoaire Toxoplasma gondii. Les bases moléculaires régissant cette différenciation parasitaire n'ont pas encore été complètement élucidées à ce jour. L'inter-conversion est marquée par l'expression spécifique de stade d'un grand nombre de protéines, conséquente à une régulation fine des gènes du parasite. Notre laboratoire a notamment mis en évidence l'existence de deux protéines homologues de l' énolase, ENO 1 exprimée chez le bradyzoïte, et ENO2 exprimée chez le tachyzoïte. Ces deux enzymes glycolytiques, ordinairement cytoplasmiques, sont localisées dans le noyau des parasites pendant la réplication active et au cours du processus d'inter-conversion. L'obtention de tachyzoïtes transgéniques sur-exprimant ENOl ou ENO2 en fusion avec l'épitope HA, a permis de confirmer la localisation nucléaire des deux protéines et de mettre en évidence l'induction de l'expression de gènes spécifiques du stade bradyzoite, suggérant un rôle de régulateur génique de ces enzymes glycolytiques. Une cinétique in vitro de l'adressage nucléaire d'ENO2 dans le tachyzoïte a révélé que la localisation nucléaire de cette enzyme était corrélée aux stades précoces de la réplication parasitaire. L'étude du processus autorisant la localisation nucléo-cytoplasmique des deux énolases a permis de démontrer que ENO1 et probablement ENO2 portent un ou plusieurs résidus O-GlcNAc, modification posttraductionnelle agissant de concert avec la phosphorylation et permettant la localisation nucléocytoplasmique. Le gène codant pour l'enzyme permettant de greffer ces résidus O-GlcNAc sur les protéines, la O-GlcNAc transférase ou OGT, a été identifié par bio-informatique et partiellement cloné. L'analyse par Blast de l'OGT putative ainsi qu'une étude phylogénétique ont mis en évidence la forte homologie de cette protéine avec les OGTs végétales, les protéines SPINDLY, rappelant le lien entre les Apicomplexa et les micro-organismes photosynthétiques. Ce travail démontre pour la première fois l'existence de la O- N-acétylglucosaminylation et de l'OGT chez Toxoplasma gondii.

Les Oligosaccharides soluble (OS) sont essentiellement générés durant le processus de dégradation des N-glycoprotéines nouvellement synthétisées et mal conformées (ERAD) et durant la voie « turn-over » des glycoprotéines matures. Dans le but de déterminer si la modification post-traductionnelle O-GlcNAc est effectivement impliquée dans le processus de dégradation des N-glycoprotéines, nous avons analysé par spectrométrie de masse les OS provenant des cellules CHO après traitement par l’inhibiteur PUGNAc. Le PUGNAc ou « O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene) amino-N-phenylcarbanate » est un inhibiteur puissant de l’O-GlcNAcase (OGA) qui catalyse l’hydrolyse du résidu O-GlcNAc des résidus sérine et thréonine des protéines O-GlcNAcylées.L’analyse par spectrométrie de masse révèle l’apparition d’une population d’OS de structures anormaux dans les cellules CHO suite au traitement par le PUGNAc. Cette population a été identifiée comme ayant des structures possédant des résidus GlcNAc au niveau de leur extrémité non-réductrice issues d’une dégradation lysosomale incomplète des glycoprotéines. Contrairement au PUGNAc, le NButGT, un autre inhibiteur de l’OGA, n’aboutit pas à l’apparition de cette population. Ainsi, Nous avons démontré que ces structures s’accumulent exclusivement dans la fraction membranaire conséquence de l’inhibition des β-hexosaminidases lysosomaux par le PUGNAc. Notre étude avait permis, d’un part, de mettre en évidence la capacité du PUGNAc de mimer une maladie de surcharge lysosomale et, d’autre part, de montrer un autre aspect des effets indésirables induits par le PUGNAc et qui nécessite d’être pris en considération lors de l’utilisation de cet inhibiteur
Free oligosaccharides (fOS) are generated as a result of glycoproteins catabolism that occurs in two principal distinct pathways: the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) of misfolded newly synthesized N-glycoproteins and the mature N-glycoproteins turnover pathway. We analyzed fOS by Mass spectrometry in PUGNAc CHO treated cells in order to investigate whether O-GlcNAc modified proteins were involved in N-glycoprotein degradation process. The O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene) amino-N-phenylcarbanate (PUGNAc) is a potent inhibitor of the O-GlcNAcase (OGA) catalyzing the cleavage of β-O-linked 2-acetamido-2-deoxy-beta-D-glucopyranoside (O-GlcNAc) from serine and threonine residues of post-translationally modified proteins. Mass spectrometry (MS) analysis revealed the appearance of an unusual population of fOS after PUGNAc treatment. The structures representing this population have been identified as containing non-reducing end GlcNAc residues resulting from incomplete lysosomal fOS degradation. Only observed after PUGNAc treatment, the NButGt, another OGA inhibitor, did not lead to the appearance of the population. These structures have clearly been shown to accumulate in membrane fractions as the consequence of lysosomal β-hexosaminidases inhibition by PUGNAc. As Lysosomal Storage Disorders (LSD) are characterized by the accumulation of fOS in various tissues, our study evokes that PUGNAc mimics a LSD and shows another off target effects that needs to be taken into account in the use of this drug

Grâce aux nombreuses structures glucidiques dont nous disposions au laboratoire, la spécificité fine d'un grand nombre de lectines a pu être précisé et un procédé général de fractionnement de n-glycosylpeptides d'origines diverses, associant à la chromatographie d'affinité sur lectines immobilisées les procédés plus classiques de tamisage moléculaire et la HPLC d'échange d'ions et de partage, développé. Ce procédé miniaturisé nous a permis d'aborder l'étude des modifications des glycannes des n-glycosylprotéines membranaires associées à la transformation maligne des cellules et a la diffusion métastatique. Des études comparées ont été menées sur les modèles expérimentaux suivants : membranes plasmiques isolées de foie de rat sain et hepatomateux ; fibroblastes de rein de hamster (BHK 21/c13/8) normaux et transformés par le virus du sarcome de hamster (BHK 21/C13/8/HS5). Des cellules uro-épithéliales humaines normales et cancéreuses et des cellules du carcinome pulmonaire de Lewis, sélectionnées par leur résistance à l'action toxique de diverses lectines et possédant des pouvoirs métastatiques différents ont également été étudiées. Le résultat capital que nous avons obtenu, simultanément avec d'autres laboratoires, concerne l'inversion des proportions : structures biantennées/structures tri- et tetraantennées dans les cellules transformées, au profit des structures polyantennées et au détriment des structures biantennées. La polyantennarisation des glycannes des n-glycosylprotéines membranaires semble constituer un marqueur de la transformation maligne des cellules et pourrait également intervenir dans le processus de diffusion métastatique. En effet, un autre résultat important concerne l'observation montrant que le pouvoir métastatique des cellules cancéreuses est lui-même modulé par l'expression de glycannes différents à la surface cellulaire

L’infection par le virus de l’hépatite E (HEV) est un problème majeur de santé publiquequi touche plus de 20 millions de personnes et tue environ 70 000 chaque année à travers lemonde. Le HEV est la cause majeure d’hépatite virale aiguë dans le monde. En France, laséroprévalence du HEV est de 22,4% dans la population générale. Ce virus se transmet parvoie féco-orale ou par consommation de viande contaminée mal cuite. Très récemment, nousavons décrit un système de culture cellulaire permettant d’amplifier efficacement le HEV. Cesystème représente un outil unique pour caractériser les différentes étapes du cycle infectieuxdu HEV qui sont très mal connues à ce jour. Dans le cadre de ma thèse, je me suis intéresséplus particulièrement à la protéine de capside ORF2 qui est l’unité structurale des particulesvirales et est donc un acteur central du cycle infectieux du HEV. La protéine ORF2 est uneprotéine de 660 acides aminés (aa) qui possède un peptide signal (PS) et trois sites potentielsde N-glycosylation (N1, N2 et N3). J’ai donc étudié le rôle de la N-glycosylation de cetteprotéine ORF2 dans le cycle infectieux du HEV. Pour atteindre cet objectif, la soucheinfectieuse HEV-p6 génotype 3 a été utilisée pour infecter les cellules de la lignéehépatocytaire PLC3, sous clone de la lignée PLC/PRF/5. Les résultats obtenus ont montré quela protéine ORF2 est N-glycosylée uniquement au niveau des sites N1 et N3 ; le site N2 estdéfavorable à la N-glycosylation. Nos résultats ont montré que la N-glycosylation de laprotéine ORF2 n’est pas importante pour sa stabilité, son oligomérisation, sa reconnaissancepar des anticorps, l’assemblage et l’infectiosité des particules virales. Nous avons aussimontré que la protéine ORF2 est importée dans le noyau des cellules hôtes au cours du cycleinfectieux du HEV de manière indépendante de la N-glycosylation. Nous avons identifié pourla première fois un signal de localisation nucléaire (NLS) fonctionnel en position N-terminalede la protéine ORF2 lui permettant d'interagir probablement avec l’importine alpha1. Demanière surprenante, ce NLS régule non seulement l’import nucléaire de cette protéine virale,mais aussi sa translocation réticulaire. Nous avons également démontré que la protéine ORF2est exportée du noyau des cellules hôtes en interagissant avec l’exportine1 et possède 3signaux d’export nucléaire (NES) en position C-terminale. Ces résultats améliorent laconnaissance du trafic intracellulaire de la protéine ORF2 et pourraient orienter les stratégiesantivirales dirigées contre le HEV
Hepatitis E virus (HEV) infection is a major public health problem that affects more than20 million people and kills approximately 70,000 worldwide each year. HEV is the leadingcause of acute viral hepatitis in the world. In France, the seroprevalance of HEV is 22.4% inthe general population. This virus is transmitted by fecal-oral route or by consumption ofundercooked contaminated meat. Very recently, we have described an efficient cell culturesystem to amplify HEV. This system represents a unique tool for characterizing the variousstages of the infectious HEV lifecycle that are very poorly understood to date. As part of mythesis, I focused on the ORF2 capsid protein which is the structural unit of viral particles andis therefore a central player in the HEV lifecycle. ORF2 is a 660 amino acids protein thatcontains a signal peptide and three potential N-glycosylation sites (N1, N2 and N3). My workaimed to identify the role of the ORF2 N-glycosylation in the HEV lifecycle. Our resultsrevealed that the ORF2 protein is N-glycosylated on the N1 and N3 sites, whereas the N2 siteis not N-glycosylated. Also, the N-glycosylation has no significant relevance neither for thestability, oligomerization, antibody recognition of the ORF2 protein nor for viral assemblyand viral infectivity. We also revealed that, the ORF2 protein is translocated into the nucleusof infected cells, independently of N-glycosylation. We identified for the first time afunctional nuclear localization signal (NLS) located at the N-terminus of the ORF2 proteinthat interacts probably with the importin alpha1. Surprisingly, this NLS regulates both nuclearimport and endoplasmic reticulum translocation of the ORF2 protein. Finally, wedemonstrated that, the ORF2 protein possesses three nuclear export signals (NES) located atits C-terminus. The ORF2 protein interacts with the exportin1 and is exported from the cellnuclei. This interaction drives the ORF2 protein from the nucleus to the cytoplasm of theinfected cells. Hence, this study led to new insights into the molecular mechanisms of theORF2 protein and could help to the design of novel antiviral strategies against HEV

Les OBP sont des petites protéines solubles qui se lient avec des molécules odorantes et phéromonales. Le rôle des OBPs n’est pas complètement compris. Une hypothèse suggère que l’OBP solubilise et transporte les ligands aux récepteurs olfactifs et la liaison entre les molécules odorantes et l’OBP est non spécifique. Une autre hypothèse suggère que le complexe formé est une liaison spécifique entre une molécule odorante donnée et une OBP spécifique. Ce travail de thèse montre que les OBPs sont impliquées dans la première étape de la discrimination des odeurs. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication de la Phe35 et la Tyr 82 dans la sortie du ligand par l’OBP. Dans un second temps, nous avons mis en évidence la présence de différentes isoformes d’OBP et de VEG qui diffèrent par les modifications post-traductionnelles (phosphorylation et GlcNAcylation) a la fois sur les protéines natives extraites de la muqueuse respiratoire et sur les protéines recombinantes produites par P.pastoris et CHO. Ces isoformes sont capables de discriminer des molécules odorantes et phéromonales. Les OBPs ne sont pas des transporteurs passifs car elles assurent un fin codage des molécules odorantes ou phéromonales avant l’interaction de ce complexe avec un récepteur spécifique
OBPs are small soluble proteins that bind with odorant molecules and pheromones. The role of OBP is not completely understood. A hypothesis suggests that OBP solubilize and transport the ligands to olfactory receptors and the binding between odorant molecule and OBP is unspecific. An other hypothesis suggest that the complex formed is the specific binding between a given odorant molecule and a specific OBP. This work of thesis show that OBP are involved in the first step of odorant discrimination. Initially, we have showed the involvement of the Phe35 and Tyr 82 in the uptake of ligands by OBP. Second, we have given rise to the presence of various isoform of OBP and VEG that differ by post-translational modifications (phosphorylation and GlcNAcylation) both on natives proteins extract of respiratory mucosa and on recombinants proteins produce by P. pastoris and CHO. These isoforms are able to discriminate of odorant molecules and pheromones. OBPs are not passives carriers because they ensure a fine coding of odorant molecules and pheromones before interaction of this complex with specific receptor

Le choc anaphylactique est l’expression clinique la plus sévère de l’anaphylaxie. La sévérité et la rapidité d’installation des signes cliniques sont caractéristiques de cet état de choc. Il est définit par une hypotension artérielle profonde et une dysfonction myocardique. La physiopathologie de cette dysfonction myocardique est encore mal comprise. La mitochondrie pourrait jouer un rôle car nous avons pu observer une dysfonction mitochondriale cardiaque avec une baisse de la respiration mitochondriale et une augmentation de la peroxydation lipidique. La O-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAcylation) est une modification post-traductionnelle ubiquitaire impliquée dans les mécanismes cellulaires protecteurs face à un stress cellulaire aigu. Dans notre modèle de choc anaphylactique, l’augmentation du niveau de O-GlcNAcylation améliore les effets de l’adrénaline sur le myocarde par une augmentation de la contractilité et du débit cardiaque tout en diminuant la lactatémie artérielle, probablement par la restauration de la respiration mitochondriale cardiaque. Avec ces résultats, la dysfonction mitochondriale peut être considérée comme une cause de dysfonction myocardique dans le choc anaphylactique. L’utilisation de traitements adjuvants à l’adrénaline permettrait d’éviter l’apparition d’un choc anaphylactique réfractaire et de limiter les effets adverses de l’adrénaline
Anaphylactic shock is the most severe clinical expression of anaphylaxis. The severity and rapidity of clinical signs are characteristic of this state of shock. It is defined by profound arterial hypotension and cardiac dysfunction. The pathophysiology of the cardiac dysfunction is still poorly understood. Mitochondria may play a role, as we have observed cardiac mitochondrial dysfunction with an impairment in mitochondrial respiration and an increase in lipid peroxidation. O-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAcylation) is an ubiquitous post-translational modification involved in the cellular stress response. In our model of anaphylactic shock, increasing the level of O-GlcNAcylation ameliorates the effects of epinephrine on the cardiac function by increasing contractility and cardiac output while decreasing arterial lactataemia, probably by restoring cardiac mitochondrial respiration. With these results, mitochondrial dysfunction can be considered as a cause of myocardial dysfunction in anaphylactic shock. The use of epinephrine adjuvant treatments could prevent the onset of refractory anaphylactic shock and limit the cardiac adverse effects of epinephrine

Le N-acétylglucosamine (GlcNAc) est un sucre aminé ayant un rôle important dans de nombreux processus cellulaires chez les cellules procaryotes et eucaryotes. La plupart des bactéries marines et des bactéries pathogènes d'insectes ont développé des mécanismes sophistiqués permettant le catabolisme de la chitine, un homopolymère de GlcNAc. La chitine est le second biopolymère le plus abondant dans la nature après la cellulose. Une bactérie non-chitinolytique rencontre-t-elle du GlcNAc dans l'environnement ? Et si oui, quelle est la source naturelle de cette molécule ? Les données obtenues au cours de ma thèse suggèrent que la bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc), l'agent responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées, rencontre et exploite du GlcNAc provenant de la plante, au cours de l'infection. La caractérisation de la voie d'utilisation du GlcNAc chez Xcc et de son réseau de régulation a permis l'identification de particularités par rapport aux autres bactéries, et notamment en ce qui concerne la source de GlcNAc. En effet, le GlcNAc utilisé au cours de l'infection par Xcc semble provenir de la dégradation des glycanes des glycoprotéines végétales. Nous avons montré qu'un transporteur de la membrane externe, ainsi que des glycosides hydrolases jouent un rôle direct dans la génération du GlcNAc in planta
N-acetylglucosamine (GlcNAc) is an amino sugar that carries out important roles in a broad range of cells from bacteria to plants and animals. Most marine bacteria and insect pathogens have developed sophisticated mechanisms for the catabolism of the second most abundant biopolymer in nature, chitin, which is a GlcNAc homopolymer. However, whether non-chitinolytic bacteria find GlcNAc in their environment and what is the natural source of this molecule remain obscure. The data presented here suggest that the plant pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc), the causal agent of black rot disease of Brassicaceae, encounters and exploits GlcNAc of plant origin during infection. Characterization of the Xcc GlcNAc utilization pathway and its complex regulatory network led to the identification of specific traits as compared to other bacteria and most notably the source of GlcNAc, i. E. Glycans from plant glycosylated proteins. An outer membrane transporter and glycoside hydrolases belonging to the Xcc GlcNAc utilization pathway were shown to play a direct role in the generation of GlcNAc in planta

La proteolyse par la clostripaine de la particule "coeur" de chromatine conduit a une nouvelle particule nucleoproteique selectivement depourvue des segments n-terminaux des histones. La proteolyse des histones par la clostripaine s'effectue en deux etapes: la fragmentation des histones h3 et h4 precedant celles des histones h2a et h2b. Ainsi un nouvel etat de proteolyse contenant les histones h3 et h4 sous forme fragmentee. Un tel etat de proteolyse n'est pas obtenu lors de la digestion de polynucleosones contenant l'histone h1. Cette observation mene a proposer un modele pour le positionnement des segments n-terminaux des histones h4 a la peripherie du nucleosome. La morphologie du nucleofilament proteolyse par la clostripaine a ete etudiee par microscopie electronique

Les plantes ont la capacité de produire des protéines recombinantes mais des problèmes de N-glycosylation et de protéolyse persistent. Afin d’établir l’impact de la localisation sur la stabilité et la glycosylation d'une protéine recombinante, nous avons exprimé l’inhibiteur de protéase α1-antichymotrypsine (AACT) humaine dans quatre compartiments (RE, vacuole, apoplasme et cytosol) de cellules de tabac en culture. Le produit obtenu s'est avéré être plus hétérogène au sein du système de sécrétion, en raison d'une maturation de la N-glycosylation et d'une maturation protéolytique. Inversement, la protéine recombinante cytosolique non glycosylée montrait une plus grande stabilité et présentait une double localisation nucléaire et cytoplasmique. L’AACT a un site de liaison à l’ADN et une mutation de ce site a permis d'inhiber cette interaction et d'altérer en partie la localisation nucléaire, suggérant l'implication de la liaison à l’ADN dans la rétention nucléaire
Plants represent interesting production platforms for recombinant proteins. Protein post-translational modifications however, may not be adequate, with a possible negative impact on their commercial value. To assess this problem, we expressed human α1-antichymotrypsin (AACT), a glycosylated serine protease inhibitor, in cultured BY­2 tobacco cells. The inhibitor was targeted to different subcellular compartments to assess the impact of cellular destination on its stability and glycosylation. Our results showed that AACT entering the secretory pathway was readily processed to lower molecular weight forms resulting from glycan maturation and proteolytic processing. Intriguingly, cytosolic expression generated more stable proteins, although not glycosylated, that accumulated mostly in the nucleus. We further demonstrated that mutation of AACT DNA binding site partially altered the nucleus distribution, thus suggesting a role of this DNA binding in nuclear retention

Dans le but de greffer une ou deux chaînes d'acides gras à des protéines hydrophiles afin de leur conférer une capacité d'interaction avec les membranes (et plus largement d'étudier le phénomène de l'acylation naturelle des protéines), un système micellaire de surfactant dans un solvant organique apolaire a été utilisé comme milieu de réaction pour la modification protéique par des réactifs lipophiles comme les chlorures d'acides gras. Le degré d'hydratation du surfactant qui gouverne la taille des micelles inverses, et d'autres paramètres tels que le pH du compartiment aqueux, la quantité de protéine micellisée et le ratio molaire réactif/protéine ont été étudiés et optimisés pour l'acylation de la ribonucléase A avec le chlorure d'acide myristique, puis appliqués pour les chlorures d'acides caprylique, palmitique, palmitoléique et stéarique. Une méthode de séparation utilisant la chromatographie liquide haute performance en phase inverse permet de récupérer en deux fractions distinctes la protéine non modifiée et la protéine modifiée. Les quantités récoltées sont de l'ordre de la dizaine de milligrammes et peuvent être augmentées. L'électrophorèse capillaire de ces échantillons a confirmé leur homogénéité et leur pureté. Les résultats obtenus par spectrométrie de masse (dispersion par électrospray) sur les dérivés acyles de la ribonucléase A ont permis de certifier qu'une seule chaîne acyl est fixée par monomère. Un séquençage par dégradation d'Edman a montré une fixation amino-terminale des résidus d'acides gras sur la lysine 1 de la ribonucléase A. Ces deux fractions conservent leur activité cataytique. La stabilité thermique des dérivés protéiques acyles est même augmentée par rapport à l'enzyme native, comme le montrent les études microcalorimétriques. En conclusion, nous avons réalisé une acylation amino-terminale en conservant l'intégrité biologique de la ribonucléase A

Les protéine arginine méthyltransférases (PRMT) sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, incluant la régulation de l’expression des gènes, le contrôle de l’épissage, le maintien de l’intégrité du génome et la transduction du signal. De nombreuses études montrent que la dérégulation de l’activité des PRMT est associée au développement de pathologies, et en particulier de cancers. Les PRMT constituent ainsi une des nouvelles cibles potentielles en chimiothérapie. Les travaux présentés dans ce manuscrit portent sur trois cibles : PRMT2, PRMT3 et PRMT4/CARM1. Combinant des approches biochimiques, biophysiques et structurales (cristallographie et cryo- microscopie électronique), ces travaux comportent deux aspects : (I) comprendre au niveau atomique la régulation de la réaction de méthylation des protéines (reconnaissance protéines-protéines et interactions entre modifications post-traductionnelles) ; (II) découvrir des inhibiteurs spécifiques et puissants de plusieurs PRMT cibles
Protein arginine methyltransferases (PRMT) are involved in many cellular processes, including gene expression regulation, splicing control, maintenance of genome integrity and signal transduction.Since deregulation of those biological processes appears to be implicated in the pathogenesis of different diseases, PRMTs have emerged as potential new targets for the development of novel therapeutic modulators. Despite the large amount of biological and structural data on PRMTs, two challenges remain to be solved by structural biology ; (I) understanding how PRMTs recognize and bind their full-length substrates ; (II) revealing how PRMTs achieve specific arginine methylation on different target sites. The works presented here focused on 3 targets: PRMT2, PRMT3 and PRMT4/ CARM1. We used biochemical, biophysical and structural methods (bio-crystallography and cryo- electron microscopy) to decipher structural clues that drive PRMT-substrate recognition. We developed new chemical probes that can be used in early drug discovery for the conception of PRMT inhibitors

L'utilisation en thérapie humaine des protéines recombinantes produites dans les plantes est actuellement limitée par leur glycosylation qui diffère de celle observée sur les glycoprotéines humaines d'origine. En effet, les structures N-glycanniques généralement observées chez les plamtes sont de type paucimannosidique [Xylβ1-2]Man3GIcNAc[Fucα1-3jGlcNAc, les résidus β1,2-xylose et α1,3-fucose étant respoensables de l'alIergénicité des glycoprotéines végétales. Au cours de nos travaux, nous avons étudié le potentiel de N-glycosylation du mai͏̈s, plante monocotylédone utilisée comme système d'expression hétérologue par la société Meristem Therapeutics de Clermont-Ferrand. Dans un premier temps, nous avons déterminé la structure des N-glycannes portés par une glycoprotéine modèle exprimée dans le mai͏̈s, la lactoferrine humaine recombinante (mLf). Nos résultats ont montré que mLf est majoritairement substituée par des N-glycannes de type paucimannosidique [Xylβ1-2]Man3GIcNAc[Fucα1-3]GlcNAc. Nous avons approfondi cette étude structurale en réalisant une analyse comparative de la N-glycosylation site-par-site de mLf avec celle de la lactoferrine humaine recombinante exprimée dans le tabac pIante dicotylédone
Cette analyse nous a permis de montrer que le mai͏̈s, comme le tabac, représente un système d'expression capable de respecter le profil de N-glycosylation d'une glycoprotéine hétérologue et ceci de manière "site spécifique". Nous avons ensuite initié l'"humanisation" du potentiel de N-glycosylation du mai͏̈s en tentant d'exprimer in planta une galactosyltransférase (hβ4GT I) et une sialyltransférase (hST6Gal I) humaines, impliquées dans la biosynthèse des antennes des N-glycannes. Après transformation stable du mai͏̈s via A. Tumefaciens avec un vecteur d'expression inserrant les ADNc de ces deux enzymes, nous avons déterminé les activités enzymatiques à partir d'extraits protéiques totaux. AIors que l'activité galactosyltransférase mesurée in vitro s'est avérée très faible, la ST6Gal I produite dans la plante est très active in vitro et présente des paramètres cinétiques comparables à ceux de ST6Gal I produite dans les cellules d'insectes. Ces premiers résultats sont encourageants et démontrent la possibilité d'exprimer des glycosyltransférases humaines actives dans le mai͏̈s et ainsi d'améliorer son potentiel de glycosylation

Dans la cellule végétale, les protéines solubles vacuolaires et extracellulaires entrent dans le système endomembranaire de sécrétion au niveau du réticulum endoplasmique. Ces protéines sont ensuite transportées via des vésicules de transport jusqu'à leur compartiment de stockage, la vacuole et le compartiment extracellulaire, en passant par l'appareil de Golgi. Dès leur insertion dans la lumière du RE, ces protéines vont subir des modifications co-traductionnelles, en particulier la N-glycosylation et le repliement qui leur conféreront stabilité et activité biologique. Des suspensions cellulaires de tabac BY-2 exprimant simultanément plusieurs protéines-marqueur vacuolaires et extracellulaires nous ont permis d'étudier les implications des modifications co-traductionnelles dans le transport de protéines et de glycoprotéines à travers le système endomenbranaire de sécrétion. Nous avons montré qu'un defaut de repliement d'une glycoprotéine vacuolaire peut d'une part entraîner une modification de sa N-glycosylation et d'autre part sa réorientation vers la surface cellulaire. Les mécanismes de tri et la maturation des glycoprotéines vacuolaires ont été également étudiés en présence de drogues perturbant le fonctionnement de l'appareil de Golgi. Enfin, le transport protéique dans le système endomembranaire de sécrétion a été étudié dans des conditions où la N-glycosylation est inhibée par la tunicamycine. Ainsi, nous avons montré qu'en absence de N-glycosylation, le transport à la vacuole des protéines et des glycoprotéines a lieu mais se trouve fortement ralenti. En revanche, la sécrétion des glycoprotéines extracellulaires est totalement inhibée alors que, dans les mêmes conditions, les protéines sont transportées vers le compartiment extracellulaire. Nous avons pu préciser que les glycoprotéines extracellulaires non-glycosylées en presence de tunicamycine sont dégradées dans le système endomembranaire de sécrétion par un mécanisme pré-golgien et indépendant des protéasomes.

Le domaine de la bioénergétique concerne l’étude des échanges et des transformations de l’énergie au sein des organismes vivants. Cette thèse propose une étude électrochimique et spectroscopique de protéines issues de la chaine respiratoire, les oxydases terminales, afin de comprendre l’influence de différentes propriétés de ces enzymes (potentiels des cofacteurs, dépendance pH…) sur leur mécanisme réactionnel. La première partie de ce travail décrit le développement d’une méthode d’immobilisation permettant de conserver l’intégrité et l’activité de ces enzymes. Cette technique a d’abord été utilisée pour étudier l’inhibition de la cytochrome aa3 oxydase de P. denitrificans et a permis de mettre en avant l’importance du transfert de protons sur la réaction de réduction de l’oxygène. Une deuxième étude propose de comparer deux isoformes de la cytochrome cbb3 oxydase dont aucune différence n’a été observée à ce jour. La spectroscopie IRTF couplée à l’électrochimie montre l’implication de résidus acides différents au cours de la réaction d’oxydoréduction suggérant des différences mécanistiques. La dernière partie propose une étude comparative d’oxydases terminales de différents types et met en perspective l’influence des potentiels relatifs des hèmes sur la réaction de réduction de l’oxygène
The field of bioenergetics concerns the study of exchange and transformation of energy in living organisms. This manuscript proposes an electrochemical and spectroscopic study of the fourth complex of the respiratory chain, the terminal oxidases. The aim of this study was to understand the influence of some properties of these enzymes (potential of the cofactors, pH dependency…) on the catalytic mechanism. The first part describes an immobilization procedure which retains the protein activity and structure. This procedure has been applied for the study the inhibition of the proton pathways of cytochrome aa3 oxidase from P. denitrificans and shows the importance of proton transfer on the oxygen reduction. In a second study, two isoforms of cytochrome cbb3 oxidase were compared. No differences were observed between them until now. Our electrochemically induced FTIR spectroscopy study suggests the implication of different acidic residues during the redox reaction implying differences in the mechanism of these enzymes. The last part deals with the comparison of terminal oxidases of different types and shows the influence of the relative order of the midpoint potentials of the hemes on the oxygen reduction

La compréhension du processus de repliement protéique et la détermination de la structure tridimensionnelle à partir de la seule information de séquence sont des problématiques majeures de la biologie structurale. Nous observons, tout d'abord, la proximité quasi-systématique des extrémités N- et C-terminales des domaines protéiques qui pourrait être liée aux premières étapes du repliement. Puis, nous abordons le repliement de polymères sur des réseaux réguliers. L'énumération des orbites et des orbites cycliques hamiltoniennes sur des réseaux carrés n x n permet d'évaluer la réduction de l'espace conformationnel associée à la proximité des extrémités des chaînes. L'exploration exhaustive de ces structures de compacité maximale fournit une limite énergétique pour les algorithmes de recherche de minima pour des séquences HP. Enfin, nous étudions des alignements multiples à faible identité de séquence et nous introduisons une mesure de la conservation de l'hydrophobie, que nous appelons topohydrophobie généralisée. A l'aide d'arbres de décision, nous prédisons des caractéristiques structurales telles que la position Central/Bord des brins becta dans les feuillets et l'accessibilité au solvant (RAPT - Relative Accessibility Prédiction Tool). Ces informations peuvent être intégrées dans des approches de prédiction ab initio du repliement protéique
Understanding the protein folding process and predicting protein structures from sequence data only remain two challenging questions for structural biologists. In this work, we first observe highly frequent proximities between N- and C-termini of protein domain, probably reflecting early stages of folding. Then we address the problem of polymer folding on regular lattices. We enumerate Hamiltonian Orbits and Cyclic Hamiltonian Orbits on n x n square lattices to evaluate the conformational space reduction associated to the termini contact constraint. Exhaustive Exploration of those maximally compact structures provides a baseline for minimum search algorithm in the HP- folding problem. Finally, we study multiple alignments at low sequence identity and introduce topohydrophobicity, a measure of topohydrophobicity conservation. We use it through decision tree to predict structural features such as Central/Edge position of beta strands in beta sheets and solvent accessibility (RAPT - Relative Accessibility Prediction Tool). These data can be used in ab initio prediction procedures of protein structures