Dissertationen zum Thema „Modelage Biophysique“

Au cours du développement, les gradients morphogénétiques fournissent l’information positionnelle nécessaire à l’établissement des axes de polarité. Si l’importance de ces gradients est bien établie, la façon dont ils assurent la reproductibilité des patrons d’expression malgré la nature stochastique de la transcription reste énigmatique.Pour répondre à cette question, j’étudie l’établissement de l’axe antéro-postérieur (AP) de l’embryon de drosophile, sous contrôle de Bicoid (Bcd), un facteur de transcription et morphogène bien connu. Les ARNs de bcd sont exprimés maternellement et ancrés au pôle antérieur de l’ovocyte. Après la ponte, ces ARNs sont traduits en protéines, qui diffusent dans le cytoplasme pour former un gradient de concentration exponentiel avec son maximum au pôle antérieur. Un modèle simple propose que le destin de chaque cellule le long de l’axe est déterminé par la concentration de Bcd qu’elle reçoit. Toutefois, de nombreux débats ont remis en question la possibilité que les patrons d’expression induits par Bcd résultent uniquement des propriétés de diffusion et d’interaction des protéines Bcd avec leurs séquences cibles.L’objectif de ma thèse était de comprendre le rôle précis de Bcd dans l’expression de son gène cible principal, hunchback (hb). Pour cela, j’ai adapté à des gènes rapporteurs synthétiques, le système MS2-MCP, qui permet l’étiquetage fluorescent des ARN et l’analyse quantitative de la dynamique transcriptionnelle avec une forte résolution spatio-temporelle dans les embryons vivants. Dans ces rapporteurs, la séquence MS2 est contrôlée par un promoteur minimal contenant aussi les sites de fixation pour Bcd ou ses partenaires, Hb et Zelda (Zld), seul ou en combinaison. Mon but était de déterminer comment les divers rapporteurs récapitulent l’expression du promoteur d’hb et d’identifier les rôles spécifiques de chacun de ces facteurs et leurs interactions dans le mécanisme de transcription.De façon intéressante, l’expression du rapporteur avec uniquement neuf sites pour Bcd (trois de plus que dans le gène hb) récapitule l’expression du rapporteur hb-MS2, mais de façon moins rapide et avec un domaine d’expression à la bordure moins nette. Cela suggère qu’en définissant la position de la bordure mais pas sa netteté ni la rapidité de son établissement, Bcd est la source principale d’information positionnelle.En outre, la fixation des partenaires de Bcd au promoteur accélère le processus en agissant à différentes étapes : i) Hb agit en synergie avec Bcd en réduisant les fluctuations du promoteur et en augmentant le taux de démarrage de la polymérase ; ii) Zld abaisse le seuil de concentration de Bcd nécessaire à l’activation par Bcd. En collaboration avec des physiciens, nous avons développé un modèle de transcription impliquant Bcd et fournissant un contexte théorique aux données expérimentales. Ce modèle montre que l’établissement rapide de la bordure d’expression d’hb peut être expliqué par une réaction d’équilibre entre Bcd et ses sites de fixation pour l’information positionnelle nécessitant Zld et Hb pour sa dynamique temporelle.Pour confirmer que Bcd est la seule source d’information positionnelle du système, j’ai comparé la position de la bordure d’expression des gènes rapporteurs dépendant uniquement de Bcd dans des embryons exprimant une ou une demi-dose de Bcd. De manière surprenante, pour chaque rapporteur, le déplacement de la bordure est plus faible que son estimation théorique tenant compte de la constante du gradient exponentiel de concentration de Bcd. Cela indique une constante plus faible pour le gradient d’activité de Bcd et suggère l’existence de sous-populations de Bcd, avec certaines molécules moins actives que d’autres. L’amplitude du déplacement de la bordure du gène rapporteur hb-MS2 est la même que celle obtenue pour les rapporteurs dépendant uniquement de Bcd ce qui confirme que Bcd est bien la seule source d’information positionnelle pour l’expression d’hb
Morphogen gradients provide concentration-dependent positional information required to establish the polarity of developmental axes. Although the critical role of these gradients is well recognized, it is unclear how they provide reproducible expression patterns. This is particularly surprising if we consider the stochastic nature of transcription.To address this question, I focus on the establishment of the anterior-posterior (AP) axis of fruit fly embryos, which is mostly defined by Bicoid (Bcd), a very well-characterized morphogen and transcription factor. bcd mRNAs are expressed maternally and anchored at the anterior tip of the oocyte. After egg laying, these mRNAs are translated into proteins, which diffuse through the cytoplasm and form a gradient with its highest concentration at the anterior. A simple model is that depending on their position along the AP axis and thus on Bcd concentration, cells will adopt different fates. However, long debates in the field have questioned the possibility that Bcd-dependent transcription patterns emerge solely from diffusive biochemical interactions between limiting amounts of Bcd molecules and the gene promoter region.The goal of my PhD was to determine how Bcd precisely regulates expression of its main target gene, hunchback (hb). For this, I adapted to synthetic reporters the MS2-MCP system, which allows the fluorescent tagging of mRNAs and provides, thus, a quantitative analysis of transcription dynamics at high spatiotemporal resolution in living embryos. In these reporters, the MS2 sequence was placed under the control of a minimal promoter also containing DNA binding sites for Bcd and/or its known partners, Hb and Zelda (Zld), either alone or in combination. My goal was to determine how the various reporters could recapitulate expression of the hb promoter (hb-MS2 reporter) and shed light on the specific roles of the different factors and their interactions in the transcription mechanism.Interestingly, expression of the reporter with only nine Bcd binding sites (three more than in the hb gene) matches almost perfectly the hb-MS2 reporter pattern, except for the very high steepness of the expression domain boundary and the speed to reach steady-state. This suggests that Bcd alone is the main source of positional information, defining the positioning of the boundary but not its steepness nor the speed of its establishment.In addition, binding of Bcd’s partners to the promoter speed-up the process by acting in different steps of the transcription mechanism: i) Hb synergizes with Bcd by reducing transcription burstiness and increasing the polymerase firing rate; ii) Zld lowers the Bcd concentration threshold required for Bcd-dependent expression. In collaboration with physicists, a biophysical model of Bcd-dependent expression was developed providing a theoretical framework for the experimental data. This model showed that the very rapid establishment of the hb expression boundary can be solely explained by an equilibrium model involving the binding of Bcd molecules to their DNA-binding sites for positional information which requires Zld and Hb for its temporal dynamics.To further confirm that Bcd is the sole source of positional information for hb expression, I compared the boundary position of the Bcd-only dependent reporters in embryos expressing one dose or half dose of Bcd. Surprisingly, the corresponding shifts of these reporters’ boundaries upon one vs half dose of Bcd were smaller than theoretically expected given the measured decay length of the Bcd protein gradient. This indicates a shorter decay length for the Bcd activity gradient and suggests the existence of different Bcd populations, with some Bcd molecules being less active than others. Importantly, the shift observed for the hb-MS2 reporter was the same as for the Bcd-only dependent reporters confirming Bcd as the sole source of positional information for hb expression

Cette etude s'inscrit dans le cadre de calculs de structure de trace par monte carlo dans un modele elabore d'adn, considere comme cible du rayonnement. Les radiations simulees sont les electrons issus d'emetteurs auger incorpores dans le milieu cellulaire et les photons de basse energie. Les dommages, directs et indirects, sont analyses au niveau moleculaire (cassures de brins) et confrontes aux resultats experimentaux. Les donnees disponibles sont utilisees pour representer l'adn et son environnement a l'interieur de la cellule. A l'aide d'un logiciel de modelisation moleculaire, nous avons genere les coordonnees atomiques d'acides nucleiques lineaires, seuls ou complexes avec des proteines, de nucleosomes et d'une portion de fibre chromosomique. Les techniques de mecanique moleculaire (notamment la minimisation) sont utilisees pour corriger les defauts de structure et ajuster le placement des molecules d'eau a la surface des acides nucleiques. Le transport du rayonnement est simule au coup par coup par la methode de monte carlo. Le code existant a ete mis a jour (sections efficaces) et ameliore pour permettre un traitement informatique efficace des interactions entre la particule et le modele cible. En particulier, l'echantillonnage du parcours electronique tient compte de la densite et de la composition atomique du milieu traverse (adn, eau ou histones). Les resultats obtenus a partir de trois rayonnements differents fournissent des informations complementaires qui sont souvent non observables par l'experience. En premier lieu, l'iode 125 est un radionucleide qui, incorpore au niveau de l'adn, produit des dommages tres complexes. Nous avons determine la contribution de l'effet indirect et de la structure de l'adn sur les cassures induites. Le second type de rayonnement concerne le fer 57. Introduit dans une proteine, la bleomycine, il forme un compose pharmaceutique qui se fixe sur l'adn et induit naturellement des cassures de brins. Nous avons montre que l'accroissement des dommages lors d'une desexcitation du fer de ce complexe pouvait etre consequent. Les rx ultra-mous constituent le troisieme type de rayonnement. Entre 0,1 et 3 kev, les sections efficaces photoelectriques des differents atomes de l'adn presentent des singularites dues aux seuils d'ionisation des couches electroniques internes. Nous avons mis en evidence les variations d'efficacite d'induction des cassures en fonction de l'energie.

Le present travail porte sur le neurone recepteur olfactif et en particulier sur le codage de l'intensite d'un stimulus olfactif a l'etat stationnaire. En premier lieu, nous presentons les bases biologiques du travail. Puis nous proposons un modele biophysique decrivant les etapes successives de la conversion d'une concentration odorante en un train des potentiels d'action : le changement de la conductance membranaire (transduction), la generation du potentiel recepteur et celle des potentiels d'action. Nous demontrons une expression analytique decrivant chacune des etapes ; l'expression qui decrit le potentiel recepteur resulte d'une methode originale fondee sur le circuit equivalent de thevenin. Nous identifions les parametres pertinents et nous etudions les proprietes de codage (c'est-a-dire l'amplitude maximale, la sensibilite et l'etendue dynamique) de chaque etape de conversion. Enfin, nous analysons en detail comment ces proprietes de codage dependent de la structure spatiale du neurone, de l'environnement sensillaire, et de la retropropagation des potentiels d'action au long du neurone. Les resultats obtenus soulignent l'importance de la prise en compte de la structure spatiale du neurone et, dans certain cas, de son environnement.

Les interactions electrostatiques jouent un role crucial dans la modelisation d'une macromolecule biologique, et particulierement dans la comprehension de l'effet du solvant sur le systeme considere. La resolution de l'equation lineaire de poisson-boltzmann (lpb) permet d'obtenir une representation de ces interactions. Plusieurs methodes resolvant cette equation (ou une approximation de cette equation) sont developpees dans le but d'etre utilisees en dynamique moleculaire. La premiere etude utilise la methode des differences finies pour discretiser le systeme et differents algorithmes mathematiques pour resoudre le systeme d'equations lineaires obtenu. Le temps de calcul reste superieur a celui d'une modelisation du solvant de facon explicite. Dans le but d'optimiser ce temps de calcul, une methode de resolution des equations aux derivees partielles, basee sur la fonctionnelle de l'energie et les fonctions de bases, est adaptee a la resolution de l'equation lpb. L'avantage majeur de cette methode est l'expression analytique du potentiel electrostatique, et par consequent de l'energie et des forces electrostatiques. L'effet du solvant peut aussi etre modelise en considerant les atomes comme des cavites dielectriques, et en exprimant le potentiel electrostatique a l'aide des multipoles. Les resultats obtenus sont tres interessants puisque le temps de calcul est nettement plus faible que pour la resolution de l'equation lpb. Cette methode est donc couplee a la dynamique moleculaire. Les methodes de representation du solvant, decrites precedemment, sont appliquees aux calculs de l'etat de protonation des residus ionisables des proteines. Les resultats obtenus sont en bon accord avec les donnees experimentales. Par ailleurs, trois dynamiques moleculaires sont realisees sur le complexe represseur 434/operateur or1 avec deux representations differentes du solvant et sur le complexe represseur 434/operateur or3 avec une representation implicite du solvant. Cette etude permet de mieux comprendre la specificite des interactions proteines/adn, ainsi que la qualite des differents modeles electrostatiques du solvant

Dans la premiere partie de ce travail, nous avons propose le principe de dimensionalite reduite dans des experiences heteronucleaires multidimensionnelles sur des proteines marquees #1#5n/#1#3c. Deux experiences (3d-mq-hncoca et 3d-mq-noesy doublement filtree #1#5n/#1#5n et/ou #1#5n/#1#3c) utilisant ce principe ont ete mises au point et en ont montre l'interet pour l'attribution et le calcul de structure tridimensionnelle preliminaire. La majeure partie de ce travail concerne l'etude de la dynamique des proteines dans la gamme ps-ms par la mesure de parametres de relaxation. Dans un premier temps, les parametres de relaxation des noyaux #1#5n contenant l'information sur la mobilite des vecteurs n-h du cytochrome c#2 de rhodobacter capsulatus ont ete interpretes en parametres dynamiques grace a l'approche de lipari et szabo. Les mouvements internes sont caracterises par un parametre d'ordre et un temps de correlation interne et sont superposes a un mouvement de reorientation isotrope caracterise par un temps de correlation global. La qualite des parametres dynamiques extraits nous ont incite a considerer un mouvement global anisotrope, caracterise par un tenseur de diffusion d. Celui-ci a pu etre caracterise avec une excellente precision et les parametres de mobilite interne ont pu ensuite etre extraits par cette approche hybride avec une plus grande fiabilite, mettant en evidence la nature relativement compacte de cette proteine meme si une plus grande flexibilite est observee dans certaines boucles. Enfin, l'etude du vecteur ca-co a ete entreprise dans l'optique de caracteriser l'anisotropie des mouvements locaux, a cote de l'information issue du vecteur n-h. Des simulations de dynamique moleculaire ont permis de proposer des modeles de mouvements du plan peptidique pour certains residus et une experience rmn triple-resonance destinee a la mesure de la vitesse de relaxation croisee ca-co a ete mise en place. Ce parametre a finalement pu etre converti en parametre d'ordre.

Le collagene est le constituant majeur de toutes les proteines des organismes vertebres. Son role principal est de contenir ainsi que de servir de support et d'intercalaire pour les tissus. Cette fonction, essentiellement structurale du collagene, est principalement due a la resistance mecanique des fibres de collagene et est assuree grace a une conformation moleculaire unique tres reguliere au niveau de la sequence d'acides amines ou l'on retrouve une tres grande regularite dans la distribution des residus. Il en resulte un alignement specifique lors de l'assemblage extracellulaire et qui possede un caractere cristallin evident lors des experiences de diffraction. Le rayonnement synchrotron est de plus en plus utilise pour des etudes structurales de molecules d'interet biologique et plus particulierement des fibres comme les tendons. Le but principal de ce travail a ete de collecter des donnees quantitatives (c. A. D. Des facteurs de structures) des fibres de collagene du tendon afin de permettre une etude structurale a basse resolution et d'elucider le probleme de l'empilement des molecules dans les domaines ordonnes des molecules de collagene. La methode du remplacement isomorphe par des atomes lourds a ete testee et montre la presence des derives lourds. Une mesure par diffraction aux petits angles a donne une taille moyenne des domaines cristallins selon l'axe de la fibre de 1 micron environ. Differents modeles d'empilement ont ete testes et les cliches de diffraction calcules pour valider la structure secondaire en triple helice ainsi que les modes d'empilement possibles

Les avancees considerables realisees dans le domaine de la synthese de fragments d'adn et des methodes d'analyse de structures, notamment en resonance magnetique nucleaire (rmn) et en modelisation moleculaire, ont permis d'ameliorer nos connaissances des interactions adn-ligand. Notre travail s'inscrit dans cette problematique. Nous avons plus particulierement etudie deux classes de molecules qui ont respectivement des applications potentielles comme (1) sondes de chiralite de l'adn ou comme (2) nucleases artificielles interagissant specifiquement au niveau des lesions abasiques (ap-lyases). A l'aide d'une approche theorique par modelisation moleculaire, nous avons evalue la capacite de reconnaissance chirale de l'adn en conformation b (helice droite) de la base de trger 9,19-methano-9,10,19,20-tetrahydrodiacridino-b,f-1,5-diazocine. Cette molecule composee de deux noyaux aromatiques formant entre eux un angle d'environ 90, existe sous la forme de deux enantiomeres 1r,5r et 1s,5s. Nous avons montre que l'enantiomere 1s,5s etait susceptible de s'associer plus fortement avec l'adn-b que l'enantiomere 1r,5r. D'autre part par la rmn et par la modelisation moleculaire, nous avons determine la structure tridimensionnelle d'un undecamere contenant en son centre un analogue chimiquement stable du site abasique de type tetrahydrofurane (x), et de sequence d(cgcacxcacgc). D(gcgtgtgtgcg). Si pour cette sequence la thymine situee en face du site abasique conserve une position intrahelicoidale, la lesion induit toutefois un coude d'environ 30. L'utilisation conjointe des techniques de rmn et modelisation moleculaire, nous a permis d'etudier egalement la reconnaissance de cette lesion par des systemes de type base-chaine-intercalant doues d'activite de coupure, et de preciser le mode d'interaction de ces ap-lyases de synthese: (1) la base est situee dans la loge abasique et probablement appariee avec la thymine qui lui fait face, selon un mode de type hoogsteen ; (2) la chaine est positionnee dans le petit sillon ; (3) l'intercalant est situe a deux paires de bases et uniquement du cote 5' du site abasique. Nous avons enfin mis en evidence par rmn que le site abasique constituait un site d'intercalation preferentiel pour l'intercalant bromure d'ethidium. L'ensemble de ces resultats constitue une base structurale importante pour la recherche de nouvelles sondes de chiralite de l'adn ou de molecules capables d'interagir specifiquement au niveau des lesions abasiques

Des cristaux bidimensionnels de sous-unite b de la gyrase avaient ete obtenus par interaction specifique de la proteine avec un film de lipides greffes covalament a la novobiocine, un inhibiteur des fonctions atpasiques de l'enzyme. Nous avons calcule un modele tridimensionnel de la sous-unite b a partir d'images de cristaux de la proteine colores negativement. Ce modele montre a 2,5-3,0 nm de resolution deux bras allonges formant une structure en v, la base du v contenant le site de liaison a la novobiocine. L'analyse d'images effectuee sur les memes cristaux hydrates congeles a permis de determiner une carte de projection de la proteine a 1,0 nm de resolution, mettant en evidence des details structuraux non resolus en coloration negative. Nous avons compare nos donnees de microscopie electronique avec la structure cristallographique d'un fragment n-terminal de la proteine contenant le site de liaison a l'atp. La localisation du fragment dans la structure de la proteine entiere suggere que les sites de liaison a l'atp et a la novobiocine sont proches l'un de l'autre. Enfin les resultats que nous avons obtenus en diffraction electronique montrent qu'une etude structurale de la proteine a haute resolution peut etre envisagee a partir des cristaux bidimensionnels. Par l'utilisation de lipides charges positivement et etales en monocouche, nous avons pu obtenir les premiers cristaux bidimensionnels d'une arn polymerase eucaryote. Le modele tridimensionnel calcule a partir des cristaux colores negativement montre a 3,0 nm de resolution une structure de forme irreguliere de 111115 nm. Cette structure est caracterisee par un sillon de 10 nm de long, et une protrusion en forme de doigt definissant un canal a l'entree du sillon. Le canal et le sillon ont les dimensions requises pour lier une molecule d'adn double brin et contiennent probablement le site catalytique de polymerisation de l'arn

Le comportement conformationnel des glycannes, et donc leur flexibilite, peuvent influencer directement la reactivite chimique et l'activite biologique de ces molecules. Dans ce travail, la modelisation moleculaire d'une serie de glycannes de complexite croissante a ete realisee en utilisant plusieurs methodes d'exploration de l'espace conformationnel, dont la methode heuristique cicada, associees a differents champs de force : mm3 et amber avec plusieurs parametrisations disponibles pour les glycannes. La validation des modeles a ete apportee par des methodes theoriques de chimie quantique et des methodes experimentales telles que la resonance magnetique nucleaire et la cristallographie aux rayons x. Pour les monosaccharides, les comportements conformationnels de deux cycles furanose ont ete etudies par plusieurs methodes et les resultats ont ete compares aux structures cristallines connues. Les constantes de couplage #3j#h#-#h intracycliques ont ete calculees et comparees aux donnees de rmn. Cette approche a permis de determiner les conformations de plus basse energie ainsi que de demontrer la grande flexibilite de ces systemes. Le comportement conformationnel de la liaison glycosidique a ete etudie par modelisation moleculaire de deux disaccharides et d'un heptasaccharide. Ces etudes ont demontre la capacite de la methode cicada a explorer des espaces conformationnels tres complexes de facon rapide et efficace. Les donnees rmn et cristallographiques ont confirme l'existence des modeles de plus basse energie. Afin d'etudier les interactions proteine-glucide, un modele tridimensionnel d'un complexe entre la lectine de lathyrus ochrus et un nonasaccharide biantenne et flucosyle a ete construit. Les comportements conformationnels du nonasaccharide libre et complexe ont ete etablis en utilisant les methodes conformationnelles validees sur les molecules plus petites. Les resultats de la modelisation ont pu etre compares avec les donnees cristallographiques de plusieurs complexes lectine/oligosaccharides. Les limites des methodes de modelisation moleculaire utilisees dans cette etude sont discutees.

La structure tridimensionnelle de proteines en solution peut etre determinee par rmn, au prix d'une longue et complexe etape d'interpretation des spectres. Dans ce travail, nous avons concu une panoplie d'outils pour automatiser cette attribution. Pour l'attribution des frequences de resonance aux protons de la molecule a partir de spectres 2d, l'expertise de l'il humain est souvent indispensable et nous proposons une approche semi-automatique, effectuee a l'aide d'un nouveau programme informatique utilisant la technique d'optimisation par recuit simule. Pour les proteines doublement marquees #1#5n/#1#3c, a partir d'experiences heteronucleaires de triple-resonance bien choisies nous avons developpe le programme alps, qui dans des cas favorables rend l'attribution realisable en quelques jours, et offre une grande flexibilite pour le traitement de systemes plus complexes. Enfin nous avons developpe et utilise des outils informatiques pour attribuer et convertir en contraintes de distance entre protons les noe observes dans differentes experiences noesy, en particulier de nouvelles experiences 3d doublement filtrees destinees a l'etude de plus grosses proteines. Les differents programmes ont ete appliques a l'etude de deux cytochromes c, une famille de transporteurs d'electrons solubles participant au metabolisme energetique d'un grand nombre d'organismes. La structure du ferrocytochrome c#5#5#5 de chlorobium limicola f. Thiosulfatophilum a ainsi ete determinee de maniere semi-automatique. Les premieres comparaisons a d'autres petits cytochromes c bacteriens suggerent une forte influence d'une boucle au voisinage de l'heme sur le controle du potentiel redox. Une structure preliminaire a egalement ete calculee a l'aide d'un echantillon enrichi en #1#5n et #1#3c pour le ferrocytochrome c#2 de rhodobacter capsulatus