Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Microscopie des cellules vivantes“

La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est une technique d’imagerie du vivant qui prend désormais une place prépondérante en biologie structurale, avec des retombées en biologie cellulaire et du développement, en bioinformatique, en biomédecine ou en physique de la cellule. Elle permet de déterminer des structures de protéines purifiées in vitro ou au sein des cellules. Cette revue décrit les principales avancées récentes de la cryo-EM, illustrées par des exemples d’élucidation de structures de protéines d’intérêt en biomédecine, et les pistes de développements futurs.

Les biomolécules peuvent être visualisées directement en microscopie optique en mesurant leurs modes vibratoires, et ceci dans des environnements complexes comme les cellules et les tissus.Cependant le passage des mesures spectroscopiques en cuvette à l’imagerie des systèmes vivants a nécessité des efforts tout particuliers qui ont aujourd’hui atteint une maturité capable d’apporter des solutions novatrices en biologie et en médecine. Cet article présente les grandes lignes des recherches et réalisations en imagerie spectroscopique vibrationnelle en partant des concepts de base pour aller vers les applications.

La microscopie à super-résolution (SRM) désigne une nouvelle catégorie de techniques de microscopie optique qui permettent de surmonter la barrière de diffraction classique,- barrière qui a rendu difficile l’observation des structures et des activités qui constituent la base de la vie cellulaire biologique. La microscopie STED, qui est l'une des techniques SRM, a attiré l'attention des neurobiologistes, car elle permet de révéler la nanostructure des cellules cérébrales non seulement dans une boîte de Pétri, mais aussi à l'intérieur du tissu cérébral réel, voire dans le cerveau intact in vivo.

Le service de l’eau de la ville de Lausanne a mené des essais de cytométrie en flux afin d’apprécier l’élimination de la bactériologie sur les différentes méthodes de traitement mises en oeuvre sur les sites de production et comparer les résultats obtenus avec un appareil de mesure en ligne et en continu avec ceux obtenus en laboratoire après échantillonnage ponctuel. La filtration sur sable ne permet pas une élimination physique des cellules. L’élimination des cellules vivantes n’est observée qu’après désinfection finale au chlore en amont du refoulement dans le réseau de distribution. Un facteur 100 d’élimination des cellules intactes est garanti par cette étape de désinfection. Les essais ont mis en évidence l’efficacité de l’ultrafiltration, considérée comme méthode de désinfection. Cette technique de filtration va permettre de retenir les cellules bactériennes telle une barrière physique. Des facteurs d’élimination de 1 000 et 10 000 ont été observés respectivement sur le nombre de cellules totales et intactes. Les tests effectués ont démontré que les résultats issus de l’appareil de mesure de la cytométrie en flux en ligne de type BactoSense étaient en adéquation et cohérents avec ceux obtenus en laboratoire après échantillonnage ponctuel. Les valeurs sont similaires, notamment dans le cas où le nombre de cellules quantifiées est supérieur à quelques milliers de cellules.

De récentes études montrent qu'il existe des sensilles sur le bord antérieur des ailes de la mouche tsé-tsé Glossina fuscipes fuscipes Newstead, 1910. L'aspect externe de ces soies laisse à penser qu'elles ont un rôle chimiorécepteur gustatif, probablement associé à une fonction tactile. L'utilisation de deux techniques modernes d'investigation, la microscopie électronique à transmission et l'électrophysiologie, confirme cette hypothèse. Ces méthodes mettent en évidence au moins quatre cellules nerveuses associées à chaque sensille. Trois de ces cellules possèdent un rôle gustatif alors qu'une seule présente un rôle mécanorécepteur. Les dendrites gustatives répondent à des stimuli très variés (excréments de mouches tsé-tsé, liquide de Ringer, phéromones sexuelles).

Phagocytose et macroautophagie, appelée ici autophagie, sont deux mécanismes essentiels de dégradation lysosomale de divers cargos englobés dans des structures membranaires. Ils sont tous deux impliqués dans la régulation du système immunitaire et la survie cellulaire. Cependant, la phagocytose permet l’ingestion de matériel extracellulaire alors que l’autophagie dégrade des composants intra-cytoplasmiques, avec des mécanismes d’activation et de maturation différents. La LAP (LC3-associated phagocytosis) est une forme particulière de phagocytose qui utilise certains éléments de l’autophagie. Elle permet l’élimination de pathogènes, de complexes immuns, de cellules avoisinantes, mortes ou vivantes, constituant un danger pour l’organisme, et de débris cellulaires, tels que les segments externes des photorécepteurs (POS, photoreceptor outer segment), ou la pièce centrale du pont intercellulaire produit en fin de mitose. Les cellules ont ainsi « optimisé » leurs moyens d’éliminer les composés potentiellement dangereux en partageant certains éléments essentiels des deux voies de dégradation lysosomale.

Si congeler de la mayonnaise n’est pas recommandé, cela pourrait toutefois nous aider à comprendre la fabrication d’alliages métalliques, la cryopréservation des cellules ou encore la congélation des sols en hiver. Nous nous intéressons ici au cas des gouttes d’huile dans une émulsion, observées par microscopie confocale au cours de la congélation. De nombreux phénomènes physiques (transport, diffusion, solidification, instabilités) prennent place lors de ce processus, offrant aux physicien.ne.s un problème inédit aux multiples ramifications. Ces études pourraient améliorer notre compréhension de plusieurs phénomènes de solidification, naturels comme technologiques.

Des mâles d'Amblyomma ont été testés comme vecteurs de Cowdria ruminantium, agent causal de la cowdriose. Les mâles ont été nourris sur des moutons infectés expérimentalement avec C. ruminantium et ont ensuite été transférés à des moutons sensibles. Dans une première expérience, A. hebraeum et le stock Palm River de C. ruminantium ont été utilisés, une deuxième expérience a été faite avec le stock de Cowdria Kiswani et A. variegatum. Des tiques ont été récoltées quotidiennement pendant toute la durée de chaque expérience, coupées en deux et préparées pour examen par microscopie classique et électronique, afin d'étudier le développement de C. ruminantium dans leurs tissus. Dans les deux expériences les tiques ont transmis Cowdria à un mouton sur deux. A l'examen microscopique quelques colonies ont été trouvées dans des cellules intestinales, mais aucune n'a été observée dans les glandes salivaires. Les deux espèces de tiques étaient infectées par Rickettsia conorii, comme en témoignait l'existence de rickettsies dans les noyaux et le cytoplasme de cellules des glandes salivaires.

La distribution des marqueurs moleculaires et des medicaments fluorescents dans le cellules vivantes a ete etudiee par microscopie confocal a balayage (laser scanning confocal fluorescence microscopy - lscfm). En particulier, la distribution intracellulaire de la doxorubicine dans des cellules (k562 et mcf-7) sensibles et resistantes a permis d'etudier le phenomene de la resistance multiple (multidrug resistance, mdr). L'utilisation d'une detection a contage de photon sur le lscfm a permis de reduire la concentration de medicament et aussi la puissance du laser d'excitation afin de garantir la survivance des cellules. La distribution de doxorubicine dans des cellules vivantes est differente de celle dans des cellules fixees. Dans les cellules sensibles la doxorubicine est localisee dans l'appareil de golgi et dans les vesicules acides, tandis que dans les cellules resistantes la cible de la doxorubicine est localisee dans des organelles ponctuels, appeles punctate pattern. Cette distribution ne peut pas correspondre a l'appareil de golgi et non plus aux vesicules acides ou aux lysosomes comme montre dans la these par un etude avec la c6-nbd-ceramide et l'acridine orange. Pour etablir l'origine de la distribution ponctuelle, on a effectuee une etude des mitochondries avec la rhodamine 123, marqueur potentiometrique des mitochondries dans les cellules vivantes. A ete trouve que deux differentes populations de mitochondries caracterisent les cellules sensibles et les resistantes. Une population de mitochondries avec le forme en s habituelle est active dans les cellules sensibles, tandis que seulement une population de mitochondries ponctuels peut etre observee dans la region sous-membranaire des cellules resistantes. Pour mieux comprendre la difference dans les deux populations on a entrepris une etude par lscfm et par microspectrofluorimetrie avec du bromure d'ethidium qui est bien connu pour etre un marqueur des mitochondries dans les cellules vivantes.

"L'étude des cellules vivantes et la dentine humaine par microscopie confocale Raman" La microscopie confocale Raman est utilisée pour suivre des médicaments et des nanoparticules dans les cellules et dans les tissus durs. La microscopie Raman est non-invasive, ne nécessite aucun marqueur et permet une imagerie à haute résolution. Dans la première partie de l'étude cette méthode est utilisée pour suivre un médicament anticancéreux, le paclitaxel, au sein d'une lignée de cellules cancéreuses vivantes Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7). Les images Raman ont été traitées par un algorithme de partitionnement des données par k-moyennes pour détecter le paclitaxel dans les cellules. La distribution du paclitaxel dans les cellules est vérifiée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson entre le spectre de référence du traitement et les spectres de l'image entière. Le temps progressif de diffusion du paclitaxel dans toute la cellule est observé. Cette observation demande une étude complémentaire sur l'action pharmaceutique du produit, basé sur la liaison rapide de la tubuline libre au paclitaxel cristallisé. L'apoptose dans les cellules a été suivies par partitionnement de données et par corrélation. Le partitionnement de données a été utilisé pour déterminer la position de mitochondries dans les cellules ; le cytochrome C de distribution à l'intérieur des cellules est basé sur l'analyse de corrélation. L'apoptose des cellules est défini par le cytochrome C dans le cytoplasme de diffusion. Le cytochrome C agit comme un déclencheur pour l'activation en cascade des caspases, et sa libération par les mitochondries est un signe d'apoptose. La Co-localisation de cytochrome C est effectuée après incubation de cellules avec une concentration différente de paclitaxel. L'autre produit étudié est le dioxyde de titane. Le titane est largement utilisé pour les matériaux orthopédiques et dentaires implantés dans le corps humain. Il est inévitable que le sang prenne contact avec la surface de l'implant et des nanoparticules. Les nanoparticules de dioxyde de titane ont été suivies en intracellulaire dans les cellules MCF-7 et TERT épithéliales humaines (lignée orale cellulaire de kératinocytes OKF6/TERT-2). La détection des nanoparticules et leur toxicité ont été étudiées en utilisant deux méthodes d'analyse. La microscopie confocale Raman a également été utilisée pour réaliser l'analyse structurale et chimique de la jonction émail-dentine-résine et de la carie dentaire, grâce à une analyse précise des constituants minéraux et organiques. La microscopie Raman associée à des méthodes d'analyse de données ouvre de nouvelles portes pour la recherche en biologie-santé et en particulier en odontologie
"The Study of living cells and human dentin by confocal Raman microscopy"Confocal Raman microscopy is employed to trace drugs and nanoparticles intracellular and in hard tissues. Raman spectroscopy a non-invasive, label-free and high spatial resolution imaging technique in first part of the study is being used to trace the anticancer drug paclitaxel in living Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) cells. An analytical method was developed and applied to Raman data acquired. The Raman images were treated by K-mean cluster analysis to detect the drug in cells. Distribution of paclitaxel in cells is verified by calculating the Pearson correlation coefficient between the reference spectrum of the drug and the whole Raman image spectra. A time dependent gradual diffusion of paclitaxel all over the cell is observed suggesting a complementary picture of the pharmaceutical action of this drug based on rapid binding of free tubulin to crystallized paclitaxel. The apoptosis in the cells were followed by post-measurement analysis including K-mean clustering and Pearson correlation coefficient. K-mean clustering was used to determine mitochondria position in cells and cytochrome c distribution inside the cells was based on correlation analysis. Cell apoptosis is defined as cytochrome c diffusion in cytoplasm. Cytochrome c acts as a trigger for the activation of the caspase cascade, and its release from mitochondria is a sign of apoptosis. Co-localization of cytochrome c is done after cell incubation with different concentration of paclitaxel. The other product used was titanium dioxide. Titanium has been widely used for orthopedic and dental implant materials. When biomaterial is implanted into the human body, it is unavoidable that blood will contact the implant surface and nanoparticles. The question is: do these nanoparticles cause toxicity? Titanium dioxide nanoparticles were followed intracellular in MCF-7 cells and TERT epithelial human oral keratinocyte cell line (OKF6/TERT-2). Detection of nanoparticles and their toxicity were studied using two analytical methods. Confocal Raman microscopy were also used to obtain Structural analysis and chemical profile of Enamel – Dentine- Resin and Raman map of decay and sound dentin samples, through accurate analysis of the mineral and organic components. The Raman spectroscopy combined with this novel method developed in this study, will provide accurate finger prints of chemical composition and by post-measurement analysis of the data acquired more information would be obtained, which might open new gates in pharmaceutical and dentistry researches

La cellule lutte à chaque instant contre les perturbations afin de maintenir l'équilibre de son milieu intérieur, et permettre sa survie. L'apparition d'espèces oxydantes ou l'augmentation de la température sont autant de perturbations auxquelles la cellule doit faire face. Mon travail de thèse s'est articulé autour de la dynamique temporelle des stress oxydant et thermique en cellules vivantes. L’originalité de l’équipe où j’ai effectué ma thèse est de proposer une alternative aux photothérapies dynamiques en produisant directement, sans photosensibilisant, de l’oxygène singulet considéré comme l’agent cytotoxique principal. Cette façon de produire directement l’oxygène singulet permet non seulement d’adresser plus directement des questions de dosimétrie qui sont importantes en thérapie mais aussi d’identifier les macromolécules impliquées dans le stress oxydant. Dans une première partie je présenterai des études de cinétique photochimique qui ont permis de déterminer dans différents solvants et en cellule, le taux de production et la réactivité de l'oxygène singulet avec un partenaire spécifique. Dans une seconde partie, je présenterai mes travaux sur la dynamique temporelle de réponse au stress thermique en cellules vivantes. Le développement d’un modèle mathématique minimal de titration du stress thermique couplé à des expériences associant un facteur de transcription clef dans la régulation du stress, nous ont permis de mettre en évidence les contributions des principales réactions impliquées dans le mécanisme de réponse cellulaire au stress thermique
The cell fight everytime against disturbances to maintain the balance of its internal environment and ensure its survival. The appearance of oxidative species or increasing the temperature are all major perturbations which the cell has to face. My thesis is structured around the temporal dynamics of oxidative and thermal stress in living cells. The originality of the team where I did my thesis, is to propose an alternative way to phototherapy dynamic in producing directly, without photosensitizer, singlet oxygen which is considered as the main cytotoxic agent. This way of producing singlet oxygen directly allows to address dosimetry issues that are important in therapy but also, to identify the macromolecules involved in oxidative stress more directly. In the first part ,I will present photochemical kinetic studies that have enable to determine in different solvents and in cells, the production rate and the reactivity of singlet oxygen with a specific partner. In the second part, I will present my work on the temporal dynamics of heat stress response in living cells. The development of a minimal mathematical model of titration of thermal stress coupled with experiments involving a key transcription factor in the regulation of stress, allowed us to identify the main reactions involved in the mechanism of cell response to heat shock

Les tissus animaux constituent des systèmes biologiques hautement organisés, où les échelles cellulaire et multicellulaire sont en corrélation constante. Non seulement les cellules régulent leur comportement au moyen de signaux biochimiques : elles transmettent aussi des stimuli mécaniques, via le cytosquelette et les complexes d'adhésion, ce qui conduit à la formation d'une organisation collective tridimensionnelle où cellules et tissu se contraignent mutuellement. Afin d'étudier les aspects mécaniques et géométriques des interactions entre cellules, nous avons cultivé des tissus épithéliaux sur des micro-environnements artificiels. Nous avons fabriqué des substrats microstructurés en polyacrylamide et en polydiméthylsiloxane, de rigidité et de géométrie définies, sur lesquels nous avons fait croître un épithélium de MDCK. Nous avons également modifié les propriétés adhésives de ces substrats pour y confiner une seule cellule et simuler ainsi les contraintes topologiques du tissu sur une cellule individuelle. Après avoir marqué les composants internes gouvernant l'architecture cellulaire, nous avons pu en obtenir des images 3D en microscopie confocale et quantifier la morphologie des cellules. Les distributions de volume des cellules et des noyaux mesurées diffèrent en fonction de leur localisation au sein du tissu, ainsi que de la géométrie et de la rigidité de l'environnement. En modifiant ces paramètres expérimentaux, nous avons pu observer l'effet de contraintes externes sur la morphologie cellulaire. Enfin, nous avons remarqué que le relief du tissu dépendait de la topographie du substrat, et nous en avons proposé un modèle qui lie les deux échelles d'organisation
Animal tissues constitute highly organized biological Systems, where the cellular and rmulticellular levels are in constant interrelation. Not only do cells regulate their behaviour via biochemical signalling: they also transmit mechanical stimuli, through the cytoskeleton and adhesion complexes, which leads to the formation of a tridimensional collective organization where cells and tissues constrain each other. To investigate the mechanical and geometrical aspects of intercellular interactions, we cultivated epithelial tissues on artificial micro-environments. We manufactured polyacrylamide and polydimethylsiloxane microstructured substrates with precise stiffness and geometry, which we grew MDCK epithelia on. We also modulated the adhesive properties of these substrates in order to confine a single cell and simulate the topological constraints of the tissue on an individual cell. After staining the internal components which govern cell architecture, we were able to obtain 3D images using confocal microscopy and to quantify the morphology of the cells. The measured volume distributions of cells and nuclei differed according to their localization within the tissue, as well as to the geometry and stiffness of the environment. Modifying these experimental parameters made it possible to observe the effect of external constraints on cell morphology. Finally, we found that the tissue profile depended on the topography of the substrate, and we suggested a mode! which correlates both organizational levels

L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésion
The aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process

Les Quantum Dots (QDs) sont des nanocristaux de semiconducteurs qui possèdent des propriétés optiques hors du commun. Leur utilisation comme sondes en biologie nécessite leur solubilisation dans l'eau, grâce à une chimie de surface adaptée, qui influence la taille finale du QD, ses propriétés optiques et son interaction avec l'environnement biologique. Nous avons développé un nouveau ligand, l'acide dihydrolipoïque-sulfobétaïne (DHLA-SB), qui permet d'obtenir des QDs à la fois petits, stables dans une vaste gamme de pH, dans des solutions saturées en sel et dans le temps, et avec une très faible adsorption non spécifique sur les cellules. Nous avons observé et caractérisé le comportement intracellulaire des QDs DHLA-SB au cours du temps et nous l'avons comparé à celui de deux autres classes de QDs : cette étude a clairement montré l'influence de la chimie de surface sur le devenir intracellulaire des nanoparticules et a révélé une stabilité accrue des QDs DHLA-SB. Nous nous sommes également intéressés à la fonctionnalisation des QDs avec la streptavidine (SA) ou la biotine afin de marquer spécifiquement des cellules vivantes ou fixées. Les QDs-SA DHLA-SB obtenus ont permis de suivre un récepteur membranaire ou encore de marquer de façon spécifique une protéine biotinylée à l'intérieur de cellules vivantes, bien plus efficacement qu'avec les QDs-SA commerciaux (Invitrogen). Enfin, nous avons proposé d'utiliser les QDs DHLA-SB pour améliorer une technique de microscopie à illumination structurée, la microscopie HiLo bicouleur, et obtenir une coupe optique (type image confocale) d'échantillons biologiques épais en une seule image.

L’ADN est constamment soumis à de nombreux stress, menaçant son intégrité et, par conséquent, le bon fonctionnement cellulaire. Pour y faire face, la cellule dispose de tout un arsenal de voies de réparation. L’une des altération du génome les plus fréquentes est l’oxydation de la guanine en 8-oxoguanine (8-oxoG). La 8-oxoG possède un fort potentiel mutagène du fait de son appariement préférentiel avec l’adénine au lieu de la cytosine lors de la réplication. Ainsi, elle doit être détectée et réparée à temps pour éviter la fixation dans le génome de mutation par transversion G:C vers T:A. Cette lésion appairée à une cytosine est détectée et excisée par la 8-oxoguanine ADN-glycosylase (OGG1), ce qui initie la réparation par excision de base. Si le fonctionnement d’OGG1 a été largement étudié in vitro et que de nombreuses données structurales sont disponibles, très peu d’études se sont penchées sur la dynamique de cette protéine au sein du noyau cellulaire. Le but de ma thèse était donc de caractériser la dynamique de recherche de la 8-oxoG par OGG1 et d’identifier les éléments (résidus ou fonctions) régulant cette dynamique. Ainsi, j’ai pu montrer que l’interaction avec l’ADN était un élément majeur de la recherche de la 8-oxoG par OGG1, et que muter les résidus impliqués dans l’interaction avec l’ADN perturbait la dynamique d’OGG1 et sa capacité à trouver et exciser la 8-oxoG. De même, la reconnaissance de la 8-oxoG, mais également celle de la cytosine lui faisant face, jouent toutes deux un rôle important dans le fonctionnement de l’ADN-glycosylase et son recrutement à la zone de dommages. Enfin, le motif NNN, très conservé mais très peu caractérisé jusqu’ici semble être essentiel à l’association spécifique avec la 8-oxoG mais pas à la dynamique de recherche
DNA is constantly subjected to various stress, threatening its integrity, and consequently, the proper functioning of the cell. In order to preserve the genomic integrity, the cell can activate a large set of repair pathways. One of the most common genomic alteration is the base modification 8-oxoguanine (8-oxoG), an oxidized form of guanine. It is highly mutagenic, due to its tendency to pair with adenine instead of cytosine during replication. Thus, it needs to be detected and repaired on time to avoid G:C to T:A transversions. 8-oxoG paired with cytosine is recognized and excised by the 8-oxoguanine DNA-glycosylase (OGG1), which initiates the base excision repair pathway. Although OGG1 has been widely studied in vitro and many structural data are available, many questions remain concerning the dynamics of the protein within the cell nucleus. Hence, the goal of my PhD project was to characterize the dynamics of OGG1 searching for 8-oxoG and get new insights about the residues or functions of OGG1 that regulate these dynamics. I was able to show that the interaction between OGG1 and DNA is crucial for the efficient search of 8-oxoG, and that mutating the residues involved in such interaction impairs OGG1 dynamics and its ability to detect and excise 8-oxoG. Similarly, 8-oxoG detection, but also that of the facing cytosine, both play an important role in the function of the DNA-glycosylase and in its ability to accumulate at the sites of damage. Finally, the NNN motif, which is highly conserved but very poorly characterized, seems to be essential to the specific association with 8-oxoG, but not for the nuclear exploration by OGG1

L’effet photothermique permet de détecter efficacement des nanoparticules d’or avec un microscope en champ lointain grâce à leur forte absorption de la lumière. L’absence de problème photophysique fait des nanoparticules d’or une alternative au marquage de biomolécules par des sondes fluorescentes. La méthode PhACS (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) utilise les fluctuations de signal photothermique dues au passage de nanoparticules dans le volume de détection pour étudier leur diffusion. Cette méthode permet également la mesure précise de diamètres hydrodynamiques de nanoparticules fonctionnalisées. La méthode SNaPT (Single Nano-Particle Tracking) réalise le suivi bidimensionnel de nanoparticules individuelles grâce à une localisation effectuée par triangulation. Nous avons appliqué cette méthode pour étudier la diffusion des intégrines alphaV-beta3 marquées par des nanoparticules d’or de 5 nm dans les adhérences focales, points d’ancrage entre le cytosquelette de la cellule et la matrice extracellulaire. Nous observons que ces intégrines ont tendance à former des agrégats qui alternent entre un mouvement diffusif et un mouvement confiné. Ce résultat appelle maintenant à un nouveau modèle où nous aurions une redistribution continue des intégrines au sein des adhérences focales
Gold nanoparticles may be detected with optical far-field microscopy by use of the photothermal effect due to their strong light absorbance. With no photophysic issues, gold nanoparticles are an alternative to fluorescent probes for use in biological systems. The PhACS method (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) is used to study diffusion by measuring the autocorrelation of photothermal signal fluctuations due to nanoparticles passing through the detection volume. This method is sensitive enough to mesure the precise hydrodynamic diameter of functionalised nanoparticles. The SnaPT method (Single Nano-Particle Tracking) can track 2-dimensional motion of individual nanoparticles by pinpointing the localization with a triangulation method. The SNaPT method was used to study motion of alphaV-beta3 integrins that were bound to a 5 nm gold nanoparticle inside focal adhesion, where the cell cytoskeleton is linked to the extracullular matrix. The integrin was found to organize into clusters oscillating between the bound and diffuse states. These observations require new working models where integrins would be constantly redistributed

La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats
The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme

Le but de notre travail est de mieux comprendre les interactions entre cellule hote de type neuronal et virus herpes simplex type-1 (hsv-1) en cellules vivantes. Nos etudes ont ete effectuees par microscopie de fluorescence au niveau unicellulaire. La thymidine kinase (tk) virale a ete impliquee dans l'etablissement de la latence et la reactivation. Grace a des etudes de durees de vie de fluorescence au niveau unicellulaire, nous avons determine, par des mesures de transfert d'energie (fret et homo-fret) entre des variants spectraux de la green fluorescent protein (gfp) fusionnes aux extremites n- ou c-terminales de la proteine tk, que celle-ci est sous forme de dimeres actifs en cellules vivantes. De plus, la disparition des 10 acides amines c-terminaux de cette proteine provoque une diminution de 90% de son activite enzymatique. Nous avons construit deux virus recombines exprimant des portions de tk fusionnees a la gfp, l'un deficient en tk, l'autre deficient a la fois en tk et en ul24, et nous les avons caracterises par des techniques de biologie moleculaire et biochimiques. Le virus deficient en ul24 ne montre pas de defaut majeur de replication en cellules cyclantes par rapport aux virus de phenotype ul24 sauvage. L'infection de cellules de type neuronal, les nd7, par le virus kos sauvage ou par l'un des deux virus recombines declenche les evenements precoces de l'apoptose (diminution partielle du potentiel de membrane mitochondriale, exposition de la phosphatidyl serine), mais n'induit pas ses evenements tardifs (condensation de la chromatine, activation des caspases). Ceci suggere que l'apoptose serait bloquee des la premiere heure apres l'infection des cellules, probablement par l'expression d'une ou de plusieurs proteines virales tres precoces. De plus, ni la proteine tk, ni la proteine ul24 ne semblent impliquees dans l'induction ou le blocage de l'apoptose induits par les virus. Les proteines virales tardives n'etant pas exprimees dans les nd7, vraisemblablement aucun virion mature n'est forme. Ceci suggere que ces cellules constituent un bon modele pour des etudes de la latence du hsv-1.

Ce chapitre présente l’intérêt d’analyser la forme d’un front d’onde dans le plan image d’un microscope optique pour en déduire un ensemble de propriétés d’échantillons transparents. On produit ainsi des cartes d’épaisseur optique conduisant à un contraste marqué, ou encore l’imagerie sélective de composants optiquement anisotropes. Surtout, la méthode est quantitative et permet certaines mesures, comme le suivi de la masse sèche de cellules biologiques vivantes.

La thèse de Church-Turing énonce qu’il n’y a qu’une seule notion universelle de calcul mécaniste, qui donc, d’une façon ou d’une autre, doit permettre de réconcilier le traitement de l’information en informatique et en biologie cellulaire. La preuve récente de Turing-complétude des réseaux de réactions chimiques continus sur un nombre fini d’espèces moléculaires, fournit les bases d’une telle réconciliation, sans construction artificielle, avec des capacités à la fois d’analyse des programmes chimiques naturels dans les cellules vivantes, et de synthèse de programmes chimiques artificiels dans des vésicules non vivantes. Ces résultats ouvrent un vaste champ de recherche fondamentale sur l’informatique analogique chimique de la cellule et des applications nouvelles en santé et environnement.