Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Microscopie de molécules uniques“

La microscopie de localisation de molécules individuelles permet de dépasser la limite de diffraction, révélant ainsi l’organisation cellulaire à l’échelle nanométrique. Cette méthode reposant sur l’analyse spatiale du signal émis par les molécules, reste souvent limitée à l’observation d’objets biologiques à de faibles profondeurs, ou très peu aberrants. Nous montrons ici que l’introduction d’un paramètre temporel dans le processus de localisation via l’introduction d’une excitation modulée permet d’adresser ces limitations.

De par leurs caractéristiques structurales bien connues, les zéolithes sont fréquemment utilisées pour leur capacité à catalyser, à échanger des ions ou à adsorber certaines molécules. Ces matériaux sont également utilisés comme phase active pour réaliser des membranes. Dans ce travail, une membrane céramique d’ultrafiltration a été réalisée en imprégnant de la Mordenite (phase active) sur un support en alumine. La structure et les caractéristiques morphologiques de cette membrane ont été étudiées (diffraction de rayons X, BET / BJH (Brunauer-Emmett-Teller et Brunauer-Joyner-Hallenda), microscopie électronique à balayage). Des mesures de potentiels zêta et d’écoulement ont été réalisées sur la phase active en présence de différentes solutions salines, afin de caractériser qualitativement et quantitativement les charges de surface de la phase active de la membrane. La sélectivité de la membrane vis-à-vis de solutions salines pures a été étudiée sur un pilote d’ultrafiltration de laboratoire. Aucune rétention n’a été observée lors de la filtration d’une solution de chlorure de sodium. Compte tenu des propriétés électriques de la membrane (fortement chargée négativement), une expérience de filtration a été réalisée en présence d’un sel divalent (Na2CO3). Dans ces conditions, une rétention importante a été observée. Après rinçage à l’eau pure, un nouvel essai de filtration a été réalisé en présence de solution de sel monovalent (NaCl) et a conduit à un taux de rétention de l’ordre de 10 % . Ce phénomène semble être lié au traitement et à la présence d’ions carbonates. Après un lavage acide, la membrane finit par retrouver ses propriétés initiales. Pour conclure, une membrane Mordenite d’ultrafiltration a été réalisée avec des propriétés de filtration qui peuvent être réversiblement modifiées par un simple traitement chimique.

A la question «Qui de l’oeuf ou de la poule est né le premier ?» Silésius répondait «l’oeuf est dans la poule et la poule dans l’oeuf» soulignant sa dualité, le passage du deux en un. Dans l’imagerie populaire, l’oeuf reflète le tout et son contraire, fragilité, protection, épargne, abondance (être «plein comme un oeuf»), richesse («avoir pondu ses oeufs»), éternité (le Phénix est né de l’oeuf) mais aussi mort et destruction («casser ses oeufs» se dit d’une fausse couche). Dans la mythologie de nombreuses civilisations, l’oeuf est le symbole de la naissance du monde (Apollon, le dieu grec de la lumière est né de l’oeuf). L’oeuf décoré apparu 3000 ans avant J.-C. en Ukraine fête, au printemps, le retour de la fécondité de la nature ; l’oeuf de Pâques la résurrection du Christ. L’oeuf est un tout à condition d’en sortir ! Fragile cependant car selon La Fontaine briser l’oeuf de la poule aux oeufs d’or (par curiosité) rompt l’effet magique (Auer et Streff 1999). Pour l’Homme, l’oeuf séduit pour sa valeur nutritionnelle, sa diversité d’utilisation en cuisine et son prix modique. Il en existe une grande diversité, de l’oeuf de Colibri (0,5 g) à l’oeuf de l’Aepyornis (8 litres soit l’équivalent de 150 oeufs), un oiseau de Madagascar (500 kg) disparu au 18ème siècle. Mais l’Homme ne consomme que l’oeuf de caille, de poule ou de cane. L’ère moderne a considérablement intensifié la production de ces deux dernières espèces car les poules saisonnées, qui étaient élevées avec soin par la fermière, ont plus que doublé leur production en 60 ans (de 120 oeufs par an dans les années 50 à plus de 300 aujourd’hui). Cette révolution technique résulte des efforts conjugués de la sélection génétique, d’une alimentation raisonnée répondant aux besoins nutritionnels, d’une évolution du système de production (apparition des cages) et d’une meilleure connaissance de la pathologie aviaire. Qu’en est-il du contrôle de la qualité nutritionnelle, organoleptique, technologique et hygiénique de l’oeuf ? L’oeuf est la plus large cellule reproductrice en biologie animale. Il assure dans un milieu externe le développement et la protection d’un embryon dans une enceinte fermée matérialisée par la coquille. Aussi, une de ses particularités est la diversité de ses constituants, de leur parfait équilibre nutritionnel et leur forte digestibilité, qui assure la croissance d’un être vivant. Ces caractéristiques sont à l’origine de la qualité nutritionnelle exceptionnelle de l’oeuf pour l’Homme. Une autre particularité est la présence d’une protection physique, la coquille mais, aussi d’un système complexe de défenses chimiques. Aussi, ce produit est-il remarquable de par son aptitude à engendrer la vie et pour l’oeuf de table à se conserver. Outre les éléments nutritifs, on y trouve de multiples molécules participant au développement et à la protection de l’embryon (molécules antibactériennes, antivirales, antioxydantes). Certaines d’entre elles, comme par exemple le lysozyme de blanc d’oeuf, sont partiellement valorisées par différents secteurs industriels (agroalimentaire, cosmétique, santé animale/humaine). La révélation récente d’un grand nombre de nouveaux constituants de l’oeuf, suite au séquençage génomique de la poule et au développement de la biologie intégrative, a conforté l’existence d‘activités antimicrobiennes, anti-adhésives, immuno-modulatrices, hypertensives, anticancéreuses, antiinflammatoires ou cryoprotectrices, prometteuses en médecine humaine et devrait à terme enrichir le potentiel d’utilisation de ce produit en agroalimentaire et en santé. L’objet de ce numéro spécial d’INRA Productions Animales est de rassembler les principales informations qui ont contribué au développement économique récent de ce produit, de rappeler les efforts en génétique, élevage et nutrition qui ont assuré des progrès quantitatifs et qualitatifs remarquables de la production et de la qualité des oeufs au cours des trente dernières années. Les poules élevées à l’origine par la femme pour un usage domestique se comptent aujourd’hui par milliers dans les élevages. Quelle sera la durabilité de ce système d’élevage dans un contexte socio-économique européen remettant en cause en 2012 le système éprouvé de production conventionnel d’oeufs en cage pour des cages aménagées ou des systèmes alternatifs avec ou sans parcours ? Notre objectif est d’analyser les facteurs qui contribueront à son maintien, notamment le contrôle de la qualité de l’oeuf. Il est aussi de décrire l’évolution spectaculaire des connaissances sur ce produit liée au développement des techniques à haut débit et des outils d’analyse des séquences moléculaires. Il permettra enfin d’actualiser les atouts de ce produit. Ce numéro est complémentaire d’un ouvrage plus exhaustif sur la production et la qualité de l’oeuf (Nau et al 2010). Le premier article de P. Magdelaine souligne la croissance considérable en 20 ans de la production d’oeufs dans les pays d’Asie et d’Amérique du Sud (× 4 pour la Chine, × 2 en Inde et au Mexique). En revanche, les pays très développés notamment européens à forte consommation (> 150 oeufs/hab) ont stabilisé leur production malgré une évolution importante de la part des ovoproduits mais aussi de leurs systèmes de production. La consommation des protéines animales entre pays est tout aussi hétérogène puisque le ratio protéines de l’oeuf / protéines du lait varie de 0,4 au USA, à 0,9 en France et 2,7 en Chine ! Le doublement de la production mondiale d’oeufs en 20 ans n’a été possible que grâce à des progrès techniques considérables. La sélection génétique a renforcé les gains de productivité (+ 40 oeufs pour une année de production et réduction de l’indice de consommation de 15% en 20 ans !). L’article de C. Beaumont et al décrit cette évolution, la prise en compte croissante de nouveaux critères de qualité technologique, nutritionnelle ou sanitaire. Ces auteurs soulignent les apports des nouvelles technologies, marqueurs moléculaires et cartes génétiques sur les méthodes de sélection. Ils dressent un bilan actualisé des apports et du potentiel de cette évolution récente en sélection. Le séquençage génomique et le développement de la génomique fonctionnelle est aussi à l’origine d’une vraie révolution des connaissances sur les constituants de l’oeuf comme le démontre l’article de J. Gautron et al. Le nombre de protéines identifiées dans l’oeuf a été multiplié par plus de dix fois et devrait dans un avenir proche permettre la caractérisation fonctionnelle de nombreuses molécules. Il donne aussi de nouveaux moyens pour prospecter les mécanismes d’élaboration de ce produit. Un exemple de l’apport de ces nouvelles technologies est illustré par l’article de Y. Nys et al sur les propriétés et la formation de la coquille. Des progrès considérables sur la compréhension de l’élaboration de cette structure minérale sophistiquée ont été réalisés suite à l’identification des constituants organiques de la coquille puis de l’analyse de leur fonction potentielle élucidée grâce à la disponibilité des séquences des gènes et protéines associés. La mise en place de collaborations internationales associant de nombreuses disciplines, (microscopie électronique, biochimie, cristallographie, mécanique des matériaux) a démontré le rôle de ces protéines dans le processus de minéralisation et du contrôle de la texture de la coquille et de ses propriétés mécaniques. Cette progression des connaissances a permis de mieux comprendre l’origine de la dégradation de la solidité de la coquille observée chez les poules en fin d’année de production. La physiologie de la poule est responsable d’évolution importante de la qualité de l’oeuf. Aussi, l’article de A. Travel et al rappelle l’importance d’effets négatifs de l’âge de la poule contre lequel nous disposons de peu de moyens. Cet article résume également les principales données, souvent anciennes, concernant l’influence importante des programmes lumineux ou de la mue pour améliorer la qualité de l’oeuf. Enfin, il souligne l’importance de l’exposition des poules à de hautes températures ambiantes sur leur physiologie et la qualité de l’oeuf. Le troisième facteur indispensable à l’expression du potentiel génétique des poules, et déterminant de la qualité technologique et nutritionnelle de l’oeuf, est la nutrition de la poule. Elle représente plus de 60% du coût de production. L’article de I. Bouvarel et al fait le point sur l’influence de la concentration énergétique de l’aliment, de l’apport en protéines et acides aminés, acides gras et minéraux sur le poids de l’oeuf, la proportion de blanc et de jaune ou sa composition notamment pour obtenir des oeufs enrichis en nutriments d’intérêt en nutrition humaine. Cependant, la préoccupation principale des éleveurs depuis une dizaine d’année est la mise en place en 2012 de nouveaux systèmes de production d’oeufs pour assurer une meilleure prise en compte du bien-être animal. L’article de S. Mallet et al traite de l’impact des systèmes alternatifs sur la qualité hygiénique de l’oeuf. Ces auteurs concluent positivement sur l’introduction de ces nouveaux systèmes pour la qualité hygiénique de l’oeuf une fois que les difficultés associées aux méconnaissances d’un nouveau système de production seront résolues. La qualité sanitaire de l’oeuf est la préoccupation majeure des consommateurs et un accident sanitaire a des conséquences considérables sur la consommation d’oeufs. L’article de F. Baron et S. Jan résume d’une manière exhaustive l’ensemble des éléments déterminants de la qualité microbiologique de l’oeuf et des ovoproduits : mode de contamination, développement des bactéries dans les compartiments de l’oeuf, défenses chimiques du blanc et moyens pour contrôler la contamination des oeufs et des ovoproduits. Le consommateur ne souhaite pas, à juste titre, ingérer d’éventuels contaminants chimiques présents dans ses aliments. L’article de C. Jondreville et al analyse ce risque associé à la consommation des oeufs. Il est exceptionnel de détecter la présence de polluants organiques au seuil toléré par la législation. Les auteurs insistent notamment sur l’importance de contrôler la consommation par les animaux élevés en plein air de sols qui peuvent être une source de contaminants. Une caractéristique de l’évolution de la production d’oeufs est le développement des ovoproduits qui répondent parfaitement à l’usage et à la sécurité sanitaire exigée en restauration collective. L’article de M. Anton et al décrit le processus d’obtention et l’intérêt des fractions d’oeufs du fait de leurs propriétés technologiques (pouvoirs moussant, foisonnant, gélifiant ou émulsifiant). Les différents processus de séparation, de décontamination et de stabilisation sont analysés pour leur effet sur la qualité du produit final. Enfin le dernier article de ce numéro spécial de F. Nau et al se devait d’aborder la principale qualité de l’oeuf qui conditionne son usage : la qualité nutritionnelle de ce produit pour l’Homme. Cet article actualise l’information dans ce domaine et fait le point sur les atouts nutritionnels en tentant de corriger de fausses idées. L’oeuf présente un intérêt nutritionnel du fait de la diversité et l’équilibre de ces constituants pour l’Homme mais mériterait plus d’études pour mieux évaluer son potentiel réel. En conclusion, l’oeuf est la source de protéines animales ayant la meilleure valeur nutritionnelle, la moins chère, facile d’emploi et possédant de nombreuses propriétés techno-fonctionnelles valorisées en cuisine. Dans les pays développés, l’oeuf a souffert jusqu’à aujourd’hui d’une image entachée par plusieurs éléments négatifs aux yeux des consommateurs : sa richesse en cholestérol, le risque sanitaire associé à sa consommation sous forme crue ou son système de production en cage. L’évolution des connaissances sur le risque cardio-vasculaire, les progrès réalisés sur le contrôle sanitaire des Salmonelloses en Europe et la modification radicale des systèmes de production d’oeufs devraient modifier positivement son image. La consommation de protéines de l’oeuf a augmenté de plus de 25% en 20 ans (2,53 g/personne/j vs 4,3 g pour le lait en 2005) et poursuivra sa croissance rapide notamment dans les pays en développementoù sa consommation par habitant reste faible. Cette évolution considérable de la production de ce produit devrait être mieux intégrée dans les formations des écoles spécialisées en productions animales. L’oeuf restera dans l’avenir une des sources de protéines animales dominantes et l’acquisition de connaissances sur la fonction des nombreux constituants récemment mis à jour devait renforcer son intérêt pour la santé de l’Homme. Je ne voudrais pas terminer cette préface sans remercier au nom des auteurs, Jean-Marc Perez, le responsable de la revue INRA Productions Animales, d’avoir pris l'initiative de la publication de ce numéro spécial dédié à l'oeuf et d’avoir amélioré par plusieurs lectures attentives la qualité finale des textes. Je voudrais aussi adresser mes remerciements à sa collaboratrice Danièle Caste pour le soin apporté dans la finition de ce document. Enfin, je n'oublie pas le travail d'évaluation critique des projets d'article par les différents lecteursarbitres que je tiens à remercier ici collectivement. Auer M., Streff J., 1999. Histoires d’oeufs. Idées et Calendes, Neuchatel, Suisse, 261p.Nau F., Guérin-Dubiard C., Baron F., Thapon J.L., 2010. Science et technologie de l’oeuf et des ovoproduits, Editions Tec et Doc Lavoisier, Paris, France, vol 1, 361p., vol 2, 552p.

Introduction : Le but de l’étude était de développer des hydrogels oraux à base de chitosane pH- sensibles, capables de libérer le phénobarbital dans l'intestin grêle du nouveau-né. Ces hydrogels amélioreraient sa biodisponibilité et son efficacité thérapeutique. Matériel et méthodes : La formulation des hydrogels a été effectuée à 37±1°C via la transition sol-gel en utilisant la méthode du tube inversé. Les hydrogels contenaient 2,45 et 2,55% de chitosane, du phénobarbital avec/sans EudragitE100. Au cours de ces expériences, nous avons étudié les énergies d’interactions mises en jeu entre les chaînes de chitosane elles-mêmes, et le chitosane avec les molécules présentes, responsables de la formation des hydrogels. Une caractérisation morphologique des hydrogels par microscopie électronique à balayage a été réalisée pour déterminer leur structure. Des études du mécanisme de libération du phénobarbital à partir d'hydrogels introduits dans des milieux mimant les valeurs de pH du tractus gastro-intestinal du nouveau-né ont été réalisées. Le dosage de la quantité de phénobarbital libérée en fonction du temps a été effectué par spectrophotométrie. Résultats : Les résultats ont montré que le temps de transition sol-gel diminuait lorsque la concentration en chitosane augmentait. La structure des hydrogels était hétérogène. La quantité de phénobarbital libérée était plus importante au pH mimant l’intestin grêle pour les hydrogels contenant 2,45% de chitosane et de l’eudragitE100. Le modèle Korsmeyer-Peppas a été utilisé pour ajuster les profils de libération du phénobarbital. Conclusion : Les hydrogels formulés ont libéré plus le phénobarbital dans le milieu mimant le pH de l’intestin grêle du nouveau-né selon une libération pulsatil

La microscopie de molécule unique (single-molecule microscopy, SMM) regroupe un ensemble de techniques pour la biologie moléculaire et cellulaire permettant de visualiser le mouvement de molécules biologiques individuelles. Néanmoins, les techniques SMM imposent de fortes contraintes en ce qui concerne les luminophores utilisés. Récemment, un nouveau luminophore appelé «particule à conversion ascendante» (upconverting nanoparticles, UCNP) a attiré l'attention de la communauté scientifique en raison de son émission efficace de lumière visible après une excitation par de la lumière infrarouge. Cette propriété fait des UCNPs un luminophore très intéressant pour les applications biologiques : l'excitation infrarouge permet d'éliminer l’autofluorescence, généralement associé à une excitation dans la gamme du visible. De plus, la photostabilité extrême des UCNP et l’absence de photoclignotement sont également de précieux atouts pour les expériences SMM. L’objectif de cette thèse était d’adapter les UCNPs aux applications SMM, avec le but ultime d’exploiter leurs propriétés uniques pour améliorer les performances des expériences SMM. Au cours du projet, les protocoles de dispersion des UCNPs dans des tampons aqueux ont été optimisées pour conserver une bonne monodispersité des particules; l'efficacité des UCNPs dans les expériences de transfert résonant d'énergie en particule unique a été estimée; des protocoles pour l'imagerie d'UCNPs uniques ont été développés; et la preuve de concept de l'utilisation des UCNPs dans des expériences de suivi de molécules uniques à la surface de cellules vivantes a été réalisée. Finalement, ces résultats forment une base solide pour de futures expériences SMM utilisant les UCNPs
Single-molecule microscopy (SMM) is a powerful set of techniques for molecular and cell biology that allows visualizing the movement of individual biological molecules, but has strict requirements towards the utilized luminophores. Recently, a new luminophore called upconverting particles (UCNPs) gained attention of the research community due to their efficient emission of visible light upon excitation with infrared light. This property makes UCNPs a valuable luminophore for biological applications due to the elimination of autofluorescence background, commonly associated with regular visible light excitation. Extreme photostability of UCNPs and absence of sporadic photoswitching are also valuable for SMM experiments. The objective of this thesis was to adapt UCNPs to SMM applications, with the ultimate goal of exploiting their unique properties towards superior performance of SMM experiments. During the project, protocols for dispersing UCNPs in aqueous buffers were streamlined to provide superior particle monodispersity; the efficiency of UCNPs in single-molecule resonance energy transfer experiments was estimated; protocols for single-molecule imaging with UCNPs were developed; and a proof-of-concept system for targeted single-molecule tracking with UCNPs in live cells was demonstrated. Overall, these findings will serve as a foundation towards robust SMM assays based on UCNPs

L’imagerie tridimensionnelle par localisation de molécules uniques (SMLM) permet d’obtenir des résolutions de quelques dizaines de nanomètres mais présentent encore certaines limitations liées notamment à une précision axiale non uniforme et une profondeur d’observation souvent limitée au premier micron de l’échantillon. Nous proposons ici une nouvelle approche de localisation de molécules uniques, appelée ModLoc, qui repose sur la modulation et la démodulation du signal de fluorescence des molécules uniques via l’utilisation d’une excitation structurée et modulée temporellement. Dans un premier temps, nous exposons les fondamentaux de l’imagerie SMLM et les limites actuelles de ce domaine. Les subtilités de ce nouveau principe de localisation sont ensuite détaillées et montrent un gain de précision théorique d’un facteur 3. Des études du caractère temporel aléatoire de l’émission des sondes fluorescentes en imagerie SMLM révèlent la nécessité d’intégrer des solutions optiques rapides (proche du kHz). La validation expérimentale du gain en précision accessible est démontrée grâce à la mise en place de deux dispositifs optiques. Nous choisissons d’appliquer ce principe afin d’améliorer la précision de localisation axiale des molécules fluorescentes. Les résultats obtenus mettent en évidence une précision de localisation uniforme de 7.5 nm et jusqu’à 7 microns en profondeur sur des échantillons de calibrations et des échantillons biologiques. La robustesse de la méthode pour l’imagerie SMLM en profondeur est également démontrée grâce notamment à des acquisitions effectuées à 30 µm de profondeur dans des milieux aberrants. Différentes pistes d’amélioration du dispositif actuel ainsi que l’extension de cette approche de localisation modulée à l’observation d’autres grandeurs telle que le temps de vie et l’orientation des molécules fluorescentes sont proposées
Three-dimensional imaging by localization of single molecules (SMLM) makes it possible to obtain resolutions of a few tens of nanometers, but still has certain limitations related in particular to non-uniform axial precision and a depth of observation often limited to the first micron of the sample. We propose here a new approach to single molecule localization, called ModLoc, which is based on the modulation and demodulation of the fluorescence signal of single molecules through the use of structured and time-modulated excitation. First, we present the fundamentals of SMLM imaging and the current limitations of this field. The subtleties of this new localization principle are then detailed and show a theoretical gain in precision by a factor of 3. Temporal emission studies of fluorescent probes in SMLM imaging reveal the need to integrate fast optical solutions (close to kHz). Experimental validation of the precision gain is demonstrated by the implementation of two optical devices. We choose to apply this principle in order to improve the accuracy of axial localization of fluorescent molecules. The results obtained show a uniform localization precision of 7.5 nm and up to 7 microns in depth on calibration samples and biological samples. The robustness of the method for in-depth MMS imaging is also demonstrated thanks in particular to acquisitions carried out at a depth of 30 µm in aberrant media. Various ways of improving the current device as well as the extension of this modulated localization approach to the observation of other quantities such as the life time and orientation of fluorescent molecules are proposed

La microscopie de fluorescence est une puissante technique pour l'observation d'échantillons biologiques et la compréhension de processus moléculaires. Les deux dernières décennies ont été témoins de grandes avancées dans ce domaine, notamment avec le développement des techniques de "super-résolution", qui permettent l'observation de structures plus fines que la limite de diffraction de la lumière visible (~200 nm). Une de ces techniques les plus populaires est le PALM (Photoactivated Localisation Microscopy, microscopie par localisation photoactivée), qui utilise des protéines fluorescentes phototransformables (PTFPs) pour observer des molécules uniques, et les localiser avec une précision de 10-20 nm. Les PTFPs sont des protéines de la même famille que la GFP (Green Fluorescent Protein, protéine fluorescente verte), qui non-seulement produisent de la fluorescence, mais peuvent aussi subir des réactions photo-induites, comme l'activation de fluorescence ou le changement de couleur d'émission. Ces propriétés sont à la base du PALM, puisqu'elle permettent la séparation temporelle stochastique des émissions de fluorescence, et l'imagerie de molécules uniques. Le fait que le PALM détecte des molécules uniques a conduit au développement d'un grand nombre d'applications, dont le sptPALM (single-particle tracking PALM, suivi de molécules uniques en PALM) et le PALM quantitatif (qPALM). Ces applications avancées permettent déjà d'acquérir des informations précieuses sur le fonctionnement des systèmes biologiques, mais leur utilisation reste difficile. Une des raisons en est le comportement photophysique complexe des PTFPs, qui va au-delà des transformations utiles pour l'imagerie PALM.L'objet de cette thèse était donc de caractériser les réactions photo-induites subies par les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs, qui sont parmi les marqueurs les plus populaires en PALM), dans le but d'améliorer les approches de suivi de molécules uniques et quantitatives en PALM. En particulier, ce travail cherchait à comprendre les pertes transitoires de fluorescence, connues sous le terme de scintillement (blinking en anglais), qui sont détrimentales aux expériences PALM. Une caractérisation poussée des réactions photo-induites ayant lieu dans les formes verte et rouge de la PCFP étudiée nous a suggéré une stratégie pour réduire l'influence du scintillement, et des artéfacts qu'il produit. Enfin, cette stratégie a été appliquée à une expérience de qPALM.Ce travail constitue un pas en avant vers une meilleure compréhension de la photophysique des PCFPs, et une meilleure extraction d'informations quantitatives des données PALM
Fluorescence microscopy is a powerful tool for the observation of biological specimens and the understanding of molecular processes. The last two decades have seen tremendous advances in the field, notably with the development of “super-resolution” techniques, which allow the observation of structures smaller than the diffraction limit of visible light (~200 nm). One of the most popular of these techniques is Photoactivated Localisation Microscopy (PALM), which uses Phototransformable Fluorescent Proteins (PTFPs) to image single molecules and localise them with 10-20 nm precision. PTFPs are proteins from the Green Fluorescent Protein (GFP) family, which not only produce fluorescence, but can also undergo light-induced reactions such as fluorescence activation or change in emission color. These specific properties are at the base of PALM, since they allow stochastic temporal separation of the fluorescence events and imaging of sparse single-molecules. The fact that PALM deals with single molecules prompted the development of a variety of applications, among which single-particle tracking PALM (sptPALM) and quantitative PALM (qPALM). These advanced applications already provide amazing insights into biological phenomena, but their use remains challenging. One of the reasons for this is the complex photophysical behaviour of PTFPs, beyond the transormations that are useful for PALM imaging.Therefore, this thesis focused on characterising the light-induced reactions occurring in Photoconvertible Fluorescent Proteins (PCFPs, some of the most popular PALM markers) with the aim of improving single-particle tracking and quantitative approaches in PALM. In particular, the work was directed to the understanding of transient losses of fluorescence, known as blinking, that are detrimental to PALM experiments. After a thorough characterisation of light-induced reactions in both the green and the red form of the investigated PCFPs, a strategy was proposed to alleviate blinking and the artefacts it produces. Finally, insights were given into the application of this strategy to improve a qPALM experiment.This work constitutes an further step towards a better understanding of PCFPs photophysics, and improved extraction of quantitative information from PALM datasets

Dans les années 80, de nombreuses études sur certains ARN ont montré qu'ils possédaient des propriétés biologiques qui jusqu'alors n'étaient attribuées aux seules protéines. Dès lors de nombreux ARN de ce type ont été découvert et la corrélation entre la structure tertiaire et les propriétés biologiques est très forte. Dans ce travail nous avons développé de nouveaux outils permettant de définir les structures de ces ARN. La première technique est une dénaturation mécanique par les pinces optiques : la signature de cette dénaturation est directement lié aux structures en présence. La deuxième technique est de suivre le repliement et donc la structure des ARN en cours de transcription par microscopie en onde évanescente. Ces deux techniques ont été complétées par des simulations numériques
In the 80th, people working on RNA discovered that some of them had some biological properties. This properties were at that time only attributed to proteins. Since that many other RNA with properties has been discovered, and the correlation between function and structure has been shown. In that work we built some new techniques to define the structures. The first tool built was based on mechanical denaturation. This denaturation were obtained by optical tweezers, the signature of such denaturation is directly related to structure. The second setup build was to follow the folding during transcription by using evanescent wave microscopy. This two techniques were completed by some numerical simulations

L'immuno-oncologie est un domaine en pleine expansion, à la frontière de la thérapie du cancer. Les immunothérapies du cancer visent à stimuler le système immunitaire de l'organisme pour qu'il cible et attaque la tumeur, grâce à des anticorps thérapeutiques. Ces anticorps se lient spécifiquement aux récepteurs membranaires des cellules T, lymphocytes jouant un rôle central dans la réponse immunitaire, modifiant leur signalisation intracellulaire. Comprendre comment l'organisation spatiale des récepteurs et des protéines de signalisation est régulée, et comment elle détermine l'activation des lymphocytes, est devenu le "Saint Graal" de l'immunologie cellulaire. Dans cette optique, une meilleure compréhension des fonctions des anticorps et du trafic intracellulaire associé, permettrait d’expliciter les différences d’efficacité des candidats thérapeutiques ciblant les récepteurs d'intérêt. La microscopie de super-résolution permet l’accès à l'organisation et la dynamique des récepteurs membranaires avec des résolutions nanométrique. Elle offre la capacité de révéler des informations sur les évènements précoces déclenchés par la liaison d’un anticorps à son récepteur, permettant à terme l’optimisation de leur efficacité fonctionnelle. Associée aux techniques de criblage à haut débit, elle a le potentiel de jouer un rôle prépondérant dans les phases précoces des projets où il est nécessaire de sélectionner les meilleurs anticorps issus de banques pouvant en compter plusieurs centaines.L'objectif de cette thèse CIFRE a été de caractériser fonctionnellement l'organisation et le trafic de paires récepteur/anticorps par l’association de méthodes de microscopie super-résolution par localisation de molécules individuelles (SMLM) et de criblage à haut débit (HCS). Dans ce contexte, nous avons mis au point et utilisé une plateforme permettant de caractériser différents anticorps thérapeutiques ciblant des récepteurs de cellules T, dans le but de recueillir des informations quantitatives sur les candidats thérapeutiques potentiels. Nous avons également optimisé la technique d'imagerie à feuille de lumière simple objectif (soSPIM) dans le but de pouvoir réaliser une cartographie 3D des récepteurs membranaires sur d'une cellule T entière avec une résolution nanométrique. Cette nouvelle approche permet l'imagerie de cellules T dans des conditions plus physiologiques, fournissant des informations complémentaires par rapport aux expériences de criblage à grande échelle. Ces deux techniques nous ont permis d’améliorer notre compréhension du mode d'action des anticorps sur les récepteurs au niveau de la cellule unique. Les expériences à grande échelle réalisées dans le cadre de ce travail ont nécessité plusieurs développements logiciels pour l'automatisation de l'acquisition et l'analyse statistique des Téraoctets de données de molécules individuelles générées. Ce projet de thèse s'est concentré sur la cible PD-1, un point de contrôle crucial du système immunitaire impliqué dans la modulation de l'activation des lymphocytes. La première partie de la thèse a été principalement consacrée à la mise en place de nouveaux protocoles pour l'imagerie de super-résolution des récepteurs PD-1 sur cellules Jurkat activées. La seconde partie concerne l’étude de l'impact d’anticorps thérapeutiques anti-PD-1 utilisés en routine en clinique, sur l'organisation spatiale et la dynamique des récepteurs PD-1 sur cellules vivantes, à l’échelle nanométrique. Ce travail est la preuve concept de l’utilité de ces outils d’imagerie de pointe pour la caractérisation quantitative d’anticorps monoclonaux thérapeutiques ciblant PD-1 à la membrane des cellules T
Immuno-oncology is a young and growing field at the frontier of cancer therapy. Immuno-oncology therapies aim to stimulate the body's immune system to target and attack the tumor through therapeutic antibodies, by binding and modifying the intracellular signaling of T-cells (lymphocytes playing a central role in the immune response) surface receptors. Understanding how the spatial organization of receptors and signaling proteins is regulated and how it determines lymphocyte activation and cell fate decisions has become a ‘holy grail’ for cellular immunology. To achieve this goal, a better comprehension of antibodies functions and subcellular trafficking is requested to explain the differential efficacies of therapeutic candidates targeting receptors of interest. Quantitative super-resolution microscopy provides access to the nanoscale organization of membrane receptors playing a physiological role. It offers a new investigation tool for antibody optimization as well as maximizing their functional efficacy. In combination with high throughput screening techniques, it has the potential to play a crucial role in the early phases of projects in which it is necessary to select the best antibodies from banks that may contain several hundred of them. The goal of this PhD thesis was to functionally characterize receptor/antibodies pairs organization and trafficking by quantitative single-molecule localization microscopy (SMLM) combined with high content screening (HCS). In this context, we have developed and used an HCS-SMLM platform to characterize multiple antibodies targeting T-cell membrane receptors, allowing gathering unprecedented quantitative insight of potential therapeutic candidates. We also optimized the single objective light-sheet microscope (soSPIM) to permit 3D mapping of membrane receptors across an entire T-cell, with single molecule resolution. It allows 3D nanoscale imaging of T-cells in more physiological conditions, and provide complementary information compared to large scale single molecule screening experiments. Altogether, these developments improved our comprehension of antibody mode of action on receptors at the single cell level. Large-scale experiments performed during this work required the development of several software for the automation of the acquisition and the statistical analysis of the Terabytes of single molecule data generated.This project is focused on targeting PD-1, a control point of the immune system involved in the modulation of immune cells activation. The first part of the thesis was mainly devoted to the implementation of new protocols for PD-1 receptors super-resolution imaging on activated Jurkat cells. In the second part, we further investigated the impact of known anti-PD-1 therapeutic antibodies used in clinics, on the nanoscale spatial organization and dynamics of PD-1 receptors in living cells using our HCS-SMLM platform. This work provides the proof of concept of the capacity of these cutting-edge imaging techniques to characterize quantitatively different therapeutic monoclonal antibodies targeting PD-1 on T-cell membrane

L'imagerie optique hyper-spectrale, qui combine la microscopie confocale et la spectroscopie optique, a été utilisée pour étudier des objets individuels de taille nanométrique (nano-objets). Les techniques spectroscopiques retenues ont été la spectroscopie Raman et la spectroscopie de fluorescence. Cette approche s'est montré bien adaptée pour l'étude à température ambiante de deux types de nano-objets, les molécules uniques et les nanotubes de carbone. Notre outil d'imagerie Raman s'est avéré efficace pour localiser les différentes espèces chimiques présentes sur nos échantillons. Entre autre, il a permis d'enregistrer les premiers spectres Raman de nouvelles espèces carbonées, comme des nanotubes remplis de molécules de pérylène ou de métallo-fullerènes (peapods). Les spectres Raman des peapods ainsi obtenus, ont révélé l'existence de processus de transfert de charge entre le tube et les métallo-fullerènes, ainsi que la polymérisation des métallofullerènes à l'intérieur des tubes. L'utilisation de surfaces nano-structurées métalliques est un point clé de ces études. D'une part, elles permettent d'exalter fortement le signal de diffusion Raman, rendant ainsi possible la détection de nano-objets en quelques secondes. D'autre part, elles accroissent la sélection spatiale du microscope, ce qui permet d'isoler le signal d'une entité unique. Ainsi, il a été possible d'étudier le signal Raman de molécules uniques ou de nanotubes uniques. J'ai alors mis en évidence certaines des caractéristiques du phénomène d'exaltation locale, son confinement au voisinage des nano-structures et le rôle joué par les irrégularités de surface, telles que les interstices et les protubérances
Single nanoobjects were studied by hyperspectral optical imaging, which associates a scanning confocal microscope with an optical spectroscopy unit. We choose to perform fluorescence spectroscopy and Raman spectroscopy. At room temperature, such spectroscopic approach has proven to be well adapted to study two different nanoobjects, as single molecules and carbon nanotubes. Our Raman imaging set-up is an efficient tool to localize different chemical species in a sample. Thus, we recorded the first Raman spectra of new carbon species, single wall carbon nanotubes which encapsulated several perylene molecules or dimetallofullernes (peapods). For peapods, we demonstrate from Raman spectre a charge transfer process between the nanotubes and the metallofullerenes, and in many cases their polymerization inside the tubes. Metallic nanostructured surfaces are usually required in this kind of experiments. In fact, we observed an enhancement of the Raman scattering with these surfaces, high enough to record the Raman scattering from a single nanoobject in few seconds. Also, they improve the spatial selection of the confocal microscope, that permit the selection of single nanoobjects. In this way, we studied single molecules and single carbone nanotubes. Then, I bring out some characteristics of the enhancement process. In particular, this enhancement is only efficient at the vicinity of the nanostructure. The surface morphology of the nanostructure must also exhibit some protrusions, or interstices

Le travail de cette thèse a été consacré au développement d’un nouvelle technique SELFI (pour self-interferences, auto-interférences en anglais). Cette méthode permet d’obtenir une localisation tridimensionnelle d’émetteurs fluorescents individuels. Nous avons démontré que cela permet l'imagerie super-résolue en 3D et le suivie 3D de molécules uniques en profondeur dans des échantillons biologiques denses et complexes. La technique SELFI se base sur l'utilisation des interférences auto-référencées (également appelées « auto-interférences ») pour remonter à la localisation 3D d’un émetteur en une seule mesure. Ces interférences sont générées via l’utilisation d'un réseau de diffraction placé en sortie du microscope de fluorescence : le signal de fluorescence diffracte sur le réseau et les ordres interfèrent, après une courte propagation, sur le détecteur. Les interférences ainsi formées sont décodées numériquement pour remonter à la localisation 3D d'une molécule fluorescente au sein de l'échantillon. Une molécule unique peut ainsi être localisée avec une précision d'une dizaine de nanomètre, et cela jusqu'à une profondeur d'au moins 50µm au sein d'un échantillon biologique vivant épais (par exemple un tissu biologique).En combinant la méthode SELFI à différentes techniques de super-résolution (PALM, dSTORM et uPAINT), nous montrons que cette méthode de localisation tridimensionnelle permet de retrouver la hiérarchie et l'organisation de protéines dans des objets biologiques. En effectuant du SELFI-PALM, nous avons pu observer différentes protéines des points focaux d’adhésion (talin-C terminale et paxiline) et retrouver les différences de hauteur attendues, et ceux sur des échantillons de cellules vivantes. Ces résultats confirment la résolution accessible avec la technique SELFI (environ 25nm) même pour un faible nombre de photons collectés (environ 500 photons par molécule).Nous mettons en évidence la robustesse de la technique SELFI en reconstruisant des images de super-résolution 3D de structures denses en profondeur dans des échantillons tissulaires complexes. En effectuant du SELFI-dSTORM, nous avons observé le réseau d’actine sur des cellules cultivées en surface de la lamelle dans un premier temps, et à différentes profondeurs (25 et 50 microns) au sein de tissus artificiels dans un second temps.Du suivi 3D de particule unique a aussi été effectué sein de tissus biologiques vivants. Nous avons observé la diffusion libre de quantum dots à différentes profondeurs (jusqu’à 50 microns, limité par l’objectif utilisé) dans des tranches vivantes de cerveau.Nous avons appliqué la technique SELFI à la détection de récepteurs postsynaptiques NMDA. Cela nous a permis d'observer, sur des échantillons de neurones en culture primaire mais aussi au sein de tranches de cerveaux de rats, une différence d'organisation entre les deux sous-unités GluN2A et GluN2B de ce récepteur au glutamate.Enfin, nous avons démontré l'importance de suivre l'évolution de l'environnement des échantillons biologiques vivants lors des acquisitions permettant la détection de molécules individuelles. Grâce à l'utilisation additionnelle et simultanée de l'imagerie de phase quantitative, nous avons pu étudier la dynamique de la membrane cellulaire durant l’activation par un facteur de croissance. L'analyse corrélative entre les images de phase quantitative en lumière blanche et les détections de molécules fluorescentes uniques permet d'obtenir de nouvelles informations pertinentes sur l'échantillon étudié
The work of this thesis was devoted to the development of a new technique SELFI (for self-interferences). This method unlocks the three-dimensional localization of individual fluorescent emitters. We have demonstrated that this allows 3D super-resolved imaging and 3D tracking of single molecules deep into dense and complex biological samples. The SELFI technique is based on the use of self-referenced interference to go back to the 3D location of a emitter in a single measurement. These interferences are generated using a diffraction grating placed at the exit of the fluorescence microscope: the fluorescence signal diffracts on the grating and, after a short propagation, the orders interfere on the detector. The formed interferences are digitally decoded to extract the 3D location of a fluorescent molecule within the sample. A single molecule can thus be localized with a precision of approximatively ten nanometers up to a depth of at least 50 µm in a thick living biological sample (for example a biological tissue).By combining the SELFI method with different super-resolution techniques (PALM, dSTORM and uPAINT), we show that this three-dimensional localization method grants the access to the hierarchy and organization of proteins in biological objects. By performing SELFI-PALM, we observed different proteins of the adhesion focal points (talin C-terminal and paxilin) and found the expected elevation differences, and those within living cell samples. These results confirm the resolution capability of the SELFI technique (about 25 nm) even for a small number of photons collected (about 500photons per molecule).We highlight the robustness of the SELFI technique by reconstructing 3D super-resolution images of dense structures at depth in complex tissue samples. By performing SELFI-dSTORM, we observed the actin network in cells grown on the surface of the coverslip at first, and at different depths (25 and 50 microns) within artificial tissues in a second time.3D single particle tracking has also been performed in living biological tissues. We observed the free diffusion of quantum dots at different depths (up to 50 microns) in living brain slices.We applied the SELFI technique to the detection of NMDA postsynaptic receptors. We observed, in primary culture of neurons but also within slices of rat brains, a difference in organization between the two subunits GluN2A and GluN2B of this glutamate receptor.Finally, we show the importance of following the evolution of the living biological sample environment during the acquisition of images leading to detections of single molecules. Thanks to the additional and simultaneous use of quantitative phase imaging, we were able to study cell membrane dynamics during the activation by a growth factor. The correlative analysis between white light quantitative phase images and single fluorescent molecule detections provides new relevant information on the sample under study

La spectroscopie de molécule unique joue aujourd’hui un rôle majeur dans de nombreux domaines allant de la physique fondamentale à la biologie. Dans ce contexte, mes travaux ont conduit au développement théorique et instrumental de deux méthodes d’investigation orientées vers la biologie. La première visait à caractériser la dynamique de complexation du calcium par la sonde calcique fluorescente Oregon Green Bapta5N communément employée pour l’analyse des signaux intracellulaires. Pour y parvenir, nous avons développé un dispositif expérimental de spectroscopie de corrélation de fluorescence à un et deux photons présentant une sensibilité proche de la molécule unique. Grace à ce dernier, nous avons pu étudier plusieurs aspects de la photophysique de la sonde et avons évalué ses limites ainsi que l’intérêt de l’appliquer in vivo. La seconde a consisté à développer une technique d’Hybridation In-Situ de Fluorescence (FISH) semi-quantitative afin de cartographier l’expression de gènes dans le cerveau de drosophiles adultes. Nous avons surmonté deux difficultés majeures, en obtenant, pour la première fois, des résultats reproductibles et semi-quantitatifs chez la drosophile adulte. Je présente ici une nouvelle approche où l’amplification enzymatique a été remplacée par une détection optimisée et un protocole réduisant l’impact de l’autofluorescence. Des résultats sur divers gènes exprimés dans le cerveau des drosophiles adultes y sont exposés au même titre qu’une étude visant à mieux comprendre une pathologie de retard mental. Pour conclure, j’ai mis en évidence la capacité de notre technique à résoudre des sondes uniques ce qui ouvre la voie vers de nouvelles applications
Single-molecule-like spectroscopy plays a major role in many domains, from fundamental physics to biology. In this framework, my dissertation focuses on instrumental and theoretical developments of two biological-related applications. The first experiment aims at characterizing the dynamics of calcium binding by the fluorescent calcium probe Oregon-green Bapta5N commonly employed in cell signaling analysis. To achieve it, I have developed an experimental set-up of fluorescence correlation spectroscopy that exhibits sensitivity close to that of single-molecule detection. Either monophotonic or biphotonic excitations can be used. I have investigated the several aspects of the photophysics of the probe and evaluated the interest and limitations of such an approach for future in-vivo measurements. The second one is devoted to the development of a semi-quantitative Fluorescent In-Situ Hybridization (FISH) technique for mapping gene expression in the adult drosophila brain. Two difficulties have to be solved. First, we succeeded in obtaining reproducible results with drosophila adult brain. Secondly, while most of the FISH protocols are not quantitative since they need a strong enzymatic, we achieved semi-quantitative detection of RNA probes. I will present results on a new approach for which enzymatic detection is replaced by a sensitive detection and a protocol which reduces autofluorescence contribution. Results will be presented for several genes in adult drosophila brain to validate the methods as well as an interesting application on a mental retardation disease. To conclude, I show that the method exhibits a single RNA sensitivity which opens the way to new applications

La compréhension fondamentale de fonctions biologiques est accordée par l’imagerie de molécules uniques dans les cellules vivantes. Cet environnement nanoscopique est compliqué et largement mal compris. La microscopie de localisation permet cet environnement d’être sondé avec le suivi de molécules uniques. Depuis longtemps, l’obstacle principal qui empêcher la compréhension de processus physiques à cette échelle était la pénurie d’information accessible; de fortes hypothèses ne peuvent pas être établies à partir de quelques dizaines de trajectoires de molécules uniques. L’introduction des techniques de suivi de molécules à haute densité a recadré les possibilités. Dans cette thèse, les outils d’inférence Bayesienne ont été développé pour élucider le comportement de molécules uniques à partir la cartographie de leurs paramètres physiques de mouvement. Ces cartes décrivent, entre autre, les hétérogénéités aux échelles locales mais aussi à l’échelle de la cellule entière. Notamment elles dévoilent les détails quantitatifs sur les processus cellulaires de base. En utilisant cette approche cartographique, les interactions entre récepteurs et protéines d’échafaudage chez les neurones et les cellules non-neuronales sont étudiés. Une étude sur les interactions imprimées dans la cellule est également effectuée grace à un système prometteur d’impression de protéine. Les différents types d’interactions entre constructions chimériques du récepteur de glycine et de protéines d’échafaudage de géphyrine sont décrits et distingué in situ. Enfin, les perspectives vis-à-vis l’obtention de cartes tridimensionnelles de dynamiques de molécules uniques sont également commentées
Imaging of single molecules inside living cells confers insight to biological function at its most granular level. Single molecules experience a nanoscopic environment that is complicated, and in general, poorly understood. The modality of choice for probing this environment is live-cell localisation microscopy, where trajectories of single molecules can be captured. For many years, the great stumbling block in comprehension of physical processes at this scale was the lack of information accessible; statistical significance and robust assertions are hardly possible from a few dozen trajectories. It is the onset of high-density single-particle tracking that has dramatically reframed the possibilities of such studies. Importantly, the consequential amounts of data it provides invites the use of powerful statistical tools that assign probabilistic descriptions to experimental observations. In this thesis, Bayesian inference tools have been developed to elucidate the behaviour of single molecules via the mapping of motion parameters. As a readout, maps describe heterogeneities at local and whole-cell scales. Importantly, they grant quantitative details into basic cellular processes. This thesis uses the mapping approach to study receptor-scaffold interactions inside neurons and non-neuronal cells. A promising system in which interactions are patterned is also examined. It is shown that interactions of different types of chimeric glycine receptors to the gephyrin scaffold protein may be described and distinguished in situ. Finally, the prospects of whole-cell mapping in three-dimensions are evaluated based on a discussion of state-of-the-art volumetric microscopy techniques

La nécessité de délivrer des médicaments directement dans les cellules est grandissante avec le développement des thérapies géniques. Les peptides pénétrants (Cell Penetrating Peptides : CPP) représentent une possibilité pour administrer ces médicaments dans les cellules sans effet délétère sur la membrane. Ce sont des peptides d’une dizaine d’acides aminés, généralement cationiques. Ils sont capables de traverser la membrane cellulaire, et conservent cette propriété lorsqu’une cargaison leur est attachée. Cependant, leurs mécanismes d’entrée ne sont toujours pas tous connus. Nous avons caractérisé quelques aspects des mécanismes permettant aux CPP de traverser directement la membrane plasmique à l’aide de trois techniques biophysiques. i) Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle des sulfates d’héparane comme partenaire d’adhésion forte du CPP pénétratine, à l’aide d’un outil de mesure de force : le Biomembrane Force Probe. ii) Nous avons montré la possibilité pour la pénétratine de franchir la bicouche lipidique (sans mécanisme cellulaire actif) si celle-ci est suffisamment riche en lipides chargés négativement. Ce passage a été étudié sur bicouches modèles, formées à l’interface entre gouttelettes obtenues par émulsion inverse dans de l’huile en présence de lipides. iii) Pour visualiser la translocation de CPP à l’échelle de la molécule unique nous avons développé un montage original de microscopie à onde évanescente sur bicouche suspendue
Gene therapy relies on an efficient and specific delivery of drugs into targeted cells. For this purpose, the use of carriers that will help the drugs to cross the membrane, without introducing deleterious effect due to the membrane disruption, are promising. A family of such carriers is known as Cell Penetrating Peptides (CPPs). These peptides are short, about ten amino acids, and often cationic. They are able to translocate through the membrane with different cargos and deliver them into the cytosol. However the mechanisms are still, to a great extent, unknown. We used three biophysical techniques to gain insights into the mechanisms leading to the translocation of a CPP. i) We found the heparan sulfates to be the strongest partner of the CPP penetratin at the cell surface. This adhesion has been pointed out using the Biomembrane Force Probe, a force measuring tool. ii) We evidenced the translocation of penetratin through the lipid bilayer (without any cell mechanism) as long as it contains enough negatively charged lipids. This has been carried out using model bilayers formed at the interface between droplets generated by an inverted emulsion: water in an oil and lipid mixture. iii) To view the translocation of CPPs at the single molecule level we developed a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) on a suspended bilayer

Obtenir des informations sur la matière à des échelles micrométriques, de manière non destructive et sans utiliser aucun marquage reste un défi méthodologique et technologique. Les techniques établies de microscopie de fluorescence ont permis de réelles avancées dans la compréhension des phénomènes biologiques mais le marquage utilisant des fluorophores limite considérablement cette technique, en particulier dans le domaine biomédical. Depuis une quinzaine d’année, la microscopie Raman cohérente a connu un important essor. Basée sur les propriétés vibrationnelles des molécules, cette technique permet aujourd’hui une imagerie tridimensionnelle des liaisons chimiques à cadence vidéo. De nombreux développements ont permis, à partir des concepts de la diffusion Raman et de l’optique non linéaire, d’élaborer des outils technologiques puissants permettant d’imager les échantillons biologiques en utilisant les contrastes de diffusion Raman anti-Stokes et de diffusion Raman stimulée. Dans ce chapitre, nous développons tout d’abord, grâce à des modèles simples, ces processus clés permettant d’appréhender la physique sous-jacente à l’imagerie Raman cohérente. Ensuite, nous illustrons ces techniques d’imagerie au travers de travaux menés récemment sur des échantillons biologiques et cristallins. Nous discutons enfin les perspectives actuelles concernant l’évolution des technologies et leurs domaines applicatifs.

Les tétrazines sont des hétérocycles connus depuis très longtemps (premier compte rendu datant de la fin du XIXe siècle), mais ont été relativement négligées par la chimie traditionnelle, à l’exception de leurs capacités à être impliquées dans des cycloadditions spéciales de Diels et Alder à demande inverse, avec des applications exclusivement en synthèse organique, pour la production de dérivés de type pyridaziniques. Depuis le début de ce siècle, cependant, ont émergé de nouvelles tétrazines, possédant des propriétés physiques remarquables, au premier rang d’entre elles la fluorescence, mais aussi l’électroactivité. Certaines de ces familles de molécules ont permis des applications parfois inattendues, comme la révélation des empreintes digitales.