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Dissertationen zum Thema „Microscopie cellulaire“
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Mercier, Luc. „Disséquer la cascade métastatique par des approches innovantes d'imagerie cellulaire“. Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAJ091/document.
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La métastase peut être considérée comme le produit final d’un processus à la fois biologique mécanique et chimique où les cellules cancéreuses disséminent dans l’organisme pour envahir un nouvel organe à distance en s’établissant dans un nouvel microenvironnement tissulaire. Bien que les métastases soient la principale cause de décès liée au cancer, les principaux mécanismes impliqués dans ce processus restent à élucider. La communauté scientifique manque de techniques d’imagerie adaptées pour disséquer avec la plus haute résolution possible le comportement des cellules tumorales in vivo. Par conséquent, le but principal de ma thèse a été de développer une approche d’imagerie intravitale non-invasive appliquée à la souris. Cette approche a été inclue dans le développement d’un protocole de microscopie corrélative intravitale permettant l’étude de cellules tumorales à différentes échelles dans leur environnement naturel. Ce protocole a été utilisé dans l’étude de cellules invasives tumorales uniques dans l’oreille et le cerveau de la souris. Le but était de décrire les détails des protrusions cellulaires ainsi que les interactions cellule-matrice lors de l’invasion et l’intravasation de cellules cancéreusesMetastasis can be considered as the end product of a multistep bio-mechano-chemical process where cancer cells disseminate to anatomically distant organs and home and establish themselves in a new tissue microenvironment. Although metastasis is the leading cause of cancer-related death, the main cellular mechanisms enabling this process remain to be elucidated. Importantly, the scientific community lacks adapted imaging technologies to accurately dissect, at the highest resolution possible, tumor cell behavior in vivo. Therefore, the main goal of my PhD thesis was to develop an intravital and non-invasive imaging approach to track tumor progression in the living mouse. This approach was included in the development of an intravital Correlative Light and Electron Microscopy protocol allowing to track tumor cells at different scales in their natural environment. It was used to study single invasive tumor cells in the mouse ear and brain and to describe the details of cell protrusions and cell-matrix interactions during invasion and intravasation of cancer cells
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Moreaux, Laurent. „Microscopie par génération du second harmonique : applications à l'imagerie cellulaire“. Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA112113.
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La microscopie bi-photonique est la forme de microscopie non linéaire la plus populaire pour l'imagerie des cellules biologiques. Une forme moins populaire basée sur la génération du second harmonique (SHG) par des surfaces ou par des tissus endogènes a été cependant utilisée plusieurs années avant l'invention de la microscopie bi-photonique. En raison des difficultés d'interprétation du signal, la microscopie SHG a été peu exploitée jusqu'à un regain d'intérêt récent. Cette thèse présente une analyse expérimentale et théorique de la microscopie par génération du second harmonique utilisée pour l'imagerie des membranes biologiques dans lesquelles des sondes exogènes sont insérées. En particulier, ce travail démontre la possibilité de combiner à la fois SHG et fluorescence bi-photonique pour l'imagerie des membranes dans lesquelles des chromophores sont insérés. Nous montrons que les résolutions deux microscopies sont identiques, ce qui rends les deux modes de contrastes optiques facilement combinables dans un seul et même instrument. Grâce à un modèle basé sur la théorie des antennes, nous avons établi l'expression de la puissance totale rayonnée, de la distribution angulaire et des propriétés de polarisation du SHG en champ lointain dans le cas de chromophores parfaitement alignés ou non dans la membrane. De plus, nous avons défini une section efficace SHG afin de permettre un comparaison direct avec la fluorescence induite par absorption à deux photons. Malgré leurs similitudes, la SHG et la fluorescence bi-photonique sont des phénomènes intrinsèquement différents. Le premier est cohérent et le second ne l'est pas. Nous montrons que cette différence offre de nouvelles possibilités pour l'étude de l'organisation moléculaire. Enfin, nous présentons une technique permettant d'étudier la nature de la réponse à un champ électrique trans-membranaire dans le but d'une application directe de la microscopie par SHG à l'imagerie des potentiels membranairesBy far the most well known form of non-linear microscopy is based on two-photon excited fluorescence (TPEF), which bas now become a laboratory standard for biological imaging. A lesser known form of this microscopy, however, was used several years prior to the invention of TPEF microscopy, based on the generation of second harmonic light either from surfaces or from endogenous tissue structures. Because of difficulties in signal, second-harmonic generation (SHG) microscopy has gone by relatively unnoticed until only very recently. This work present a detailed experimental and theoretical analysis of the generation of second-harmonic radiation from biological membranes labeled with exogenous markers. We demonstrate that simultaneous second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence can be used to image biological membranes labeled with properly designed chromophore. Moreover, we show that spatial resolutions provided by SHG and TPEF microscopies are commensurate, meaning that the two contrast modes can very often be conveniently derived from the same instrument. Based on phased-array antennas model, we derive expressions for the SHG radiation power, angular distribution and polarization dependence in the cases of ideal or non-ideal molecular alignment in the membrane. We define an SHG cross-section similar to that used in two-photon excited fluorescence to allow direct comparison. Despite their similarities, however, SHG and TPEF are fundamentally different phenomena. The first is coherent whereas the second is not. We demonstrate, moreover, that this basic difference provides a unique window into molecular spatial organization which is inaccessible to fluorescence. At least, we present a screening technique to quantify and ascertain the nature of the second-harmonic generation response of chromophores to a trans-membrane electric field. These results are specifically directed to the optimisation of membrane potential response in SHG microscopy
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Colomb, Evelyne. „Etude du cycle cellulaire de l'épithelium mammaire humain par microscopie quantitative“. Aix-Marseille 2, 1991. http://www.theses.fr/1991AIX22026.
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Le cycle cellulaire d'une cellule somatique eucaryote type est caracterise par quatre phases successives: g1, s, g2 et m. La progression de la cellule dans le cycle est etroitement surveillee par des controles extracellulaires et intracellulaires. Notamment, en phase g1, des facteurs extracellulaires engendres par des interactions moleculaires et cellulaires determinent l'etat proliferant/non proliferant de la cellule. Des perturbations de ces processus de regulation peuvent entraine la naissance de cellules cancereuses: ces cellules se reproduisent malgre les restrictions et finissent par envahir et coloniser des sites normalement reserves a d'autres types cellulaires. Pour aborder le role des interactions cellulaires dans la regulation de la proliferation cellulaire, une methodologie a ete developpee a partir du systeme d'analyse microphotometrique a balayage automatique (samba 200), pour determiner la phase du cycle (g0/g1, g2 ou m) des cellules de l'epithelium mammaire humain en culture, tout en preservant leur topographie cellulaire. In situ, les cellules sont colorees par la reaction nucleale stchiometrique de feulgen. La mesure de 15 parametres caracteristiques de la teneur en adn et de la texture nucleaire, sur chaque noyau suivie d'analyses multiparametriques des donnees permet de determiner la phase de chaque cellule analysee, et d'evaluer la repartition d'une population cellulaire dans les differentes phases. Cette methode s'applique parfaitement aux populations cellulaires presentant un profil de distribution de leur teneur en adn unimodal, a condition toutefois que l'integrite du noyau soit preservee. Elle a permis non seulement d'etudier l'effet de diverses molecules (hormones, facteurs de croissance, anthracyclines) sur la progression des cellules dans le cycle, mais aussi de detecter des modifications de la morphologie nucleaire consecutives a un traitement par les anthracyclines. Enfin, une methode a ete elaboree pour reconnaitre et denombrer les cellules sensibles aux anthracyclines
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Valon, Léo. „Contrôle Optogénétique de la Polarité Cellulaire“. Thesis, Paris, Ecole normale supérieure, 2014. http://www.theses.fr/2014ENSU0008/document.
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Dans cette thèse, nous avons concentré notre étude sur les mécanismes qui génèrent la polarité cellulaire, en particulier dans le cas de la migration cellulaire. Malgré les derniers développements concernant l’observation de l’activité des RhoGTPases, les principes qui dictent la capacité des cellules à coordonner plusieurs modules de signalisation en parallèle ne sont toujours pas compris. L’optogénétique est un outil d’intérêt pour disséquer ces réseaux de signalisation à partir de la création d’une perturbation dont les caractéristiques spatiotemporelles sont contrôlées. Tout d’abord, à partir de la caractérisation des différents processus biophysiques en jeu, nous avons établi les relations quantitatives entre l’illumination et les gradients moléculaires que l’on induit. Nous avons déterminé qu’il est possible de créer des gradients subcellulaires avec une résolution spatiale de l’ordre de 5 μm et temporelle d’environ 3 minutes Ensuite, nous avons utilisé cette approche optogénétique pour contrôler l’activité de Cdc42, Rac1 et RhoA. Nous avons caractérisé les effets subcellulaires de l’activation de ces RhoGTPases en utilisant l’activité de membrane, les changements de forme cellulaire et leurs déplacements comme rapporteurs de la polarisation et de la migration. Nous avons ainsi montré qu’une activation locale de RhoGTPase permet la réorganisation interne des cellules jusqu’à générer un phénotype de migration.Enfin, nous avons caractérisé les effets d’une activation locale de RhoA sur différents acteurs moléculaires comme les points focaux d’adhésion, l’actine et les moteurs moléculaires myosines. Nous avons mesuré alors la dynamique de l’intégration des points focaux dans le cytosquelette et analysé la réponse du réseau d’acto-myosine au cours d’évènements de rétraction.Notre approche optogénétique couple le contrôle d’une perturbation à la mesure de la réponse cellulaire simultanément de manière directe et reproductible. Elle apporte une méthode pour contrôler la polarité cellulaire et une manière de disséquer des réseaux de signalisation à l’échelle subcellulaireIn this thesis we focus on the mechanisms that establish cell polarization, particularly during cell migration. Despite latest developments that enable visualization of RhoGTPases activity, the underlying principles dictating the cell’s ability to coordinates multiple signaling modules is still unclear. Optogenetic methods have been recognized as promising tools to dissect these intracellular signaling networks by allowing perturbations to be spatially and temporally controlled. We established the quantitative relationship between illumination patterns and the corresponding gradients of induced signaling activity through the characterization of the biophysical properties of CRY2/CIBN. We determined that it is possible to create subcellular gradients of recruited proteins of different shapes of choice up to spatial resolutions of 5μm and temporal ones of ca. 3 minutes.We applied the aforementioned optogenetic approach as a means to perturb the activity of cdc42, Rac1 and RhoA. We characterized the effects of subcellular activation of those RhoGTPases using membrane activity, cell shape changes and cell displacement as reporters of cell polarization and migration. We show that localized activation of RhoGTPases can trigger cellular organization and drive the cell into a migrating state.We also characterized the effects of local activation of RhoA on different cellular effectors as focal adhesion complexes, actin filaments and myosin molecular motors. We measured the dynamics of the newly formed focal adhesion complexes and the acto-myosin complex during retraction events.Altogether, our optogenetic methodology enables simultaneous measurement of the imposed perturbation and the cell response in a straightforward and reproducible way. It provides a quantitative way to control cell polarity and a step forward in the dissection of subcellular signaling networks
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Combes, Julien. „Etude de l'adhésion d'ostéoblastes sur substituts apatitiques par microscopie à force atomique“. Phd thesis, Ecole Nationale Supérieure des Mines de Saint-Etienne, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00445705.
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L'objectif de cette étude s'inscrit dans une démarche de développement de céramiques apatites phosphocalciques et de leur évaluation biologique. Les matériaux étudiés sont des hydroxyapatites silicatées ou carbonatés denses en monophasées. Il s'agit d'un travail interdisciplinaire, qui va de la synthèse et la mise en œuvre de matériaux céramiques à la biomécanique cellulaire et les essais de cultures cellulaires in vitro. La dimension originale du projet concerne le suivi de la réponse des cellules osseuses déposées sur ces céramiques par l'indentation à l'aide d'un AFM. Ces travaux montrent d'une part, que la bioactivité des matériaux étudiés était semblables et d'autre part, que la relaxation de cellules ensemencées sur TA6V et hydroxyapatite stochiométrique suivent une loi puissance (exposant ≈ 0.2) sur 2-200 secondes. La méthode originale utilisée montre par ailleurs que la relaxation d'une fibre d'actine est différentiable de la relaxation de la membrane cellulaire.
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Caillat, Ludovic. „Nano-sondes optiques à forte non-linéarite pour l'imagerie cellulaire à haute résolution“. Paris 6, 2013. http://www.theses.fr/2013PA066059.
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L’un des enjeux du XXI siècle concerne la compréhension de la machine cellulaire. Le principal problème à l’heure actuelle que rencontrent les biologistes est la diffraction due à la nature ondulatoire de la lumière qui limite la résolution des instruments optiques. Dans cette thèse, nous avons montré pour la première fois que l’up-conversion présent dans les nanoparticules dopées terres rares pouvaient dépasser la limite d’Abbe. Nous avons montré que la résolution latérale dans notre microscope pouvait dépasser λ/5 bien supérieure à la limite d’abbe. Ce concept permet d’atteindre des résolutions proches de 180 nm pour des processus à 4 photons. Ces résultats sont intéressants, ils permettent d’obtenir des résolutions proches d’un microscope confocal, tout en conservant l’excitation infrarouge de faible puissance de l’ordre de quelques µW, permettant de nous s’affranchir d’un laser femto-seconde, et donc de développer un microscope multi-photon à bas coutMajor bottleneck in microscopic imaging is the limited lateral resolution due to the diffraction of light. To overcome this limit, here we demonstrate the up-conversion process in the rare earth doped nanoparticles, which may serve as an original fluorescence source mechanism. Rare earth doped nanoparticles, have been reported to serve as efficient bio-labels for cellular and small animal imaging. In this work, we demonstrate that non-linearity of up-conversion allows achieving high lateral resolution in the images using multiphoton microscopy, demonstrating significant improvement in lateral resolution, using low pumping laser power. This new technique may serve as another approach for high-resolution optical imaging
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Aimon, Sophie. „Study of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles“. Paris 6, 2011. http://www.theses.fr/2011PA066196.
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Il est difficile d'étudier in vivo le rôle de la membrane dans l'excitabilité des cellules car les paramètres pertinents (composition et état mécanique de la membrane, densité de canaux. . . ) sont activement régulés par la cellule elle-même et donc difficilement ajustables expérimentalement. J’ai donc développé une méthode pour reconstituer un canal voltage-dépendant dans une membrane où ces paramètres peuvent être contrôlés. Pour cela j’ai exprimé, purifié et marqué KvAP, un canal potassique voltage-dépendant. J’ai ensuite adapté une méthode existante pour le reconstituer dans des Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs). J’ai mesuré la densité des canaux dans les GUVs grâce à la microscopie confocale. Des expériences d’électrophysiologie ont, de plus, montré que le canal reste fonctionnel après reconstitution. Ce système m’a permis d’étudier tout d’abord l’affinité du canal pour les membranes courbées. Pour cela, j’ai tiré des nanotubes de rayon contrôlé à partir de ces GUVs et j’ai mesuré la distribution du canal entre la vésicule et le tube par microscopie confocale. J’ai montré que le canal est enrichi dans le tube proportionnellement à sa courbure. Ce résultat est en accord avec une théorie basée sur l’élasticité de la membrane. Nous avons également étudié l’effet du confinement de la membrane sur la diffusion de KvAP. Par des expériences de suivi de particule unique, nous avons montré que le coefficient de diffusion le long du tube diminue d’un facteur 3 lorsque le rayon du tube décroît de 250 à 10 nm. Ce résultat est en accord avec le modèle hydrodynamique de Saffman et Delbrück appliqué à la géométrie cylindrique
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Schultz, Patrick. „Etudes structurales du minichromosome du virus sv40 et de la chromatine cellulaire : approches en microscopie electronique“. Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1987. http://www.theses.fr/1987STR13082.
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Cayron, Julien. „Caractérisation de la réponse cellulaire associée à différents stress chez la bactérie Escherichia coli“. Thesis, Lyon, 2019. https://n2t.net/ark:/47881/m6qv3kv7.
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La prolifération bactérienne requiert la coordination entre les grands processus du cycle cellulaire qui sont la réplication et la ségrégation de l’ADN, l’élongation et la division cellulaire. Durant leur vie, les bactéries sont exposées à différents stress endogènes ou exogènes (antibiotiques, pH, manque de nutriments…) qui peuvent perturber le cycle cellulaire. Ces conditions défavorables activent alors une réponse cellulaire qui vise à améliorer la survie aux stress. Chez E. coli, la formation de cassures sur le chromosome induit la réponse SOS qui inhibe la division des cellules. Dans ce contexte, la bactérie continue à s’allonger ce qui aboutit à la formation d’une cellule filamenteuse. La filamentation a longtemps été considérée comme un symptôme de mort cellulaire, mais des études récentes suggèrent qu’il s’agirait plutôt d’un changement de morphologie transitoire qui améliorerait la survie en conditions défavorables. L’objectif principal de cette thèse est de caractériser le processus de filamentation et surtout le redémarrage de la division du filament, permettant un retour à une croissance normale de la bactérie. J’ai pour cela mis en place une approche combinant la microscopie en cellules vivantes en chambre microfluidique, la cytométrie en flux, la microbiologie traditionnelle et la génétique bactérienne. L’association de ces techniques constitue une approche globale permettant de caractériser l’effet d’un stress sur la viabilité, la morphologie et le contenu en ADN des bactéries, et ce de la cellule unique à l’échelle de la population. Cette approche a permis de décrire comment les cellules filamenteuses se divisent rapidement en cellules viables et de comprendre comment cet état de différenciation cellulaire transitoire et réversible constitue une stratégie efficace de survie aux stress. Par ailleurs, l’expertise développée au cours de ces travaux m’a permis d’être impliqué dans l ‘étude du transfert de gène de résistance à la tétracycline par conjugaison bactérienne. Ces mêmes expertisent ont aussi permis la caractérisation de l’effet de biocides induisant la réponse aux stress de l’enveloppe et la visualisation de l’effet de la production chez E. coli de deux toxines prédites pour être impliquées dans un système d’inhibition de croissance contact-dépendant chez A. baumanniiBacterial growth requires coordination between the main cell cycle processes that are DNA replication and segregation, elongation and cell division. During their life, bacteria are exposed to different endogenous or exogenous stresses (antibiotics, pH, nutrients starvation…) that can disturb the bacteria cell cycle. Those hostile life conditions trigger a cellular response aiming at improving survival in stress conditions. In E. coli, DNA breaks induce the SOS response that inhibits cell division while the bacteria continue to elongate, resulting in the formation of a filamentous cell. Filamentation has long been considered as a symptom of cell death, however recent studies suggest that this phenotype could instead be a transient morphology change improving the survival in hostile environments. The main objective of this thesis is to characterize the filamentation process, especially the restart of the filament division allowing to resume normal bacterial growth. To do so, I developped an approach combining live-cell microscopy in microfluidic chamber, flow cytometry, traditional microbiology technics and bacterial genetics. Association of those techniques constitutes a global approach allowing characterization of the stress effect on bacterial viability, morphology and DNA content, from the single cell to the population level. This experimental framework allowed to describe how filamentous cells quickly divide into viable cells, thus understanding how this transient and reversible cellular differentiation state constitute an efficient stress-survival strategy. Furthermore, the expertise I developed during this ph.D. project allowed me to be involved into the study of drug-resistance acquisition by gene transfer through bacterial DNA conjugation. Besides, I contributed to the characterization of the effects of biocides inducing envelop stress response and to the characterize the impact on E. coli of the production of Acinetobacter baumannii toxins predicted to be involved in contact-dependant growth inhibition
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Becker, Martine. „Une structure de membrane en microscopie électronique dans les leucémies aiguës de l'adulte“. Bordeaux 2, 1988. http://www.theses.fr/1988BOR23016.
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Sivankutty, Siddharth. „Imaging beyond the diffraction limit STED and SAF microscopy“. Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112108.
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La compréhension des processus cellulaires au niveau membranaire est un domaine d’étude important en recherche biomédicale. Contourner la limite de diffraction en microscopie de fluorescence est maintenant devenu possible en exploitant les transitions moléculaires du fluorophore. Ce travail présente le développement instrumental de deux techniques complémentaires permettant d’atteindre une résolution nanométrique, grâce à l'émission stimulée (STimulated Emission Depletion - STED) d’une part, et la microscopie de fluorescence aux angles supercritiques (Supercritical Angle Fluorescence, SAF) d’autre part. La microscopie STED est une méthode permettant de surpasser la barrière de diffraction et d’atteindre des résolutions latérales de l'ordre de 40 nm dans des échantillons biologiques. Ce dispositif de microscopie exploite les transitions moléculaires des marqueurs fluorescents pour surmonter la limite de résolution due à la diffraction. L'amélioration de la résolution est obtenue par déplétion de l'état excité du fluorophores dans les régions périphériques de l'espace du volume focal. Cependant, malgré l'amélioration importante de la résolution latérale avec la technique STED, cette dernière présente une réelle complexité de mise en œuvre qui a par conséquence un impact important sur le cout des instruments STED commerciaux. Dans ce contexte, la réalisation instrumentale et la performance en imagerie d'un dispositif STED sont présentées dans ce manuscrit. Bien que les microscopes STED classiques offrent une meilleure résolution latérale, la résolution axiale est toujours limitée par la diffraction. L’amélioration de la résolution dans cette direction implique une certaine complexité instrumentale. Dans ce cadre, nous démontrons une nouvelle approche utilisant l’imagerie SAF permettant d'obtenir un sectionnement axial de l'ordre de 150 nm. L’approche se base sur la propriété d'une molécule à émettre dans les angles supercritiques uniquement lorsqu’elle se rapproche de l'interface verre-eau. Le sectionnement axial est obtenu dans une configuration simple en détectant uniquement les composantes de l’émission supercritique. La combinaison de ces techniques d'imagerie donne un outil puissant pour étudier les phénomènes moléculaires sur les membranes biologiquesUnderstanding cellular processes on membranes has been a key area of biomedical research. Circumventing the diffraction limit in fluorescence microscopy has now become possible by exploiting the molecular transitions of the fluorophore. In this context, this work presents the instrumental development of two complementary techniques for realizing nanometric all-optical resolution and axial sectioning, namely STimulated Emission Depletion (STED) and Supercritical Angle Fluorescence (SAF) microscopy. STED microscopy is an elegant method that has allowed us to break the diffraction barrier with light microscopes and has achieved resolutions of the order of 40 nm (transverse) in biological samples. In this technique, we exploit the molecular transitions of the fluorescent marker to overcome the resolution limit due to diffraction. Resolution enhancement is achieved by efficient depletion of the excited state of the marker in the peripheral spatial regions of the focal volume by using depletion beams in addition to the excitation beam. Despite the major resolution improvement demonstrated, the technique is not well spread out, mainly due to its apparent complexity; and the cost and limited tunability of the commercial system. In this context, the instrumental realization and the imaging performance of a cost-effective home-built STED microscope is presented in this manuscript. While conventional STED microscopes offer improved lateral resolution, an isotropic gain in resolution usually comes at the cost of complex instrumentation. In this regard, we demonstrate SAF microscopy as a powerful tool that achieves an axial sectioning of the order of 150 nm. This is done by exploiting the property of a molecule to emit into the supercritical anglesonly when near the glass-water interface. Axial sectioning is obtained in a simple configuration by detecting solely the supercritical components of radiation. A combination of these imaging techniques offer a powerful tool to study molecular phenomena on the biological membranes
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Miserey-Lenkei, Stéphanie. „Récepteur AT1a de l'angiotensine II fluorescent : trafic cellulaire au cours de son activation“. Paris 6, 2001. http://www.theses.fr/2001PA066169.
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Vivancos, Cécile Morel Gérard. „Mécanisme et conséquences métaboliques de l'internalisation de l'hormone de croissance“. [S.l.] : [s.n.], 2004. http://tel.archives-ouvertes.fr/docs/00/06/38/06/PDF/theseVC.pdf.
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Germier, Thomas. „Dynamique de la chromatine et transcription“. Thesis, Toulouse 3, 2018. http://www.theses.fr/2018TOU30376.
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La dynamique de la chromatine est affectée par les processus biologiques. Pour comprendre comment la physique de la chromatine et la biologie se repondent, nous avons besoin d'outils pour analyser la dynamique de la chromatine in vivo. Plusieurs systèmes existent pour marquer les loci d'ADN et déterminer efficacement leur position dans le noyau, mais ils présentent des inconvénients dans les cellules de mammifères lorsqu'il s'agit d'étudier le mouvement de la chromatine dans le contexte de processus biologiques. Cela est particulièrement vrai lorsqu'il s'agit de mécanismes où l'ADN doit être lu à proximité du marquage. Pour étudier la dynamique de la chromatine in cellulo, l'équipe Bystricky a développé ANCHOR. ANCHOR repose sur l'insertion d'une séquence courte et non répétitive (ANCH) dans le génome de l'hôte. Cette séquence contient des sites de liaison pour une protéine (OR) qui, une fois liée, s'oligomérise et permet la visualisation du locus marqué. ANCHOR est dérivé des systèmes de partitionnement des chromosomes bactériens. L'outil a été implémenté avec succès dans la levure bourgeonnante (Saad et al. 2014) et plus récemment dans la drosophile (H. Chen, Fujioka, et Gregor 2017 ; Gomez-Lamarca et al. 2018). L'un de mes projets de thèse consistait à appliquer le système ANCHOR dans des cellules humaines. La séquence ANCH3 a été insérée de manière aléatoire et en une seule copie dans le génome de la lignée cellulaire de cancer du sein MCF7 par Hafida Sellou (étudiante en M2) et Fatima Moutahir (technicienne). Pour insérer la séquence ANCH3, les cellules MCF7 ont d'abord été modifiées pour insérer un site FRT dans le génome. Ensuite, un plasmide contenant l'ANCH3 couplé au transgène Cyclin D1 et un site FRT a été transfecté. La recombinaison entre les deux sites FRT a été favorisée par la Flipase. La protéine OR3 étiquetée par fluorescence a été exprimée de manière stable ou transitoire pour permettre l'imagerie du gène CCND1 (voir (Germier et al. 2017, 2018) pour plus de détails). Nous avons voulu établir une preuve de principe pour l'utilisation d'ANCHOR dans des cellules de mammifères. Des cellules MCF7 contenant un transgène CCND1, appelé G7-CCND1 (Germier et al. 2017) ont été transfectées de manière stable avec OR3-Santaka et le locus CCND1 a été suivi sur 24 heures à travers une division cellulaire. Nous avons pu suivre efficacement le locus du transgène sans photoblanchiment. La présence de la protéine OR3-Santaka sur le locus chromatinien n'a pas perturbé la réplication et deux loci ont été effectivement observés dans les deux cellules filles (Germier et al. 2018). En utilisant le système ANCHOR3, nous avons donc développé un outil puissant pour étudier à la fois des événements rapides et courts comme la transcription et des événements à long terme se déroulant sur plusieurs jours, comme la division ou la différenciation cellulaireChromatin dynamics are affected by biological processes. To understand how physical behaviour of chromatin and biology work together, we need tools to analyse chromatin motion in living cells. Several systems exist to fluorescently label DNA loci and to effectively determine their position within the nucleus, but they have drawbacks in mammalian cells when it comes to studying chromatin motion in the context of biological processes. This is especially true when it comes to mechanisms where DNA needs to be processed in the vicinity of the labeling. To study chromatin dynamics in cellulo, the Bystricky group developed the ANCHOR DNA labelling system. ANCHOR relies on the insertion of a short, non-repetitive sequence (ANCH) in the host genome. This sequence contains binding sites for a protein (OR) which once bound, oligomerize and allow visualization of the tagged locus. ANCHOR is derived from the bacterial chromosome partitioning systems. The tool was successfully implemented in budding yeast (Saad et al. 2014) and more recently in Drosophila (H. Chen, Fujioka, and Gregor 2017; Gomez-Lamarca et al. 2018). One of my thesis projects was to apply the ANCHOR system in human cells. The ANCH3 sequence was inserted randomly and in one copy in the genome of breast cancer cell line MCF7 by Hafida Sellou (M2 student) and Fatima Moutahir (technician). To insert the ANCH3 sequence, MCF7 cells were first modified to insert a FRT site in the genome. Then, a plasmid containing ANCH3 coupled to Cyclin D1 transgene and a FRT site was transfected. Recombination between the two FRT site was promoted by Flipase. The fluorescently-tagged OR3 protein was either stably or transiently expressed to allow imaging of the CCND1 gene (see (Germier et al. 2017, 2018) for details). We wanted to establish a proof of principle for the use of ANCHOR in mammalian cells. MCF7 cells containing a CCND1 transgene, called G7-CCND1 (Germier et al. 2017) were stably transfected with OR3-Santaka and the CCND1 locus was followed using fast- time lapse microscopy over 24 h through one cell division in a single cell. We could effectively follow the transgene locus without much photobleaching. The presence of OR3-Santaka protein on the chromatin locus did not disturb replication and two loci were effectively observed in the two daughter cells (Germier et al. 2018). Using the ANCHOR3 system, we hence developed a powerful tool to study both rapid, short events such as transcription and long-term events taking place over days, such as cell division or differentiation
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Asfour, Makdam. „Mesure atraumatique des variations de hauteur cellulaire : élaboration d'une technique de microscopie uniaxiale par conductance ionique“. Université Joseph Fourier (Grenoble), 1998. http://www.theses.fr/1998GRE19011.
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Delpech, Floriane. „Dynamique cellulaire des protéines de la réplication chez l'archée halophile Haloferax volcanii“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLX087/document.
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Ce travail de thèse porte sur l’étude de la réplication chez les archées, qui constituent le troisième domaine du vivant avec les bactéries et les eucaryotes. L’organisme modèle que nous avons utilisé est l'archée halophile Haloferax volcanii car les outils génétiques disponibles permettent d’exprimer des protéines fusionnées à la Protéine Fluorescente Verte (GFP) dans cet organisme mésophile et aérobe et ainsi de localiser les protéines d’intérêt dans des cellules vivantes. Nous nous sommes ainsi intéressés à la localisation cellulaire de quatre protéines de la réplication qui ont été fusionnées à la GFP et exprimées sous contrôle de leur propre promoteur : (i) la protéine ‘Flap Endonuclease 1’ (FEN1), qui intervient dans la maturation des fragments d’Okazaki, (ii) la protéine ‘Origin Recognition Complex’ (ORC1) impliquée dans la reconnaissance des origines de réplication, (iii) la protéine ‘Proliferating Cellular Nuclear Antigen’ (PCNA), anneau de processivité des ADN polymérases réplicatives, et (iv) la protéine de fixation à l’ADN simple-brin ‘Replication Protein A’ (RPA2) essentielle à la réplication chez H. volcanii. Seule la protéine PCNA n’a pu être exprimée en fusion avec la GFP, suggérant que la protéine fusion n’est pas fonctionnelle. GFP::Orc1 et GFP::Fen1 ont été exprimées dans la cellule mais ne présentent pas de localisation spécifique reflétant un rôle de ces protéines dans la réplication de l’ADN. En revanche des foyers de fluorescence de la protéine fusion GFP::Rpa2 ont été observés, dont le nombre augmente significativement dans des cellules exposées à l’aphidicoline, drogue inhibant la synthèse de l’ADN et induisant ainsi un stress réplicatif. Cependant une localisation différente de la protéine GFP::Rpa2 a été observée lorsque les cellules sont exposés à la phléomycine, qui induit notamment des cassures double-brin de l‘ADN. Dans ces cellules, GFP::Rpa2 forme un foyer de fluorescence massif qui colocalise avec l’ADN compacté dans la grande majorité des cellules observées. Nos résultats suggèrent donc que la localisation spécifique observée pour GFP::Rpa2 reflète son rôle dans la réparation de l’ADN et/ou le redémarrage des fourche de réplication arrêtéesThe aim of this thesis project was to improve our understanding of DNA replication in archaea, the third domain of life with bacteria and eukarya. The model organism chosen for these studies is the halophilic archaea Haloferax volcanii, a mesophilic aerobe for which genetics tools allow studying in living cells the localization of proteins fused to the Green Fluorescent protein (GFP). Four proteins involved in DNA replication were fused to the GFP and expressed under the control of their own promoter: (i) the ‘Flap Endonuclease 1’ (FEN1), involved in Okazaki fragments maturation, (ii) the ‘Origin Recognition Complex’ (ORC1), involved in DNA replication origin recognition, (iii) the ‘Proliferating Cellular Nuclear Antigen’ (PCNA), processivity factor of replicative DNA polymerases, and (iv) the ‘Replication Protein A’ (RPA2), single-stranded DNA binding protein essential for DNA replication in H. volcanii. Only the PCNA fusion to the GFP was not successful, suggesting that the GFP hinders essential roles of PCNA in DNA replication. Fen1 and Orc1 were successfully fused to the GFP and expressed in living cells, but specific localization in cells related to growth phase, reflecting different replication dynamics, were not observed. In contrast, we could observed fluorescent foci formed by the fully functional GFP::Rpa2 protein that actively responded to DNA damage in H. volcanii cells. The number of these fluorescent foci per cell was constant during cell growth but it significantly increased in cells exposed to aphidicoline, which inhibits DNA synthesis during replication. When cells were treated with phleomycine, a DNA damaging agent mainly causing double-strand breaks, formation of a massive fluorescent focus coinciding with DNA compaction was observed. Our results suggest that the specific cellular localization of GFP::Rpa2 observed reflects Rpa2 roles in DNA repair and/or DNA replication fork restart
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Orré, Thomas. „Mécanismes moléculaires d’activation des intégrines par la kindline-2 lors de l’adhésion cellulaire“. Thesis, Bordeaux, 2017. http://www.theses.fr/2017BORD0824/document.
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Les adhérences focales (AF), structures adhésives reliant la cellule à la matrice extra-cellulaire (MEC), constituent de véritables plateformes de signalisation biochimique et mécanique qui contrôlent l'adhérence, la migration, la différenciation et la survie cellulaire. Les récepteurs transmembranaires intégrines sont au coeur des AF, où elles connectent la MEC au cytosquelette d'actine. Au début des années 2000, la protéine intracellulaire taline, qui se lie aux parties cytoplasmiques bêta des intégrines, était considérée comme le principal activateur des intégrines. Néanmoins, il a depuis été montré que la kindline, autre protéine intracellulaire se liant aux parties bêta cytoplasmiques, jouait également un rôle essentiel dans l'activation des intégrines. Ainsi,plusieurs études ont mis en évidence que la kindline et la taline étaient complémentaires et avaient une action synergique durant l'activation des intégrines. Les bases moléculaires de ces phénomènes restent à déterminer. De plus, la plupart des données sur lerôle de la kindline dans l'adhérence et l'activation des intégrines provient d'expériences menées sur des cellules en suspension et/ou avec l'intégrine plaquettaire αIIbβ3. Ainsi, la régulation de ces processus par la kindline dans les cellules adhérentes est encore peu comprise. Dans cette étude, nous combinons la microscopie PALM et le suivi de protéines individuelles pour révéler le rôle et le comportement de la kindline à l'intérieur et à l'extérieur des AF au cours des événements moléculaires clés se déroulant au niveau de la membrane plasmique, et qui mènent à l'activation des intégrines. Nous avons observé que les intégrines bêta1 etbêta3 portant une mutation ponctuelle inhibant l'interaction avec la kindline montrent un défaut d'immobilisation dans les AF. Nous avons également observé que la kindline-2, qui est enrichie dans les AF, diffusait librement au niveau de la membrane plasmique,à l'intérieur et à l'extérieur des AF. Ceci constitue une distinction majeure par rapport à la taline, qui, au niveau de la membrane plasmique, est essentiellement observée dans les AF où elle est immobile, montrant qu'elle est recrutée dans les AF directement depuis le cytosol sans diffusion latérale membranaire (Rossier et al. 2012). Afin d'identifier les bases moléculaires du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline, nous avons utilisé différents variants mutés de kindline précédemment décrits. Le mutant kindline-2-QW614/615AA (liaison aux intégrines inhibée) montre une diffusion membranaire accrue, ce qui suggère que la kindline peut diffuser au niveau de la membrane plasmique sans être associée aux intégrines. Par ailleurs, la baisse d'immobilisation au niveau des AF observée avec ce mutant montre qu'une partie de l'immobilisation de la kindline est due aux intégrines, suggérant l'existence d'un complexe intégrine-kindline immobile dans les AF. La délétion du domaine PleckstrinHomology (PH) de la kindline diminue considérablement son recrutement et sa diffusion membranaire. Nous avons évalué le rôle fonctionnel du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline en réexprimant ces mutants dans des cellules déplétéesen kindline-1 et -2 (cellules KO kindline-1 -/-, kindline-2 -/-). Ces expériences montrent que le recrutement et la diffusion membranaire de la kindline sont cruciaux pour l'activation des intégrines durant l'étalement cellulaire et favorisent la formation d’adhérences. Cela suggère que la kindline utilise un chemin différent de celui de la taline pour atteindre et activer les intégrines,ce qui pourrait expliquer au niveau moléculaire comment la kindline complémente la taline durant l'activation des intégrinesFocal adhesions (FAs) are adhesive structures linking the cell to the extracellular matrix (ECM) and constitute molecular platforms for biochemical and mechanical signals controlling cell adhesion, migration, differentiation and survival. Integrin transmembrane receptors are core components of FAs, connecting the ECM to the actin cytoskeleton. During the early 2000s, the intracellular protein talin, which directly binds to the cytoplasmic tail of β-integrins, was considered as the main integrin activator. Nevertheless, it has been shown that kindlin, another intracellular protein that bind to β-integrin, is also a critical integrin activator. In fact, several studies have shown that kindlin and talin play complementary and synergistic roles during integrin activation. The molecular basis of these phenomena remains to determine. Moreover, most studies focusing on the role of kindlin during integrin activation and cell adhesion have been performed with suspended cells and/or with the platelet integrin αIIbβ3. Here we combined PALM microscopy with single protein tracking to decipher the role and behavior of kindlin during key molecular events occurring outside and inside FAs at the plasma membrane and leading to integrin activation, as we have done previously for talin (Rossier et al., 2012). We found that beta1 and beta3-integrins with a point mutation inhibiting binding to kindlin show reduced immobilization inside FAs. We also found that kindlin-2, which is enriched inside FAs, displayed free diffusion at the plasma membrane outside and inside FAs. This constitutes a major difference with talin, which, at the plasma membrane level, is observed almost exclusively in FAs, where it is immobile, which shows that talin is recruited into FAs directly from the cytosol without lateral diffusion along the plasma membrane (Rossier et al. 2012). To determine the molecular basis of kindlin membrane recruitment and diffusion, we used a kindlin variant known to decrease binding to integrins (kindlin-2- QW614/615AA). This mutant displayed increased membrane diffusion, suggesting that kindlin-2 can freely diffuse at the plasma membrane without interacting with integrins. Moreover, the kindlin-2-QW mutant showed decreased immobilization inside FA, showing that part of kindlin immobilization depends on interaction with integrins. This suggests that kindlin can form an immobile complex with integrins inside focal adhesions. Deletion of the kindlin pleckstrin homology (PH) domain strongly reduced the membrane recruitment and diffusion of kindlin. We assessed the functional role of kindlin membrane recruitment and diffusion by re-expressing different kindlin-2 mutants in kindlin-1/kindlin-2 double KO cells. Those experiments demonstrated that kindlin-2 membrane recruitment and diffusion are crucial for integrin activation during cell spreading and favor adhesion formation. This suggests that kindlin uses a different route from talin to reach integrins and trigger their activation, providing a possible molecular basis for their complementarity during integrin activation
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Tremblay-Bordeleau, François. „Microscopie de force photonique comme outil d'évaluation de la tension cellulaire au site d'adhésion focale“. Thesis, Université Laval, 2007. http://www.theses.ulaval.ca/2007/24526/24526.pdf.
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Bytebier, Karl. „Etude du comportement mécanique de la paroi cellulaire du bois par Microscopie à Force Atomique“. Phd thesis, Université Montpellier II - Sciences et Techniques du Languedoc, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00648700.
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Le bois en tant que matériau présente des propriétés effectives exceptionnelles mais son origine biologique entraine un manque de stabilité physico-mécanique et biochimique ainsi qu'une grande variabilité d'organisation de ses éléments constitutifs à plusieurs échelles (cerne annuel, tissus ligneux, cellule, paroi cellulaire, matière ligno-cellulosique, macromolécules) qui limitent son utilisation. Nous avons, dans le cadre de cette thèse, utilisé la microscopie à force atomique en tant qu'outil de caractérisation des propriétés mécaniques. Le but était de quantifier les propriétés viscoélestiques de couche de la paroi cellulaire de bois. Les travaux ont porté sur la mise au point de protocoles expérimentaux visant à l'amélioration de la qualité des échantillons de bois, à la calibration de la raideur et du rayon de pointe des microleviers utilisés en AFM et de sa réponse lors de l'utilisation d'un mode AFM particulier: le mode contact résonnant. Les résultats obtenus se situent dans la même gamme que les valeurs issues de la littérature, et laissent entrevoir des développements futurs pouvant apporter des réponses qu'il ne semble pas possible d'atteindre avec les autres méthodes disponibles à l'heure actuelle.
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Bordeleau, François. „Microscopie de force photonique comme outil d'évaluation de la tension cellulaire au site d'adhésion focale“. Master's thesis, Université Laval, 2007. http://hdl.handle.net/20.500.11794/19147.
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Genthial, Rachel. „Caractérisation du réseau lacuno-canaliculaire osseux par microscopie optique“. Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016GREAY058/document.
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Cette thèse porte sur l'étude du réseau lacuno-canaliculaire (Lacuno-canalicular Network : LCN) osseux grâce à différentes techniques de microscopie optique. Le LCN correspond à l'empreinte dans la matrice osseuse du réseau ostéocytaire formé de cellules dendritiques (les ostéocytes) interconnectées. Bien qu'il joue un rôle majeur dans la formation, le remodelage et le maintien des propriétés biomécaniques de l'os, les informations sur ce réseau cellulaire dans sa globalité restent limitées. Cela provient notamment de la difficulté à caractériser ce réseau dense et complexeavec une résolution sub-micrométrique sur des échelles allant jusqu'à l'organe entier. Dans cetravail de thèse nous avons cherché à améliorer la caractérisation du LCN en utilisant deux approches : la mise en place d'une méthode d'analyse du LCN à grande échelle à partir dela microscopie confocale d'une part et l'évaluation du potentiel de la microscopienon linéaire pour l'étude du LCN d'autre part.Dans un premier temps nous avons mis au point un protocole allant de la préparation des échantillons jusqu'au traitement des images et à l'analyse des données afin d'optimiser l'imagerie confocale des tissus osseux dans le but d'obtenir une analyse quantitative du réseau à grande échelle. Les résultats préliminaires mettent en évidence une grande variabilité des paramètres du réseau à toutes les échelles révélant la complexité de celui-ci. Cette analyse a été mise en pratique afin d'étudier les variations du LCN à l'échelle d'un fémur entier de souris.Dans un second temps, nous avons évaluer le potentiel de la microscopie optique non linéaire et notamment de la génération de troisième harmonique (THG) pour l'imagerie et l'étude du LCN. Nous avons tout d'abord montré la possibilité de visualiser le LCN, sans marquage fluorescent, grâce à la microscopie THG. A partir de cette preuve de principe nous avons expliqué l'origine des contrastes observés dans l'os par microscopie THG : un signal provenant des porosités et permettant de visualiser le réseau et un signal de fond structuré provenant des interfaces entre les fibrilles de collagène. Nous avons également évaluer les possibilités de la combinaisons de signaux non linéaires, principalement ceux de la THG et de la SHG (génération de seconde harmonique) qui permettent de visualiser simultanément le réseau et la matrice de collagène respectivement. Une corrélation entre la structure du réseau et l'organisation du collagène a pu être établie grâce à la visualisation de ces deux signaux sur de grandes échelles. Enfin des résultats quantitatifs sur le LCN ont pu être obtenus à partir des images THG permettant une étude des effets de la micro-gravité sur la structure de ce réseauThis thesis focuses on the study of bone lacuno-canalicular network (LCN) using different optical microscopy techniques. The LCN is the porosity network in the bone matrix where the cellular network lie. It is formed of dendritic cells: the osteocytes which are connected to each other. Although it plays a major role in the formation, remodeling and maintenance of biomechanical properties of bone, only little is known about this network as a whole. This can be explain by the difficult characterization of such a dense and complex network with sub-micron resolution and scales up to the entire organ. In this work we have sought to improve the characterization of the LCN using two approaches: the development of a method to analyse the network on large scale using confocal microscopy on one hand, and the assessment of the potential of non linear microscopy technique to study the LCN on the other hand.First, we have developed a protocol from sample preparation to image processing and data analysis to optimize confocal imaging of bone tissue in order to obtain a quantitative large scale analysis of the network. Preliminary results show a wide variation of network parameters at all scales revealing its complexity. This analysis was then used in order to assess changes in the LCN across an entire mice femur.Secondly, we study the potential of the non-linear optical microscopies especially the third harmonic generation (THG) microscopy for imaging and the study of the LCN. Initially, we demonstrated the ability to visualise the LCN without fluorescent labelling using THG microscopy. From this proof of concept we explained the origin of the different ThG microscopy contrasts observed in bone tissue: a signal from the porosities allowing to visualize the network and a structured background signal generated at the interfaces between collagen fibrils. We also assess the possibilities of combinations between different non-linear signals, mainly THG and SHG (second harmonic generation) that can simultaneously image the network and the collagen matrix respectively. A correlation between the network structure and collagen organization has been established using the visualization of these two signals over large scales. Finally quantitative parameters of the LCN were obtained from THG images and applied to study the effects of microgravity on the cellular network structure
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Gueu, Pascaline. „Imagerie de la dynamique de fluorescence (FLIM, FCS) par excitation à deux photons pour des études en milieu cellulaire et au sein de biofilms monobactériens“. Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112268.
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L’imagerie de la dynamique d’émission de fluorescence biphotonique est un développement technologique particulièrement attractif dans le domaine de la biophotonique. En particulier, les techniques de FLIM et FCS permettent l’imagerie cellulaire avec le suivi en temps réel des phénomènes biologiques mis en jeu, tandis que leur couplage à une excitation multiphotonique offre de plus grandes performances en termes de résolution spatiale, de profondeur de pénétration, d’innocuité vis-à-vis des systèmes biologiques. Les mesures FLIM par excitation biphotonique ont été utilisées pour l’étude in vitro et ex vivo d'un anti-intégrase du VIH-1, la 2-styrylquinoline Fz41. L’étude en solution de la dynamique réactionnelle de ce composé a permis de préciser sa spécificité de reconnaissance avec l’intégrase. Ces données ont été confrontées à des mesures au sein de cellules HeLa transduites par un vecteur lentiviral. C’est grâce à la durée de vie de fluorescence utilisée comme facteur de contraste qu’il a été permis de décrire l’activité intracellulaire de Fz41. La FCS a été utilisée pour étudier la diffusion-réaction de bactériophages c2 au sein de biofilms (communauté microbienne contenue dans une matrice de polymères organiques) sensibles ou non à cette entité biologique. Les résultats expérimentaux ont permis de conclure que la diffusion des particules virales au sein des biofilms est contrôlée par la structure de la matrice d’exopolymères. Dans ce travail, pour la première fois, la méthode FCS a permis de « visualiser » in situ l’interaction des bactériophages avec les bactéries possédant sur leur membrane le site de reconnaissance spécifiqueThe imaging of the biphotonic fluorescence emission dynamics is a technological development especially attractive in biophotonic. In particular, the FLIM and FCS techniques make cell imaging possible with a real-time follow-up of the occurring biological phenomena. Furthermore, their combination to a multiphotonic excitation increases their performance in terms of spatial resolution, penetration depth and harmlessness to biological systems. FLIM with two-photon excitation was used for the in-vitro and ex-vivo study of the 2-styrylquinoline Fz41 VIH-1 anti-integrase. The reaction dynamic study in solution of this component enabled us to check its specific recognition of the integrase. These data were compared with measurements performed in HeLa cells transduced with a lentiviral vector. By using the fluorescence lifetime as a contrast factor, the Fz41 intracellular activity could be described. The FCS was used to study the diffusion-reaction of c2 bacteriophages in biofilms (microbial community in an organic matrix) sensitive or not to this biological entity. The experimental results enabled us to conclude that the viral particle diffusion into biofilms is controlled by the exopolymeric matrix. In this study, for the first time, with the FCS technique, it was possible to visualise in situ the interaction of bacterophages with the bacteria whose membrane contained the specific recognition site
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Chabot, Vincent. „Plates-formes de microscopie et fluorescence par résonance de plasmons de surface appliquées à l'imagerie cellulaire“. Thèse, Université de Sherbrooke, 2013. http://hdl.handle.net/11143/6632.
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L'élaboration de nouveaux médicaments repose sur les études pharmacologiques, dont le rôle est d'identifier de nouveaux composés actifs ou de nouvelles cibles pharmacologiques agissant entre autres au niveau cellulaire. Récemment, la détection basée sur la résonance des plasmons de surface (SPR) a été appliquée à l'étude de réponses cellulaires. Cette méthode de détection, permettant d'observer des variations d'indice de réfraction associés à de faibles changements de masse à la surface d'un métal, a l'avantage de permettre l'étude d'une population de cellules vivantes en temps réel, sans nécessiter l'introduction d'agents de marquage. Pour effectuer la détection au niveau de cellules individuelles, on peut employer la microscopie SPR, qui consiste à localiser spatialement la détection par un système d'imagerie. Cependant, la détection basée sur la SPR est une mesure sans marquage et les signaux mesurés sont attribués à une réponse moyennée des différentes sources cellulaires. Afin de mieux comprendre et identifier les composantes cellulaires générant le signal mesuré en SPR, il est pertinent de combiner la microscopie SPR avec une modalité complémentaire, soit l'imagerie de fluorescence. C'est dans cette problématique que s'insère ce projet de thèse, consistant à concevoir deux plates-formes distinctes de microscopie SPR et de fluorescence optimisées pour l'étude cellulaire, de sorte à évaluer les possibilités d'intégration de ces deux modalités en un seul système. Des substrats adaptés pour chaque plate-forme ont été conçus et réalisés. Ces substrats employaient une couche d'argent passivée par l'ajout d'une mince couche d'or. La stabilité et la biocompatibilité des substrats ont été validées pour l'étude cellulaire. Deux configurations permettant d'améliorer la sensibilité en sondant les cellules plus profondément ont été évaluées, soit l'emploi de plasmons de surface à longue portée et de guides d'onde à gaine métallique. La sensibilité accrue de ces configurations a aussi été démontrée pour un usage en biodétection cellulaire. Une plate-forme permettant de mesurer la spectroscopie SPR simultanément avec l'acquisition d'images de fluorescence a été réalisée. Cette plate-forme a ensuite été validée par l'étude de réponses cellulaires suite à une stimulation pharmacologique. Puis, un système basé sur la microscopie SPR a été conçu et caractérisé. Son emploi pour l'étude de réponses au niveau de cellules individuelles a été démontré. Finalement, les forces et faiblesses des substrats et des plates-formes réalisées au cours de la thèse ont été évaluées. Des possibilités d'amélioration sont mises de l'avant et l'intégration des modalités de microscopie SPR et de fluorescence suite aux travaux de la thèse est discutée. Les réalisations au cours de cette étude ont donc permis d'identifier les composantes cellulaires impliquées dans la génération du signal mesuré en biodétection SPR.
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De, Dorlodot Bertrand. „Réfractométrie des liquides in situ, locale et résolue temporellement pour l'imagerie cellulaire en microscopie holographique numérique“. Master's thesis, Université Laval, 2020. http://hdl.handle.net/20.500.11794/66754.
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La microscopie de phase quantitative, en particulier la microscopie holographique numérique (MHN), est une approche d’imagerie cellulaire très prometteuse, notamment dans le domaine émergent des cellules souches pluripotentes induites humaines, en raison de sa complémentarité avec l’imagerie de fluorescence, sa grande sensibilité, son caractère non invasif et la richesse du signal quantitatif de phase mesuré. Ce signal quantitatif, très riche, est également compliqué à interpréter. Notamment, il dépend de l’indice de réfraction de la solution physiologique dans laquelle baignent les cellules étudiées. Pour être en mesure d’interpréter correctement le signal quantitatif de phase produit par les cellules, cet indice de réfraction extracellulaire (IRE) doit donc être précisément mesuré. Ce mémoire présente la conception, le développement et la caractérisation d’une méthode de réfractométrie de l’IRE directement dans la chambre d’imagerie, à partir du signal quantitatif de phase mesurée avec un MHN. La capacité du MHN à mesurer précisément un indice de réfraction est d’abord démontrée. Ensuite, son utilisation pour la réfractométrie des liquides dans une chambre d’imagerie est analysée, en remplaçant une des lamelles fermant cette chambre par une lamelle rainurée dont les rainures sont très bien caractérisées. Une précision moyenne de 0.0003 sur l’indice de réfraction est démontrée, ce qui correspond à la précision d’un réfractomètre des liquides commercial typique. Enfin, une preuve de concept faite en utilisant ces lamelles dans un contexte d’imagerie cellulaire sous le MHN. Les données obtenues sont discutées et caractérisées en détail, et la pertinence de ces lamelles dans ce contexte est démontrée.Quantitative phase microscopy, in particular digital holographic microscopy, is a promising imaging technique for the study of living cells, notably the emerging field of human induced pluripotent stem cells, because of its great sensitivity and resolution, its strict non-invasiveness and its complementarity with fluorescence imaging. This technique allows for the retrieval of the quantitative phase signal (QPS) produced by cells, which is very rich but also complicated to interpret. In particular, the QPS depends on the refractive index (RI) of the medium surrounding the cells in an imaging chamber; therefore, this RI needs to be well monitored in order to correctly and precisely analyse the QPS. In this master’s thesis, the design, development and characterization of a method to measure this extracellular RI directly inside the imaging chamber using the QPS measured by a DHM are described. First, the DHM capability to measure precisely and accurately a RI is demonstrated. Then, its use for liquid refractometry in an imaging chamber is analysed, using a grooved coverslip with well characterized grooves in place of one of the coverslip closing the imaging chamber. An average accuracy on RI measurement of 0.0003 is demonstrated, which is similar to the one of a typical commercial liquid refractometer. Finally, a proof of concept using these grooved coverslips in a biological experiment involving cell imaging under the DHM is completed. The results are thoroughly analysed and discussed, and the relevance of these grooved coverslip for liquid refractometry in a biological context is demonstrated.
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Schultz, Patrick. „Etudes structurales du minichromosome du virus SV40 et de la chromatine cellulaire approches en microscopie électronique /“. Grenoble 2 : ANRT, 1987. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb37609778d.
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Socol, Marius. „La synchronisation électrochimique de l'étalement cellulaire sur des surfaces solides“. Phd thesis, Grenoble, 2010. http://www.theses.fr/2010GRENY012.
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La synchronisation des cellules est importante pour l'analyse des processus moléculaires impliqués dans l'étalement la motilité. Les interactions électrostatiques entre les cellules et les surfaces ont été étudiées dans le but de synchroniser la première étape de l'adhésion cellulaire. Les cellules Dictyostelium discoideum marquées avec LimE-GFP ont été utilisées pour le suivi en fluorescence des événements de polymérisation de l'actine. Des pics de fluorescence ont été observés pour les cellules individuelles pendant l'étalement en tampon phosphate. Dans une solution de concentration faible (0. 17 mM tampon phosphate sucrose) les cellules lévitent au dessous des surfaces conductrices (Indium Tin Oxide ITO), à cause de la répulsion électrostatique. Un dispositif électrochimique a été construit dans le but d'appliquer un pulse électrique (+2. 5 V/Ag,AgCI) sur une surface de ITO pendant 0,1 secondes. Dans ces conditions, l'oxydation de l'eau produit des protons qui réduisent la charge de surface négative de l'ITO et ainsi, les cellules sont attirées simultanément. Ces contacts irréversibles avec la surface déclenchent l'étalement cellulaire. Pour 37 parmi les 47 cellule étudiées (80%), apparaissent des pics de fluorescences successives plus au moins réguliers en temps, montrant une activité de polymérisation de l'actine oscillante. Remarquablement, aucun pic de fluorescence n'apparaît dans les 7 premières secondes d'après l'application du pulse. De plus, 29 des cellules parmi les 37 ont eu le premier pic dans un intervalle de 4 secondes, entre 7,5 et Il,5 secondes après le pulse. Ainsi, nous avons obtenu, pour la première fois, la synchronisation de l'étalement cellulaire d'un groupe de cellules grâce à une méthode électrochimiqueCell synchronization is important for the analysis of molecular events involved in cell spreading and motility. Electrostatic interactions between cells and surfaces were investigated in order to synchronize the fIrst step in cell adhesion. LimE-GFP marked Dictyostelium discoideum cells were used for fluorescent tracking of actin polymerization events. Oscillating LimE fluorescent peaks were observed for individual cells in standard phosphate buffer during spreading. At low ionic concentration (phosphate sucrose buffer 0. 17 mM), cells levitate over the conductive surfaces (Indium Tin Oxide, ITO) due to electrostatic repulsion. An electrochemical device was designed in order to apply an J overpotential pulse (+2. 5 V/Ag,AgCI) during 0. 1 s to the ITO surface. Ln these conditions, protons are produced by wate oxidation, which reduce the ITO negative surface charge and thus, attracting the levitating cells simultaneously. Consequently, these irreversible contacts with the surface triggered the onset of cell spreading. For 37 from 47 studied cells (80%), successive fluorescent peaks appear, more or less regularly spaced in time, showing an oscillating actin polymerization activity. Remarkably, no maxima appeared before 7 s after the pulse application. Moreover, 29 cells frOID 37 (79%) had the fIrst peak within 4 seconds interval, between 7. 5 sand 11. 5 s after the pulse. Therefore, we obtained synchronization of the spreading of a cell population for the fIrst time thanks to an electrochemical method
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Galimberti, Massimo. „Migration des lymphocytes : méthodes expérimentales pour l'évaluation des effets de la gravité“. Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066054.
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BUTEAU, LOZANO HELENE. „Etude fonctionnelle et localisation cellulaire du recepteur de la prolactine (doctorat : biochimie et biologie moleculaire)“. Paris 11, 1998. http://www.theses.fr/1998PA11T010.
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Iordan, Andreea Luminita. „Propriérés rhéologiques de matériaux biologiques : des suspensions cellulaires aux tissus“. Université Joseph Fourier (Grenoble), 2008. http://www.theses.fr/2008GRE10278.
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Les propriétés rhéologiques de suspensions cellulaires (CHO) et tissus sont étudiées. La concentration varie sur une large gamme. En particuIier, nous avons caractérisé l’écoulement et les propriétés viscoélastiques. Le seuil d’écoulement et le module de plateau élastique varient avec la concentration et sont décrits par un modèle de structures fractales en écoulement. Ces effets sont reliés à des paramètres microscopiques. Un tissu modèle est ensuite réalisé, en incluant ces cellules dans une matrice de collagène. Pour mesurer les changements structurels, la microscopie confocale est utilisée. Un phénomène nouveau est observé, la diminution de la rigidité du gel, en présence de cellules. En effet, les cellules s’allongent dans le gel et peuvent le remodeler, en fonction de la concentration : l’adhésion des cellules est facilitée lorsque la concentration en collagène est importante, mais l’espace est restreint. Ces deux effets s’opposent mais expliquent les comportements observésWe characterize the rheological properties of cell suspensions and tissues. The suspension concentration is varied over a wide range. CHO cell suspensions are used. In particular, we are able to characterize the flow properties of cells as well as their viscoelastic properties. The concentration-dependent yield stress and elastic plateau modulus are explained in the context of fractal aggregates under shear. These effects are related to intrinsic microscopic parameters. Then a model tissue is constructed, by including the same cells in a collagen matrix. To characterize the structural changes, confocal microscopy is used. A new important feature is observed, which is the breakdown of the collagen network, due to the presence of cells. Indeed, cells elongate within the gel and can remodel it, in a concentration dependent manner: adhesion of cells is easier when collagen concentration increases, but space is reduced. These two mechanisms compete and can explain the behaviours observed
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Cardoso, dos Santos Marcelina. „Etude de l’adhésion de vésicules géantes et de cellules vivantes par nanoscopie de fluorescence“. Thesis, Troyes, 2015. http://www.theses.fr/2015TROY0012/document.
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L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésionThe aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process
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Brau, Frédéric. „La microscopie de bioluminescence sur cellules en culture : mesure de l'ATP libre intracellulaire“. Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO1T080.
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Radecki, Guillaume. „Imagerie cellulaire par résonance magnétique rehaussée au manganèse (CelMEMRI)“. Thesis, Paris 11, 2015. http://www.theses.fr/2015PA112212/document.
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La science a avancé depuis le XIX ème siècle. Des nouveaux outils sont apparus : la microscopie optique nous donne la vision des cellules, la microscopie électronique nous entraine au cœur de celles-ci. L’imagerie par résonance magnétique est apparue dans les années soixante-dix. Depuis son évolution, l’IRM nous entraine de plus en plus loin dans les profondeurs secrètes de nos cerveaux. La possibilité d’observer l’activité neuronale à l’aide de l’imagerie fonctionnelle est une grande révolution. Cette thèse montrera la possibilité que l’on a d’observer l’activité d’un neurone individuel sans modification de son réseau grâce à l’imagerie rehaussée au manganèse. L’étude sera effectuée sur des Aplysies à très haut champ (17T). Ces animaux sont des mollusques marins gastropodes qui possèdent une particularité : leurs neurones sont de tailles importantes, ils peuvent atteindre 1 mm de diamètre. Leurs neurones sont regroupés en plusieurs ganglions. Mon étude portera sur le ganglion buccal, qui est le ganglion le plus étudié dans les recherches en électrophysiologie. Avant de réaliser les acquisitions, j’ai dû concevoir plusieurs antennes de tailles microscopiques adaptées à la taille des ganglions. En réduisant la taille des antennes, le rapport signal sur bruit augmente. Dans un deuxième temps, une double antenne a été développée permettant l’acquisition de deux échantillons simultanément. Cette antenne a nécessité de créer des préamplificateurs fonctionnant à 730 MHz. La première série d’expériences a permis d’observer l’évolution de l’activité neuronale selon différents stimulus liés au comportement alimentaire des aplysies in-vivo. J’ai montré grâce à la technique mise en place que l’on peut distinguer par IRM l’activité de chaque neurone face à un stimulus. Par la suite, pour continuer ce travail, une deuxième série d’expériences a été effectuée in-vitro. J’ai étudié le comportement des neurones selon les neuro-stimulateurs perfusés : la dopamine et la sérotonine, tous les deux présents naturellement dans l’aplysie. Globalement les neurones ont été activés mais après les avoir observés individuellement, j’ai remarqué quelques différences selon les neurotransmetteurs. Cette technique peut maintenant être utilisée pour étudier d’autres conduites de l’aplysie comme le comportement compulsif. L’étude sur la mémoire peut être aussi envisagée. Les origines comportementales ont probablement des mécanismes identiques entre les différentes espèces animales et donc avec l’Homme comme l’a démontré les études d’Eric Kandel sur la mémoireScience has evolved since the 19th century. New tools have appeared such as optical microscopy which gives us the vision of cells and electronic microscopy which leads us into their hearts. The magnetic resonance imaging appeared in the seventies. Evolving over time, the MRI has taken us farther and farther into the secret depths of our brains. The possibility of observing the neuronal activity thanks to the functional imaging is a major evolution. This thesis will show the possibility we have to observe the activity of a single neuron without modification of its network thanks to the manganese enhanced magnetic resonance imaging technique. The study was done on the Aplysia at very high field magnet (17T). These animals are marine gastropod mollusks with a peculiarity: their neurons are of important size and can reach 1 mm in diameter. Their neurons are grouped into several ganglia. My study concerns the buccal ganglion which is the most studied ganglia in the research in electrophysiology. Before making any acquisitions, I had to conceive several microscopic coils adapted to the size of the ganglions. By reducing the size of the coils, the signal of the noise ratio increases. Then, a double coil allowing the simultaneous acquisition of two samples was built. This antenna required the construction of pre-amplifiers operating at 730 MHz. The first series of experiments helped observe the evolution of the neuronal activity according to different stimuli linked to the eating habits of the Aplysia in vivo. Thanks to the technique implemented, I shall show that, using MRI, it is possible to distinguish the activity of each neuron with respect to a stimulus. Afterwards, to continue this work, a second series of experiments was made in vitro. I studied the behavior of neurons when perfused with neural stimulators: dopamine and serotonin, both naturally present in the Aplysia. Generally, all neurons were activated but when observing them individually, I noticed some differences. Studies in electrophysiology will allow us to get a better understanding and a confirmation of the results of this study. The MEMRI technique can be used in the future to study various disorders such as compulsive behaviors, which are present in the Aplysia, and probably have the same origins as in humans, given that many fundamental processes (such as memory studied by Eric Kandel who he demonstrated that human and Aplysia memories works with the same mechanism) are similar between the two species
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Ribaut, Clotilde. „Elaboration d'un biocapteur cellulaire impédancemétrique pour la mesure des changements physiologiques affectant la cellule parasitée“. Toulouse 3, 2008. http://thesesups.ups-tlse.fr/534/.
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L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier les changements physiologiques affectant des cellules parasitées et en particulier de mettre en évidence le stress oxydant provenant de l'infection à l'aide de la spectroscopie d'impédance électrochimique. Les études impédancemetriques réalisées d'une part sur des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum (agent pathogène du paludisme), et d'autre part sur des macrophages infectés par Leishmania amazonensis responsable de la leishmaniose ont mis en évidence des différences entre les deux états cellulaires, sain et parasité des cellules hôtes. Dans le cas des macrophages infectés, cette technologie innovante a permis la détection d'espèces caractéristiques du stress oxydant qui ont par ailleurs été détectées par d'autres techniques, la résonance paramagnétique électronique et la microscopie confocaleThe aim of the present work is to study physiological changes affecting parasitized cells and in particular the oxidative stress originating from the infection using electrochemical impedance spectroscopy. Impedancemetric studies carried out with in one hand red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum (malaria agent) and in the other hand macrophages infected by Leishmania amazonensis responsible of leishmaniasis allow differentiation between healthy and infected state of the host cell. In the case of infected macrophages, this innovative technology allows the detection of species characteristic of the oxidative stress which has been highlighted elsewhere by other techniques such as electronic paramagnetic resonance and confocal microscopy
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Makarchuk, Stanislaw. „Measurement of cell adhesion forces by holographic microscopy“. Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAE034/document.
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Les forces mécaniques, générées par la cellule jouent un rôle crucial dans l'adhésion cellulaire, qui est un processus commun à un grand nombre de lignées cellulaires. Afin de mesurer la champ des forces pendant l'adhérence cellulaire, nous utilisons la microscopie de force de traction, où la cellule adhère à la surface plane d'un substrat souple dans le plan. Les forces sont calculées à partir du champ de déplacement mesuré à l'intérieur du substrat sous la cellule. Nous avons construit le microscope, dans lequel nous utilisons des billes sphériques en polystyrène pour mesurer le champ de déplacement. Les positions des marqueurs sont obtenues en analysant I' image interférentielle des particules. Avec cette technique, nous atteignons une précision nanométrique sur le champ de déplacement des particules, ce qui nous permet d'améliorer la résolution en force de ce type de microscope. Les premières mesures ont été effectuées avec la lignée de cellules cancéreuses SW 480Mechanical forces, generated by the cell plays crucial role in cell adhesion - common process for different cell lines. ln order to measure the force map during cellular adhesion, we use Traction Force Microscopy (TFM), where cell adheres to the soft substrate in 20 plane, and the forces are calculated from measured displacement field inside the substrate underneath the cell. We built the microscope, where instead of using fluorescent markers, we use spherical polystyrene beads in order to measure the displacement field. Positions of the markers are obtained by analyzing the interference pattern caused by the beads in bright-field light. With this technique, we reach nanometer accuracy of the microsphere position determination, that, respectively, influence accuracy of the calculated force field. With the microscope first measurements were performed with cancer cell line SW 480
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Socol, Marius. „La synchronisation électrochimique de l'étalement cellulaire sur des surfaces solides“. Phd thesis, Grenoble, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00506773.
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La synchronisation des cellules est importante pour l'analyse des processus moléculaires impliqués dans l'étalement et la motilité. Les interactions électrostatiques entre les cellules et les surfaces ont été étudiées dans le but de synchroniser la première étape de l'adhésion cellulaire. Les cellules Dictyostelium discoideum marquées avec LimE-GFP ont été utilisées pour le suivi en fluorescence des événements de polymérisation de l'actine. Des pics de fluorescence ont été observés pour les cellules individuelles pendant l'étalement en tampon phosphate. Dans une solution de concentration faible (0.17 mM tampon phosphate sucrose) les cellules lévitent au dessous des surfaces conductrices (Indium Tin Oxide, ITO), à cause de la répulsion électrostatique. Un dispositif électrochimique a été construit dans le but d'appliquer un pulse électrique (+2.5 V/Ag,AgCl) sur une surface de ITO pendant 0,1 secondes. Dans ces conditions, l'oxydation de l'eau produit des protons qui réduisent la charge de surface négative de l'ITO et ainsi, les cellules sont attirées simultanément. Ces contacts irréversibles avec la surface déclenchent l'étalement cellulaire. Pour 37 parmi les 47 cellules étudiées (80%), apparaissent des pics de fluorescences successives plus au moins réguliers en temps, montrant une activité de polymérisation de l'actine oscillante. Remarquablement, aucun pic de fluorescence n'apparaît dans les 7 premières secondes d'après l'application du pulse. De plus, 29 des cellules parmi les 37 ont eu le premier pic dans un intervalle de 4 secondes, entre 7,5 et 11,5 secondes après le pulse. Ainsi, nous avons obtenu, pour la première fois, la synchronisation de l'étalement cellulaire d'un groupe de cellules grâce à une méthode électrochimique.
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Beaudouin, Joël. „Dynamique structurale et moléculaire des protéines nucléaires révélée par microscopie de fluorescence“. Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077008.
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Proag, Amsha. „Sensibilité de cellules vivantes aux propriétés mécaniques et géométriques de leur environnement“. Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077056.
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Les tissus animaux constituent des systèmes biologiques hautement organisés, où les échelles cellulaire et multicellulaire sont en corrélation constante. Non seulement les cellules régulent leur comportement au moyen de signaux biochimiques : elles transmettent aussi des stimuli mécaniques, via le cytosquelette et les complexes d'adhésion, ce qui conduit à la formation d'une organisation collective tridimensionnelle où cellules et tissu se contraignent mutuellement. Afin d'étudier les aspects mécaniques et géométriques des interactions entre cellules, nous avons cultivé des tissus épithéliaux sur des micro-environnements artificiels. Nous avons fabriqué des substrats microstructurés en polyacrylamide et en polydiméthylsiloxane, de rigidité et de géométrie définies, sur lesquels nous avons fait croître un épithélium de MDCK. Nous avons également modifié les propriétés adhésives de ces substrats pour y confiner une seule cellule et simuler ainsi les contraintes topologiques du tissu sur une cellule individuelle. Après avoir marqué les composants internes gouvernant l'architecture cellulaire, nous avons pu en obtenir des images 3D en microscopie confocale et quantifier la morphologie des cellules. Les distributions de volume des cellules et des noyaux mesurées diffèrent en fonction de leur localisation au sein du tissu, ainsi que de la géométrie et de la rigidité de l'environnement. En modifiant ces paramètres expérimentaux, nous avons pu observer l'effet de contraintes externes sur la morphologie cellulaire. Enfin, nous avons remarqué que le relief du tissu dépendait de la topographie du substrat, et nous en avons proposé un modèle qui lie les deux échelles d'organisationAnimal tissues constitute highly organized biological Systems, where the cellular and rmulticellular levels are in constant interrelation. Not only do cells regulate their behaviour via biochemical signalling: they also transmit mechanical stimuli, through the cytoskeleton and adhesion complexes, which leads to the formation of a tridimensional collective organization where cells and tissues constrain each other. To investigate the mechanical and geometrical aspects of intercellular interactions, we cultivated epithelial tissues on artificial micro-environments. We manufactured polyacrylamide and polydimethylsiloxane microstructured substrates with precise stiffness and geometry, which we grew MDCK epithelia on. We also modulated the adhesive properties of these substrates in order to confine a single cell and simulate the topological constraints of the tissue on an individual cell. After staining the internal components which govern cell architecture, we were able to obtain 3D images using confocal microscopy and to quantify the morphology of the cells. The measured volume distributions of cells and nuclei differed according to their localization within the tissue, as well as to the geometry and stiffness of the environment. Modifying these experimental parameters made it possible to observe the effect of external constraints on cell morphology. Finally, we found that the tissue profile depended on the topography of the substrate, and we suggested a mode! which correlates both organizational levels
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Winckler, Pascale. „Spectroscopie de corrélation de fluorescence : fluidité membranaire et détection de molécule unique en solution concentrée“. Troyes, 2011. http://www.theses.fr/2011TROY0009.
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La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) est une technique de molécules uniques particulièrement bien adaptée aux études en milieu biologique. Elle est ici mise en œuvre pour analyser localement la membrane plasmique de cellules vivantes. Dans un premier temps, la distribution de la microfluidité membranaire de cellules vivantes a été caractérisée grâce à des mesures de temps de diffusion par FCS. Nous avons ainsi pu établir la loi de distribution de la fluidité membranaire à l’échelle de la cellule unique pour différentes lignées cellulaires (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA et MDCKII). Une simulation Monte-Carlo montre qu’un modèle simple de diffusion à deux dimensions dans une matrice contenant des microdomaines visqueux peut rendre compte de l’allure asymétrique typique des distributions obtenues. Ce résultat a été utilisé pour évaluer les modifications membranaires liées à la surexpression de la P-glycoprotéine, protéine responsable d'un phénomène de résistance à la chimiothérapie. Nous avons également comparé la structuration membranaire de diverses lignées cancéreuses, chacune se déclinant en une version sensible et une version résistante à un médicament : la Doxorubicine. Dans un second temps, nous proposons une nouvelle méthode d’illumination locale basée sur un transfert d’énergie non radiatif. Cette méthode permet de réduire la profondeur de champ du microscope à l’échelle nanométrique. Nous en démontrons ici le potentiel pour l'utilisation de la FCS dans des solutions micromolaires ainsi que pour l'imagerie de l'adhésion cellulaireFluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a single molecule technique very well suited for in vivo studies. We have used FCS to explore plasma membrane microfluidity of living cells. Measurements were conducted at the single cell level, which enabled us to get a detailed over-view of the typical plasma membrane microviscosity distribution of each cell line studied (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA and MDCKII). A Monte Carlo simulation based on a 2D diffusion model enables us to link the asymetric fluidity distribution profile with the plasma membrane micro-organization. This result was used to determine the membrane organisation related to the surexpression of the P-glycoprotein (Pgp), a protein implicated in multidrug resistance. We also compare the membrane structuration of various cancer cell lines, each comes in two versions, a sensitive one and a resistant one to a chemotherapeutic drug: the Doxorubicin. Secondly, we propose a new excitation scheme based on a nonradiative energy transfert. This approach allow us to reduce the illumination depth of the microscope at the nanometric scale. We demonstrate its potential through two applications: FCS in micromolar solutions and fluorescence imaging on cells adhesion areas
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Aknoun, Sherazade. „Analyse quantitative d’images de phase obtenues par interféromètrie à décalage quadri-latéral. Applications en biologie“. Thesis, Aix-Marseille, 2014. http://www.theses.fr/2014AIXM4358/document.
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Ces travaux de thèse, consacrés à l'étude et analyse quantitative d'images de phase obtenues par interférométrie à décalage quadri-latéral, ont pour but la caractérisation d'un point de vue métrologique d'un outil de mesure et de ses différentes applications. Cette technique d'interférométrie, développée initialement par la société Phasics pour les marchés de la métrologie optique et de la caractérisation de faisceaux laser essentiellement, peut aussi permettre d'obtenir la cartographie d'un champ électromagnétique complexe grâce à une mesure de front d'onde. En l'utilisant sur un microscope en condition d'imagerie, ont été obtenues des images de l'intensité et de la différence de chemin optique introduite par un échantillon semi-transparent, définissant ainsi une nouvelle technique de contraste de phase quantitatif. La première partie de cette thèse sera consacrée aux techniques en microscopie qui permettent une quantification. Nous verrons les enjeux de l'obtention de ce caractère quantitatif et ce qu'il signifie dans le cadre de différentes techniques utilisant la fluorescence. On étudiera la mesure dans le cadre d'une approximation dite "projective" réalisant certaines hypothèses. On verra quelles sont les grandeurs accessibles grâce à une mesure dans le cadre de cette approximation et quelles applications en biologie peuvent être développées concernant les éléments isotropes dans une première partie et les éléments anisotropes dans une seconde partie.Nous démontrerons la possible transposition de ces applications réalisées en deux dimensions en trois dimensions avec une résolution axiale suffisante permettant une reconstruction tomographiqueThe aim of this thesis, dedicated to the study and quantitative analysis of phase images obtained thanks to quadri-wave lateral shearing interferometry, is to caracterize a metrological tool and its three proposed different applications.This work has been done in collaboration between Institut Fresnel (Marseille, France) and Phasics company (Palaiseau, France) and continues that of Pierre Bon who has been in charge the application this technique to microscopy. This interferometric technique, developped by Phasics, for optical metrology and lasers characterization, allows to record complex eletromagnetic field maps thanks to a wave front measurement. By using it in the microscope image plane, one can obtain inetnsity and optical path difference images of a semi-transparent biological sample. this technique is now considered as a new quantitative phase contrast technique.The first part of this manuscript will be a state of the art of quantitative microscopy techniques. The issues of quantification and its meanings in the framework of different fluorescent and phase based techniques will be discussed.A description of the technique that is used and its comparison with similar phase techniques will be done.The measurement, under the projective approximation, is studied leading to different variables. We show different applications concerning isotropic elements in a first part and anisotropic elements in the second one.We show how this measurement is trnasposed to the third dimensions allowing three dimensional imaging and complete reconstruction of refractive index maps of biological samples
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Gillant, Flavie. „Pince optique et microscopie à contraste de phase pour l'étude de la mécanique cellulaire : développement, modélisation et calibration en réflexion“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLO016/document.
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Ce manuscrit détaille le développement d'un montage de pince optique permettant d'étudier les propriétés mécaniques des cellules endothéliales, impliquées dans le développement de l'athérosclérose. Le but est de déterminer les propriétés viscoélastiques des cellules, et de suivre la propagation d’une contrainte mécanique au sein de la cellule. Cette contrainte mécanique est appliquée via une bille liée à la membrane de la cellule et soumise à un piège optique.Le dispositif réalisé combine le piégeage optique et la microscopie à contraste de phase, permettant d'exercer une force tout en imageant les cellules via le même objectif de microscope. L'originalité du montage de pince optique repose sur la détection du signal rétrodiffusé par la bille piégée, dans un plan conjugué du plan focal arrière de l'objectif, afin de mesurer la position relative de la bille par rapport au piège.Une part importante de ce travail a consisté à comprendre l'allure du signal détecté présentant un système d'interférences en anneaux, et à l’expliquer par un modèle simple. Ce modèle a permis de comprendre la présence d’artefacts de mesure de position dus à la superposition de l'anneau de phase sur la figure d’interférence. Pour y remédier, l'anneau de phase est déporté dans un plan conjugué intervenant uniquement dans l'imagerie de l'échantillon.La figure d'interférence présente un atout majeur : elle donne accès à la hauteur précise de la bille piégée, généralement difficile à mesurer. Cette information est nécessaire pour calibrer la constante de raideur du piège optique à la hauteur des cellules, que ce soit par l'analyse de la densité spectrale de puissance du mouvement brownien de la bille piégée ou par sa réponse à un échelon de position du piège. Ces deux méthodes de calibration, ainsi que l'application du théorème d’équipartition et l'analyse par inférence bayésienne, ont été mises en œuvre. Tous les résultats s'avèrent en bon accord. La calibration complète du dispositif en fait un outil prêt à l'emploi pour exercer des forces locales contrôlées en direction et en amplitude sur les cellulesThis manuscript details the development of an optical tweezer setup to study the mechanical properties of endothelial cells, involved in the development of atherosclerosis. The goal is to determine the viscoelastic properties of the cells, and to follow the propagation of the mechanical constraint inside the cell. This mechanical constraint is applied via a bead attached to the cell membrane and subjected to an optical trap.The setup built combines optical trapping with phase contrast microscopy, to apply a force while imaging the cells with the same microscope objective. The originality of the optical tweezer setup relies on the detection of the signal backscattered by the trapped bead, in a plane conjugate to the back focal plane of the objective, in order to measure the relative position of the bead with respect to the center of the trap.An important part of this work was dedicated to the understanding of the detected signal presenting an interference pattern with rings, explained by a simple model. This model provides an explanation for the position measurement artifacts arising from the superposition of the phase ring and the interference pattern. To solve the problem, the phase ring was moved in a conjugate plane involved only in the imaging path of the sample.The interference pattern has the main advantage of giving access to the precise height of the trapped bead, usually difficult to measure. This information is necessary to calibrate the optical trap stiffness at the height of the cells, either by the power spectrum analysis of the Brownian motion of the trapped bead, or by its response to a step motion of the trap. These two calibration methods, along with the application of the equipartition theorem and Bayesian inference analysis, were implemented and their results compared, showing a good agreement. The complete calibration of the setup makes it a ready-to-use tool to exert local forces controlled in direction and amplitude on cells
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Dumat, Blaise. „Sondes fluorescentes vinyl-triphénylamines optimisées pour la microscopie biphotonique : Etude des intéractions non covalentes avec l'ADN et la HSA et application à l'imagerie cellulaire“. Thesis, Paris 11, 2012. http://www.theses.fr/2012PA112319/document.
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L’avènement de la microscopie biphotonique et des techniques dites de « super-résolution » ont permis d’améliorer les performances de la microscopie de fluorescence et de l’appliquer à l’imagerie intravitale et à l’analyse des tissus biologiques. Ces techniques requièrent néanmoins l’emploi de sondes aux propriétés optiques et biologiques optimisées.Plusieurs séries de colorants cationiques basés sur le motif vinyl-triphénylamine (TP) ont été développés pour le marquage d’ADN. Ces fluorophores rouges ou jaunes dont l’émission de fluorescence est commutée par l’interaction avec l’ADN sont des ligands de petit sillon de l’hélice B et possèdent des sections efficaces d’absorption à deux photons élevées.Les TP marquent l’ADN du noyau des cellules fixées ou en apoptose avec une intensité et un contraste élevés. Elles sont non-cytotoxiques, photostables et sont perméables à la membrane cellulaire. L’optimisation des propriétés a permis d’obtenir la TP-2Bzim, qui possède une brillance biphotonique parmi les plus élevées rapportées dans la littérature pour des molécules de faible poids moléculaire (383 GM) et permet une détection en microscopie biphotonique à basse concentration et à faible puissance d’excitation. En cellules vivantes, les TP sont localisées dans les mitochondries mais, sous excitation mono- ou bi-photonique constante, elles déclenchent l’apoptose de la cellule et se relocalisent dans le noyau. Le phénomène peut être imagé par fluorescence, et les TP pourraient donc être employées comme photosensibilisateurs théranostiques.Enfin, une stratégie de synthèse pour fonctionnaliser la TP-2Bzim a été développée. Elle a ainsi pu être couplée à des oligonucléotides et à un PNA pour la détection d’hybridation par fluorescence et à l’acide folique et à la spermidine pour le ciblage de cellules cancéreusesSignificant advances were made in the field of in vivo fluorescence imaging thanks to the recent development of biphotonic microscopy and super-resolution techniques, rendering intravital imaging and biological tissues analysis possible. Those techniques however require the use of new probes with optimized optical and biological properties.Several series of cationic dyes for DNA staining were developed based on the vinyl-triphenylamine (TP) scaffold. Those new switchable yellow or red fluorophores bind in the minor-groove of DNA and display high two-photon absorption cross-sections. Two anionic derivatives were also designed for staining HSA.In fixed or apoptotic cells, the cationic dyes stain nuclear DNA with a high brightness and contrast. They are non-cytotoxic, photostable and cell permeant. The molecule with the most optimized properties, TP-2Bzim, has one of the highest two-photon brightness to date (383 GM in DNA), allowing sensible detection in biphotonic microscopy at low concentration and excitation power. In live cells, the dyes are localized in the mitochondria, but it appears that upon constant mono- or bi-photonic excitation they trigger cell apoptosis within a few minutes and are released in the nucleus. Since the phenomenon can be imaged by fluorescence microscopy, the TP dyes could thus be used as photosensitizers for theranostics.A synthetic pathway was also developed to functionalize the TP-2Bzim. It was then coupled by “click-chemistry” to short oligonucleotides or PNA sequences for fluorescence in situ hybridization, and to folic acid and spermidine for cancer cells targeting
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Babić, Ana. „Etude en temps réel de la conjugaison chez Escherichia coli par la microscopie à fluorescence“. Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066232.
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Le transfert horizontal de gènes permet aux bactéries d’acquérir rapidement de nouveaux gènes. La conjugaison, avec la transduction par les phages et les plasmides, est un des mécanismes majeurs dans le transfert horizontal de gènes. Pendant la conjugaison, l’ADN de la cellule donatrice est transféré à la cellule réceptrice. Il peut ensuite être soit dégradé soit recombiné dans le chromosome de la réceptrice. Jusqu’a présent les connaissances sur les mécanismes moléculaires de la conjugaison étaient basées sur des études génétiques qui traitaient des populations de cellules réceptrices et donatrices. Nous avons ici étudie la conjugaison en temps réel au niveau de cellule individuelle. Cela a été accompli par la construction de la protéine hybride SeqA-YFP qui marque l’ADN transféré de la manière stable et spécifique. Grâce a ce système nous avons pu étudier i) le transfert de l’ADN, ii) la recombinaison et/ou la dégradation de l’ADN transféré, iii) les événements précoces de la recombinaison qui sont à l’origine des colonies hétérogènes et iv) l’effet de la conjugaison sur la viabilité des cellules réceptrices. Notre système permet donc de suivre en temps réel le transfert et la recombinaison de l’ADN au cours de la conjugaison constitue un outil puissant de la recherche et de pédagogie.
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Chambaud, Clément. „Compréhension des mécanismes précoces dans l'établissement de la relation porte greffe-greffon chez Arabidopsis“. Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0395.
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Le greffage est une pratique qui consiste à couper et joindre les appareils racinaires et aériens de deux plantes pour former un organisme chimérique unique, combinant au sein d'un même individu, les caractéristiques biologiques les plus avantageuses de ces deux plantes, telles que la résistance aux agents pathogènes du sol et la production fruitière. Pour survivre, les plantes greffées, où toutes les communications cellulaires entre les parties aériennes et racinaires ont été interrompues par la coupe, doivent interagir ensemble pour établir de nouvelles voies d'échange. De nos jours, des efforts considérables ont été déployés pour comprendre les mécanismes de développement sous-jacents à la formation d'une union au niveau de la greffe en termes de signalisation hormonale, d'expression génique et d'histologie ; mais les données ultrastructurales sont encore insuffisantes.En raison de la difficulté de cibler de manière fiable l'interface de greffe en microscopie électronique, très peu de données ultrastructurales de l'interface de greffe sont disponibles. Cependant, ces données sont essentielles pour comprendre l'établissement de communications greffons / porte-greffes.Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était de caractériser les développements ultrastructuraux survenant au cours de la formation de cette union afin de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués. Tout d'abord, une approche par microscopie correlative (CLEM) a été développée sur des hypocotyles greffés d'Arabidopsis thaliana et des greffes in vitro de vigne. Bien que la qualité obtenue sur le modèle de la vigne doive encore être améliorée, la préservation de la fluorescence et de l'ultrastructure obtenue pour A. thaliana a permis de révéler au moins quatre voies de communication entre le greffon et le porte-greffe: exosomes, plasmodesmes, phloème et xylème. La caractérisation ultrastructurale des plasmodesmes formés de novo à l’interface de greffe, par tomographie électronique, a montré que plus de 30% des tentatives pour former une connexion symplastique échouaient et aboutissaient à la formation d’hémi-plasmodesmes ne traversant pas la paroi cellulaire, aussi bien du côté du greffon que du porte-greffe. De plus, les observations d'événements de biogenèse de plasmodesmes secondaires semblent indiquer que ces plasmodesmes seraient formés dans des cellules présentant un amincissement synchrone de la paroi cellulaire. Enfin, pour la première fois, des échanges cytoplasmiques ont été observés à l’interface de greffe. Ainsi, le processus de greffage combiné à notre approche de CLEM pourrait être un moyen d’induire et d’étudier des événements de transplastomiques. Ces fusions cytoplasmiques pourraient jouer un rôle dans la cicatrisation des blessures ou la reconnexion vasculaire. Finalement, des lignées transgéniques d’Arabidopsis ont été mises au point pour suivre, à l'avenir, la perméabilité des plasmodesmes à l'interface de greffe. L’intégration d’études ultrastructurales et d’études dynamiques lors du greffage de différents mutants permettra d’élucider la fonctionnalité de la connexion de cellule à cellule pendant la formation de la greffeGrafting consists of the cutting and joining of two plants together to form one unique chimeric organism; it is done to combine biological traits of the two plants such as resistance to soil borne pathogens and high fruit quality in one plant. To survive, grafted plants, where all physical cell communications between aerial and root parts are interrupted by cutting, have to interact together to establish new exchange pathways. Nowadays, considerable efforts have been done to understand the developmental mechanisms underlying graft union formation in terms of hormone signaling, gene expression and histology however ultrastructural data are still lacking.Because of the difficulty of reliably targeting the graft interface under the electron microscope very few ultrastructural data of the graft interface are available; however such precise data is essential to understand the establishment of scion/rootstock communications.In this context, the aim of my thesis was to characterize the ultrastructural developments occurring during graft union formation to provide insights into the cellular mechanisms involved. First, a correlative light and electron microscopy (CLEM) approach was implemented on grafted hypocotyls of Arabidopsis thaliana and in vitro grafts of grapevine. Although quality obtained on the grapevine model still needs to be improved, the fluorescence and ultrastructure preservation obtained for A. thaliana allowed me to reveal four potential pathways of communication between the scion and rootstock: exosomes, plasmodesmata, phloem and xylem. The ultrastructural characterization of de novo plasmodesmata formed at the graft interface, by electron tomography, showed that more than 30 % of the attempts to form symplastic connection failed and resulted in the formation, both at scion or rootstock side of the cell wall, of hemi-plasmodesmata that do no span the cell wall. Moreover, the observations of events of secondary plasmodesmata biogenesis seem to indicate that plasmodesmata can be formed successfully between cells where there is a synchronous thinning of the cell wall. Finally, for the first time cytoplasmic exchanges were shown to happen at the graft interface and confirm that grafting combined with our CLEM approach could be a way to induce and study transplastomic events. They could play a role in wound healing or vascular reconnection. Additionally, biological tools have been developed to follow, in the future, the permeability of plasmodesmata at the graft interface of A. thaliana. The integration of ultrastructural and dynamic studies on different mutants will allow us to decipher the functional establishment of the cell-to-cell connectivity during the graft union formation
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Wozniak, Zdzislaw Michal. „Expression des organisateurs nucléolaires évaluée par analyse d'images microscopiques et microscopie confocale à balayage laser en pathologie cellulaire“. Université Joseph Fourier (Grenoble), 1994. http://www.theses.fr/1994GRE19008.
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Pusset, David. „Approches microscopiques et développement d'une méthode de microcartographie pour la localisation du neptunium-237 à l'échelle cellulaire : mise en évidence de processus apoptotiques in vivo“. Besançon, 2004. http://www.theses.fr/2004BESA2025.
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A l'heure actuelle, la distribution tissulaire et les bio cinétiques d'élimination du neptunium-237 sont relativement bien connues. Par contre, les données concernant sa distribution intracellulaire sont peu nombreuses et disparates, et ne permettent pas d'expliquer la difficulté présentée quant à la décorporation de ce radio nucléide. Cette étude vise à déterminer les cibles cellulaires de concentration de ce radioélément artificiel de très longue période, tout en s'attachant à définir son influence sur le vivant. Dans un premier temps, deux approches ont été envisagées afin de localiser le neptunium au niveau cellulaire. La première de ces approches est une étude histologique reposant sur la mise en œuvre de techniques de microscopie électronique et ionique. Ces études ont ainsi permis de confirmer une concentration intranucléaire dans le foie et le rein. Ensuite, une méthode basée sur la micro cartographie des fragments de fission, issus de l'irradiation neutronique de coupes organiques contenant du neptunium, a été développée. Ce procédé consiste à induire la fission d'atomes de neptunium présents dans une coupe organique et d'enregistrer la position de ces fissions à l'aide d'un détecteur solide de traces nucléaires, couplé à un système de repérage micrométrique. Ce travail consiste en la faisabilité du développement d'une telle technique et dans sa validation quant à la détection du neptunium-237. Enfin, les effets toxiques du neptunium-237 ont été démontrés en observant une densité importante de lésions apoptotiques au sein des tissus de foie, de reins et de moelle osseuse, et corrélés à la concentration du neptuniumNowadays, the tissue distribution and the biokinetics of elimination of neptunium-237 are quite well known. On the other hand, data concerning its intracellular distribution are rare and varied, and they don't allow to explain the difficult décorporation of this radionuclide. The aim of this research is to determine the cellular sites of concentration of this very long half-life radioelement, and its toxic effects on the living. Concerning the neptunium localisation, two approaches have been developed. The first one is an histological study based on the implementation of electron and ion microscopy techniques. These studies have confirmed the concentration of neptunium in the nuclei of the cells in the kidneys and the liver. The second approach is based on the cartography of the neutron-induced fission fragments of neptunium nuclei, in some thin organ sections. This process consists in inducing the fission of a part of the neptunium nuclei present in an organ section, and in recording the position of the nuclei that have fissionned, by using a solid state nuclear tracks detector associated with a micrometric location device. In this work, the feasibility of this technology, and its validation in the detection of neptunium-237 nuclei have been realised. Finally, the toxicity of neptunium have been proved by observing a significant density of apoptotic lesions in liver kidneys or bone marrow tissue. A correlation between the tissue distribution of neptunium and the appearance of the lesions, have been studied, and the problem in determining which kind of toxicity is predominantly exhibited by neptunium, is raised
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Pelloux, Sophie. „Induction de la cardioprotection par le diazoxide : études en temps réel sur un modèle cellulaire“. Lyon 1, 2008. http://www.theses.fr/2008LYO10040.
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Une protection contre les lésions dues à une ischmie-reperfusion peut être induite par le diazoxide, un ouvreur de canaux potassiques ATP-dépendants (Katp). Le diazoxide est aussi connu pour inhiber la succinate déshydrogénase (SDH), enzyme de la chaîne respiratoire et du cycle de Krebs. Pour mieux comprendre les mécanismes en jeu, nous avons caractérisé la lignée cellulaire d'origine cardiaque HL-1-NB, adaptée à l'utilisation de techniques optiques, pour suivre en temps réel plusieurs paramètres cellulaires. Sur ce modèle nous avons montré que le diazoxide n'induit pas l'ouverture des canaux KATP, ni sarcolemmaux, ni mitochondriaux, dans des conditions qui induisent pourtant une protection. Nos résultats sont en faveur d'un rôle clé de l'inhibition de la SDH dans l'induction de la protection. Ils suggèrent par ailleurs que le diazoxide pourrait avoir, par une action sur les canaux KATP sarcolemmaux, indépendamment de leur ouverture, un effet métabolique compartimenté
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Gibeaux, Romain. „Microtubules et mouvements nucléaires : Saccharomyces cerevisiae et de la croissance filamenteuse chez Ashbya gossypii“. Rennes 1, 2012. http://www.theses.fr/2012REN1S040.
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Nuclear migration is essential for normal growth and development of all eukaryotes and many key nuclear movements depend on microtubules. We addressed the question of microtubule-driven nuclear movements by studying the Saccharomyces cerevisiae karyogamy and the Ashbya gossypii hyphal growth as two model systems. To study the principles of these movements we used electron tomography as a main tool to analyse the microtubule organisation with high ultra-structural details, together with genetics, live-cell imaging and mathematical modelling. We first explored the mechanism of nuclear congression in the S. Cerevisiae mating pathway. We analysed the organisation of cytoplasmic microtubules during mating at the electron tomography resolution. Combining genetics and live-cell imaging we deciphered the role of the minus-end-directed kinesin Kar3 in force generation and its involvement at its spindle pole body localisation. We demonstrated that Kar3 directs spindle pole body migration along microtubules during yeast mating to promote nuclear congression. Secondly, we addressed the question of nuclear positioning during A. Gossypii hyphal growth based on an electron tomography analysis. We asked how cytoplasmic microtubules are organised at the spindle pole bodies, orient and associate with the cell cortex. New insights in nuclear oscillation and bypassing were provided. Also, as a potential limiting factor in nuclear displacement, we analysed the spatial organisation of organelles in the hypha tip region. These two model systems allowed us to identify common components and basic properties of nuclear movements that can be extended from yeast to mammalsLa migration nucléaire est essentielle pour la croissance et le développement des eucaryotes et nombre de ces mouvements dépendent des microtubules (MTs). Nous avons étudié ces mouvements grâce aux systèmes modèles de la caryogamie chez Saccharomyces cerevisiae et la croissance filamenteuse chez Ashbya gossypii. Afin d'analyser leurs principes, nous avons utilisé la tomographie électronique pour examiner l'organisation des MTs avec d'importants détails structuraux, et combiné cette approche avec la génétique, l'imagerie optique et la modélisation mathématique. Nous avons d'abord exploré la congression nucléaire lors de l'accouplement de cellules de S. Cerevisiae. La tomographie a permis de révéler l'organisation des MTs cytoplasmiques. Combinant la génétique et l'imagerie optique nous avons élucidé le rôle de la kinésine Kar3 dans la génération de forces et le rôle de sa localisation au SPB (Spindle pole body). Nous avons démontré que Kar3 permet la migration des SPBs le long des MTs pour promouvoir la congression nucléaire. D'autre part, nous avons abordé la question du positionnement nucléaire lors de la croissance filamenteuse chez A. Gossypii. La tomographie a permis d'analyser l'organisation des MTs aux SPBs, leur orientation et leur association avec le cortex cellulaire. Une nouvelle compréhension de l'oscillation nucléaire et du dépassement de noyaux a été apportée. En outre, comme un facteur limitant potentiel pour le déplacement nucléaire, nous avons analysé l'organisation des organites dans les filaments. Ces systèmes modèles nous ont permis d'identifier des éléments communs et les propriétés de base des mouvements nucléaires pouvant être étendus aux mammifères
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Sune, Albert. „Diffusion transverse de phospholipides dans la membrane plasmique de cellules sanguines : étude par résonance paramagnétique et microscopie électronique“. Montpellier 1, 1987. http://www.theses.fr/1987MON13513.
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Cottet‐Rousselle, Cécile. „Mesure par microscopie confocale du métabolisme mitochondrial et du niveau énergétique cellulaire au cours d’épisodes de carences en substrats et/ou en oxygène“. Thesis, Paris, EPHE, 2016. http://www.theses.fr/2016EPHE3096/document.
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La mitochondrie est un carrefour d’informations au centre du fonctionnement cellulaire puisque son rôle physiologique consiste à récupérer l’énergie fournie par la dégradation des produits issus de notre alimentation pour produire de l’ATP, par le processus d’oxydation phosphorylante. Cependant, des altérations du fonctionnement de la mitochondrie peuvent être responsables de nombreuses pathologies. Parmi les stress métaboliques pouvant entraîner un dysfonctionnement mitochondrial, l’ischémie-reperfusion est un phénomène présent également dans de nombreuses situations pathologiques. L’objectif de ce travail consiste à développer une approche méthodologique basée sur la microscopie confocale et l’analyse d’images afin de décortiquer les conséquences cellulaires des stress métaboliques induits lors d’épisodes de privation de substrats associée ou non à une privation partielle ou totale d’oxygène. Après avoir mis au point le programme d’analyse d’images basée sur la méthode du « tophat », deux approches ont été développées pour visualiser et quantifier la fonction mitochondriale. La première, qui combine le marquage du TMRM et l’autofluorescence du NADH, a permis de mettre en évidence des différences de réponses au stress d’ischémie-reperfusion au niveau de la chaîne respiratoire ou de l’ouverture du PTP pour les quatre types cellulaires testés : HMEC-1, INS1, RT112 ou hépatocytes primaires. La seconde approche a consisté à tester l’utilisation de biosenseurs permettant de suivre les variations de concentration d’ATP (Ateam) ou d’activation de l’AMPK (AMPKAR). Les conditions expérimentales réalisées dans ce travail n’ont pas permis de valider leur utilisationMitochondria form an information hub at the center of the cellular metabolism because of its physiological role consisting in the porduction of ATP from the degradation of porducts stemming from our food through the OXPHOS process. However, changes in the functionnig of the mitochondria can be responsible for numerous diseases. Among the different foms of metabolic stress leading to mitchondrial dysfunctions, ischemia-reperfusion can be found in numerous pathological situations. This work aims at developing a methodological approach based on confocal microscopy and image analysis to dissect –at cell level- the consequences of metabolic stress induced by episodes of deprivation in substrata associated or not with hypoxia or anoxia. Having developed the program of image analysis based on the « tophat » method, two approaches were designed to vizualize and quantify the mitochondrial function. The first one, combining TMRM labelling with NADH fluorescence made it possible to highlight some differences in the response to the stress caused by ischemia-reperfusion at the level of the respiratory chain or concerning the PTP opening in the four cellular types that were tested : HMEC-1, INS1, RT112 or pirmary heaptocyes. The second approach consisted in testing the use of biosensors designed to follow the variations of ATP concentration (ATeam) or the activation of AMPK (AMPKAR). The experimental conditions established in this work did not allow us to validate their use
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Racine, Victor. „Quantification des dynamiques cellulaires par analyse de données de vidéo-microscopie 3D+t“. Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066480.
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Cette thèse présente des méthodes d’analyse d’images numériques issues de la microscopie de fluorescente pour la biologie cellulaire. Elle s’intéresse essentiellement à la localisation et au suivi des complexes multimoléculaires dans les données multidimensionnelles (2D, 2D+t, 3D et 3D+t). Une première partie du travail est dédiée à l’extraction et la caractérisation de structures biologiques dans les images en utilisant des techniques de segmentation basées sur la décomposition en ondelettes. Plusieurs études biologiques réalisées en collaboration avec différentes équipes de recherche et exploitant directement ces outils sont présentées, comme par exemple l’étude de la morphométrie des organelles des cellules contraintes sur des micro-patterns et le travail sur la localisation de la protéine mid1p dans la levure. Dans une deuxième partie, il est présenté une méthode permettant de suivre dans le temps des molécules uniques ou des complexes multi moléculaires marqués. Elle permet la mise en correspondance des objets segmentés par minimisation des coûts d’association en utilisant la technique de recuit simulé. Cette méthode est bien adaptée à nombre de situations rencontrées en biologie cellulaire, car elle modélise de multiples comportements tels que l’apparition, la disparition ou la fusion et la dissociation. Une application au suivi de molécules uniques (ADN mono disperse 166kpb) est présentée dans le but d’étudier les variations de leur coefficient de diffusion. La troisième partie de cette thèse décrit un ensemble d’analyses appliquées à la caractérisation spatiale et temporelle des intermédiaires de transport du trafic membranaire marqués par les protéines chimériques GFP-Rab6A et GFP-Rab6A’. Plusieurs approches complémentaires sont exposées dans le but d’extraire un maximum d’informations quantitatives et de tenter une description des mécanismes biologiques sous-jacentsThis thesis presents several approaches aiming to analyze fluorescence microscopy images in the field of cell biology. It is essentially focused on techniques for localization and tracking of multimolecular complexes in multidimensional data (2D, 2D+t, 3D and 3D+t). The first part of this work is dedicated to the extraction and characterization of fluorescent biological structures using wavelet based segmentation. Various biological studies performed in collaboration with various research groups are detailed, such as a study about morphometric analysis of organelles of cell constrained by micro patterns or the localization of the mid1p protein in yeasts. In a second part, a tracking algorithm of labeled molecular structures is presented. It is based on the linking over time of segmented objects by minimizing the association costs by a simulated annealing technique. This method is particularly well adapted in a lot of biological situations, because it allows modeling of many events like birth, death, fusion and fission. A single molecule (mono-disperse DNA 166kbp) dynamics analysis has been made using this tracking technique in order to extract the variations of the molecular diffusion coefficient. The third part describes a set of analyzes with the goal to study the spatial and temporal localization of transport intermediates involved in the membrane trafficking tagged by chimerical GFP-Rab6A and GFP-Rab6A’ proteins. Several complementary approaches are used to extract quantitative information and to describe the underneath biological processes