Dissertationen zum Thema „Microenvironnement tumoral (TME)“

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est le sous-type le plus fréquent de lymphome non hodgkinien (NHL), caractérisé par une prolifération anormale de cellules B matures. C'est une maladie agressive pour laquelle les stratégies thérapeutiques actuelles sont insuffisantes. Le microenvironnement tumoral (TME) est un réseau dynamique de cellules, molécules et des autres éléments qui entourent une tumeur. Ceux-ci tiennent un rôle prépondérant dans le développement du cancer, la réponse au traitement et la survie des patients. Étudier le TME chez les patients atteints de DLBCL est essentiel pour découvrir de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaire impliqués dans progression de la maladie et identifier des biomarqueurs pronostiques. Cependant, sa structure tissulaire diffuse rend difficile l'étude précise de l'organisation et des interactions cellulaires au sein du TME.L'objectif de ce projet de thèse est de réaliser une caractérisation multimodale complète des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral du DLBCL. Pour faciliter l'accès aux échantillons humains, j'ai développé et mis en place un protocole de recherche clinique permettant un accès à des biopsies de patients suivis à l'hôpital Saint-Louis, et garantissant que la cohorte de patients reflète l'hétérogénéité de la maladie.Tout d'abord, j'ai réalisé une caractérisation en profondeur des lymphocytes T infiltrant la tumeur (TILS). Pour ce faire, j'ai utilisé des technologies innovantes de cytométrie en flux et spectrale multiparamétrique pour étudier finement la diversité de cellules T dans les biopsies de DLBCL ainsi que leurs réseaus de communication avec les autres cellules immunitaires. Une analyse non supervisée a pu mettre en évidence la présence de nouveaux sous-types de cellules T, par comparaison aux tissus contrôle. De plus, l'analyse de l'expression ligand-récepteur a permis d'étudier la communication cellulaire de ces sous-populations de cellules T dans le TME.En parallèle de cette étude, j'ai pu caractériser les profils transcriptomiques des cellules immunitaires présents dans le TME. Pour ce faire, j'ai utilisé une technologie de pointe, la transcriptomique spatiale, des outils bio-informatiques innovant pour cartographier l'expression des gènes directement dans des échantillons de biopsies de DLBCL fixés au formol et inclus en paraffine. J'ai ainsi pu identifier des profils d'expression génique distincts et anatomiquement restreints, défiant la notion historique d'une architecture diffuse du TME du DLBCL. Ces profils peuvent être classifiés en écosystèmes, différant de par leurs compositions cellulaires, leurs fonctions et leurs interactions avec les cellules avoisinantes. De façon importante, la prédominance de certains écosystèmes permettent une classification des patients selon leur taux de survie globale, révélant le potentiel pronostique de ces identités cellulaires spatiales.Enfin, j'ai réalisé une évaluation in vitro du mécanisme d'action et de l'efficacité d'un anticorps bloquant développé par la société pharmaceutique Servier. Celui-ci a été développé pour qui perturber un signal inhibiteur entre les cellules NK et les cellules B malignes. Mes résultats montrent que le candidat améliore la cytotoxicité des cellules NK à l'encontre des cellules tumorales dans un système de co-culture in vitro. Ces résultats soulignent l'importance de cibler les interactions cellulaires entre les cellules immunitaires et les cellules B malignes pour le développement de thérapies plus efficaces dans le DLBCL.Ce projet multidisciplinaire, mené sur des échantillons humains, apporte une compréhension approfondie de l'hétérogénéité des cellules immunitaires, de leurs interactions et localisations dans le microenvironnement du DLBCL. Ainsi, ce projet pourrait conduire à la découverte de nouveaux biomarqueurs et de stratégies thérapeutiques plus efficaces pour les patients atteints de DLBCL
Diffuse Large B-cell Lymphoma (DLBCL) is the most prevalent subtype of non-Hodgkin's Lymphoma worldwide, characterized by an abnormal proliferation of mature B cells. It is an aggressive B-cell malignancy for which the current therapeutic strategies are still insufficient. The tumor microenvironment (TME) is the dynamic network of cells and all elements surrounding and interacting with the tumor. It plays an important role in cancer development, treatment response, and patient survival. Consequently, investigating the TME in DLBCL patients is crucial to discover the mechanisms leading to relapse and identify prognostic biomarkers. However, its diffuse tissue structure presents a challenge in elucidating the cellular organization and communication within the TME. The objective of my Ph.D. thesis is to conduct a comprehensive multimodal characterization of the immune cells within the DLBCL tumor microenvironment.To facilitate access to human samples, I developed and implemented an ethically approved clinical research protocol and a circuit of tissue and blood samples from patients with DLBCL treated at Saint Louis hospital, ensuring that the patient cohort reflects the heterogeneity of the disease.First, I performed a deep characterization of T lymphocytes, with special focus on describing their role within the DLBCL tissue. Indeed, Tumor-infiltrating T-cells (TILS) are key players in the NHL TME, presenting different subtypes and cell states. I apply multiparametric flow cytometry and high-dimensional spectral cytometry to investigate the complex landscape of T diversity in DLBCL biopsies, as well as their communication patterns with other immune cells in the tissue. The unsupervised analysis approach identified unexpected T-cell subtypes at a protein level, compared to tissue control and other lymphoproliferative disorders. Furthermore, the ligand-receptor expression analysis enabled the cell-cell communication study of those T-cell subpopulations within the TME context. Second, I aimed to characterize transcriptomic immune landscapes at a large scale within DLBCL tissue. However, RNA sequencing technologies characterize isolated cells from dissociated tissues with a loss of spatial context. I applied spatial transcriptomics, a cutting-edge technology that enables gene expression mapping in formalin-fixed paraffin-embedded samples of DLBCL biopsies, thus preserving their morphological information. I identified distinct anatomically restricted gene expression profiles in DLBCL samples, defying the historical notion of DLBCL diffuse architecture. These profiles can be classified into ecosystems that differ in cellular composition, functional patterns, and neighborhood characteristics. Moreover, their spatially resolved signatures classify patients with different overall survival revealing the prognostic potential of these spatial identities.Third, I evaluated the effects of altering the communication between NK cells and malignant B cells in DLBCL. I performed a functional in vitro assessment of a blocking antibody developed by the pharmaceutical company Servier. The functional assays demonstrated the effect of the molecular candidate in co-culture settings by improving cytotoxic functions of NK cells against tumor cells. These findings highlight the importance of targeting the interaction between effector cells and malignant B cells to develop effective therapies for DLBCL.This multidisciplinary project carried out on human samples provides a deep understanding of the heterogeneity of immune cells in DLBCL microenvironment at a protein and transcriptomic level while considering their spatial organization. Hence, this project holds significant therapeutic potential, by gaining insights into the disease heterogeneity and its impact on clinical outcome. This project could eventually lead to the discovery of new potential biomarkers and effective therapeutic strategies for DLBCL patients

L'immunothérapie anti-cancéreuse est un traitement efficace chez certains patients, mais cela dépend de l'organe atteint. Les patients avec un cancer du foie primitif ou des métastases hépatiques d'un cancer colorectal (MHCCR) ont souvent des réponses limitées. Cela est lié à l’environnement immunitaire particulier du foie. Dans cette étude, nous avons examiné l’impact des cellules immunitaires dans le MHCCR, en particulier les mastocytes et les neutrophiles, dans la survie. La présence accrue de mastocytes était liée à un meilleur pronostic, tandis que la présence de neutrophiles était associée à un mauvais pronostic. De plus, chez les patients atteints d’un carcinome hépatocellulaire précoce, différents profils immunitaires ont été identifiées, ce qui pourrait aider à personnaliser le traitement. En résumé, comprendre la réaction immunitaire dans le foie est essentiel pour améliorer l'efficacité de l'immunothérapie contre les tumeurs hépatiques, et cela pourrait conduire à de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la survie des patients
Anti-cancer immunotherapy can be highly effective for certain patients, but its success depends on the affected organ. Individuals with primary liver cancer or liver metastases from colorectal cancer often have limited responses to immunotherapy. This is largely due to the immune environment within the liver. In this study, we examined how immune cells, particularly mast cells and neutrophils, impact outcomes in patients with colorectal cancer liver metastasis. We found that an increased presence of mast cells in tumors was associated with better outcomes for patients, while the presence of neutrophils was linked to a less favorable outcome. Furthermore, in the case of early-stage liver cancer, we discovered that patients could be grouped into different immune profiles, which could help personalize treatment. In summary, this study highlights the importance of understanding how the immune system reacts in the liver to enhance the effectiveness of immunotherapy for liver cancer and colorectal cancer. This information could also assist in identifying new therapeutic targets to improve treatments and patient survival in the future

Le microenvironnement tumoral, l'angiogenèse tumorale et l'hypoxie jouent un rôle crucial dans la progression tumorale et le développement de thérapies de nombreux cancers. Les limites de pénétration des médicaments, les phénomènes de résistance aux anti-cancéreux, la vascularisation de la tumeur et l’hypoxie sont tous des paramètres influençant les effets du médicament. La culture cellulaire 3D permet de créer un microenvironnement qui imite l’architecture et la fonction des tissus in vivo. L’expression de gènes et de protéines modifiée par l’environnement 3D est une autre caractéristique qui impacte l’effet d’une molécule thérapeutique. Dans notre première étude, afin de développer un modèle 3D vascularisé imitant celle des tumeurs in vivo, nous avons mis en culture des cellules endothéliales en 2D avec des cellules tumorales en 3D. Après 2 semaines de culture, un réseau vasculaire s’est organisé avec des structures de type tubulaire présentant une lumière et exprimant différents marqueurs angiogéniques tels que VEGF, CD31 et Collagène IV. Dans notre deuxième étude, nous avons développé un modèle d’hypoxie in vitro intégrant l'environnement 3D et un agent mimétique de l'hypoxie (CoCl2). Le but de ce modèle est de créer un modèle d'hypoxie imitant les tumeurs in vivo et de montrer l'importance de l'hypoxie dans la réponse et la résistance aux médicaments. Ces résultats ont révélé que la meilleure condition était la combinaison 3D+CoCl2, conduisant à la surexpression des gènes relatifs à l’hypoxie (GLUT1/3, VEGF) et à la résistance aux médicaments (ABCG2, MRP1). L'angiogenèse et l'hypoxie sont des facteurs clés pour le microenvironnement tumoral in vivo et ils doivent être adoptés dans la conception de modèles tumoraux in vitro pour mieux sélectionner et cribler les médicaments anticancéreux
The tumor microenvironment, tumor angiogenesis, and hypoxia play a critical role in the tumor progression and therapy development of many cancers. Limitations in drug penetration, multidrug resistance phenomena, tumor vascularization, and oxygen deficiency are all parameters influencing drug effects. 3D cell culture allows to create a microenvironment that more closely mimics in vivo tissue architecture and function, thus, gene and protein expression modified by the 3D environment are further features that affect treatment outcome. In our first study, in order to develop a vascularized 3D model like in vivo tumors, we co-cultured 2D endothelial cells with 3D tumor cells. After 2 weeks of this combination, a vascular network was formed and organized with tubule-like structures presenting a lumen and expressing different angiogenic markers such as VEGF, CD31 and Collagen IV. In our second study, we developed an in vitro hypoxia model integrating the 3D environment and a hypoxia mimetic agent (CoCl2) to mimic the in vivo tumors and to show the importance of hypoxia in drug response and resistance. Results revealed that the best condition was the combination 3D+CoCl2 model, leading to overexpression oh hypoxia (GLUT1/3, VEGF) and drug resistance (ABCG2, MRP1) related genes. Taken together, angiogenesis and hypoxia are key factors for in vivo tumor microenvironment and they should be adopted in in vitro model design to better select and screen anticancer drugs

Bien que rares, les tumeurs endocrines développées chez l'Homme demeurent problèmatiques. Une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent leur croissance constitue un objectif essentiel pour identifier des cibles thérapeutiques nouvelles.Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'impact du microenvironnement tumoral (MeT), définit par l'ensemble des facteurs qui encerclent la niche tumorale primitive, sur la croissance des tumeurs endocrines digestives. In vitro, nous observons un effet prolifératif réciproque entre des fibroblastes, l'une des cellules pivots du MeT, et des lignées cellulaires humaines de tumeurs endocrines pancréatiques, tel qu'il est susceptible d'exister in situ. Dans une seconde partie, nous avons montré que le pegvisomant, un antagoniste du récepteur de l'hormone de croissance utilisé chez des patients atteint d'adénome hypophysaire somatotrope, n'a pas d'effet prolifératif in vitro sur les cellules somatotropes adénomateuses
Although rare, endocrine tumors developed in Humans remain problematic, such as a better understanding of their regulatory mechanisms of growth represent a step forward to identify new therapeutical targets.In the first part of this thesis, we investigated the impact of the tumor microenvironment (TME), as defined by the factors surrounding the tumor primitive niche, on the growth of human digestive endocrine tumors. We, here, showed the occurrence of a reciprocal proliferation between human fibroblasts, a key cell within the TME, and human pancreatic neuroendocrine tumor cell lines, suggesting that human fibroblasts may constitue a new therapeutical target of interest in the TME of digestive endocrine tumors. In a second part, we showed that pegvisomant (PEG), a growth hormone receptor antagonist currently used in patients with GH-secreting pituitary adenoma, did not impact in vitro the proliferation rate of GH-secreting adenoma cells and therefore is suitable in patients with a persisting GH-secreting pituitary adenoma residue after surgery

Le canal TRPC1 (pour transient receptor potential canonical 1) est l'un des canaux cationiques non sélectifs les plus impliqués dans plusieurs maladies, y compris la progression du cancer. Les TRPC peuvent être activés par différents stimuli physico-chimiques dont le pH. Par ailleurs, l'une des caractéristiques du cancer représente les variations pH extracellulaire, notamment dans l'adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP). Il existe de fortes indications quant à l'agressivité de l'ACP qui est causée par l'interaction entre le microenvironnement acide de la tumeur et la dérégulation des canaux ioniques. Cependant, cette interaction n'a jamais été étudiée. Lors de ce travail, nous avons étudié si TRPC1 ainsi que les fluctuations du pH acide du microenvironnement tumoral régulent la progression de l'ACP et plus particulièrement la prolifération et de migration cellulaires. Nous avons constaté que TRPC1 était surexprimé dans le tissu tumoral pancréatique par rapport au tissu normal, et dans la lignée cellulaire agressive PANC-1, par rapport à une lignée cellulaire de type canalaire, hTERT-HPNE. Pour déterminer si les fluctuations du microenvironnement acide de la tumeur affectent la dérégulation de TRPC1, les cellules PANC-1 ont été incubées dans un milieu présentant un pH de 7,4 ou 6,5 pendant 30 jours, après quoi les cellules ont été récupérées à pH 7,4 pendant 14 jours (7.4 R). L'adaptation acide (6.5) a réduit l'expression de la protéine TRPC1 mais a favorisé sa localisation membranaire par rapport au contrôle (7.4). Dans des conditions de pH 7,4R, les cellules cancéreuses présentaient une expression de TRPC1 exacerbée avec une localisation membranaire élevée, à la fois dans les modèles 2D et 3D. Nous avons constaté que les fluctuations de pH et l'invalidation moléculaire par siARN (KD) de TRPC1 affectaient respectivement la prolifération de PANC-1 dans un modèle 2D et sphéroïde. Dans notre modèle 2D, nous avons montré que TRPC1 KD affectait la progression à travers la phase G0/G1 dans toutes les conditions et la phase S lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu pH 7,4, et la phase G2/M dans les conditions pH 6,5 et 7,4 R. En outre, pH 6,5 a amélioré tandis que le KD de TRPC1 a diminué la migration cellulaire. De plus, nous avons constaté que TRPC1 interagissait fortement avec PI3K dans des conditions acides, et CaM dans toutes les conditions. Le KD de TRPC1 diminuait à la fois cette interaction et l'activation de AKT et ERK1/2. Enfin, l'entrée basale de Ca2+ a été significativement réduite par le KD de TRPC1 dans les conditions de pH 6,5 et 7,4R. La réduction de la concentration de Ca2+ extracellulaire a entraîné une diminution additionnelle de la prolifération et de la migration des cellules transfectées avec siTRPC1 cultivées à pH 6,5 et 7,4R, mais pas dans des conditions normales de pH 7,4. Collectivement, nos résultats montrent que TRPC1 est régulé positivement dans les tissus et lignées d’ACP. Le microenvironnement acide de la tumeur favorise sa localisation membranaire et son interaction avec PI3K/CaM. Enfin, le Ca2+ transitant par TRPC1 participe à la prolifération et à la migration cellulaires. De plus, nous avons effectué un criblage du profil d'expression des canaux ORAI, de leur partenaire STIM1, d'un canal sodique activé par le voltage (Nav1.6) et d'un canal ionique détectant l'acidité (ASIC1) dans les tissus et lignées d'ACP. Nous avons examiné si le microenvironnement acide affecte la régulation épigénétique des canaux ioniques. Nous avons constaté qu'ORAI3 était régulé positivement dans le tissu ACP par rapport au tissu normal, tandis que STIM1 et NaV1.6 étaient régulés négativement. De plus, ORAI3 était préférentiellement localisé au niveau membranaire dans le tissu tumoral. De plus, nos résultats préliminaires montrent que le microenvironnement acide de la tumeur n'affecte pas les niveaux de méthylation de la région promotrice des gènes codant pour ASIC1 ou TRPC1, mais également du gène SCN8A
The transient receptor potential canonical 1 channel (TRPC1) is one of the most prominent nonselective cation channels involved in several diseases, including cancer progression. TRPCs can be activated by different physio-chemical stimuli of their surroundings, for instance, pH. Another hallmark of cancer is the variable extracellular pH landscape, notably in epithelial cancers such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). PDAC progression and development are linked to the physiology and microenvironment of the exocrine pancreas. There are strong indications that PDAC aggressiveness is caused by the interplay between the tumor acidic microenvironment and ion channel dysregulation. However, this interaction has never been studied before. Here, we investigate if TRPC1 is involved in PDAC progression in the form of proliferation and migration and if the pH fluctuations of the acidic tumor microenvironment affect these processes. We found that TRPC1 was significantly upregulated in PDAC tumor tissue compared to adjacent normal tissue, and in the aggressive PDAC cell line PANC-1, compared to a duct-like cell line, hTERT-HPNE. To investigate if fluctuations of the acidic tumor microenvironment affect TRPC1 dysregulation, PANC-1 cells were incubated in a medium with a pH of 7.4 or 6.5 over 30 days, where after cells were recovered in pH 7.4 for 14 days (7.4R). Acid adaptation (6.5) reduced TRPC1 protein expression but favored its membrane localization compared to the control (7.4). pH recovery treatment (7.4R) resulted in an upregulation of TRPC1 expression with a high membrane localization, both in 2D and 3D models. We found that pH fluctuations and the siRNA-based knock-down (KD) of TRPC1 affected 2D and spheroid PANC-1 proliferation, respectively. In our 2D model, flow cytometry and cell cycle regulating protein immunoblotting showed that TRPC1 KD affected the progression through G0/G1 phase under all conditions and S-phase under control pH 7.4, which shifts to the G2/M phase in pH 6.5 and 7.4R. In addition, pH 6.5 enhanced, and the KD of TRPC1 decreased cell migration, respectively. Furthermore, we found that TRPC1 interacted strongly with PI3K under acidic conditions and CaM under all conditions, and a KD of TRPC1 decreased both this interaction and the activation of AKT and ERK1/2. Finally, basal Ca2+ entry was significantly reduced upon the KD of TRPC1 in pH 6.5 and 7.4R, where the entry was enhanced. The reduction of extracellular Ca2+ concentration resulted in an additional decrease in proliferation and migration of cells transfected with siTRPC1 growing in pH 6.5 and 7.4R, but not in normal pH 7.4 conditions.Collectively, our results show that TRPC1 is upregulated in PDAC tissue and cell lines. The acidic tumor microenvironment favors its plasma membrane localization, and its interaction with PI3K/CaM and Ca2+ entry leads to PDAC cells proliferation and migration. In addition, we performed an expression profile screening of ORAI channels, their partner STIM1, and a voltage-activated sodium channel (Nav1.6), and an acid-sensing ion channel (ASIC1) in PDAC tissues and cell lines, and investigated whether the acidic tumor microenvironment affects epigenetic regulation of ion channel expression. We found that ORAI3 was upregulated in PDAC tissue compared to normal tissue, where STIM1 and NaV1.6 were significantly downregulated. Moreover, ORAI3 was more localized in the plasma membrane in tumor tissue. Acid-adaptation had a differential effect on Ca2+ channel expression. Furthermore, our preliminary results show that the acidic tumor microenvironment does not affect the methylation levels of the ASIC1 or TRPC1 promoter region, but so some extend the SCN8A gene promoter

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des maladies hématologiques hétérogènes caractérisées par une prolifération clonale des blastes myéloïdes qui s’infiltrent dans la moelle osseuse (MO), le sang et d’autres organes. Identifiée comme le type le plus courant de leucémie aiguë chez l’adulte avec 80% des cas, la LAM est synonyme de rechute et de mauvais pronostic, avec 70% des patients étant confrontés à une mortalité dans l’année suivant le diagnostic. La présence des cellules souches leucémiques (CSL) a été associée à une résistance à la chimiothérapie et à une rechute dans la LAM. Le microenvironnement tumoral a été décrit pour son rôle clé dans la régulation des CSL par l’interaction des voies de signalisation. La voie des Bone Morphogenetic Proteins (BMP) est fortement impliquée dans la régulation des cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais elle a également été reconnue pour réguler les CSL. Ici, nous avons identifié des concentrations élevées de BMP2 et BMP4 dans la MO des patients atteints de LAM au moment du diagnostic. De plus, nous avons identifié pour la première fois une nouvelle cascade de signalisation impliquant la liaison de BMP4 au récepteur BMPR1A, qui induit l’expression de ΔNp73 et NANOG. L’activation de cette signalisation favorise un phénotype proche des cellules souches dans les cellules leucémiques. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que cette voie est responsable de la capacité de résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie. En outre, nous avons identifié BMPR1A/ΔNp73/NANOG comme marqueurs potentiels du pronostic dans la LAM, en raison de leurs surexpressions au moment du diagnostic associé à une rechute dans les trois ans. Lorsque nous avons analysé des échantillons de LAM lors d’une rechute, nous avons constaté des taux plus élevés de l’isoforme ΔNp73 par rapport à ceux de patients au moment du diagnostic. D’autre part, nous avons identifié une forte expression du récepteur BMPR1A, ΔNp73, NANOG, SOX2 et ID1 dans les cellules leucémiques primaires résistantes à court terme. Ces résultats sont en corrélation avec ce que nous avons observé dans les cellules résistantes de LAM, où BMPR1A, ΔNp73, NANOG et ID1 semblent être impliqués dans la capacité de résistance des cellules de LAM face à la chimiothérapie. La modulation et le ciblage des éléments de la voie BMP et des gènes associés identifiés au travers de notre étude représentent donc une approche prometteuse pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes et plus efficaces contre les LAM
Acute myeloid leukemias (AML) are heterogeneous hematological malignancies characterized by a clonal proliferation of myeloid blasts which infiltrate the bone marrow, blood and other organs. Identified as the most common type of acute leukemia in adults with 80% of cases, AML is associated with high relapse and poor prognosis where 70% of patients face mortality within one year after diagnosis. Leukemic stem cell (LSCs) presence has been related to resistance to chemotherapeutic agents and relapse in AML. The tumor microenvironment has been described for its key role regulating LSCs through the crosstalk of signaling pathways. Bone Morphogenetic Proteins (BMP) pathway is highly involved in hematopoietic stem cell (HSC) regulation, but has also been recognized to regulate LSCs. Here, we have identified high concentrations of BMP2 and BMP4 in bone marrow (BM) AML samples at diagnosis. Furthermore, we have identified for the first time a new signaling cascade, involving the binding of BMP4 to BMPR1A receptor, which induces the expression of ΔNp73 and NANOG. Activation of this signaling promotes a stem-like phenotype in leukemic cells. Therefore, we hypothesized that this signaling is responsible for the resistant capacity of leukemic cells to chemotherapy. In addition, we have reported BMPR1A/ΔNp73/NANOG as potential AML prognosis markers, due to their overexpression at diagnosis associated to an increased rate of relapse of AML patients within three years. When we analyzed AML samples at relapse, higher levels of ΔNp73 isoform were found compared to patients at diagnosis. Moreover, we have identified high expression of the BMPR1A receptor, ΔNp73, NANOG, SOX2 and ID1 in short-term resistant primary leukemic cells. These results correlate with what we observed in AML resistant cells, where BMPR1A, ΔNp73, NANOG and ID1 seem to be implicated in driving the resistant capacity of AML cells to drug therapy. Therefore, modulation and targeting of the BMP pathway elements and related genes identified with our study, represent a promising approach towards the development of new and more effective therapeutic strategies against AML

Les lymphocytes « Natural Killer » (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée, capables de lyser les cellules cancéreuses grâce au relargage de la protéase cytotoxique Granzyme B (GzmB). Récemment, de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, basées sur l’utilisation des cellules NK, ont émergé et se sont révélées très prometteuses. Il est maintenant clairement établi que le microenvironnement tumoral hypoxique influence la réponse immunitaire et constitue, de ce fait, un obstacle majeur pour établir des protocoles d’immunothérapies efficaces. Des études récentes ont montré que l’autophagie est un régulateur important de l’immunité innée dans le microenvironnement tumoral, mais les mécanismes de régulation impliqués restent encore peu connus. Nous avons montré in vitro que l'hypoxie diminue la sensibilité des cellules de carcinome mammaire à la lyse dépendante des cellules NK par un mécanisme impliquant l'activation de l'autophagie. De manière intéressante, cette diminution de lyse est reversée par l’inhibition de l’autophagie. Nous avons démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NK n'est liée ni à un défaut de reconnaissance des cellules cibles, ni à une altération de l’activité cytotoxique des effecteurs. Nous avons mis en évidence que l'activation de l’autophagie conduit à la dégradation de GzmB dans les lysosomes des cellules hypoxiques. Ainsi, ces cellules deviennent résistantes à l’apoptose, qui est normalement induite par GzmB, transféré par les cellules NK. L’invalidation génétique et pharmacologique de l'autophagie permet de restaurer le niveau intracellulaire de GzmB et réduit la résistance des cellules cibles hypoxiques in vitro. Nos résultats mettent en évidence que l'autophagie est un régulateur primordial de la réponse immunitaire anti-tumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce concept in vivo en montrant que l’inhibition de l'autophagie favorise de manière significative la prise en charge de la tumeur par les cellules NK dans des modèles murins de mélanome et de carcinome mammaire. Cette étude contribue à l’avancé des connaissances sur la manière dont l'autophagie, induite par l'hypoxie, affecte la lyse dépendante des cellules NK et ouvre la voie à la formulation de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-tumorales combinant l’utilisation des cellules NK à des inhibiteurs d'autophagie
Natural killer (NK) cells are effectors of the antitumor immunity, able to kill cancer cells through the release of the cytotoxic protease granzyme B. NK-based therapies have recently emerged as promising anticancer strategies. However, it is well established that hypoxic microenvironment interferes with the function of antitumor immune cells and constitutes a major obstacle for cancer immunotherapies. Recent studies demonstrated that autophagy is an important regulator of innate immune response in this microenvironment, but the mechanism by which autophagy regulates NK cell-mediated antitumor immune responses remains elusive. Here, we demonstrate that hypoxia impairs breast cancer cell susceptibility to NK-mediated lysis in vitro via the activation of autophagy. This impairment was not related to a defect in target cell recognition by NK cells but to the degradation of NK-derived granzyme B in autophagosomes of hypoxic cells. Inhibition of autophagy by targeting beclin1 (BECN1) restored granzyme B levels in hypoxic cells in vitro and induced tumor regression in vivo by facilitating NK-mediated tumor cell killing. Together, our data highlight autophagy as a mechanism underlying the resistance of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis and provides a cutting-edge advance in our understanding of the underlying mechanism. This study might pave the way for the formulation of more effective NK cell-based antitumor therapies

La croissance tumorale peut être détectée et ralentie par le système immunitaire. Des cellules de l’immunité innée, comme les cellules NK et les cellules iNKT, ainsi que des cellules de l’immunité adaptative, comme les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques, sont capables de tuer les cellules tumorales et de coopérer pour éliminer une tumeur en développement. Leur action s’exerce également à travers leur sécrétion de cytokines comme l’IFN-. l’IFN- a des effets pléiotropes au sein du micro-environnement tumoral. Il augmente l’expression du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I à la surface des cellules tumorales, ce qui rend celles-ci plus sensibles à leur mort cellulaire induite par les lymphocytes T cytotoxiques. Il peut également réduire leur prolifération, induire directement leur mort ou même agir indirectement sur l’ensemmble du micro-environnement tumoral en réduisant l’angiogenèse. Malgré notre compréhension des effets de l’IFN-, nous ne connaissons pas bien son activité spatio-temporelle dans la tumeur. Durant mon doctorat, je me suis donc demandé si l’IFN- agissait spécifiquement dans des zones discrètes de la tumeur, situées autour des cellules immunitaires qui le produisent, ou s’il est capable de diffuser et d’agir d’une manière globale dans tout le micro-environnement tumoral. Je me suis aussi intéressé au temps d’exposition nécessaire à l’IFN- pour induire un changement fonctionnel et phénotypique important chez les cellules tumorales. J’ai pu montrer que, bien que produit localement par les lymphocytes T, l’IFN- possède une activité large au sein de la tumeur. En utilisant conjointement des approches de microscopie intravitale biphotonique et un reporter de la translocation nucléaire de STAT1, j’ai montré que la signalisation par l’IFN- se produisait à des endroits de la tumeur distants des sites de sécrétion par les lymphocytes T. Ces résultats suggèrent une diffusion importante de l’IFN- suite à sa sécrétion, qui aboutit à un champ cytokinique baignant l’ensemble de la tumeur. Enfin, mon travail a démontré qu’une exposition soutenue à l’IFN- était nécessaire pour que les cellules tumorales modifient leur fonction et phénotype
Tumor growth can be detected and restricted by the immune system. Innate immune cells, such as Natural Killer (NK) cells or invariant NK T (iNKT) cells, as well as adaptive immune cells such as cytotoxic CD8+ T cells, are able to kill tumor cells and cooperate towards tumor elimination. Their action can also be achieved through their secretion of cytokines like IFN-γ. IFN-γ has pleiotropic effects in the tumor microenvironment. It enhances Major Histocompatibility Complex (MHC) class I expression on tumor cells, which makes them more sensitive to T cell-mediated lysis. It can also reduce their proliferation or directly induce cell death but also act indirectly on the tumor microenvironment by reducing angiogenesis. Despite a good understanding of IFN-γ−mediated effects, little is known about its spatiotemporal activity in the tumor. During my Ph.D, I thus wondered whether IFN-γ specifically acted in discrete areas of the tumor around the immune cells that produce it, or whether it is able to diffuse and widely act in the whole tumor microenvironment. I also focused on understanding the duration to which tumor cells need to be exposed to IFN- γ in order for the cytokine to alter their function and phenotype. I was able to show that, despite being produced locally, T cell-derived IFN-γ had a broad bystander activity in the tumor. Using two-photon intravital imaging and a reporter of Signal Transducer and Activator of Transcription 1 (STAT1) nuclear translocation, I showed that IFN-γ signaling was occuring at distant sites from producing T cells. Those findings suggest an extensive diffusion of IFN- γ following its secretion which leads to a cyokine field bathing the entire tumor microenvironment Finally, my work demonstrated that sustained IFN-γ exposure is needed to alter tumor cell phenotype and functions

Une tumeur est un environnement complexe comprenant à la fois des composants immunitaires et non immunitaires. Dans notre équipe, nous avons démontré précédemment le rôle des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans les cancers du poumon, dans la génération de réponses anti-tumorales protectrices. Cependant, les tumeurs peuvent se développer en utilisant des mécanismes d’immunosuppression tels que l’infiltration des cellules T régulatrices (Tregs) dans le microenvironnement tumoral. Cette thèse a étudié le mécanisme présumé des Tregs dans la régulation des réponses immunitaires dans le cancer du poumon. Cette étude démontre la présence de Tregs FoxP3+ dans les TLS aussi bien que dans les autres régions tumorales. Les Tregs infiltrant la tumeur (Ti-Tregs) présentent un phénotype de lymphocytes T à mémoire centrale, et effecteur mémoire. Ces cellules expriment un vaste répertoire de molécules d’activation et de « chekpoints » immunologiques. L’analyse de l’expression des gènes et des résultats de cytométrie en flux a montré que les Tregs expriment des marqueurs de co-stimulation et de co-inhibition. Une forte densité de Ti-Tregs dans les TLS ou les autres régions tumorales, est associée à une faible survie des patients. Lorsqu’on combine ce résultat avec la densité de DC matures ou lymphocytes B associés aux TLS ou CD8+, un groupe de patients présentant de faible densités de ces cellules mais de fortes densités en Tregs a le pronostic le moins favorable avec le plus grand risque de décès. Les Tregs créent un environnement immunosuppresseur dans les cancers pulmonaires. Ce mécanisme pourrait être une explication de la réduction observée de la survie de ces patients
Tumor comprise complex niche of the immune and non-immune components. The complex interaction between the tumor cells with its environment turns into either eradication or the growth and metastasis of the tumors. We have previously demonstrated the role of TLS (tertiary lymphoid structures) in lung tumors, in protective anti-tumor responses. Despite of this, tumors do develop via exploiting the regulatory mechanisms, particularly includes, infiltration of the Tregs (regulatory T cells). The aim of thesis was to study the putative role of Tregs in regulating the immune responses in lung cancer. This study strongly demonstrates the presence of FoxP3+ Tregs in the TLS as well as non-TLS areas of the lung tumors. Tregs mainly exhibit central and effector memory phenotype expressing vast repertoire of the activation and immune checkpoint molecules. The gene expression and flow cytometry data showed that Tregs express the co-stimulatory and inhibitory markers which are known to be involved in the their activation and immune suppression. The high density of the Ti-Tregs either in TLS or in nonTLS areas is associated with the poor survival of the NSCLC patients. When combined with the density of TLS mature DC or B cells or CD8+ T cells, a group of patients with the low DC, B cells and CD8+ T cells but high Tregs densities, had the worst clinical outcome. This allowed, to identify the NSCLC patients with highest risk of death. Thus, it be concluded that the Tregs create the immunosuppressive environment in the lung tumors by acting in both TLS and nonTLS areas of the tumors and thus could be possible reason for the reduced survival of the lung cancer patients

Les nucléotides jouent un rôle majeur dans une pléiade de processus biologiques comme la composition des acides nucléiques, la signalisation, ou la régulation de la balance énergétique. Les nucléotides extracellulaires exercent également des fonctions biologiques. Par conséquent, des dérégulations des pools de nucléotides impactent l’homéostasie de multiples façons, par exemple en promouvant l’instabilité génétique ou un environnement immunosuppresseur. Or, ces paramètres font partie des « Hallmarks du Cancer » décrits par Hanahan et Weinberg. Ces observations confirment l’éventualité d’un rôle clé des nucléotides dans le cadre du cancer.cN-II et CD73 sont des 5’-nucléotidases impliquées respectivement dans les métabolismes nucléotidiques intra- et extracellulaire. Elles sont de nouvelles cibles thérapeutiques en oncologie. Cependant, leurs rôles dans la biologie de la cellule cancéreuse, ou le possible impact de leur utilisation en tant que cible thérapeutique sur le comportement des cellules tumorales sont peu connus. Considérant l’implication de ces enzymes dans les métabolismes nucléotidiques, nous avons enquêté sur les modifications de l’agressivité de la cellule cancéreuse ou sur sa capacité à interagir avec son microenvironnement, dans le cas d’une invalidation ou une diminution d’expression de cN-II et/ou CD73. cN-II semble donc impliquée dans l’adaptabilité métabolique et la combinaison des invalidations de cN-II et CD73 est associée à une modification d’expression d’enzymes du métabolisme du glucose. CD73 peut aussi moduler l’expression de gènes de la migration cellulaire. cN-II est impliquée dans la migration cellulaire, via l’axe COX-2/PGE2, et dans la sensibilité à des agents modulant ce paramètre. Ces caractéristiques sont plus marquées en association avec une invalidation de CD73. Ici, cN-II et CD73 ne semblent pas jouer de rôle dans la prolifération ou le dialogue avec une sous-population de cellule de l’immunité innée
Nucleotides play a major role in nucleic acids constitution and are involved in various cell phenomena. Indeed, intracellular ATP, GTP, AMP, GMP and their cyclic forms are components of cell signaling and define the energetic balance. Extracellularly, they also play multiple roles. Thus, when nucleotide pools are deregulated various processes are impacted. For example, a low availability of nucleotides supports genetic instability and aberrant levels of extracellular adenosine can lead to an immunosuppressive microenvironment. Interestingly, the cited parameters are among the Cancer Hallmarks described by Hanahan and Weinberg. These observations confirm the possibility of a key role of these molecules in this pathology. cN-II and CD73 are 5’-nucleotidases, involved in intra- and extracellular nucleotide metabolism respectively and have been identified as possible targets for new anti-cancer therapies. Nevertheless, very little is known about their biological roles on cancer cells and what parameters of cell biology could be impacted by such strategies. Considering the involvement of these purines in cell metabolism, we wondered what changes a decrease in cN-II and/orCD73 expressions or their silencing could trigger in cancer cells as well as in the interplay with their microenvironment.We studied cancer cell aggressiveness and the interplay with innate immune cells under cN-II and CD73 modulations. We observed that cN-II is involved in metabolic adaptability. The association of cN-II and CD73 invalidations results in glucose-metabolism-related gene modifications. CD73 can regulate migration-related genes expression but does not affect the process. cN-II is also involved in cell migration, via the COX-2/PGE2 axis. Again, these characteristics are accentuated when associated with CD73 deficiency. Here, cN-II and CD73 do not seem to be involved in cancer cell proliferation or in their interplay with a subset of innate immune cells

L'immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire (ICBs) est un traitement prometteur pour les patients atteints de mélanome ; cependant, seule une petite sous-population en tire un bénéfice à long terme. Un des défis pour améliorer l'efficacité et étendre le bénéfice des ICBs aux patients non répondeurs est de concevoir des approches innovantes permettant de transformer les tumeurs dites "froides ou désertes pour les cellules immunitaire" en tumeurs dites "chaudes ou infiltrées par les cellules immunitaires" qui sont éligibles aux ICBs. Nous avons étudié l'impact du ciblage du gène de l'autophagie Beclin1 sur le paysage immunitaire des tumeurs de mélanome B16-F10. Nos résultats ont démonté que ce ciblage inhibait significativement la croissance tumorale B16-F10 et augmentait l'infiltration des leucocytes CD45+. Le phénotypage immunitaire a révélé une augmentation de l'infiltration de cellules NK (Natural Killer) actives, de macrophages inflammatoires et résidents de type 1, de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD8+ actifs. L’inhibition de la croissance tumorale Becn1- n'était plus observée par la déplétion des CD8+ de l'hôte, soulignant ainsi leur rôle dans le contrôle du développement de ces tumeurs. Nos résultats ont démontré que La régulation du paysage immunitaire des tumeurs Becn1- était associée à une modulation du réseau de cytokines/chémokines dans le microenvironnement tumoral (TME). Ainsi, les tumeurs Becn1- présentaient une signature de cytokines inflammatoires (comprenant CCL5, CXCL10 et IFNg) qui pourrait être responsable de l'établissement de microenvironnement inflammatoire permissif aux cellules CD8. Nous avons révélé que la surexpression de l'IFNg dans le TME des tumeurs Becn1- était responsable de l'induction de PD-L1 sur les cellules tumorales par la voie d'activation JAK/STATs. En conclusion, cette étude met en évidence Beclin1 comme une cible majeure, capable d'induire l'infiltration des cellules effectrices immunitaires dans les mélanomes en induisant une signature inflammatoire. Elle fournit également la preuve de concept pour combiner des inhibiteurs d'autophagie avec les ICBs comme une approche de pointe pour améliorer leur efficacité
Immune Checkpoint Blockades (ICBs)-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for melanoma patients; however only a small subset of patients reaps a long term benefit. One of the major challenges to enhance the efficacy and extend the benefit of ICBs to non-responder patients is to design innovative approaches allowing the switch of “immune desert cold tumors” to “immune infiltrated hot tumors" which are eligible for ICB-based therapies. Here, we investigated the impact of targeting the early autophagy gene Beclin1 on the immune landscape of B16-F10 melanoma tumors. We found that targeting Beclin1 (Becn1-) significantly inhibited B16-F10 tumor growth and increased the infiltration of CD45+ leukocytes into the tumor bed. Immune phenotyping revealed an increased infiltration of active Natural Killer (NK) cells, inflammatory and resident type 1 macrophages, dendritic cells, and active CD8+ T lymphocytes. The inhibition of Becn1- tumor growth was no longer observed by depleting host CD8+ T cells, thus highlighting their major role in the control of Becn1- B16-F10 tumor development. We showed that Beclin1-dependent regulation of the immune landscape was associated with profound modulation of the cytokine/chemokine network in the tumor microenvironment (TME). Importantly, we revealed that Becn1- tumors displayed an inflammatory cytokine signature (comprised, but not restricted to, CCL5, CXCL10 and IFNg) that could be responsible for the switch from cold non T-inflamed to hot T-inflamed tumors. Mechanistically, we reported that the overexpression of IFNg in Becn1- TME was responsible for the induction of Programed Death ligand-1 (PD-L1) on tumor cells through the activation of JAK/STATs pathway. Overall, this study highlights Beclin1 as a valuable target, able to drive immune effectors cells into the melanoma tumors by inducing an inflammatory signature. This study provides the proof of concept for combining drugs inhibiting early autophagy process along with ICBs as a cutting-edge approach to improve their efficacy

Les tumeurs sont entourées d'un microenvironnement complexe comprenant des cellules tumorales, des fibroblastes et une diversité de cellules immunitaires. Avec le développement actuel des immunothérapies, la compréhension de la composition du microenvironnement tumoral est d'une importance critique pour effectuer un pronostic sur la progression tumorale et sa réponse au traitement. Cependant, nous manquons d'approches quantitatives fiables et validées pour caractériser le microenvironnement tumoral, facilitant ainsi le choix de la meilleure thérapie. Une partie de ce défi consiste à quantifier la composition cellulaire d'un échantillon tumoral (appelé problème de déconvolution dans ce contexte), en utilisant son profil omique de masse (le profil quantitatif global de certains types de molécules, tels que l'ARNm ou les marqueurs épigénétiques). La plupart des méthodes existantes utilisent des signatures prédéfinies de types cellulaires et ensuite extrapolent cette information à des nouveaux contextes. Cela peut introduire un biais dans la quantification de microenvironnement tumoral dans les situations où le contexte étudié est significativement différent de la référence. Sous certaines conditions, il est possible de séparer des mélanges de signaux complexes, en utilisant des méthodes de séparation de sources et de réduction des dimensions, sans définitions de sources préexistantes. Si une telle approche (déconvolution non supervisée) peut être appliquée à des profils omiques de masse de tumeurs, cela permettrait d'éviter les biais contextuels mentionnés précédemment et fournirait un aperçu des signatures cellulaires spécifiques au contexte. Dans ce travail, j'ai développé une nouvelle méthode appelée DeconICA (Déconvolution de données omiques de masse par l'analyse en composantes immunitaires), basée sur la méthodologie de séparation aveugle de source. DeconICA a pour but l'interprétation et la quantification des signaux biologiques, façonnant les profils omiques d'échantillons tumoraux ou de tissus normaux, en mettant l'accent sur les signaux liés au système immunitaire et la découverte de nouvelles signatures. Afin de rendre mon travail plus accessible, j'ai implémenté la méthode DeconICA en tant que librairie R. En appliquant ce logiciel aux jeux de données de référence, j'ai démontré qu'il est possible de quantifier les cellules immunitaires avec une précision comparable aux méthodes de pointe publiées, sans définir a priori des gènes spécifiques au type cellulaire. DeconICA peut fonctionner avec des techniques de factorisation matricielle telles que l'analyse indépendante des composants (ICA) ou la factorisation matricielle non négative (NMF). Enfin, j'ai appliqué DeconICA à un grand volume de données : plus de 100 jeux de données, contenant au total plus de 28 000 échantillons de 40 types de tumeurs, générés par différentes technologies et traités indépendamment. Cette analyse a démontré que les signaux immunitaires basés sur l'ICA sont reproductibles entre les différents jeux de données. D'autre part, nous avons montré que les trois principaux types de cellules immunitaires, à savoir les lymphocytes T, les lymphocytes B et les cellules myéloïdes, peuvent y être identifiés et quantifiés. Enfin, les métagènes dérivés de l'ICA, c'est-à-dire les valeurs de projection associées à une source, ont été utilisés comme des signatures spécifiques permettant d'étudier les caractéristiques des cellules immunitaires dans différents types de tumeurs. L'analyse a révélé une grande diversité de phénotypes cellulaires identifiés ainsi que la plasticité des cellules immunitaires, qu'elle soit dépendante ou indépendante du type de tumeur. Ces résultats pourraient être utilisés pour identifier des cibles médicamenteuses ou des biomarqueurs pour l'immunothérapie du cancer
Tumors are engulfed in a complex microenvironment (TME) including tumor cells, fibroblasts, and a diversity of immune cells. Currently, a new generation of cancer therapies based on modulation of the immune system response is in active clinical development with first promising results. Therefore, understanding the composition of TME in each tumor case is critically important to make a prognosis on the tumor progression and its response to treatment. However, we lack reliable and validated quantitative approaches to characterize the TME in order to facilitate the choice of the best existing therapy. One part of this challenge is to be able to quantify the cellular composition of a tumor sample (called deconvolution problem in this context), using its bulk omics profile (global quantitative profiling of certain types of molecules, such as mRNA or epigenetic markers). In recent years, there was a remarkable explosion in the number of methods approaching this problem in several different ways. Most of them use pre-defined molecular signatures of specific cell types and extrapolate this information to previously unseen contexts. This can bias the TME quantification in those situations where the context under study is significantly different from the reference. In theory, under certain assumptions, it is possible to separate complex signal mixtures, using classical and advanced methods of source separation and dimension reduction, without pre-existing source definitions. If such an approach (unsupervised deconvolution) is feasible to apply for bulk omic profiles of tumor samples, then this would make it possible to avoid the above mentioned contextual biases and provide insights into the context-specific signatures of cell types. In this work, I developed a new method called DeconICA (Deconvolution of bulk omics datasets through Immune Component Analysis), based on the blind source separation methodology. DeconICA has an aim to decipher and quantify the biological signals shaping omics profiles of tumor samples or normal tissues. A particular focus of my study was on the immune system-related signals and discovering new signatures of immune cell types. In order to make my work more accessible, I implemented the DeconICA method as an R package named "DeconICA". By applying this software to the standard benchmark datasets, I demonstrated that DeconICA is able to quantify immune cells with accuracy comparable to published state-of-the-art methods but without a priori defining a cell type-specific signature genes. The implementation can work with existing deconvolution methods based on matrix factorization techniques such as Independent Component Analysis (ICA) or Non-Negative Matrix Factorization (NMF). Finally, I applied DeconICA to a big corpus of data containing more than 100 transcriptomic datasets composed of, in total, over 28000 samples of 40 tumor types generated by different technologies and processed independently. This analysis demonstrated that ICA-based immune signals are reproducible between datasets and three major immune cell types: T-cells, B-cells and Myeloid cells can be reliably identified and quantified. Additionally, I used the ICA-derived metagenes as context-specific signatures in order to study the characteristics of immune cells in different tumor types. The analysis revealed a large diversity and plasticity of immune cells dependent and independent on tumor type. Some conclusions of the study can be helpful in identification of new drug targets or biomarkers for immunotherapy of cancer

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est l'une des rares maladies tumorales, avec mélanome et carcinome vésical, pour lesquelles les médicaments immuno-oncologiques ont conduit à une révolution thérapeutique. Seuls 20 à 30% des patients atteints de CPNPC bénéficient de la monothérapie avec inhibiteurs des points de contrôle immunitaires (ICP) avec des réponses durables, tandis que les combinaisons ont conduit à réponse longue dans jusqu'à 40% des patients. Notre étude vise à mieux caractériser la modulation du microenvironnement tumoral lors d'un traitement ICP, plus ou moins une chimiothérapie concomitante, afin de guider des stratégies d'immunothérapie plus convaincantes. Inspiré par la technologie d'organes sur puce, nous avons reconstitué ex vivo un microenvironnement de tumeur pulmonaire immunocompétent simplifié en réalisant des co-cultures 3D dans des dispositifs microfluidiques. Cette approche nous a permis de réaliser une imagerie en direct et une quantification des effets de l'ICP sur l'écosystème tumoral. L’architecture de la puce se compose de trois micro-chambres parallèles, séparées par des micro-piliers qui permettent le confinement d'un hydrogel biomimétique dans le canal central par capillarité. En co-cultivant des cellules CPNPC et des lymphocytes T cytotoxiques autologues (récoltés à partir des TIL du même patient et amplifiés ultérieurement in vitro), nous pourrions récapituler, visualiser et quantifier une activité cytotoxique efficace et spécifique des cellules T contre les cellules cancéreuses autologues. Pour cela, nous avons développé un nouvel algorithme qui pourrait localiser les cellules cancéreuses et, grâce à un rapporteur fluorescent de l'activité caspase, mesurer leur mort d'une manière spécifique au temps et à l'espace. Dans ces co-cultures 3D, l'activité cytotoxique des cellules T a été renforcée par le traitement avec l'inhibiteur PD-1 et l'inhibiteur PD-L1, reconstituant ainsi sur puce une réponse ICI. De plus, cette méthode nous a permis d'extraire un paramètre, le potentiel d'induction de la mort, qui estime mathématiquement la «contagiosité de la mort» en calculant la proximité dans l'espace et le temps des signaux de mort. Fait intéressant, cette analyse nous a révélé que la mort des cellules cancéreuses causée par la chimiothérapie ou par les cellules T cytotoxiques est contagieuse, alors que dans les conditions témoins, la mort des cellules cancéreuses est stochastique. Cette observation peut avoir des implications biologiques et cliniques, par exemple en ce qui concerne « l'effet spectateur », observé après un traitement de radiothérapie. De plus, afin d'avoir un aperçu moléculaire de l'impact de la co-culture sur les cellules T, en présence ou en l'absence d'ICI, nous avons analysé par cytométrie de flux l'expression de plusieurs marqueurs de cellules T. Après 3 jours de co-culture sur puce, les lymphocytes T ont montré une expression accrue des marqueurs d'activation, tels que CD69 et CD25, ainsi qu'une augmentation de l’expression des marqueurs d'épuisement, notamment PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG- 3, CD137 et OX-40. Le couplage de l'analyse d'image et de l'étude de la plasticité des lymphocytes T, nous a permis d'associer pour la première fois l'activité cytotoxique finement quantifiée des lymphocytes T avec leur statut d'activation / épuisement et de décrire un phénotype réactif aux immunothérapies. Dans cette thèse, nous avons démontré que la tumeur-sur-puce peut être exploité pour évaluer l'efficacité des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires, potentiellement pour déterminer l'effet de médicaments combinés et enfin pour étudier les mécanismes de résistance primaire des cellules cancéreuses
Non-small cell lung cancer (NSCLC) is one of the few tumor diseases, with melanoma and vesical carcinoma, for which immuno-oncology drugs led to a therapeutic revolution. Only 20 to 30% of the NSCLC patients benefit from immune checkpoint inhibitors (ICI) monotherapy with durable responses, while combinations led up to 40% of long responder patients. Our study aims to better characterize the modulation of the tumor microenvironment upon ICI treatment, plus or minus concurrent chemotherapy, in order to guide more compelling immunotherapy strategies. Inspired by the organ-on-a-chip technology, we implemented the reconstitution ex vivo of a simplified immunocompetent lung tumor microenvironment by performing 3D co-cultures in microfluidic devices. This approach allowed us to perform live-imaging and quantification of the effects of ICI on the tumor ecosystem.The design of the chip consists of three parallel micro-chambers, separated by micro-pillars that allow the confinement of a biomimetic hydrogel in the central channel by capillarity. By co-culturing autologous NSCLC cells and cytotoxic T lymphocytes (harvested from the TILs of the same patient and furtherly amplified in vitro) we could recapitulate, visualize and quantify an efficient and specific cytotoxic activity of the T cells against the autologous cancer cells. For this purpose, we developed a novel algorithm that could localize the cancer cells and, thanks to a fluorescent reporter of the caspase activity, measure their death in a time- and space-specific manner. In these 3D co-cultures the cytotoxic activity of T cells was enhanced by the treatment with PD-1 inhibitor and PD-L1 inhibitor, therefore reconstituting on-chip an ICI response. Furthermore, this method allowed us to extract a parameter, the potential of death induction, which mathematically estimates the “contagiousness of death” by computing the proximity in space and time of death signals. Interestingly, this analysis revealed us that the death of cancer cells caused by either chemotherapy or cytotoxic T cells is contagious, whereas in control conditions the cancer cells death is stochastic. This observation may have biological and clinical implications, for instance regarding the bystander effect, observed after radiotherapy treatment. Furthermore, in order to have a molecular insight on the impact of the co-culture on T cells, in presence or absence of ICI, we analyzed by flow cytometry the expression of several T cell markers. After 3 days of co-culture on chip, the T cells showed an increased expression of activation markers, such as CD69 and CD25, as well as an increased expression of exhaustion markers, notably PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CD137 and OX-40. The coupling of image analysis and the study of T cell plasticity, allowed us to associate for the first time the finely quantified cytotoxic activity of the T cells and their activation/exhaustion status and describe a responsive phenotype to immunotherapies. In this thesis, we demonstrated that the tumor-on-chip is suitable to evaluate the efficacy of immune checkpoint inhibitors, to potentially assess the effect of combined drugs and to study the mechanisms of cancer cell primary resistance

.Les pDCs et Tγδ ont des rôles cruciaux dans l’initiation et l’orientation des réponses immunitaires. Leurs fonctions uniques, leur grande plasticité et leur capacité d’interagir avec de nombreux acteurs immunitaires leur permettent de créer un lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. Elles contribuent donc grandement aux réponses immunitaires protectrices et pathogéniques, et sont de ce fait très prometteuses pour le développement d’immunothérapies anti-tumorales, autant en tant que vecteurs que cibles. Cependant, les lymphocytes Tγδ n’ont pas été étudiés de manière approfondie en contexte de mélanome, et les interactions entre pDCs et Tγδ n’ont été explicitées ni en contexte sain, ni en contexte mélanome, ou le contrôle immunitaire de la tumeur ‡ long terme est encore un défi. Nous avons réalisé une étude détaillée du phénotype et de la fonction des lymphocytes Tγδ circulant et infiltrant le mélanome, et analysé leur impact sur l’évolution clinique. Nous avons aussi caractérisé les interactions bidirectionnelles entre les pDCs et les Tγδ issus de sang de donneurs sains, et de sang ou de tumeur de patients. Nous avons mis en évidence que le mélanome détourne les fonctions effectrices des Tγδ dans le but d’échapper au contrôle immunitaire, et que les caractéristiques des Tγδ issus de sang ou de tumeurs de patients peuvent étre des bio-marqueurs prometteurs d’évolution clinique. Nous avons également montré que les interactions entre pDCs et Tγδ sont médiées par les IFNs de type I et II et par le récepteur BTN3A, essentiel pour l’activation des Td2+, et sont dérégulées en contexte de mélanome. L’administration de cytokines et d’anticorps ciblant les points de contrôle immunitaire peut rétablir des interactions fonctionnelles entre les deux populations cellulaires. De façon intéressante, nous avons observé une augmentation de l’expression de BTN3A sur les pDCs et Tγδ issus de sang de patients ou de tumeurs, tout en soulignant une potentielle dysfonction de cette molécule. Notre étude révèle que le mélanome détourne les interactions entre pDCs et Tgd notamment via la dérégulation de BTN3A. De tels résultats motivent l’exploitation de ces effecteurs immunitaires ainsi que de leur synergie, pour développer de nouvelles approches thérapeutiques exploitant leur potentiel anti-tumoral tout en évitant leur détournement par la tumeur pour améliorer l’évolution clinique des patients. Nos découvertes soutiennent l’exploitation de ces partenaires puissants et prometteurs pour élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques et restaurer des réponses immunes appropriées en contexte de cancer, infections et auto-immunité
Both pDCs and γδT cells harbor critical roles in immune responses induction and orientation. Their unique features, high functional plasticity and ability to interact with many immune cell types allow them to bridge innate and adaptive immunity. They actively contribute to protective and pathogenic immune responses, which render them very attractive both as targets and vectors for cancer immunotherapy. Yet, γδT cells have not been extensively explored in melanoma, and despite strategic and closed missions, cross-talks between pDCs and γδT cells have not been deciphered yet, neither in healthy context nor in cancers, especially in melanoma where the long-term control of the tumor still remains a challenge. We provided here a detailed investigation of the phenotypic and functional properties of circulating and tumor-infiltrating γδT cells in melanoma patients, as well as their impact on clinical evolution. We also characterized the bidirectional cross-talks between pDCs and γδT cells both from healthy donor’s blood, patient’s blood and tumor micro-environment. Our study highlighted that melanoma hijacked γδT cells to escape from immune control, and revealed that circulating and tumor-infiltrating γδT cell features are promising potential biomarkers of clinical evolution. We also demonstrated crucial bidirectional interactions between these key potent immune players though type I and II IFN and BTN3A that are dysfunctional in the context of melanoma. Reversion of the dysfunctional bidirectional cross-talks in melanoma context could be achieved by specific cytokine administration and immune checkpoint targeting. We also revealed an increased expression of BTN3A on circulating and tumor-infiltrating pDCs and γδT cells from melanoma patients but stressed out its potential functional impairment.Thus, our study uncovered that melanoma hijacked pDCs/ γδT cells bidirectional interplay to escape from immune control, and pointed out BTN3A dysfunction. Such understanding will help harnessing and synergizing the power of these potent immune cells to design new therapeutic approaches exploiting their antitumor potential while counteracting their skewing by tumors to improve patient outcomes. Our findings pave the way to manipulate these potent and promising cell partners to design novel immunotherapeutic strategies and restore appropriate immune responses in cancers, infections and autoimmune diseases

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent et le deuxième cancer le plus mortel dans le monde. En conséquence, de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ainsi qu’une amélioration des traitements actuels sont nécessaires. Les tumeurs se développent dans des microenvironnements complexes où les cellules cancéreuses interagissent et modulent la réponse immunitaire locale pour persister et se multiplier. Les lectines de type C, exprimées notamment par les cellules de l’immunité, régulent la réponse anti-cancéreuse, et donc le développement tumoral. Parmi elles, l'immunorécepteur des cellules dendritiques (DCIR), a été montré comme jouant un rôle immunitaire majeur au cours des maladies infectieuses et auto-immunes. À l’inverse, son rôle dans l'immunité tumorale reste méconnu. L'analyse des données transcriptomiques de deux cohortes de patients atteints de CCR a révélé un lien entre une expression élevée de DCIR et une meilleure survie des patients. Dans ce contexte, l'objectif principal de ma thèse était de déterminer l'impact de DCIR sur le développement du CCR et la réponse immunitaire associée. Dans ce but, j’ai établi un modèle murin préclinique, orthotopique et syngénique du CCR consistant en l'injection intracaecale de cellules tumorales MC38 exprimant la luciférase (MC38-fLuc+) dans des souris C57BL/6. Le suivi de la croissance tumorale par bioluminescence a montré que, malgré l’acquisition initiale de tumeurs solides par toutes les souris, seulement 30% des souris ont développé un CCR progressif et mortel, tandis que les autres animaux ont spontanément rejeté leurs tumeurs. Aucun rejet des tumeurs CCR MC38 n'a été observé en l'absence d'immunité adaptative, ni lors de l'injection de cellules MC38 dans d'autres sites anatomiques. L'immunophénotypage par transcriptomique et cytométrie de flux a révélé que les souris développant des tumeurs progressives présentaient une réponse immunitaire pro-tumorale, définie par une signature caractéristique des lymphocytes T régulateurs, détectable peu après l'implantation tumorale, et par une infiltration de cellules myéloïdes suppressives connues pour favoriser la croissance tumorale. En revanche, les souris rejetant les tumeurs présentaient une signature pro-inflammatoire précoce et un microenvironnement anti-tumoral enrichi en lymphocytes T CD8+. Ainsi, nos résultats démontrent un rôle du microenvironnement spécifique du côlon dans la régulation de l'équilibre entre les réponses immunitaires anti- ou pro-tumorales et souligne l'importance d'utiliser des modèles murins orthotopiques pour les études in vivo. Dans la seconde partie de ma thèse, j’ai utilisé ce modèle murin de CCR pour comparer le développement tumoral dans des souris C57BL/6 de type sauvage ou des souris déficientes pour l’expression de mDcir1 (mDcir1-KO), un homologue murin du DCIR humain. Bien que l'absence de mDCIR1 n'ait aucune incidence sur le pourcentage de souris développant ou rejetant les tumeurs du CCR, nous avons observé que les animaux mDcir1-KO développaient des tumeurs plus importantes que les sauvages En accord avec ce résultat, nous avons constaté une infiltration plus faible de lymphocytes CD8+ cytotoxiques et une activation moindre des lymphocytes T CD4+ et CD8+ (c'est-à-dire T-BET+, CD44haut, CTLA-4+) dans les tumeurs des souris mDcir1-KO par rapport aux souris sauvages. Ainsi, nos données indiquent un rôle protecteur et anti-tumoral de DCIR pendant le développement du CCR, probablement dû à une dérégulation de l'équilibre existant entre la tumeur et la réponse immunitaire. Dans l'ensemble, cette étude ouvre la voie à la mise au point éventuelle de biomolécules pharmacologiques ciblant DCIR pour déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale efficace dans le contexte du CCR et au-delà
Colorectal cancer (CRC) is the third most common and second deadliest cancer worldwide accounting for 900.000 deaths in 2018. Consequently, there is a strong need for new biomarkers as well as an improvement of the current treatments. Tumors develop in complex microenvironments where cancer cells constantly crosstalk with, and modulate, the local immune response to persist and replicate. C-type lectins receptors, expressed in particular by immune cells, actively regulate the immune response to cancer cells and, therefore, tumor development. Dendritic cell immunoreceptor (DCIR), a C-type lectin expressed by myeloid cells, has been shown to play a major role in immunity to infectious and autoimmune diseases. Yet, the role played by DCIR in tumor immunity remains unknown. Analysis of publicly available transcriptomic data from two cohorts of CRC patients revealed an association between high DCIR gene expression and improved survival of patients. In this context, the principal objective of my PhD thesis was to determine the role played by DCIR in the immune response during CRC development. First, I developed an orthotopic syngeneic pre-clinical CRC mouse model consisting in the intra-caecal injection of engineered MC38 tumor cells expressing firefly luciferase (MC38-fLuc+) in C57BL/6 mice. Monitoring of the tumor growth by bioluminescence revealed that, despite an initial growth of solid tumors in all the mice, only 30% of mice developed a progressive lethal CRC, while the remaining animals spontaneously rejected their solid tumor and survived more than 100 days. No rejection of tumors was observed in the absence of adaptive immunity, nor when MC38-fLuc+ cells were injected in other anatomical locations (i.e., liver and skin). Immunophenotyping by transcriptomic and flow cytometry showed that mice with progressive CRC tumors exhibited a pro-tumor immune response, characterized by a regulatory T cell pattern, discernible shortly post-tumor implantation, as well as myeloid suppressor cells that are well-known to favor tumor growth. By contrast, tumor-rejecting mice presented an early pro-inflammatory response and an anti-tumor microenvironment enriched with CD8+ T cells. Taken together, our results demonstrate a preponderant role of the colon-specific microenvironment in regulating the balance between anti- or pro-tumor immune responses and underline the importance of using orthotopic mouse models for in vivo studies. In a second part of my thesis, we used this CRC mouse model to compare the tumor development in wild-type (WT) C57BL/6 mice or mice deficient for mDcir1 (mDcir1-KO), a murine homologue of human DCIR. While the lack of mDCIR1 has no impact on the percentage of mice developing or rejecting CRC tumors, we observed that mDcir1-KO animals developed bigger tumors than their WT counterparts. In line with this result, we found a lower infiltration of cytotoxic CD8+ and decreased activation of both CD4+ and CD8+ T cells (i.e., T-BET+, CD44high, CTLA-4+) in CRC tumors from mDcir1-KO mice compared to WT mice. Altogether, our data point to a protective and anti-tumor role of DCIR during CRC development, probably due to a dysregulation of the balance existing between the tumor and the immune response. Overall, this study paves the way for the potential future development of pharmacological biomolecules targeting DCIR to trigger an efficient anti-tumor immune response in the context of CRC and beyond

La sénescence est un important mécanisme cellulaire qui prévient la tumorigenèse et se caractérise par un arrêt permanent du cycle cellulaire orchestré principalement par les inhibiteurs des cycline-kinases dépendantes (i.e p16INK4a). La sénescence est une caractéristique importante du vieillissement, mais un déséquilibre dans son induction peut être délétère pour la régénération tissulaire et paradoxalement pour la progression tumorale. L'irradiation (IR) est couramment utilisée comme approche thérapeutique dans le cancer. Chez les enfants survivants du cancer, l’exposition à l’irradiation et à la chimiothérapie entrainent le développement d’importants effets secondaires, lesquels sont associés à une forme de vieillissement prématuré. La formation de cellules sénescentes, en inhibant la prolifération tissulaire et en sécrétant des cytokines proinflammatoires, pourrait être en être responsable. Notre groupe a précédemment démontré que le gène p16INK4a est augmenté de manière tardive (environ 8 semaines) suite à une exposition à l’irradiation. Il n'a pas encore été étudié si cette expression retardée survient en réponse aux dommages causés par l'irradiation sur l’homéostasie tissulaire ou à titre de mécanismes de suppression tumorale. Un objectif de cette thèse visait donc à déterminer s’il était possible de moduler/inhiber l’expression de p16INK4a dans le but d’accroitre la régénération tissulaire sans nécessairement accroitre les risques d’incidence du cancer. En effet, ceci pourrait être possible dans la mesure ou la sénescence induite par p16INK4a est également irréversible in vivo. Nos résultats ont démontré que l’inhibition de l’expression de p16INKa (suite à l’administration de tamoxifen chez les souris p16L/LCre), induit à la fois une augmentation de la régénération tissulaire mais malheureusement également une augmentation de l’incidence du cancer. Nous voulions également connaitre l’impact de l’accumulation de ces cellules sénescentes sur les tissus, plus spécifiquement sur la fonction des cellules immunitaires de la rate. Nous avons démontré que des altérations (dépendantes de p16INK4a) au sein du microenvironnement splénique pouvaient altérer les fonctions intrinsèques des macrophages, des cellules dendritiques et des lymphocytes T. En outre, l'élimination systémique des cellules p16INK4a positives (modèle de sourie p16-3MR) a conduit à une restauration partielle de la fonction de ces cellules immunitaires. La combinaison de ces données nous permet de mieux comprendre le rôle et la fonction du gène p16INK4a dans le processus de sénescence induite par l’irradiation. Nos résultats suggèrent qu’il est envisageable d’utiliser des agents pharmacologiques tels que des composés sénolytiques, capables d’induire l’apoptose chez les cellules sénescentes spécifiquement, afin de potentiellement diminuer les effets du vieillissement prématuré induit par la sénescence cellulaire chez les survivants du cancer.
Senescence is an important cellular mechanism that prevents tumorigenesis and is characterized by a permanent cell cycle arrest orchestrated by cyclin-dependent kinases inhibitors (i.e p16INK4a). Senescence is an important hallmark of aging and unbalanced levels of senescence is considered deleterious for tissue regeneration, and paradoxically for tumor progression. Irradiation (IR) is commonly used therapeutic approach in cancer treatment. Together with surgery and chemotherapy, it has helped to increase the life expectancy of patients and, in some cases, leads to complete remission. However, long-after therapy, children who survive cancer encounter alterations in the integrity of tissues/organs associated with premature aging. The accumulation of senescent cells may be responsible for this accelerated aging by limiting tissue proliferation and secreting pro-inflammatory cytokines. Our group has previously demonstrated that the p16INK4a gene is increased in a delayed manner (approximately 8 weeks) following exposure to IR. It has not yet been investigated whether this delayed expression occurs in response to IR-induce damage of tissue homeostasis or as tumor suppression mechanisms. One objective of this thesis was to determine whether it was possible to modulate / inhibit the expression of p16INK4a in order to increase tissue regeneration without necessarily increasing the risk of cancer incidence. Indeed, this may be possible since p16INK4a-induced senescence is also irreversible in vivo. Our results demonstrated that the inhibition of p16INK4a expression in conditional-p16INK4a null mice , induces both an increase in tissue regeneration but unfortunately also an increase in the incidence of cancer. We also wanted to know the impact of the accumulation of these senescent cells on the tissues, more specifically on the function of the immune cells in the spleen. We have demonstrated that alterations (p16INK4a-dependent) within the splenic microenvironment can alter the intrinsic functions of macrophages, dendritic cells and T cells. In addition, the systemic elimination of p16INK4a positive cells (mouse model p16-3MR) has led to a partial restoration of the function of these immune cells. The combination of these data allows us to better understand the role and function of the p16INK4a gene in the irradiation-induced senescence process. Our results suggest that it is conceivable to use pharmacological agents such as senolytic compounds, capable of inducing apoptosis in senescent cells specifically, in order to potentially reduce the effects of premature aging induced by cellular senescence in cancer survivors.