Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Microenvironnement tumoral (TME)“

Introduction Although progression free survival and overall survival of patients with Hodgkin lymphoma (HL) has improved in the past 10 years, 15 % of patients will fail to conventional therapy and die of their lymphoma. The search of new prognostic factors for identifying these high risk patients at diagnosis of HL remains challenging in PET-guided strategies developed to improve the outcome HL patients while reducing treatment toxicity The aim of this study was therefore to assess the impact of baseline tumor microenvironnement in a large cohort of HL patients prospectively treated with upfront escalated BEACOPP in a randomized phase III clinical trial evaluating a PET-driven strategy (AHL 2011, NCT01358747) and to compare its prognostic value with other clinicopathological markers. Material and Methods Tumoral material was collected from HL patients prospectively enrolled in the AHL2011 study from LYSA centers in France and Belgium. The AHL2011 study was designed to evaluate in 16-60y HL patients with Ann Arbor stage III, IV or high risk IIB, a de-escalade PET-driven strategy after 2 cycles of BEACOPPesc (PET2) randomly compared to a standard treatment not driven by PET delivering 6 cycles of BEACOPPesc. The AHL2011 strategy was shown to safely guide treatment of advanced HL patients allowing using ABVD in early responders to BEACOPPesc (PET2 negative) reducing toxicities without impairing disease control (Casasnovas et al, Lancet Oncol 2019, JCO 2022). The tumor microenvironnement (TME) was analyzed on formalin fixed paraffin embedded diagnostic tissue biopsy obtained before treatment by morphological evaluation on standard staining on whole slides (% polynuclear eosinophils, % lymphocytes, % plasmocytes, % histiocytes), and immunohistochemistry (IHC) scoring (score 0-1-2-3) for CD20, CD3, CD4, CD8, CD68-TAMs (tumor-associated macrophages), CD163 (n=680) and EBERS (n= 634). Additional staining were done on Tissue microarray (TMA n=409) for PD-1, PD-L1, TIM3, GATA3, CD45R0, TBET and were centrally reviewed. Computational analysis was used for the TMA analysis using Tissu Studio software (Definiens). For each marker, a H-score was calculated (stained cells x 1, 2 or 3 according to the intensity of staining divided by the total number of cells x100) Results 680 patients were included on the whole slides analyses and 409 for those on the TMA analyses. Patients included had similar characteristics to the remaining patients of AHL2011 not included here. Among all the microenvironnement biomarkers tested only CD20 and CD68 had prognosis value. In univariate analysis, high CD20 H-score was associated with a favorable PFS (HR=0.43, 95%CI 0.22-0.86), while patients having high CD68 H-score had unfavorable PFS (HR=2.29, 95%CI 1.29-4.05). Then, the patients with a combined CD20 low/CD68high TME (n= 239, 47%) had a significant lower PFS compared to other groups (HR=2.46, 95%CI 1.48-4.09; p=0.004) (figure 1). In multivariate analysis including all relevant variables (Bulky disease / IPS / TMTV (total metabolic volume) / PET2 /PET4 / combination CD20 CD68 / % of tumor cells /EBV status / B symptoms), only High TMTV >220ml (HR = 2.09, p =0.017), PET4 positivity (HR= 7.06 ; p < 0.0001) and the CD20 low/CD68high profile (HR=1.95, p=0.025) had an independant prognosis value on PFS. Patients harboring both a TME depleted in CD20 and enriched in CD68, had peculiarities. Indeed, they had significantly more B symptoms (78.2% vs 64.2%, p<0.001), higher median TMTV (270 vs 163ml, p<0.001), were more frequently EBERs positive (23.6 vs 12.7%, p=0.002), had more frequently lymphopenia (38.5 vs 18.2%, p<0.001) and high IPS (69.2 vs 53%, p<0.001). Finally, patients with a CD20low/CD68high profile, had a higher median tumor cells PD-L1 H-score compared to other patients (39.7 vs 7.4, p<0.001). Conclusion Altogether these results demonstrate in a large PET-guided phase III trial (AHL2011), the interest of analyzing CD20 and CD68 expressions within the tumor microenvironnement to better evaluate the risk of treatment failure prior to therapy in patients with advanced HL. The prognosis value of the CD20/CD68 profile is independant of those of the baseline PET metrics (TMTV), and the early reponse to treatment. The enrichment of highly positive PD-L1 tumor cells in patients with CD20 low/CD68high TME suggests that PD-1 blockers could be a good therapeutic option in frontline treatment of this poor prognosis group.

L’immunothérapie à base d’anticorps monoclonaux (AcM) connaît un plein essor en cancérologie. En 2020, plus de 40% des anticorps approuvés par la FDA (Food and Drug Administration) (34 sur 84 anticorps, selon The Antibody Society) ont une indication pour les thérapies anti-cancéreuses. Contrairement à la chimiothérapie standard, ils démontrent un bien meilleur profil de tolérance pour les patients. Malgré cela, des effets indésirables néfastes peuvent survenir en raison du ciblage de l’antigène qui est également exprimé au niveau des tissus sains. C’est pourquoi des stratégies émergentes visent à optimiser le format des anticorps et à tenir compte des particularités du microenvironnement tumoral pour conférer une action encore plus spécifique de l’anticorps au niveau tumoral.

Abstract Although progression free survival and overall survival of patients with Hodgkin lymphoma (HL) has improved with modern treatment in the past 10 years, 10 % of patients will fail to conventional therapy and die of their lymphoma. The search of new prognostic factors for identifying these high risk patients at diagnosis of HL remains challenging in daily practice. The evaluation of the tumor microenvironnement was shown to help identifying a subset of patients treated with ABVD having a high risk of treatment failure (Tan KL et al, Blood 2012). PET positivity after 2 cycles of chemotherapy allows also identifying a subset of patients with poor outcome (Gallamini, JCO 2007) and PET-guided strategy were developed to improve the management of HL patients in order to either intensify treatment for high risk patients or deescalate treatment for sparing the others from toxicities. The aim of this study was therefore to evaluate the impact of baseline tumor microenvironnement in a large cohort of HL patients prospectively treated with upfront escalated BEACOPP in a randomized phase III clinical trial evaluating a PET-driven strategy (AHL 2011, NCT01358747) and to compare its prognostic value with other clinicopathological markers. Material and Methods Tumoral material was collected from May 2011 to May 2014 from HL patients prospectively enrolled in the AHL 2011 study. The AHL 2011 trial was designed to evaluate in 16-60 years old HL patients with Ann Arbor stage III, IV or high risk IIB, a de-escalade PET-driven strategy after 2 cycles of BEACOPPesc randomly compared to a standard treatment not driven by PET and delivering 6 cycles of BEACOPPesc. PET were centrally reviewed and interpreted according to Deauville criteria. As recently reported (Casasnovas, ASH 2015 Abs 577), the 2y-PFS was similar in the PET-driven (88%) and the standard arm (91%; p =0.79). The tumor microenvironnement was analyzed on formalin fixed paraffin embedded lymph node biopsy obtained for the diagnosis before treatment by morphological evaluation on standard staining (% polynuclear eosinophils, % lymphocytes, % plasmocytes, % histiocytes), and immunohistochemistry (IHC) scoring (score 0-1-2-3) for CD20, CD3, CD68-TAMs (tumor-associated macrophages) and CD163 and were centrally reviewed. Percentage of tumoral cells and EBV status were also analysed. In this analysis, the prognosis value of tissue markers expressions were compared to those of clinical and biological patient's characteristics, and PET results after 2 cycles of escalated BEACOPP. Results Six hundred fifty eight patients with available IHC data out of 823 enrolled in AHL2011 study were included in the analysis. With a median follow-up of 16.1 months, 2-year PFS was 89.4% (95% CI [86.2% ; 91.9%]) and 2-year OS 98.7% (95% CI [96.4% ; 99.5%]). In univariate analysis male gender, at least one extra-nodal involvement, B symptoms, Hemoglobin <10.5g/dL, Albumin <40g/L, IPS score≥ 3, positive PET2, immunophenotyping CD20 (2-3vs0-1) and CD163 (2-3 vs 1) were significantly associated with shorter PFS. In multivariate analysis positive PET2 was the only factor retaining an independent prognosis value and associated to a shorter PFS (p=.04, HR=2.5, CI95% (1.03-5.8)). Among baseline patients characteristics, male gender, hemoglobin <10.5g/dL, IPS score ≥3, low % of lymphocytes, immunophenotyping CD3 (score ≥1), high CD20 (score ≥2), CD68 and CD163 expression were significantly associated with a higher risk of PET2 positivity. In multivariate analysis high CD68 expression (score 2-3 vs 1) was the only independent prognostic factor predicting PET2 positivity (p=.03, HR=2.4, CI95% (1.1-5.2)). 79% of PET2 positive patients have high CD68 expression and the combination of high CD68 expression and PET2 positivity identifies a subset of 50 patients (%) with a shorter 2y-PFS (72%) than PET2+/CD68low patients (2y-PFS=100%, p 0.066). In conclusion, CD68 expression was confirmed to be an important prognostic marker in this large prospective cohort of patients treated with upfront escalated BEACOPP in a modern PET-guided strategy. Baseline high CD68 expression is associated to a higher risk of PET2 positivity and the combination of this microenvironment marker and PET2 results allowed identifying a population of patients with high risk of treatment failure. Figure 1 Figure 1. Figure 2 Figure 2. Disclosures Brice: Takeda Pharmaceuticals International Co.: Honoraria, Research Funding; Bristol Myers-Squibb: Honoraria; Seattle Genetics: Research Funding; Gilead: Honoraria; Roche: Honoraria. Casasnovas:BMS: Consultancy, Honoraria; Sanofi: Consultancy, Honoraria; Takeda: Consultancy, Honoraria; Abbvie: Consultancy, Honoraria; Gilead: Consultancy, Honoraria, Research Funding; ROCHE: Consultancy, Honoraria, Research Funding.

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est le sous-type le plus fréquent de lymphome non hodgkinien (NHL), caractérisé par une prolifération anormale de cellules B matures. C'est une maladie agressive pour laquelle les stratégies thérapeutiques actuelles sont insuffisantes. Le microenvironnement tumoral (TME) est un réseau dynamique de cellules, molécules et des autres éléments qui entourent une tumeur. Ceux-ci tiennent un rôle prépondérant dans le développement du cancer, la réponse au traitement et la survie des patients. Étudier le TME chez les patients atteints de DLBCL est essentiel pour découvrir de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaire impliqués dans progression de la maladie et identifier des biomarqueurs pronostiques. Cependant, sa structure tissulaire diffuse rend difficile l'étude précise de l'organisation et des interactions cellulaires au sein du TME.L'objectif de ce projet de thèse est de réaliser une caractérisation multimodale complète des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral du DLBCL. Pour faciliter l'accès aux échantillons humains, j'ai développé et mis en place un protocole de recherche clinique permettant un accès à des biopsies de patients suivis à l'hôpital Saint-Louis, et garantissant que la cohorte de patients reflète l'hétérogénéité de la maladie.Tout d'abord, j'ai réalisé une caractérisation en profondeur des lymphocytes T infiltrant la tumeur (TILS). Pour ce faire, j'ai utilisé des technologies innovantes de cytométrie en flux et spectrale multiparamétrique pour étudier finement la diversité de cellules T dans les biopsies de DLBCL ainsi que leurs réseaus de communication avec les autres cellules immunitaires. Une analyse non supervisée a pu mettre en évidence la présence de nouveaux sous-types de cellules T, par comparaison aux tissus contrôle. De plus, l'analyse de l'expression ligand-récepteur a permis d'étudier la communication cellulaire de ces sous-populations de cellules T dans le TME.En parallèle de cette étude, j'ai pu caractériser les profils transcriptomiques des cellules immunitaires présents dans le TME. Pour ce faire, j'ai utilisé une technologie de pointe, la transcriptomique spatiale, des outils bio-informatiques innovant pour cartographier l'expression des gènes directement dans des échantillons de biopsies de DLBCL fixés au formol et inclus en paraffine. J'ai ainsi pu identifier des profils d'expression génique distincts et anatomiquement restreints, défiant la notion historique d'une architecture diffuse du TME du DLBCL. Ces profils peuvent être classifiés en écosystèmes, différant de par leurs compositions cellulaires, leurs fonctions et leurs interactions avec les cellules avoisinantes. De façon importante, la prédominance de certains écosystèmes permettent une classification des patients selon leur taux de survie globale, révélant le potentiel pronostique de ces identités cellulaires spatiales.Enfin, j'ai réalisé une évaluation in vitro du mécanisme d'action et de l'efficacité d'un anticorps bloquant développé par la société pharmaceutique Servier. Celui-ci a été développé pour qui perturber un signal inhibiteur entre les cellules NK et les cellules B malignes. Mes résultats montrent que le candidat améliore la cytotoxicité des cellules NK à l'encontre des cellules tumorales dans un système de co-culture in vitro. Ces résultats soulignent l'importance de cibler les interactions cellulaires entre les cellules immunitaires et les cellules B malignes pour le développement de thérapies plus efficaces dans le DLBCL.Ce projet multidisciplinaire, mené sur des échantillons humains, apporte une compréhension approfondie de l'hétérogénéité des cellules immunitaires, de leurs interactions et localisations dans le microenvironnement du DLBCL. Ainsi, ce projet pourrait conduire à la découverte de nouveaux biomarqueurs et de stratégies thérapeutiques plus efficaces pour les patients atteints de DLBCL
Diffuse Large B-cell Lymphoma (DLBCL) is the most prevalent subtype of non-Hodgkin's Lymphoma worldwide, characterized by an abnormal proliferation of mature B cells. It is an aggressive B-cell malignancy for which the current therapeutic strategies are still insufficient. The tumor microenvironment (TME) is the dynamic network of cells and all elements surrounding and interacting with the tumor. It plays an important role in cancer development, treatment response, and patient survival. Consequently, investigating the TME in DLBCL patients is crucial to discover the mechanisms leading to relapse and identify prognostic biomarkers. However, its diffuse tissue structure presents a challenge in elucidating the cellular organization and communication within the TME. The objective of my Ph.D. thesis is to conduct a comprehensive multimodal characterization of the immune cells within the DLBCL tumor microenvironment.To facilitate access to human samples, I developed and implemented an ethically approved clinical research protocol and a circuit of tissue and blood samples from patients with DLBCL treated at Saint Louis hospital, ensuring that the patient cohort reflects the heterogeneity of the disease.First, I performed a deep characterization of T lymphocytes, with special focus on describing their role within the DLBCL tissue. Indeed, Tumor-infiltrating T-cells (TILS) are key players in the NHL TME, presenting different subtypes and cell states. I apply multiparametric flow cytometry and high-dimensional spectral cytometry to investigate the complex landscape of T diversity in DLBCL biopsies, as well as their communication patterns with other immune cells in the tissue. The unsupervised analysis approach identified unexpected T-cell subtypes at a protein level, compared to tissue control and other lymphoproliferative disorders. Furthermore, the ligand-receptor expression analysis enabled the cell-cell communication study of those T-cell subpopulations within the TME context. Second, I aimed to characterize transcriptomic immune landscapes at a large scale within DLBCL tissue. However, RNA sequencing technologies characterize isolated cells from dissociated tissues with a loss of spatial context. I applied spatial transcriptomics, a cutting-edge technology that enables gene expression mapping in formalin-fixed paraffin-embedded samples of DLBCL biopsies, thus preserving their morphological information. I identified distinct anatomically restricted gene expression profiles in DLBCL samples, defying the historical notion of DLBCL diffuse architecture. These profiles can be classified into ecosystems that differ in cellular composition, functional patterns, and neighborhood characteristics. Moreover, their spatially resolved signatures classify patients with different overall survival revealing the prognostic potential of these spatial identities.Third, I evaluated the effects of altering the communication between NK cells and malignant B cells in DLBCL. I performed a functional in vitro assessment of a blocking antibody developed by the pharmaceutical company Servier. The functional assays demonstrated the effect of the molecular candidate in co-culture settings by improving cytotoxic functions of NK cells against tumor cells. These findings highlight the importance of targeting the interaction between effector cells and malignant B cells to develop effective therapies for DLBCL.This multidisciplinary project carried out on human samples provides a deep understanding of the heterogeneity of immune cells in DLBCL microenvironment at a protein and transcriptomic level while considering their spatial organization. Hence, this project holds significant therapeutic potential, by gaining insights into the disease heterogeneity and its impact on clinical outcome. This project could eventually lead to the discovery of new potential biomarkers and effective therapeutic strategies for DLBCL patients

L'immunothérapie anti-cancéreuse est un traitement efficace chez certains patients, mais cela dépend de l'organe atteint. Les patients avec un cancer du foie primitif ou des métastases hépatiques d'un cancer colorectal (MHCCR) ont souvent des réponses limitées. Cela est lié à l’environnement immunitaire particulier du foie. Dans cette étude, nous avons examiné l’impact des cellules immunitaires dans le MHCCR, en particulier les mastocytes et les neutrophiles, dans la survie. La présence accrue de mastocytes était liée à un meilleur pronostic, tandis que la présence de neutrophiles était associée à un mauvais pronostic. De plus, chez les patients atteints d’un carcinome hépatocellulaire précoce, différents profils immunitaires ont été identifiées, ce qui pourrait aider à personnaliser le traitement. En résumé, comprendre la réaction immunitaire dans le foie est essentiel pour améliorer l'efficacité de l'immunothérapie contre les tumeurs hépatiques, et cela pourrait conduire à de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la survie des patients
Anti-cancer immunotherapy can be highly effective for certain patients, but its success depends on the affected organ. Individuals with primary liver cancer or liver metastases from colorectal cancer often have limited responses to immunotherapy. This is largely due to the immune environment within the liver. In this study, we examined how immune cells, particularly mast cells and neutrophils, impact outcomes in patients with colorectal cancer liver metastasis. We found that an increased presence of mast cells in tumors was associated with better outcomes for patients, while the presence of neutrophils was linked to a less favorable outcome. Furthermore, in the case of early-stage liver cancer, we discovered that patients could be grouped into different immune profiles, which could help personalize treatment. In summary, this study highlights the importance of understanding how the immune system reacts in the liver to enhance the effectiveness of immunotherapy for liver cancer and colorectal cancer. This information could also assist in identifying new therapeutic targets to improve treatments and patient survival in the future

Le microenvironnement tumoral, l'angiogenèse tumorale et l'hypoxie jouent un rôle crucial dans la progression tumorale et le développement de thérapies de nombreux cancers. Les limites de pénétration des médicaments, les phénomènes de résistance aux anti-cancéreux, la vascularisation de la tumeur et l’hypoxie sont tous des paramètres influençant les effets du médicament. La culture cellulaire 3D permet de créer un microenvironnement qui imite l’architecture et la fonction des tissus in vivo. L’expression de gènes et de protéines modifiée par l’environnement 3D est une autre caractéristique qui impacte l’effet d’une molécule thérapeutique. Dans notre première étude, afin de développer un modèle 3D vascularisé imitant celle des tumeurs in vivo, nous avons mis en culture des cellules endothéliales en 2D avec des cellules tumorales en 3D. Après 2 semaines de culture, un réseau vasculaire s’est organisé avec des structures de type tubulaire présentant une lumière et exprimant différents marqueurs angiogéniques tels que VEGF, CD31 et Collagène IV. Dans notre deuxième étude, nous avons développé un modèle d’hypoxie in vitro intégrant l'environnement 3D et un agent mimétique de l'hypoxie (CoCl2). Le but de ce modèle est de créer un modèle d'hypoxie imitant les tumeurs in vivo et de montrer l'importance de l'hypoxie dans la réponse et la résistance aux médicaments. Ces résultats ont révélé que la meilleure condition était la combinaison 3D+CoCl2, conduisant à la surexpression des gènes relatifs à l’hypoxie (GLUT1/3, VEGF) et à la résistance aux médicaments (ABCG2, MRP1). L'angiogenèse et l'hypoxie sont des facteurs clés pour le microenvironnement tumoral in vivo et ils doivent être adoptés dans la conception de modèles tumoraux in vitro pour mieux sélectionner et cribler les médicaments anticancéreux
The tumor microenvironment, tumor angiogenesis, and hypoxia play a critical role in the tumor progression and therapy development of many cancers. Limitations in drug penetration, multidrug resistance phenomena, tumor vascularization, and oxygen deficiency are all parameters influencing drug effects. 3D cell culture allows to create a microenvironment that more closely mimics in vivo tissue architecture and function, thus, gene and protein expression modified by the 3D environment are further features that affect treatment outcome. In our first study, in order to develop a vascularized 3D model like in vivo tumors, we co-cultured 2D endothelial cells with 3D tumor cells. After 2 weeks of this combination, a vascular network was formed and organized with tubule-like structures presenting a lumen and expressing different angiogenic markers such as VEGF, CD31 and Collagen IV. In our second study, we developed an in vitro hypoxia model integrating the 3D environment and a hypoxia mimetic agent (CoCl2) to mimic the in vivo tumors and to show the importance of hypoxia in drug response and resistance. Results revealed that the best condition was the combination 3D+CoCl2 model, leading to overexpression oh hypoxia (GLUT1/3, VEGF) and drug resistance (ABCG2, MRP1) related genes. Taken together, angiogenesis and hypoxia are key factors for in vivo tumor microenvironment and they should be adopted in in vitro model design to better select and screen anticancer drugs

Bien que rares, les tumeurs endocrines développées chez l'Homme demeurent problèmatiques. Une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent leur croissance constitue un objectif essentiel pour identifier des cibles thérapeutiques nouvelles.Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'impact du microenvironnement tumoral (MeT), définit par l'ensemble des facteurs qui encerclent la niche tumorale primitive, sur la croissance des tumeurs endocrines digestives. In vitro, nous observons un effet prolifératif réciproque entre des fibroblastes, l'une des cellules pivots du MeT, et des lignées cellulaires humaines de tumeurs endocrines pancréatiques, tel qu'il est susceptible d'exister in situ. Dans une seconde partie, nous avons montré que le pegvisomant, un antagoniste du récepteur de l'hormone de croissance utilisé chez des patients atteint d'adénome hypophysaire somatotrope, n'a pas d'effet prolifératif in vitro sur les cellules somatotropes adénomateuses
Although rare, endocrine tumors developed in Humans remain problematic, such as a better understanding of their regulatory mechanisms of growth represent a step forward to identify new therapeutical targets.In the first part of this thesis, we investigated the impact of the tumor microenvironment (TME), as defined by the factors surrounding the tumor primitive niche, on the growth of human digestive endocrine tumors. We, here, showed the occurrence of a reciprocal proliferation between human fibroblasts, a key cell within the TME, and human pancreatic neuroendocrine tumor cell lines, suggesting that human fibroblasts may constitue a new therapeutical target of interest in the TME of digestive endocrine tumors. In a second part, we showed that pegvisomant (PEG), a growth hormone receptor antagonist currently used in patients with GH-secreting pituitary adenoma, did not impact in vitro the proliferation rate of GH-secreting adenoma cells and therefore is suitable in patients with a persisting GH-secreting pituitary adenoma residue after surgery

Le canal TRPC1 (pour transient receptor potential canonical 1) est l'un des canaux cationiques non sélectifs les plus impliqués dans plusieurs maladies, y compris la progression du cancer. Les TRPC peuvent être activés par différents stimuli physico-chimiques dont le pH. Par ailleurs, l'une des caractéristiques du cancer représente les variations pH extracellulaire, notamment dans l'adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP). Il existe de fortes indications quant à l'agressivité de l'ACP qui est causée par l'interaction entre le microenvironnement acide de la tumeur et la dérégulation des canaux ioniques. Cependant, cette interaction n'a jamais été étudiée. Lors de ce travail, nous avons étudié si TRPC1 ainsi que les fluctuations du pH acide du microenvironnement tumoral régulent la progression de l'ACP et plus particulièrement la prolifération et de migration cellulaires. Nous avons constaté que TRPC1 était surexprimé dans le tissu tumoral pancréatique par rapport au tissu normal, et dans la lignée cellulaire agressive PANC-1, par rapport à une lignée cellulaire de type canalaire, hTERT-HPNE. Pour déterminer si les fluctuations du microenvironnement acide de la tumeur affectent la dérégulation de TRPC1, les cellules PANC-1 ont été incubées dans un milieu présentant un pH de 7,4 ou 6,5 pendant 30 jours, après quoi les cellules ont été récupérées à pH 7,4 pendant 14 jours (7.4 R). L'adaptation acide (6.5) a réduit l'expression de la protéine TRPC1 mais a favorisé sa localisation membranaire par rapport au contrôle (7.4). Dans des conditions de pH 7,4R, les cellules cancéreuses présentaient une expression de TRPC1 exacerbée avec une localisation membranaire élevée, à la fois dans les modèles 2D et 3D. Nous avons constaté que les fluctuations de pH et l'invalidation moléculaire par siARN (KD) de TRPC1 affectaient respectivement la prolifération de PANC-1 dans un modèle 2D et sphéroïde. Dans notre modèle 2D, nous avons montré que TRPC1 KD affectait la progression à travers la phase G0/G1 dans toutes les conditions et la phase S lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu pH 7,4, et la phase G2/M dans les conditions pH 6,5 et 7,4 R. En outre, pH 6,5 a amélioré tandis que le KD de TRPC1 a diminué la migration cellulaire. De plus, nous avons constaté que TRPC1 interagissait fortement avec PI3K dans des conditions acides, et CaM dans toutes les conditions. Le KD de TRPC1 diminuait à la fois cette interaction et l'activation de AKT et ERK1/2. Enfin, l'entrée basale de Ca2+ a été significativement réduite par le KD de TRPC1 dans les conditions de pH 6,5 et 7,4R. La réduction de la concentration de Ca2+ extracellulaire a entraîné une diminution additionnelle de la prolifération et de la migration des cellules transfectées avec siTRPC1 cultivées à pH 6,5 et 7,4R, mais pas dans des conditions normales de pH 7,4. Collectivement, nos résultats montrent que TRPC1 est régulé positivement dans les tissus et lignées d’ACP. Le microenvironnement acide de la tumeur favorise sa localisation membranaire et son interaction avec PI3K/CaM. Enfin, le Ca2+ transitant par TRPC1 participe à la prolifération et à la migration cellulaires. De plus, nous avons effectué un criblage du profil d'expression des canaux ORAI, de leur partenaire STIM1, d'un canal sodique activé par le voltage (Nav1.6) et d'un canal ionique détectant l'acidité (ASIC1) dans les tissus et lignées d'ACP. Nous avons examiné si le microenvironnement acide affecte la régulation épigénétique des canaux ioniques. Nous avons constaté qu'ORAI3 était régulé positivement dans le tissu ACP par rapport au tissu normal, tandis que STIM1 et NaV1.6 étaient régulés négativement. De plus, ORAI3 était préférentiellement localisé au niveau membranaire dans le tissu tumoral. De plus, nos résultats préliminaires montrent que le microenvironnement acide de la tumeur n'affecte pas les niveaux de méthylation de la région promotrice des gènes codant pour ASIC1 ou TRPC1, mais également du gène SCN8A
The transient receptor potential canonical 1 channel (TRPC1) is one of the most prominent nonselective cation channels involved in several diseases, including cancer progression. TRPCs can be activated by different physio-chemical stimuli of their surroundings, for instance, pH. Another hallmark of cancer is the variable extracellular pH landscape, notably in epithelial cancers such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). PDAC progression and development are linked to the physiology and microenvironment of the exocrine pancreas. There are strong indications that PDAC aggressiveness is caused by the interplay between the tumor acidic microenvironment and ion channel dysregulation. However, this interaction has never been studied before. Here, we investigate if TRPC1 is involved in PDAC progression in the form of proliferation and migration and if the pH fluctuations of the acidic tumor microenvironment affect these processes. We found that TRPC1 was significantly upregulated in PDAC tumor tissue compared to adjacent normal tissue, and in the aggressive PDAC cell line PANC-1, compared to a duct-like cell line, hTERT-HPNE. To investigate if fluctuations of the acidic tumor microenvironment affect TRPC1 dysregulation, PANC-1 cells were incubated in a medium with a pH of 7.4 or 6.5 over 30 days, where after cells were recovered in pH 7.4 for 14 days (7.4R). Acid adaptation (6.5) reduced TRPC1 protein expression but favored its membrane localization compared to the control (7.4). pH recovery treatment (7.4R) resulted in an upregulation of TRPC1 expression with a high membrane localization, both in 2D and 3D models. We found that pH fluctuations and the siRNA-based knock-down (KD) of TRPC1 affected 2D and spheroid PANC-1 proliferation, respectively. In our 2D model, flow cytometry and cell cycle regulating protein immunoblotting showed that TRPC1 KD affected the progression through G0/G1 phase under all conditions and S-phase under control pH 7.4, which shifts to the G2/M phase in pH 6.5 and 7.4R. In addition, pH 6.5 enhanced, and the KD of TRPC1 decreased cell migration, respectively. Furthermore, we found that TRPC1 interacted strongly with PI3K under acidic conditions and CaM under all conditions, and a KD of TRPC1 decreased both this interaction and the activation of AKT and ERK1/2. Finally, basal Ca2+ entry was significantly reduced upon the KD of TRPC1 in pH 6.5 and 7.4R, where the entry was enhanced. The reduction of extracellular Ca2+ concentration resulted in an additional decrease in proliferation and migration of cells transfected with siTRPC1 growing in pH 6.5 and 7.4R, but not in normal pH 7.4 conditions.Collectively, our results show that TRPC1 is upregulated in PDAC tissue and cell lines. The acidic tumor microenvironment favors its plasma membrane localization, and its interaction with PI3K/CaM and Ca2+ entry leads to PDAC cells proliferation and migration. In addition, we performed an expression profile screening of ORAI channels, their partner STIM1, and a voltage-activated sodium channel (Nav1.6), and an acid-sensing ion channel (ASIC1) in PDAC tissues and cell lines, and investigated whether the acidic tumor microenvironment affects epigenetic regulation of ion channel expression. We found that ORAI3 was upregulated in PDAC tissue compared to normal tissue, where STIM1 and NaV1.6 were significantly downregulated. Moreover, ORAI3 was more localized in the plasma membrane in tumor tissue. Acid-adaptation had a differential effect on Ca2+ channel expression. Furthermore, our preliminary results show that the acidic tumor microenvironment does not affect the methylation levels of the ASIC1 or TRPC1 promoter region, but so some extend the SCN8A gene promoter

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des maladies hématologiques hétérogènes caractérisées par une prolifération clonale des blastes myéloïdes qui s’infiltrent dans la moelle osseuse (MO), le sang et d’autres organes. Identifiée comme le type le plus courant de leucémie aiguë chez l’adulte avec 80% des cas, la LAM est synonyme de rechute et de mauvais pronostic, avec 70% des patients étant confrontés à une mortalité dans l’année suivant le diagnostic. La présence des cellules souches leucémiques (CSL) a été associée à une résistance à la chimiothérapie et à une rechute dans la LAM. Le microenvironnement tumoral a été décrit pour son rôle clé dans la régulation des CSL par l’interaction des voies de signalisation. La voie des Bone Morphogenetic Proteins (BMP) est fortement impliquée dans la régulation des cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais elle a également été reconnue pour réguler les CSL. Ici, nous avons identifié des concentrations élevées de BMP2 et BMP4 dans la MO des patients atteints de LAM au moment du diagnostic. De plus, nous avons identifié pour la première fois une nouvelle cascade de signalisation impliquant la liaison de BMP4 au récepteur BMPR1A, qui induit l’expression de ΔNp73 et NANOG. L’activation de cette signalisation favorise un phénotype proche des cellules souches dans les cellules leucémiques. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que cette voie est responsable de la capacité de résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie. En outre, nous avons identifié BMPR1A/ΔNp73/NANOG comme marqueurs potentiels du pronostic dans la LAM, en raison de leurs surexpressions au moment du diagnostic associé à une rechute dans les trois ans. Lorsque nous avons analysé des échantillons de LAM lors d’une rechute, nous avons constaté des taux plus élevés de l’isoforme ΔNp73 par rapport à ceux de patients au moment du diagnostic. D’autre part, nous avons identifié une forte expression du récepteur BMPR1A, ΔNp73, NANOG, SOX2 et ID1 dans les cellules leucémiques primaires résistantes à court terme. Ces résultats sont en corrélation avec ce que nous avons observé dans les cellules résistantes de LAM, où BMPR1A, ΔNp73, NANOG et ID1 semblent être impliqués dans la capacité de résistance des cellules de LAM face à la chimiothérapie. La modulation et le ciblage des éléments de la voie BMP et des gènes associés identifiés au travers de notre étude représentent donc une approche prometteuse pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes et plus efficaces contre les LAM
Acute myeloid leukemias (AML) are heterogeneous hematological malignancies characterized by a clonal proliferation of myeloid blasts which infiltrate the bone marrow, blood and other organs. Identified as the most common type of acute leukemia in adults with 80% of cases, AML is associated with high relapse and poor prognosis where 70% of patients face mortality within one year after diagnosis. Leukemic stem cell (LSCs) presence has been related to resistance to chemotherapeutic agents and relapse in AML. The tumor microenvironment has been described for its key role regulating LSCs through the crosstalk of signaling pathways. Bone Morphogenetic Proteins (BMP) pathway is highly involved in hematopoietic stem cell (HSC) regulation, but has also been recognized to regulate LSCs. Here, we have identified high concentrations of BMP2 and BMP4 in bone marrow (BM) AML samples at diagnosis. Furthermore, we have identified for the first time a new signaling cascade, involving the binding of BMP4 to BMPR1A receptor, which induces the expression of ΔNp73 and NANOG. Activation of this signaling promotes a stem-like phenotype in leukemic cells. Therefore, we hypothesized that this signaling is responsible for the resistant capacity of leukemic cells to chemotherapy. In addition, we have reported BMPR1A/ΔNp73/NANOG as potential AML prognosis markers, due to their overexpression at diagnosis associated to an increased rate of relapse of AML patients within three years. When we analyzed AML samples at relapse, higher levels of ΔNp73 isoform were found compared to patients at diagnosis. Moreover, we have identified high expression of the BMPR1A receptor, ΔNp73, NANOG, SOX2 and ID1 in short-term resistant primary leukemic cells. These results correlate with what we observed in AML resistant cells, where BMPR1A, ΔNp73, NANOG and ID1 seem to be implicated in driving the resistant capacity of AML cells to drug therapy. Therefore, modulation and targeting of the BMP pathway elements and related genes identified with our study, represent a promising approach towards the development of new and more effective therapeutic strategies against AML

Les lymphocytes « Natural Killer » (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée, capables de lyser les cellules cancéreuses grâce au relargage de la protéase cytotoxique Granzyme B (GzmB). Récemment, de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, basées sur l’utilisation des cellules NK, ont émergé et se sont révélées très prometteuses. Il est maintenant clairement établi que le microenvironnement tumoral hypoxique influence la réponse immunitaire et constitue, de ce fait, un obstacle majeur pour établir des protocoles d’immunothérapies efficaces. Des études récentes ont montré que l’autophagie est un régulateur important de l’immunité innée dans le microenvironnement tumoral, mais les mécanismes de régulation impliqués restent encore peu connus. Nous avons montré in vitro que l'hypoxie diminue la sensibilité des cellules de carcinome mammaire à la lyse dépendante des cellules NK par un mécanisme impliquant l'activation de l'autophagie. De manière intéressante, cette diminution de lyse est reversée par l’inhibition de l’autophagie. Nous avons démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NK n'est liée ni à un défaut de reconnaissance des cellules cibles, ni à une altération de l’activité cytotoxique des effecteurs. Nous avons mis en évidence que l'activation de l’autophagie conduit à la dégradation de GzmB dans les lysosomes des cellules hypoxiques. Ainsi, ces cellules deviennent résistantes à l’apoptose, qui est normalement induite par GzmB, transféré par les cellules NK. L’invalidation génétique et pharmacologique de l'autophagie permet de restaurer le niveau intracellulaire de GzmB et réduit la résistance des cellules cibles hypoxiques in vitro. Nos résultats mettent en évidence que l'autophagie est un régulateur primordial de la réponse immunitaire anti-tumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce concept in vivo en montrant que l’inhibition de l'autophagie favorise de manière significative la prise en charge de la tumeur par les cellules NK dans des modèles murins de mélanome et de carcinome mammaire. Cette étude contribue à l’avancé des connaissances sur la manière dont l'autophagie, induite par l'hypoxie, affecte la lyse dépendante des cellules NK et ouvre la voie à la formulation de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-tumorales combinant l’utilisation des cellules NK à des inhibiteurs d'autophagie
Natural killer (NK) cells are effectors of the antitumor immunity, able to kill cancer cells through the release of the cytotoxic protease granzyme B. NK-based therapies have recently emerged as promising anticancer strategies. However, it is well established that hypoxic microenvironment interferes with the function of antitumor immune cells and constitutes a major obstacle for cancer immunotherapies. Recent studies demonstrated that autophagy is an important regulator of innate immune response in this microenvironment, but the mechanism by which autophagy regulates NK cell-mediated antitumor immune responses remains elusive. Here, we demonstrate that hypoxia impairs breast cancer cell susceptibility to NK-mediated lysis in vitro via the activation of autophagy. This impairment was not related to a defect in target cell recognition by NK cells but to the degradation of NK-derived granzyme B in autophagosomes of hypoxic cells. Inhibition of autophagy by targeting beclin1 (BECN1) restored granzyme B levels in hypoxic cells in vitro and induced tumor regression in vivo by facilitating NK-mediated tumor cell killing. Together, our data highlight autophagy as a mechanism underlying the resistance of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis and provides a cutting-edge advance in our understanding of the underlying mechanism. This study might pave the way for the formulation of more effective NK cell-based antitumor therapies

La croissance tumorale peut être détectée et ralentie par le système immunitaire. Des cellules de l’immunité innée, comme les cellules NK et les cellules iNKT, ainsi que des cellules de l’immunité adaptative, comme les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques, sont capables de tuer les cellules tumorales et de coopérer pour éliminer une tumeur en développement. Leur action s’exerce également à travers leur sécrétion de cytokines comme l’IFN-. l’IFN- a des effets pléiotropes au sein du micro-environnement tumoral. Il augmente l’expression du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I à la surface des cellules tumorales, ce qui rend celles-ci plus sensibles à leur mort cellulaire induite par les lymphocytes T cytotoxiques. Il peut également réduire leur prolifération, induire directement leur mort ou même agir indirectement sur l’ensemmble du micro-environnement tumoral en réduisant l’angiogenèse. Malgré notre compréhension des effets de l’IFN-, nous ne connaissons pas bien son activité spatio-temporelle dans la tumeur. Durant mon doctorat, je me suis donc demandé si l’IFN- agissait spécifiquement dans des zones discrètes de la tumeur, situées autour des cellules immunitaires qui le produisent, ou s’il est capable de diffuser et d’agir d’une manière globale dans tout le micro-environnement tumoral. Je me suis aussi intéressé au temps d’exposition nécessaire à l’IFN- pour induire un changement fonctionnel et phénotypique important chez les cellules tumorales. J’ai pu montrer que, bien que produit localement par les lymphocytes T, l’IFN- possède une activité large au sein de la tumeur. En utilisant conjointement des approches de microscopie intravitale biphotonique et un reporter de la translocation nucléaire de STAT1, j’ai montré que la signalisation par l’IFN- se produisait à des endroits de la tumeur distants des sites de sécrétion par les lymphocytes T. Ces résultats suggèrent une diffusion importante de l’IFN- suite à sa sécrétion, qui aboutit à un champ cytokinique baignant l’ensemble de la tumeur. Enfin, mon travail a démontré qu’une exposition soutenue à l’IFN- était nécessaire pour que les cellules tumorales modifient leur fonction et phénotype
Tumor growth can be detected and restricted by the immune system. Innate immune cells, such as Natural Killer (NK) cells or invariant NK T (iNKT) cells, as well as adaptive immune cells such as cytotoxic CD8+ T cells, are able to kill tumor cells and cooperate towards tumor elimination. Their action can also be achieved through their secretion of cytokines like IFN-γ. IFN-γ has pleiotropic effects in the tumor microenvironment. It enhances Major Histocompatibility Complex (MHC) class I expression on tumor cells, which makes them more sensitive to T cell-mediated lysis. It can also reduce their proliferation or directly induce cell death but also act indirectly on the tumor microenvironment by reducing angiogenesis. Despite a good understanding of IFN-γ−mediated effects, little is known about its spatiotemporal activity in the tumor. During my Ph.D, I thus wondered whether IFN-γ specifically acted in discrete areas of the tumor around the immune cells that produce it, or whether it is able to diffuse and widely act in the whole tumor microenvironment. I also focused on understanding the duration to which tumor cells need to be exposed to IFN- γ in order for the cytokine to alter their function and phenotype. I was able to show that, despite being produced locally, T cell-derived IFN-γ had a broad bystander activity in the tumor. Using two-photon intravital imaging and a reporter of Signal Transducer and Activator of Transcription 1 (STAT1) nuclear translocation, I showed that IFN-γ signaling was occuring at distant sites from producing T cells. Those findings suggest an extensive diffusion of IFN- γ following its secretion which leads to a cyokine field bathing the entire tumor microenvironment Finally, my work demonstrated that sustained IFN-γ exposure is needed to alter tumor cell phenotype and functions

Une tumeur est un environnement complexe comprenant à la fois des composants immunitaires et non immunitaires. Dans notre équipe, nous avons démontré précédemment le rôle des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans les cancers du poumon, dans la génération de réponses anti-tumorales protectrices. Cependant, les tumeurs peuvent se développer en utilisant des mécanismes d’immunosuppression tels que l’infiltration des cellules T régulatrices (Tregs) dans le microenvironnement tumoral. Cette thèse a étudié le mécanisme présumé des Tregs dans la régulation des réponses immunitaires dans le cancer du poumon. Cette étude démontre la présence de Tregs FoxP3+ dans les TLS aussi bien que dans les autres régions tumorales. Les Tregs infiltrant la tumeur (Ti-Tregs) présentent un phénotype de lymphocytes T à mémoire centrale, et effecteur mémoire. Ces cellules expriment un vaste répertoire de molécules d’activation et de « chekpoints » immunologiques. L’analyse de l’expression des gènes et des résultats de cytométrie en flux a montré que les Tregs expriment des marqueurs de co-stimulation et de co-inhibition. Une forte densité de Ti-Tregs dans les TLS ou les autres régions tumorales, est associée à une faible survie des patients. Lorsqu’on combine ce résultat avec la densité de DC matures ou lymphocytes B associés aux TLS ou CD8+, un groupe de patients présentant de faible densités de ces cellules mais de fortes densités en Tregs a le pronostic le moins favorable avec le plus grand risque de décès. Les Tregs créent un environnement immunosuppresseur dans les cancers pulmonaires. Ce mécanisme pourrait être une explication de la réduction observée de la survie de ces patients
Tumor comprise complex niche of the immune and non-immune components. The complex interaction between the tumor cells with its environment turns into either eradication or the growth and metastasis of the tumors. We have previously demonstrated the role of TLS (tertiary lymphoid structures) in lung tumors, in protective anti-tumor responses. Despite of this, tumors do develop via exploiting the regulatory mechanisms, particularly includes, infiltration of the Tregs (regulatory T cells). The aim of thesis was to study the putative role of Tregs in regulating the immune responses in lung cancer. This study strongly demonstrates the presence of FoxP3+ Tregs in the TLS as well as non-TLS areas of the lung tumors. Tregs mainly exhibit central and effector memory phenotype expressing vast repertoire of the activation and immune checkpoint molecules. The gene expression and flow cytometry data showed that Tregs express the co-stimulatory and inhibitory markers which are known to be involved in the their activation and immune suppression. The high density of the Ti-Tregs either in TLS or in nonTLS areas is associated with the poor survival of the NSCLC patients. When combined with the density of TLS mature DC or B cells or CD8+ T cells, a group of patients with the low DC, B cells and CD8+ T cells but high Tregs densities, had the worst clinical outcome. This allowed, to identify the NSCLC patients with highest risk of death. Thus, it be concluded that the Tregs create the immunosuppressive environment in the lung tumors by acting in both TLS and nonTLS areas of the tumors and thus could be possible reason for the reduced survival of the lung cancer patients

Les nucléotides jouent un rôle majeur dans une pléiade de processus biologiques comme la composition des acides nucléiques, la signalisation, ou la régulation de la balance énergétique. Les nucléotides extracellulaires exercent également des fonctions biologiques. Par conséquent, des dérégulations des pools de nucléotides impactent l’homéostasie de multiples façons, par exemple en promouvant l’instabilité génétique ou un environnement immunosuppresseur. Or, ces paramètres font partie des « Hallmarks du Cancer » décrits par Hanahan et Weinberg. Ces observations confirment l’éventualité d’un rôle clé des nucléotides dans le cadre du cancer.cN-II et CD73 sont des 5’-nucléotidases impliquées respectivement dans les métabolismes nucléotidiques intra- et extracellulaire. Elles sont de nouvelles cibles thérapeutiques en oncologie. Cependant, leurs rôles dans la biologie de la cellule cancéreuse, ou le possible impact de leur utilisation en tant que cible thérapeutique sur le comportement des cellules tumorales sont peu connus. Considérant l’implication de ces enzymes dans les métabolismes nucléotidiques, nous avons enquêté sur les modifications de l’agressivité de la cellule cancéreuse ou sur sa capacité à interagir avec son microenvironnement, dans le cas d’une invalidation ou une diminution d’expression de cN-II et/ou CD73. cN-II semble donc impliquée dans l’adaptabilité métabolique et la combinaison des invalidations de cN-II et CD73 est associée à une modification d’expression d’enzymes du métabolisme du glucose. CD73 peut aussi moduler l’expression de gènes de la migration cellulaire. cN-II est impliquée dans la migration cellulaire, via l’axe COX-2/PGE2, et dans la sensibilité à des agents modulant ce paramètre. Ces caractéristiques sont plus marquées en association avec une invalidation de CD73. Ici, cN-II et CD73 ne semblent pas jouer de rôle dans la prolifération ou le dialogue avec une sous-population de cellule de l’immunité innée
Nucleotides play a major role in nucleic acids constitution and are involved in various cell phenomena. Indeed, intracellular ATP, GTP, AMP, GMP and their cyclic forms are components of cell signaling and define the energetic balance. Extracellularly, they also play multiple roles. Thus, when nucleotide pools are deregulated various processes are impacted. For example, a low availability of nucleotides supports genetic instability and aberrant levels of extracellular adenosine can lead to an immunosuppressive microenvironment. Interestingly, the cited parameters are among the Cancer Hallmarks described by Hanahan and Weinberg. These observations confirm the possibility of a key role of these molecules in this pathology. cN-II and CD73 are 5’-nucleotidases, involved in intra- and extracellular nucleotide metabolism respectively and have been identified as possible targets for new anti-cancer therapies. Nevertheless, very little is known about their biological roles on cancer cells and what parameters of cell biology could be impacted by such strategies. Considering the involvement of these purines in cell metabolism, we wondered what changes a decrease in cN-II and/orCD73 expressions or their silencing could trigger in cancer cells as well as in the interplay with their microenvironment.We studied cancer cell aggressiveness and the interplay with innate immune cells under cN-II and CD73 modulations. We observed that cN-II is involved in metabolic adaptability. The association of cN-II and CD73 invalidations results in glucose-metabolism-related gene modifications. CD73 can regulate migration-related genes expression but does not affect the process. cN-II is also involved in cell migration, via the COX-2/PGE2 axis. Again, these characteristics are accentuated when associated with CD73 deficiency. Here, cN-II and CD73 do not seem to be involved in cancer cell proliferation or in their interplay with a subset of innate immune cells