Dissertationen zum Thema „Microenvironnement tumoral immun“

Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) répondent mal à l’immunothérapie et leur environnement immun n’est pas bien caractérisé. Notre objectif était de faire le pont entre les aspects morphologiques, viraux et immuns et analyser leur impact sur la sensibilité à l’immunothérapie. Nous avons réalisé une analyse transcriptomique de l’environnement immun de 170 CHC: 23% d’étiologie virale B (VHB), 29% d’étiologie virale C (VHC), 16% d’étiologie métabolique, 17% d’étiologie alcoolique, 14% d’étiologie indéterminée. Nous avons corrélé les profils transcriptomiques aux données cliniques, morphologiques et virales (ARN prégénomique du VHB). Nous n’avons pas observé de différence globale dans l’environnement immun des CHC en fonction des étiologies, mais avons identifié 3 clusters du VHB donc aucun n’exprimait d’interféron-γ (contre 25% des CHC toutes étiologies confondues). Le Cluster 1, associé à une récurrence élevée, avait un profil immun ambivalent et chaud, surexprimait des marqueurs d’épuisement mais montrait morphologiquement une faible densité de lymphocytes T et était associé à la présence d’une transcription du VHB. Le Cluster 2, aussi associé à une récurrence élevée, était enrichi en sous-type macrotrabéculaire et avait profil immun froid. Le Cluster 3, de meilleur pronostic, était plus développé sur foie cirrhotique et montrait un niveau intermédiaire d’infiltration de cellules immunes, sans expression de marqueurs d’épuisement. En conclusion, nous montrons des spécificités immunes au sein des CHC liés à l’HBV, en relation avec des facteurs viraux transcriptionnels, et avec une portée pronostique
Hepatocellular carcinoma (HCC) shows globally low response to immunotherapy and HCC immune microenvironment is not well characterized. Our objective was to connect immune, viral and morphologic aspects of HCC and understand how they intervene in sensitivity to immune checkpoint blockade. In this study, we performed a transcriptomic analysis of onco-immune genes to characterize the tumor microenvironment of 170 HCC: 23% hepatitis B (HBV), 29% hepatitis C (HCV), 16% metabolic syndrome, 17% alcohol consumption related, and 14% of undetermined etiology. We correlated gene expression profiles with clinical, morphological and viral features. We did not observe difference of immune microenvironment at a global scale, between etiologies. But within HBV group, we identified 3 Clusters. None of of these clusters expressed ϒ-interferon (compared to 25% of HCC of all etiologies combined). Cluster 1 showed an ambivalent « hot » and exhausted profile with higher expression of exhaustion markers but lower densities of T lymphocytes by immunostaining. This Cluster was associated with HBV transcription and patients from this Cluster showed higher recurrence. Cluster 2 was enriched with macrotrabecular massive subtype and was immunologically “cold” and was also associated with higher recurrence. At last, Cluster 3 was developed much more on cirrhotic liver and showed an intermediate level of immune cells infiltration, with no marker of exhaustion. It was associated with lower recurrence. In conclusion we highlight viral related specificities within HBV HCC, associated with prognostic significance

Les tumeurs rhabdoïdes (TR) constituent un rare cancer indifférencié du jeune enfant et du nourrisson, avec un âge médian au diagnostic de 20 mois. Ces tumeurs sont caractérisées par une inactivation biallélique du gène suppresseur de tumeur SMARCB1, un des membres du complexe SWI/SNF, acteur majeur du remodelage de la chromatine, sans autre altération génomique récurrente. Le pronostic des TR est péjoratif, le taux de survie globale atteignant 30% dans la plupart des séries, malgré des approches thérapeutiques conventionnelles particulièrement agressives. Les approches d’immunothérapies ont obtenu un succès certain dans certains cancers de l’adulte, et récentes analyses de l’infiltrat immun des cancers pédiatriques ne montrent pas un fort taux de tumeurs infiltrées à l’exception de rare types de cancers dont les TR intracrâniennes. Nous avons donc procédé à une analyse multimodale de l’infiltrat immun de cohortes de patients ainsi que d’un modèle de TR murines établi dans notre laboratoire. Nous avons identifié une forte proportion de tumeurs infiltrées dans certains sous-groupes de TR. Cet infiltrat était composé à la fois de cellules myéloïdes incluant des populations au phénotype immunosuppresseur, et lymphocytaires T notamment de phénotype résident mémoire caractérisées par une forte expansion clonale probablement spécifique d’un antigène tumoral. Nous avons identifié des cibles thérapeutiques communes aux tumeurs humaines et au modèle murin syngénique, et trouvé que cibler l’infiltrat lymphocytaire T ou myéloïde était susceptible d’induire une réponse tumorale complète avec induction d’une mémoire immunitaire, confirmant le caractère immunogénique des TR, et apportant de nouvelles stratégies thérapeutiques utiles en clinique. Enfin, nous avons identifié que les TR étaient le site d’une réexpression de rétrovirus endogènes, dépendante de celle de SMARCB1, avec activation des voies de l’interféron, apportant une base à une immunogénicité des TR issue du génome non codant
Rhabdoid tumors (RT) are highly undifferentiated cancers occurring in infancy and early childhood, with a median age at diagnosis about 20 months. These tumors are characterized by the biallelic inactivation of SMARCB1 tumor suppressor gene, core member of the SWI/SNF complex, one major chromatin remodeling actor, in an otherwise highly stable genome. The prognosis of RT is dismal with overall survival hardly reaching 30% in most series, despite particularly aggressive conventional treatment. Immunotherapy approaches has gained a striking success within some adult cancer types and recent analyses of immune cell content of pediatric cancers don’t reveal a high rate of infiltrated tumors, except in few tumor types such as intracranial rhabdoid tumors. Then, we conducted a comprehensive analysis of the immune context of both human RT cohorts and a mouse RT model, including at single cell level. We identified a high recurrence of infiltrated tumors, in a RT-subgroup related manner, composed of both myeloid cells including cells with immune suppressive phenotypes, and T cells with notably a tissue resident memory phenotype demonstrating a high clonal expansion highly suggestive of immunogenicity. We identified common targetable immune populations between human and mouse RTs, and found that targeting both T and myeloid infiltrating cells was able to induce complete anti-tumor response with induced memory, confirming the immunogenic properties of RTs, and identifying new therapeutic strategies of clinical relevance. We finally identified that RTs were the site of SMARCB1-dependent endogenous retroviruses reexpression, with subsequent activation of interferon signaling, likely triggering the immune response in the context of RT, and providing a basis of non-coding genome-driven immunogenicity for these tumors

Les Formes réactives de l’oxygène (FRO) ont un rôle bien établi dans l’oncogénèse en augmentant les capacités de prolifération et d’invasion des cellules tumorales. Mais les FRO exercent aussi un effet important sur le microenvironnement tumoral, en particulier en participant à l’échappement des tumeurs au système immunitaire. Une modulation pharmacologique de l’équilibre oxydo-réductif tumoral est donc susceptible d’influencer la progression tumorale. Il a été montré que l’induction pharmacologique d’un stress oxydant dans les cellules tumorales peut induire un effet cytotoxique mais ses effets sur le microenvironnement sont moins bien connus. L’objectif de nos travaux était d’étudier l’effet d’une modulation du stress oxydant sur les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral et in fine de préciser les conséquences potentielles sur la progression tumorale. L’arsenic trioxyde (As2O3), inducteur de FRO, présentait à faible dose, dénuée d’effet cytotoxique direct sur les cellules malignes, un effet antitumoral dans un modèle de cancer colique murin. Cet effet était lié à une déplétion sélective en lymphocytes T régulateurs (Tregs) et était médié par la génération d’anions superoxyde (O2°-) et de monoxyde d’azote (NO), eux même responsables de la formation de peroxynitrite. Les Tregs présentaient un niveau basal de FRO plus élevé que les autres populations lymphocytaires, qui pourrait expliquer leur plus grande sensibilité à un surcroît de stress oxydant induit par l’As2O3. Un cytotoxique antitumoral, la vinorelbine, s’est également montré capable d’exercer un effet sur le microenvironnement tumoral. Par co-cultures, nous avons montré que la vinorelbine induisait un effet bystander toxique sur les cellules immunitaires effectrices voisines des cellules tumorales. In vivo, le prétraitement par vinorelbine de cellules malignes implantées à la souris était responsable d’une perte de la réactivité anti-tumorale des cellules mono-nuclées. Cet effet était dépendant de la production d’O2°- et de NO par les cellules malignes. Un modulateur du stress oxydant, le mangafodipir, inhibait cet effet, permettant ainsi de restaurer la réponse immunitaire antitumorale locale. Notre travail a donc permis de mettre en évidence que des modulateurs du stress oxydant peuvent agir sur le microenvironnement, et spécialement sur les cellules immunitaires. Ils pourraient être utilisés en clinique pour restaurer la réponse immunitaire antitumorale. Une meilleure compréhension du rôle du stress oxydant dans la défaillance de l’immunité antitumorale est nécessaire
Several reports have demonstrated the involvement of reactive oxygen species (ROS) in carcinogenesis, through promotion of cancer cell proliferation and invasion. But ROS could also have consequences on non cancerous cells which are part of the tumor microenvironment, such as immune cells. Therefore, a pharmacological modulation of oxidative stress can induce a cytotoxic effect on tumor cells but its consequences on microenvironment are unknown. The aim of our studies was to evaluate the effects of a pharmacological modulation of oxidative stress on immune cells from the tumor microenvironment. At low dose, Arsenic trioxide (As203), an oxidative stress modulator, was shown to exert antitumor effects in colon tumor-bearing mice. We observed that this effect was related to As203-induced regulatory T cells (Tregs) -selective depletion in vitro and in vivo and was mediated by oxidative and nitrosative bursts. The differential effect of As203 on Tregs versus other CD4 cells was related to difference in the cells’redox status. We also observed that vinorelbine, an anticancer agent, could interfere with the antitumor immune response. We showed that vinorelbine could alter the function of immune cells surrounding tumor cells by a bystander toxic effect against tumor effector cells. In vivo experiment in A549 tumor bearing nude mice showed that adoptive transfer of A549 immune splenocytes was not able to delay tumor growth when vinorelbine-pretreated A549 cells were used for immunization. This effect was mediated by ROS and was inhibited by an oxidative stress modulator, mangafodipir, which restored antitumor immune function. Therefore, our work showed that oxidative stress modulators can influence tumor microenvironment and more specifically, immune cells. They could be used to restore antitumor immune response

L’immunothérapie est une avancée majeure dans le traitement des cancers, même s’il reste fondamental d’identifier de nouvelles cibles pour optimiser la réponse anti-tumorale. Des enzymes impliquées dans le métabolisme d'acides aminés ont été décrites comme pouvant inhiber ces réponses immunitaires et ainsi favoriser la progression tumorale. Elles sont donc devenues des cibles thérapeutiques de premier choix. L’IL-4 induced gene 1 (IL4I1) est une phénylalanine oxydase qui, au cours de cette dernière décennie, s’est dévoilée dans la littérature comme un véritable outil de la tolérance périphérique. Ses fonctions restent cependant largement inexplorées. Au cours de ma thèse, j’ai étudié les propriétés immunorégulatrices de l’IL4I1 en contexte tumoral dans un modèle de mélanome spontané (souris Ret), mais également dans la physiologie des lymphocytes B (LB). Dans un premier temps, mes résultats mettent en avant que l’activité enzymatique de l’IL4I1 dans les rates des souris Ret est corrélée avec la sévérité de la maladie. De façon intéressante, l’inactivation génétique de l’IL4I1 dans ce modèle (RetIL4I1KO) retarde le développement de la tumeur primaire, mais aussi la dissémination métastatique. Nous démontrons que l’IL4I1, principalement exprimée par les cellules myéloïdes, a la capacité de façonner la composante immunitaire du microenvironnement tumoral, et ce, par le recrutement préférentiel de cellules myéloïdes au détriment d’effecteurs lymphocytaires T. Par ailleurs, mes données chez les souris déficientes pour l’IL4I1 (IL4I1KO) ont mis en évidence un rôle crucial de l’IL4I1, régulant de nombreuses étapes de la biologie des LB. Les souris IL4I1KO présentent une sortie accélérée des LB de la moelle osseuse, entraînant l'accumulation de LB folliculaires en périphérie. Ces souris ont un taux sérique élevé d'immunoglobulines naturelles et des anticorps auto-réactifs. Nous démontrons aussi que l’IL4I1 contrôle la réaction du centre germinatif, la différenciation des plasmocytes et la production d'anticorps spécifiques en réponse à une immunisation par un antigène T-dépendant. In vitro, l’absence de l’IL4I1 dans les LB augmente l’activation des voies de signalisation en aval du récepteur à l’antigène des LB (BCR), ainsi que leur prolifération. Par conséquent, nos résultats révèlent une propriété clé de l’IL4I1, contrôlant négativement l'activation dépendante du BCR. Compte tenu de l’effet majeur de l’IL4I1 sur la biologie des LB, il reste important d’investiguer si l’hyperréactivité du BCR des LB déficients pour l’IL4I1 participe au meilleur contrôle de la progression tumorale
Immunotherapy is one of the most promising advance in cancer treatments. It remains essential to identify new targets to maximize the anti-tumor immune response. Enzymes involved in amino acid metabolism have been described to impede these responses and thus promote tumor progression. They became good therapeutic targets. IL-4-induced gene 1 (IL4I1) is a phenylalanine oxidase which, over the last decade, was unveiled as a real tool for peripheral tolerance. However its functions remain largely unexplored. During my PhD thesis, I studied the immunoregulatory properties of IL4I1 in a tumoral context involving a spontaneous melanoma model (Ret mice), but also in the B cell physiology. First, my results highlight that the IL4I1 enzymatic activity is positively correlated with disease aggressiveness in the spleen of Ret mice. Interestingly, genetic inactivation of IL4I1 in this model (RetIL4I1KO) delayed the development of both primary tumor and metastatic dissemination. We demonstrate that IL4I1, mainly expressed by myeloid cells, has the ability to shape the immune compartment within the tumor microenvironment, through recruitment of myeloid cells instead of activated T cells. Furthermore, my data in mice deficient for IL4I1 (IL4I1KO) have emphasized a crucial role of IL4I1 in regulating many steps of B cell biology. Indeed, IL4I1KO mice exhibit an accelerated B cell egress from the bone marrow, resulting in the accumulation of peripheral follicular B cells. These mice have a high serum level of natural immunoglobulins and auto-reactive antibodies. We also demonstrate that IL4I1 controls the germinal center reaction, plasma cell differentiation and specific antibody production in response to a T-dependent antigen immunization. In vitro, the absence of IL4I1 in B cells increases their proliferation and the activation of signaling pathways upon B cell receptor (BCR) engagement. Thus, our results reveal a key role of IL4I1, which negatively controls the BCR-dependent activation. Regarding these effects of IL4I1 on B cell biology, it remains important to evaluate whether the BCR-dependent hyperreactivity in IL4I1KO mice contributes in the tumor control

Le cancer colorectal est une maladie grave et fréquente, pour laquelle la survie s'est considérablement améliorée du fait de l'essor des thérapeutiques et des stratégies de combinaisons médico-chirurgicales, même en situation métastatique. C'est également une entité hétérogène, pour laquelle la personnalisation de la prise en charge reste réduite, de par l'absence de scores pronostiques ou prédictifs utilisés en routine et guidant les pratiques. Les classifications moléculaires établies n'ont pas de caractère prédictif et semblent inadaptées au stade métastatique, mais elles peuvent apporter de l'aide à la meilleure compréhension de la biologie des cancers colorectaux et de leur microenvironnement. L'utilisation de tests sériques récapitulant les caractéristiques de la tumeur serait probablement plus simple et moins couteux. La recherche de biomarqueurs résumant les caractéristiques de la tumeur, et guidant les traitements, est donc un enjeu majeur.Ce travail de thèse a porté sur l'étude de l'Angiopoietine 2, de la signature génique et protéique qui lui est associée, et sur l'analyse du microenvironnement et de la réponse immunitaire périphérique Th1 chez des patients atteints d'un cancer colorectal.La première partie du travail a consisté à étudier la valeur pronostique de l'Angiopoietine 2 au sein d'une cohorte de patients atteints d'un cancer colorectal métastatique. Un seuil discriminant de l'Angiopoietine 2 a été établi, définissant les patients de mauvais pronostic, indépendamment associé à la survie globale. Ce dosage améliorait la capacité discriminante de scores pronostiques classiques. La seconde partie du travail a consisté à identifier, à partir de bases de données transcriptomiques, les caractéristiques des patients porteurs de cancer colorectaux et surexprimant l'Angiopoietine 2. Les voies de signalisation et les gènes associés à cette entité de tumeur ont été analysés, pour mieux comprendre les éléments qui confèrent un mauvais pronostic, et pour définir des candidats, protéines sécrétées, pouvant être dosées chez les patients. Une signature génique puis sérique a été élaborée, reflétant le stroma l'angiogenèse l'invasion et la chimiorésistance. Le dosage des marqueurs ANGPT2, CD138 et STC1 sur une cohorte de patients a confirmé l'association de ces biomarqueurs au caractère de chimiorésistance. Cette signature associée aux tumeurs surexprimant l'Angiopoietine 2 est inversement corrélée à la réponse immunitaire dans les premières approches réalisées. Ceci nous a incité à étudier l'effet de la réponse immunitaire périphérique CD4 de type Th1 anti télomérase, COA1 et mésothéline, sur la survie globale des patients atteints de cancers colorectaux métastatiques. L'étude sérique de l'Angiopoietine 2 y a été associée. Nous avons ainsi validé des données récemment publiées dans d'autres localisations tumorales, attestant de la valeur pronostique de la réponse immunitaire périphérique, sur la survie globale pour les cancers du côlon métastatiques (étude prospective Epitopes-CRC02). Une corrélation inverse entre réponse immunitaire CD4 de type Th1 et l'ANGPT2 a été confirmée.Ces travaux ouvrent la voie sur le ciblage spécifique des tumeurs présentant la signature Angiopoietine 2 de chimiorésistance et de stroma abondant, par une approche combinatoire associant des thérapeutiques ciblant le microenvironnement tumoral. Un monitoring est également réalisable pour accompagner ces futurs projets de recherche, et les modèles pronostiques à venir intégreront ces données au sein des tests de survie multi-paramétriques
Colorectal cancer (CRC) is a severe and frequent disease, with important survival improvement due to therapeutic new approaches and surgical methods, even in metastatic setting. It is an heterogeneous entity, and personalized strategies are mandated, whereas few predictive and prognostic biomarkers are available in practical care. Molecular classifications are useful to better understand CRC biological characteristics, but they do not have predictive values, and seem to be inadequate for metastatic setting. Seric biomarkers are attractive since they could recapitulate tumor features, while being simpler and less expansive. There is a need to investigate surrogacy biomarkers illustrating intra tumoral microenvironment, in order to adapt treatment strategies.This thesis is about the clinical and molecular characterization of Angiopoietin 2 (ANGPT2) associated colorectal cancer. Assessment of microenvironment and peripheral immune Th1 response are performed and correlated with this entity.Prognostic value of ANGPT2 in metastatic colorectal cancer was studied in the first part of the manuscript. We described that ANGPT2 plasmatic levels were associated with a worst overall survival in metastatic setting. In the second part, using the open source transcriptomic tools, we decided to define the specific molecular signaling pathways correlated to ANGPT2 expression in CRC and its prognostic value in localized CRC. A specific signature was drawn, combining genes associated with stroma, invasion, angiogenesis, and chemo-resistance. Looking for associated secreted proteins, we could identify a seric signature (combining STC1, CD138 and ANGPT2), predictive for chemo-resistance. An negative correlation was observed between ANGPT2 signature and immune response. The last part of the thesis then explored the prognostic value of anti TERT peripheral immune Th1 response in metastatic colorectal cancer (Epitopes-CRC02 study), and validated its beneficial role for predicting OS. A negative correlation was confirmed, in seric measurement between CD4 immune response and ANGPT2.This work paves the way for individualized treatments in tumors harboring ANGPT2 associated characteristics', targeting the stromal and immune microenvironment. This immune and stromal biomonitoring is feasible and have to be associated to futures clinical studies. Future prognostic scores should probably assess the place of these biomarkers in order to improve their discriminant values

Article 1 : Inhibiteurs de points de contrôle dans le carcinome rénal papillaire métastatique : le carcinome papillaire à cellules rénales (pRCC) est le CCR à cellules non claires (nccRCC) le plus courant et une entité distincte, bien qu'hétérogène, associée à de mauvais pronostics. Le paysage thérapeutique du pRCC métastatique (mpRCC) reposait jusqu'à présent sur des thérapies ciblées, imitant les développements antérieurs dans le carcinome rénal métastatique à cellules claires. Cependant, les antiangiogéniques ainsi que les inhibiteurs de mTOR ne conservent qu'une activité limitée dans le mpRCC. Alors que le développement d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) est actuellement en cours chez les patients atteints de mpRCC, notre objectif était de discuter des données d'activité précoces et du potentiel de futures stratégies thérapeutiques en monothérapie ou en association. L'expression de points de contrôle immunitaires tels que PD-L1 et de cellules immunitaires infiltrantes dans le pRCC pourrait fournir des informations sur leur immunogénicité potentielle, bien que celle-ci soit actuellement mal décrite. Sur la base de données rétrospectives et prospectives, l'efficacité de l'ICI en monothérapie reste limitée. Les associations avec des inhibiteurs de la tyrosine-kinase, notamment avec des inhibiteurs anti-MET, présentent des taux de réponse prometteurs et pourraient entrer dans la norme de soins chez les patients non traités. Un travail collaboratif est nécessaire pour affiner le paysage moléculaire et immunitaire du pRCC et poursuivre les efforts visant à mettre en place des essais cliniques prédictifs basés sur des biomarqueurs dans ces tumeurs rares.Article 2 : Analyses complètes du microenvironnement tumoral immunitaire dans le carcinome papillaire à cellules rénales. Contexte : le carcinome papillaire à cellules rénales (pRCC) est le CCR à cellules non claires (nccRCC) le plus courant et associé à de mauvais résultats dans le contexte métastatique. Dans cette étude, nous avions pour objectif d'évaluer de manière exhaustive le microenvironnement tumoral immunitaire (TME), largement inconnu, des patients atteints de pRCC métastatique et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Méthodes : nous avons effectué une analyse quantitative de l'expression génique du TME en utilisant la méthodologie du compteur MCP, sur 2 cohortes indépendantes de pRCC localisés (n=271 et n=98). Nous avons ensuite caractérisé le TME, en utilisant l'immunohistochimie (n = 38) et le séquençage d'ARN (RNA-seq) (n = 30) sur des pRCC métastatiques de la cohorte prospective de l'essai AXIPAP. Résultats : le clustering non supervisé a identifié 2 « sous-types de TME » dans chacune des cohortes : le « immuno-enrichi » et le « immuno-faible ». Au sein de la cohorte de l'essai AXIPAP, le cluster « immuno-enrichi » était significativement associé à un plus mauvais pronostic. selon la médiane de survie globale à 8 mois (IC95%, 6-29) versus 37 mois (IC95%, 20-NA, p=0,001). Les 2 signatures immunitaires, Teff et JAVELIN Renal 101 Immuno signature, prédictives de La réponse aux inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (IPC) dans le ccRCC était significativement plus élevée dans le groupe « enrichi sur le plan immunitaire » (p < 0,05 ajusté). Enfin, 5 gènes différentiellement surexprimés ont été identifiés, correspondant principalement aux populations de lymphocytes B. Conclusion : pour la première fois, en utilisant RNA-seq et IHC, nous avons mis en évidence un sous-type immunitaire TME spécifique du pRCC métastatique, significativement plus infiltré par la population T et Bimmune. Ce groupe « immunoenrichi » semble avoir un pronostic plus défavorable et pourrait avoir une valeur prédictive potentielle de réponse à l’immunothérapie, justifiant la confirmation de ces résultats dans une cohorte de pRCC métastatiques traités par CPI et en association avec des thérapies ciblées
Article 1: Checkpoint inhibitors in metastatic papillary renal cell carcinoma : papillary Renal Cell Carcinoma (pRCC) is the most common non-clear cell RCC (nccRCC) and a distinct entity, although heterogenous, associated with poor outcomes. The treatment landscape of metastatic pRCC (mpRCC) relied so far on targeted therapies, mimicking previous developments in metastatic clear-cell renal cell carcinoma. However, antiangiogenics as well as mTOR inhibitors retain only limited activity in mpRCC. As development of immune checkpoint inhibitors (ICI) is now underway in patients with mpRCC, we aimed at discussing early activity data and potential for future therapeutic strategies in monotherapy or combination. Expression of immune checkpoints such as PD-L1 and infiltrative immune cells in pRCC could provide insights into their potential immunogenicity, although this is currently poorly described. Based on retrospective and prospective data, efficacy of ICI as single agent remains limited. Combinations with tyrosine-kinase inhibitors, notably with anti-MET inhibitors, harbor promising response rates and may enter the standard of care in untreated patients. Collaborative work is needed to refine the molecular and immune landscape of pRCC, and pursue efforts to set up predictive biomarker-driven clinical trials in these rare tumors. Article 2 : Comprehensive analyses of immune tumor microenvironment in papillary renal cell carcinoma. Background : papillary Renal CellCarcinoma (pRCC) is the most common non-clear cell RCC (nccRCC), and associated with poor outcomes in the metastatic setting. In this study, we aimed to comprehensively evaluate the immune tumor microenvironment (TME) ,largely unknown, of patients with metastatic pRCC and identify potential therapeutic targets. Methods : we performed quantitative gene expression analysis of TME using MCP-counter methodology, on 2 independent cohorts of localized pRCC (n=271 and n=98). We then characterized the TME, using immunohistochemistry (n=38) and RNA-sequencing (RNA-seq) (n=30) on metastatic pRCC from the prospective AXIPAP trial cohort. Results: unsupervised clustering identified 2 "TME subtypes", in each of the cohorts : the “immune-enriched” and the “immune-low”.Within AXIPAP trial cohort, the “immune-enriched” cluster was significantly associated with a worse prognosis according to the median overall survival to 8 months (95%CI, 6-29) versus 37 months (95%CI, 20-NA,p=0.001).The 2 immune signatures, Teff and JAVELIN Renal 101 Immuno signature, predictive of response to immune checkpoint inhibitors (CPI) in ccRCC, were significantly higher in the “immune-enriched” group (adjusted p<0.05). Finally, 5 differentially overexpressed genes were identified, corresponding mainly to B lymphocyte populations. Conclusion : for the first time, using RNA-seqand IHC, we have highlighted a specific immune TME subtype of metastatic pRCC, significantly more infiltrated with T and Bimmune population. This “immune-enriched” group appears to have a worse prognosis and could have a potential predictive value for response to immunotherapy, justifying the confirmation of these results in a cohort of metastatic pRCC treated with CPI and incombination with targeted therapies

Au cours de la réponse immunitaire antitumorale, l’instabilité génétique des tumeurs combinée à la pression de sélection du système immunitaire peut conduire, via l’immunoediting, à l’émergence de variants tumoraux résistants à la lyse par les effecteurs cytotoxiques. Une meilleure compréhension de ces mécanismes potentiellement impliqués dans la susceptibilité tumorale à la lyse naturelle et/ou spécifique pourrait permettre le développement de stratégies d’immunothérapie intégratives plus efficaces. Dans ce cadre nous avons étudié un modèle de résistance à la lyse spécifique impliquant un remaniement du cytosquelette d’actine (i). Nous avons pu mettre en évidence que l’inhibition conjointe de protéines interagissant avec l’actine (caldesmone, ézrine, radixine et moésine) générait une réduction de la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs). Parallèlement, nous avons identifié les microARNs différentiellement exprimés entre le variant résistant et la lignée parentale et étudié leur implication dans la susceptibilité tumorale à la lyse par les CTLs. Dans le but de déterminer le rôle d’une pression de sélection par les cellules tueuses naturelles (NK pour Natural Killer), de l’immunité innée, sur les cellules tumorales et l’émergence de variants résistants, nous avons aussi établi un modèle de coculture continue de cellules tumorales de mélanomes avec des cellules NK (ii). Les cellules tumorales obtenues sont résistantes à la lyse NK (mais toujours sensibles à la lyse spécifique par un clone lymphocytaire T cytotoxique) et établissent moins de contact et de synapse immunologique avec les cellules NK que la lignée parentale. L’analyse transcriptomique a révélé la baisse d'expression de B7-H6 (ligand d'un récepteur activateur des cellules NK) qui contribue partiellement au phénomène de résistance. De nombreux gènes impliqués dans les phénomènes de migration/invasion/adhérence sont également modulés et certaines propriétés cellulaires (croissance en milieu semi-solide, adhérence, migration) semblent refléter l’acquisition d’une agressivité tumorale accrue suite à la coculture. Nous avons finalement analysé l’impact sur la réponse antitumorale de la connexine-43, impliquée dans la formation des jonctions communicantes (GJ pour Gap Junction) (iii). Nous avons montré que sa présence à la synapse entre cellules tumorales et CTL n'exerce aucun impact sur la susceptibilité à la lyse. Néanmoins, les GJs sont impliquées dans l’émergence par stimulation antigénique de lymphocyte T CD8+ spécifique hautement réactif
During antitumor immune response, cancer cells genetic instability combined with immune system selective pressure may drive to the emergence of tumor variant resistant to lysis by cytotoxic effector cells through a phenomenon called immunoediting. A better understanding of those mechanisms putatively involved in tumor susceptibility to natural and/or specific lysis would enable new integrative and more effective immunotherapeutic strategies. In this context, we studied a model of resistance to specific lysis linked to actin cytoskeleton remodeling (i). We showed that combined inhibition of actin interacting protein (caldesmone, ezrin, radixin and moesin) reduced tumor cells susceptibility to cytotoxic T lymphocytes (CTLs) lysis. Moreover, we identified microRNAs differentially expressed between parental cell line and resistant variant and are currently studying their impact on tumor susceptibility to CTLs lysis. In order to depict the role of innate immunity Natural Killer (NK) cells selective pressure, on tumor cells and on the emergence of resistant variants, we also established a maintained coculture model of melanoma cells with NK cells (ii). Selected cells obtained were resistant to NK cells-mediated lysis (but still susceptible to CTLs-mediated specific lysis) and formed less contact and immune synapse with NK cells than parental cell line. Transcriptomic analysis revealed the reduced expression of B7-H6 (ligand of an NK cells activating receptor) partially contributing to the resistance phenotype. The expression of several genes involved in migration/invasion/adhesion is also modulated and some cell characteristics (cell growth in semi-solid medium, adhesion, migration) tend to reflect the acquisition through coculture of an increased aggressiveness. Finally, we evaluated the impact of connexin-43 (Cx43), involved in the establishment of Gap Junctions (GJs), on antitumor response (iii). We showed that despite localization at the immune synapse between tumor target cell and CTL, Cx43 and GJs do not modulate susceptibility to CTL-mediated specific lysis. Nevertheless, GJs contribute to the emergence of highly reactive specific CD8+ T lymphocytes following antigen stimulation

Le cancer du sein est une maladie impactant le système immunitaire dont le rôle évolue au cours de la tumorigénèse, allant de la détection et l'élimination des cellules transformées (immunosurveillance) à la promotion du développement tumoral (immunosubversion). Les efforts déployés pour définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ont révélé que rétablir l'immunité anti-tumorale chez les patientes permettrait d'améliorer leur pronostic. Durant ma thèse, nous avons mis en évidence l'existence de signaux activateurs et inhibateurs des pDC dans les cancers du sein, qui confèrent aux pDC un rôle dans l'immunosurveillance et dans l'échappement immunitaire du cancer du sein respectivement. Nous avons ainsi montré que le TGF-beta et le TNF-alpha sont impliqués dans l'inhibition fonctionnelle des TApDC en réprimant l'expression et l'activation d'IRF-7. Dans un second temps, nous avons montré i) la présence de complexes [ADN-LL37] produits par les neutrophiles dans les tumeurs et capables d'induire la production d'IFN-alpha par les pDC, ii) l'expression des gènes associés aux IFN-I dans les tumeurs de sein et iii) un rôle majeur de la voie des IFN-I dans l'immunosurveillance des tumeurs mammaires chez la souris. De plus, des données préliminaires chez la souris suggèrent que les pDC participent à l'immunosurveillance anti-tumorale in vivo. Les travaux présentés dans ce manuscrit apportent de nouvelles données sur le rôle des pDC dans l'immunosurveillance des cancers du sein et ouvrent sur de nouvelles stratégies d'immunothérapie anti-tumorale ciblant les pDC
Breast cancer are disease impacting immune system whose play role during tumorigenesis, to detect and eliminate malign cells (immunosurveillance) or promote tumoral development (immunosubversion). Efforts to define new therapeutic strategies revealed that restoring anti-tumor immunity in patients would improve their prognosis. During my thesis, first, we demonstrated the existence of stimulatory and inhibitory signals of pDCs in the breast, which give the pDCs a role in immunosurveillance and immune escape of breast cancer, respectively. We showed that TGF-beta and TNF-alpha are involved in the functional inhibition of TApDC repressing IRF-7 expression and activation. Secondly, we showed i) the presence of [DNA LL37] complex produced by neutrophils in tumors that can induce the production of IFN-alpha by pDCs, ii) the expression of type I IFN associated genes in breast tumors and iii) a major role of IFN-I pathway in immunosurveillance of mammary tumors in mice. In addition, in mice, preliminary data suggest that pDC could play a role in anti-tumor immunosurveillance in vivo. The work presented in this thesis provide new data on the role of pDCs in immunosurveillance of breast cancers, and open new anti-tumor immunotherapy strategies targeting pDCs

L’étiologie des cancers cutanées est liée à des mutations génétiques résultant de l’exposition aux rayonnements ultraviolets (UV) émis par le soleil. La propagation des cellules cancéreuses dépend aussi des interactions avec les cellules présentes dans le microenvironnement circulant, notamment des fibroblastes associés au cancer (FAC) et des cellules immunitaires. Xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique qui comprend 7 groupes de complémentation génétique (XP-A à XP-G). Les patients XP présentent une déficience du mécanisme de réparation des lésions de l’ADN provoquées par les UV. Ces patients sont susceptibles au développement précoce de très nombreux cancers cutanées. XP-C est le groupe de complémentation le plus représenté en Europe. Chez ces patients, les carcinomes spino-cellularies (CSC) sont plus fréquents que les carcinomes baso-cellulaires (CBC) (taux 5 : 1). Les CSC ont un potentiel métastatique plus élevé que les CBC. Des travaux précédents ont suggéré que la réponse immunitaire chez les patients XP pouvait être altérée, incluant un déficit de l’activité cytolytique des cellules Natural Killer (NK) et une diminution du nombre des lymphocytes T circulants.L’objectif central de cette thèse était, d’identifier des facteurs du microenvironnement impliqués dans la progression des cancer cutanées agressifs, en prenant comme modèle de susceptibilité au cancer, des cellules de patients XP-C. Une analyse transcriptomique comparant les fibroblastes WT et des patients XP-C a permis d’identifier que CLEC2A, un ligand activateur du récepteur NKp65 des cellules NK, est exprimé par les fibroblastes WT mais pas par les fibroblastes XP-C. Nos travaux ont pu montrer une diminution du niveau d’expression de CLEC2A au cours de la sénescence réplicative ; une absence dans les FAC et dans les CSC et que, des facteurs solubles secrétés para les CSC diminuent l’expression de CLEC2A. Ces résultats suggèrent que la perte de CLEC2A peut induire un déficit d’activation des cellules NK au sein du microenvironnement tumoral et dans les dermes des patients XP-C. Par la suite, nous avons élaboré un modèle de culture de peau 3D, dans lequel nous avons introduit des cellules NK, en présence ou absence d’anticorps bloquants CLEC2A. Ce modèle nous a permis de montrer que l’interaction CLEC2A/NKp65 régule l’invasion des CSC via un dialogue entre fibroblastes et cellules NK. Nos résultats suggèrent que l’expression de CLEC2A dans les fibroblastes WT contribue à la surveillance immunitaire dans la peau et que son absence, par des facteurs encore inconnus, favorise le développement des cancers agressifs chez les patients XP-C. CLEC2A peut être une cible dans le combat contre la progression des CSC
Skin cancer etiology is related to genetic mutations arising after ultraviolet (UV) sun exposure. The propagation of cancer cells is also dependent of a crosstalk with cells present in the surrounding microenvironment, mainly cancer associated fibroblasts (CAF) and immune cells. Xeroderma pigmentosum (XP) is a genetic disease that comprises seven groups of genetic complementation (XP-A to XP-G). XP patients present a default in the mechanism responsible for the repair of UV-induced DNA lesions. They are prone to develop skin cancers with high frequencies early in their life. XP-C is the most represented complementation group in Europe and in XP-C patients squamous cell carcinoma (SCC) are more frequent than basal cell carcinoma (BCC) (ratio 5:1). SCC have high metastatic potential compared to BCC. Previous studies suggested that the immune responses in XP patients could be altered with defects in their NK lytic activity and a decrease in the levels of circulating T lymphocytes. The main objective of this thesis was to identify microenvironment factors that could contribute to the progression of aggressive skin cancers using XP-C disease cells as a model of skin cancer susceptibility. Comparative transcriptomic analysis of WT and XP-C dermal patient’s fibroblasts revealed that CLEC2A, a ligand of the activating NK receptor NKp65 implicated in the activation of the innate immune system, is expressed in WT fibroblasts and absent in XP-C fibroblasts. Additional work showed that CLEC2A level is decreased in WT fibroblasts during replicative senescence, is absent in CAF and SCC, and is down regulated by soluble factors secreted by SCC cells. These results suggest that the loss of CLEC2A may induce a deficit of NK cell activation in the tumor microenvironment of SCC and in the dermis of XP-C patients. Elaboration of 3D skin culture models including NK cells and, in the presence or absence of blocking anti-CLEC2A antibody, allowed us to show that CLEC2A/NKp65 interaction regulates SCC cells invasion through a crosstalk between fibroblasts and NK cells. Our results suggest that the expression of CLEC2A in fibroblasts contributes to skin immune surveillance while, conversely, its absence under yet unidentified factors, favors the development of aggressive cancers in XP-C patients. CLEC2A could be a potential target in the fight against SCC progression

L'immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire (ICBs) est un traitement prometteur pour les patients atteints de mélanome ; cependant, seule une petite sous-population en tire un bénéfice à long terme. Un des défis pour améliorer l'efficacité et étendre le bénéfice des ICBs aux patients non répondeurs est de concevoir des approches innovantes permettant de transformer les tumeurs dites "froides ou désertes pour les cellules immunitaire" en tumeurs dites "chaudes ou infiltrées par les cellules immunitaires" qui sont éligibles aux ICBs. Nous avons étudié l'impact du ciblage du gène de l'autophagie Beclin1 sur le paysage immunitaire des tumeurs de mélanome B16-F10. Nos résultats ont démonté que ce ciblage inhibait significativement la croissance tumorale B16-F10 et augmentait l'infiltration des leucocytes CD45+. Le phénotypage immunitaire a révélé une augmentation de l'infiltration de cellules NK (Natural Killer) actives, de macrophages inflammatoires et résidents de type 1, de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD8+ actifs. L’inhibition de la croissance tumorale Becn1- n'était plus observée par la déplétion des CD8+ de l'hôte, soulignant ainsi leur rôle dans le contrôle du développement de ces tumeurs. Nos résultats ont démontré que La régulation du paysage immunitaire des tumeurs Becn1- était associée à une modulation du réseau de cytokines/chémokines dans le microenvironnement tumoral (TME). Ainsi, les tumeurs Becn1- présentaient une signature de cytokines inflammatoires (comprenant CCL5, CXCL10 et IFNg) qui pourrait être responsable de l'établissement de microenvironnement inflammatoire permissif aux cellules CD8. Nous avons révélé que la surexpression de l'IFNg dans le TME des tumeurs Becn1- était responsable de l'induction de PD-L1 sur les cellules tumorales par la voie d'activation JAK/STATs. En conclusion, cette étude met en évidence Beclin1 comme une cible majeure, capable d'induire l'infiltration des cellules effectrices immunitaires dans les mélanomes en induisant une signature inflammatoire. Elle fournit également la preuve de concept pour combiner des inhibiteurs d'autophagie avec les ICBs comme une approche de pointe pour améliorer leur efficacité
Immune Checkpoint Blockades (ICBs)-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for melanoma patients; however only a small subset of patients reaps a long term benefit. One of the major challenges to enhance the efficacy and extend the benefit of ICBs to non-responder patients is to design innovative approaches allowing the switch of “immune desert cold tumors” to “immune infiltrated hot tumors" which are eligible for ICB-based therapies. Here, we investigated the impact of targeting the early autophagy gene Beclin1 on the immune landscape of B16-F10 melanoma tumors. We found that targeting Beclin1 (Becn1-) significantly inhibited B16-F10 tumor growth and increased the infiltration of CD45+ leukocytes into the tumor bed. Immune phenotyping revealed an increased infiltration of active Natural Killer (NK) cells, inflammatory and resident type 1 macrophages, dendritic cells, and active CD8+ T lymphocytes. The inhibition of Becn1- tumor growth was no longer observed by depleting host CD8+ T cells, thus highlighting their major role in the control of Becn1- B16-F10 tumor development. We showed that Beclin1-dependent regulation of the immune landscape was associated with profound modulation of the cytokine/chemokine network in the tumor microenvironment (TME). Importantly, we revealed that Becn1- tumors displayed an inflammatory cytokine signature (comprised, but not restricted to, CCL5, CXCL10 and IFNg) that could be responsible for the switch from cold non T-inflamed to hot T-inflamed tumors. Mechanistically, we reported that the overexpression of IFNg in Becn1- TME was responsible for the induction of Programed Death ligand-1 (PD-L1) on tumor cells through the activation of JAK/STATs pathway. Overall, this study highlights Beclin1 as a valuable target, able to drive immune effectors cells into the melanoma tumors by inducing an inflammatory signature. This study provides the proof of concept for combining drugs inhibiting early autophagy process along with ICBs as a cutting-edge approach to improve their efficacy

Au cours de la dernière décennie, l’avènement des immunothérapies antitumorales a été une vraie percée dans le monde de la cancérologie avec le succès clinique des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICP) ou des thérapies cellulaires basées sur l’utilisation de récepteurs antigéniques chimériques (CAR). Cependant, aujourd’hui elles montrent leurs limites contre les tumeurs solides, notamment à cause d’un manque d’antigène spécifique et d’un microenvironnement tumoral complexe capable de moduler la réponse immune au profit de l’expansion des cellules cancéreuses. La molécule HLA-G est une protéine immunosuppressive participant exclusivement à la tolérance foeto-maternelle en contexte normal mais dont la fonction a été détournée par les tumeurs pour inhiber la réponse effectrice à son encontre. HLA-G est donc identifié comme un excellent antigène associé aux tumeurs et son inhibition est un élément crucial pour restaurer la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, aucune stratégie immunothérapeutique ciblant HLA-G n’existait jusqu’à aujourd’hui.L’absence de traitement efficace contre ou ciblant HLA-G provient de l’incapacité à générer efficacement des anticorps contre cette protéine complexe du fait de la présence de nombreuses isoformes et de leurs caractères immunotolérogéniques. Dans la première partie de ces travaux, grâce à une méthode d’immunisation originale basée sur l’utilisation de vecteurs lentiviraux, nous avons pu générer des anticorps capables de reconnaitre le site d’interaction de HLA-G avec ses récepteurs et donc de potentiellement bloquer la fonction ICP de HLA-G. La deuxième partie de cette étude décrit la génération d’une thérapie CAR ciblant HLA-G en tant qu’antigène spécifique aux tumeurs. Tout d’abord, nous nous sommes préalablement concentrés sur la régulation et l’expression de la chaine CAR au niveau transcriptionnel. Cette approche visait à limiter les multiples effets secondaires liés à une thérapie CAR tels que l’activation continue des cellules CAR-T ou l’élimination de cellules saines exprimant l’antigène ciblé. Nous avons ensuite généré deux nouveaux CAR de 3ème génération capable de reconnaitre spécifiquement les isoformes majoritaires de HLA-G en contexte tumoral, et nous avons démontré leur efficacité à éliminer des tumeurs exprimant HLA-G in vitro et in vivo. Enfin, une série d’optimisations ont été réalisées sur la structure des protéines CAR pour augmenter leur capacité cytotoxique et permettre leur régulation par l’introduction du gène suicide iC9 pour les modèles précliniques. Nous démontrons pour la première fois que la thérapie CAR anti-HLA-G est extrêmement efficace in vitro et in vivo.Enfin, nous discutons du potentiel des immunothérapies anti-HLA-G aussi bien au travers des anticorps monoclonaux bloquants que des cellules CAR-T dans le contexte des tumeurs solides, de leurs implications sur le microenvironnement et de leur possible combinaison avec d’autres immunothérapies
Over the last decade, anti-tumor immunotherapies have been a breakthrough in the oncology field following the clinical successes obtained with immune checkpoint inhibitors (ICPs) or chimeric antigenic receptors (CAR) based therapies. However, they are less effective against solid tumors, especially because of the lack of tumor specific antigen and of a tumor microenvironment capable of inhibiting the immune response favoring the tumor expansion. The HLA-G molecule is an immunosuppressive protein originally exclusively demonstrated to be involved in maternal-fetal tolerance but whose function has been hijacked by tumors to inhibit and escape from immune responses. HLA-G is now identified as an exquisite tumor associated antigen and its inhibition is crucial to restore the anti-tumor immune responses. Yet, no immunotherapy directed against HLA-G has been developed to date.The lack of effective treatment against or targeting HLA-G is related to the inefficiency to induce antibodies against this complex protein since HLA-G could be expressed through several isoforms that are immunosuppressives. In the first part of this study, thanks to an original immunization method based on the use of lentiviral vectors, we demonstrate the possibility to generate antibodies which are capable to recognize the HLA-G interaction domain with its receptors and are expected to inhibit the ICP function of HLA-G. The second part describes a CAR-T cell immunotherapy targeting HLA-G for its TAA properties. We first focused on the regulation and on the expression of the CAR chain at the transcriptional level. This approach was meant to limit the side effects caused by CAR therapies such as continuous activation of the CAR-T cells or elimination of healthy cells expressing the targeted antigen. We then generated two new 3rd generation CARs demonstrated to specifically recognize major HLA-G isoforms expressed by tumor cells and to eradicate HLA-G expressing tumor cells in vitro and in vivo. Several optimizations were carried out on the CAR chain structure to increase CAR-T cells cytotoxic function and to control their persistence through the insertion of the iC9 suicide gene. Given the results presented here, we provide the first vitro and vivo proofs of concept that a CAR therapy directly targeting HLA-G, and more generally an ICP is strikingly efficient.Finally, we discussed the potential for both anti-HLA-G blocking monoclonal antibodies and CAR-T cells immunotherapies against solid tumors and its implication against the tumor microenvironment and possible combinations with other immunotherapies

Les tumeurs sont entourées d'un microenvironnement complexe comprenant des cellules tumorales, des fibroblastes et une diversité de cellules immunitaires. Avec le développement actuel des immunothérapies, la compréhension de la composition du microenvironnement tumoral est d'une importance critique pour effectuer un pronostic sur la progression tumorale et sa réponse au traitement. Cependant, nous manquons d'approches quantitatives fiables et validées pour caractériser le microenvironnement tumoral, facilitant ainsi le choix de la meilleure thérapie. Une partie de ce défi consiste à quantifier la composition cellulaire d'un échantillon tumoral (appelé problème de déconvolution dans ce contexte), en utilisant son profil omique de masse (le profil quantitatif global de certains types de molécules, tels que l'ARNm ou les marqueurs épigénétiques). La plupart des méthodes existantes utilisent des signatures prédéfinies de types cellulaires et ensuite extrapolent cette information à des nouveaux contextes. Cela peut introduire un biais dans la quantification de microenvironnement tumoral dans les situations où le contexte étudié est significativement différent de la référence. Sous certaines conditions, il est possible de séparer des mélanges de signaux complexes, en utilisant des méthodes de séparation de sources et de réduction des dimensions, sans définitions de sources préexistantes. Si une telle approche (déconvolution non supervisée) peut être appliquée à des profils omiques de masse de tumeurs, cela permettrait d'éviter les biais contextuels mentionnés précédemment et fournirait un aperçu des signatures cellulaires spécifiques au contexte. Dans ce travail, j'ai développé une nouvelle méthode appelée DeconICA (Déconvolution de données omiques de masse par l'analyse en composantes immunitaires), basée sur la méthodologie de séparation aveugle de source. DeconICA a pour but l'interprétation et la quantification des signaux biologiques, façonnant les profils omiques d'échantillons tumoraux ou de tissus normaux, en mettant l'accent sur les signaux liés au système immunitaire et la découverte de nouvelles signatures. Afin de rendre mon travail plus accessible, j'ai implémenté la méthode DeconICA en tant que librairie R. En appliquant ce logiciel aux jeux de données de référence, j'ai démontré qu'il est possible de quantifier les cellules immunitaires avec une précision comparable aux méthodes de pointe publiées, sans définir a priori des gènes spécifiques au type cellulaire. DeconICA peut fonctionner avec des techniques de factorisation matricielle telles que l'analyse indépendante des composants (ICA) ou la factorisation matricielle non négative (NMF). Enfin, j'ai appliqué DeconICA à un grand volume de données : plus de 100 jeux de données, contenant au total plus de 28 000 échantillons de 40 types de tumeurs, générés par différentes technologies et traités indépendamment. Cette analyse a démontré que les signaux immunitaires basés sur l'ICA sont reproductibles entre les différents jeux de données. D'autre part, nous avons montré que les trois principaux types de cellules immunitaires, à savoir les lymphocytes T, les lymphocytes B et les cellules myéloïdes, peuvent y être identifiés et quantifiés. Enfin, les métagènes dérivés de l'ICA, c'est-à-dire les valeurs de projection associées à une source, ont été utilisés comme des signatures spécifiques permettant d'étudier les caractéristiques des cellules immunitaires dans différents types de tumeurs. L'analyse a révélé une grande diversité de phénotypes cellulaires identifiés ainsi que la plasticité des cellules immunitaires, qu'elle soit dépendante ou indépendante du type de tumeur. Ces résultats pourraient être utilisés pour identifier des cibles médicamenteuses ou des biomarqueurs pour l'immunothérapie du cancer
Tumors are engulfed in a complex microenvironment (TME) including tumor cells, fibroblasts, and a diversity of immune cells. Currently, a new generation of cancer therapies based on modulation of the immune system response is in active clinical development with first promising results. Therefore, understanding the composition of TME in each tumor case is critically important to make a prognosis on the tumor progression and its response to treatment. However, we lack reliable and validated quantitative approaches to characterize the TME in order to facilitate the choice of the best existing therapy. One part of this challenge is to be able to quantify the cellular composition of a tumor sample (called deconvolution problem in this context), using its bulk omics profile (global quantitative profiling of certain types of molecules, such as mRNA or epigenetic markers). In recent years, there was a remarkable explosion in the number of methods approaching this problem in several different ways. Most of them use pre-defined molecular signatures of specific cell types and extrapolate this information to previously unseen contexts. This can bias the TME quantification in those situations where the context under study is significantly different from the reference. In theory, under certain assumptions, it is possible to separate complex signal mixtures, using classical and advanced methods of source separation and dimension reduction, without pre-existing source definitions. If such an approach (unsupervised deconvolution) is feasible to apply for bulk omic profiles of tumor samples, then this would make it possible to avoid the above mentioned contextual biases and provide insights into the context-specific signatures of cell types. In this work, I developed a new method called DeconICA (Deconvolution of bulk omics datasets through Immune Component Analysis), based on the blind source separation methodology. DeconICA has an aim to decipher and quantify the biological signals shaping omics profiles of tumor samples or normal tissues. A particular focus of my study was on the immune system-related signals and discovering new signatures of immune cell types. In order to make my work more accessible, I implemented the DeconICA method as an R package named "DeconICA". By applying this software to the standard benchmark datasets, I demonstrated that DeconICA is able to quantify immune cells with accuracy comparable to published state-of-the-art methods but without a priori defining a cell type-specific signature genes. The implementation can work with existing deconvolution methods based on matrix factorization techniques such as Independent Component Analysis (ICA) or Non-Negative Matrix Factorization (NMF). Finally, I applied DeconICA to a big corpus of data containing more than 100 transcriptomic datasets composed of, in total, over 28000 samples of 40 tumor types generated by different technologies and processed independently. This analysis demonstrated that ICA-based immune signals are reproducible between datasets and three major immune cell types: T-cells, B-cells and Myeloid cells can be reliably identified and quantified. Additionally, I used the ICA-derived metagenes as context-specific signatures in order to study the characteristics of immune cells in different tumor types. The analysis revealed a large diversity and plasticity of immune cells dependent and independent on tumor type. Some conclusions of the study can be helpful in identification of new drug targets or biomarkers for immunotherapy of cancer

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à une population cellulaire rare et peu étudiée de l’épithélium intestinal ; les cellules tuft. La fonction de ces cellules fut longtemps débattue dans la littérature, jusqu’à ce que nous découvrions leur fonction dans l’initiation de la réponse immune de type II en réponse à une infection parasitaire. De manière intéressante, ces cellules sont présentes de manière massive et transitoire au sein des lésions adénomateuses précoces et certains groupes ont suggéré l’implication de ces cellules en tant que cellules souches tumorales. Les principaux objectifs de ma thèse ont été de déterminer le rôle des cellules tuft au cours de la tumorigenèse intestinale et colorectale.Nous avons montré que l’absence de cellules tuft impacte le processus de tumorigenèse à la fois dans l’intestin grêle, dans des souris de la lignée Apc14/+, et au niveau du colon, après traitement avec un agent carcinogène. Nos données indiquent que si les cellules tuft n’agissent pas en tant que cellules souches tumorales, leur absence impacte certaines populations de cellules immunitaires. Afin de déterminer les mécanismes permettant aux cellules tuft de moduler le microenvironnement immunitaire, nous avons identifié par analyse transcriptomique de cellules tuft isolées par cytométrie en flux, des gènes codant pour des médiateurs connus pour être impliqués dans la communication avec le système immunitaire. Des analyses in-vivo, permettront de valider d’un point de vue fonctionnel l’implication de ces médiateurs immunitaires dans la fonction immuno-régulatrice des cellules tuft ainsi que dans le développement tumoral.L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier une fonction immuno-régulatrice des cellules tuft au cours d’une infection parasitaire, mais aussi très probablement lors du développement tumoral. La compréhension des mécanismes permettant aux cellules tuft de moduler certaines populations de cellules immunitaires permettra d’identifier des cibles d’intérêt thérapeutique potentiel pour le traitement de patients atteints d’un cancer colorectal
I focused my PhD project on a scare epithelial cell population referred as tuft cells. Their function has been debated for decades in the literature, until we discovered their crucial role in the initiation of the so-called type-2 immune response following parasitic infection. Interestingly, tuft cells are present in early adenomatous intestinal lesions and literature suggested that these cells could act as cancer stem cells. The main objective of my PhD was to determine the tuft cell function during intestinal and colorectal cancer.We showed that tuft cells deficiency impacts both intestinal and colorectal tumorigenesis process, using Apc14/+ mouse strain and chemically induced carcinogenesis model, respectively. Our data indicate that tuft cells are not cancer stem cells, but that these cells are able to regulate immune cell populations. To get more insights into mechanisms allowing tuft cells to modulate the immune microenvironment, we identified, by transcriptomic analysis of FACS-isolated tuft cells, specific genes encoding mediators involved in the crosstalk with the immune system. Functional in-vivo validation of the most relevant candidates will identify tuft cells derived factors crucial for the immune-regulatory tuft cell function and for tumor development.This work allowed to highlight the immune-regulatory function of tuft cells during parasitic infection and likely during tumor development. A better knowledge of the mechanisms allowing tuft cells to shape either a pro- or an anti-tumoral microenvironment, will potentially paves the way for new therapeutic strategies regarding intestinal and colorectal tumorigenesis

.Les pDCs et Tγδ ont des rôles cruciaux dans l’initiation et l’orientation des réponses immunitaires. Leurs fonctions uniques, leur grande plasticité et leur capacité d’interagir avec de nombreux acteurs immunitaires leur permettent de créer un lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. Elles contribuent donc grandement aux réponses immunitaires protectrices et pathogéniques, et sont de ce fait très prometteuses pour le développement d’immunothérapies anti-tumorales, autant en tant que vecteurs que cibles. Cependant, les lymphocytes Tγδ n’ont pas été étudiés de manière approfondie en contexte de mélanome, et les interactions entre pDCs et Tγδ n’ont été explicitées ni en contexte sain, ni en contexte mélanome, ou le contrôle immunitaire de la tumeur ‡ long terme est encore un défi. Nous avons réalisé une étude détaillée du phénotype et de la fonction des lymphocytes Tγδ circulant et infiltrant le mélanome, et analysé leur impact sur l’évolution clinique. Nous avons aussi caractérisé les interactions bidirectionnelles entre les pDCs et les Tγδ issus de sang de donneurs sains, et de sang ou de tumeur de patients. Nous avons mis en évidence que le mélanome détourne les fonctions effectrices des Tγδ dans le but d’échapper au contrôle immunitaire, et que les caractéristiques des Tγδ issus de sang ou de tumeurs de patients peuvent étre des bio-marqueurs prometteurs d’évolution clinique. Nous avons également montré que les interactions entre pDCs et Tγδ sont médiées par les IFNs de type I et II et par le récepteur BTN3A, essentiel pour l’activation des Td2+, et sont dérégulées en contexte de mélanome. L’administration de cytokines et d’anticorps ciblant les points de contrôle immunitaire peut rétablir des interactions fonctionnelles entre les deux populations cellulaires. De façon intéressante, nous avons observé une augmentation de l’expression de BTN3A sur les pDCs et Tγδ issus de sang de patients ou de tumeurs, tout en soulignant une potentielle dysfonction de cette molécule. Notre étude révèle que le mélanome détourne les interactions entre pDCs et Tgd notamment via la dérégulation de BTN3A. De tels résultats motivent l’exploitation de ces effecteurs immunitaires ainsi que de leur synergie, pour développer de nouvelles approches thérapeutiques exploitant leur potentiel anti-tumoral tout en évitant leur détournement par la tumeur pour améliorer l’évolution clinique des patients. Nos découvertes soutiennent l’exploitation de ces partenaires puissants et prometteurs pour élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques et restaurer des réponses immunes appropriées en contexte de cancer, infections et auto-immunité
Both pDCs and γδT cells harbor critical roles in immune responses induction and orientation. Their unique features, high functional plasticity and ability to interact with many immune cell types allow them to bridge innate and adaptive immunity. They actively contribute to protective and pathogenic immune responses, which render them very attractive both as targets and vectors for cancer immunotherapy. Yet, γδT cells have not been extensively explored in melanoma, and despite strategic and closed missions, cross-talks between pDCs and γδT cells have not been deciphered yet, neither in healthy context nor in cancers, especially in melanoma where the long-term control of the tumor still remains a challenge. We provided here a detailed investigation of the phenotypic and functional properties of circulating and tumor-infiltrating γδT cells in melanoma patients, as well as their impact on clinical evolution. We also characterized the bidirectional cross-talks between pDCs and γδT cells both from healthy donor’s blood, patient’s blood and tumor micro-environment. Our study highlighted that melanoma hijacked γδT cells to escape from immune control, and revealed that circulating and tumor-infiltrating γδT cell features are promising potential biomarkers of clinical evolution. We also demonstrated crucial bidirectional interactions between these key potent immune players though type I and II IFN and BTN3A that are dysfunctional in the context of melanoma. Reversion of the dysfunctional bidirectional cross-talks in melanoma context could be achieved by specific cytokine administration and immune checkpoint targeting. We also revealed an increased expression of BTN3A on circulating and tumor-infiltrating pDCs and γδT cells from melanoma patients but stressed out its potential functional impairment.Thus, our study uncovered that melanoma hijacked pDCs/ γδT cells bidirectional interplay to escape from immune control, and pointed out BTN3A dysfunction. Such understanding will help harnessing and synergizing the power of these potent immune cells to design new therapeutic approaches exploiting their antitumor potential while counteracting their skewing by tumors to improve patient outcomes. Our findings pave the way to manipulate these potent and promising cell partners to design novel immunotherapeutic strategies and restore appropriate immune responses in cancers, infections and autoimmune diseases

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent et le deuxième cancer le plus mortel dans le monde. En conséquence, de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ainsi qu’une amélioration des traitements actuels sont nécessaires. Les tumeurs se développent dans des microenvironnements complexes où les cellules cancéreuses interagissent et modulent la réponse immunitaire locale pour persister et se multiplier. Les lectines de type C, exprimées notamment par les cellules de l’immunité, régulent la réponse anti-cancéreuse, et donc le développement tumoral. Parmi elles, l'immunorécepteur des cellules dendritiques (DCIR), a été montré comme jouant un rôle immunitaire majeur au cours des maladies infectieuses et auto-immunes. À l’inverse, son rôle dans l'immunité tumorale reste méconnu. L'analyse des données transcriptomiques de deux cohortes de patients atteints de CCR a révélé un lien entre une expression élevée de DCIR et une meilleure survie des patients. Dans ce contexte, l'objectif principal de ma thèse était de déterminer l'impact de DCIR sur le développement du CCR et la réponse immunitaire associée. Dans ce but, j’ai établi un modèle murin préclinique, orthotopique et syngénique du CCR consistant en l'injection intracaecale de cellules tumorales MC38 exprimant la luciférase (MC38-fLuc+) dans des souris C57BL/6. Le suivi de la croissance tumorale par bioluminescence a montré que, malgré l’acquisition initiale de tumeurs solides par toutes les souris, seulement 30% des souris ont développé un CCR progressif et mortel, tandis que les autres animaux ont spontanément rejeté leurs tumeurs. Aucun rejet des tumeurs CCR MC38 n'a été observé en l'absence d'immunité adaptative, ni lors de l'injection de cellules MC38 dans d'autres sites anatomiques. L'immunophénotypage par transcriptomique et cytométrie de flux a révélé que les souris développant des tumeurs progressives présentaient une réponse immunitaire pro-tumorale, définie par une signature caractéristique des lymphocytes T régulateurs, détectable peu après l'implantation tumorale, et par une infiltration de cellules myéloïdes suppressives connues pour favoriser la croissance tumorale. En revanche, les souris rejetant les tumeurs présentaient une signature pro-inflammatoire précoce et un microenvironnement anti-tumoral enrichi en lymphocytes T CD8+. Ainsi, nos résultats démontrent un rôle du microenvironnement spécifique du côlon dans la régulation de l'équilibre entre les réponses immunitaires anti- ou pro-tumorales et souligne l'importance d'utiliser des modèles murins orthotopiques pour les études in vivo. Dans la seconde partie de ma thèse, j’ai utilisé ce modèle murin de CCR pour comparer le développement tumoral dans des souris C57BL/6 de type sauvage ou des souris déficientes pour l’expression de mDcir1 (mDcir1-KO), un homologue murin du DCIR humain. Bien que l'absence de mDCIR1 n'ait aucune incidence sur le pourcentage de souris développant ou rejetant les tumeurs du CCR, nous avons observé que les animaux mDcir1-KO développaient des tumeurs plus importantes que les sauvages En accord avec ce résultat, nous avons constaté une infiltration plus faible de lymphocytes CD8+ cytotoxiques et une activation moindre des lymphocytes T CD4+ et CD8+ (c'est-à-dire T-BET+, CD44haut, CTLA-4+) dans les tumeurs des souris mDcir1-KO par rapport aux souris sauvages. Ainsi, nos données indiquent un rôle protecteur et anti-tumoral de DCIR pendant le développement du CCR, probablement dû à une dérégulation de l'équilibre existant entre la tumeur et la réponse immunitaire. Dans l'ensemble, cette étude ouvre la voie à la mise au point éventuelle de biomolécules pharmacologiques ciblant DCIR pour déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale efficace dans le contexte du CCR et au-delà
Colorectal cancer (CRC) is the third most common and second deadliest cancer worldwide accounting for 900.000 deaths in 2018. Consequently, there is a strong need for new biomarkers as well as an improvement of the current treatments. Tumors develop in complex microenvironments where cancer cells constantly crosstalk with, and modulate, the local immune response to persist and replicate. C-type lectins receptors, expressed in particular by immune cells, actively regulate the immune response to cancer cells and, therefore, tumor development. Dendritic cell immunoreceptor (DCIR), a C-type lectin expressed by myeloid cells, has been shown to play a major role in immunity to infectious and autoimmune diseases. Yet, the role played by DCIR in tumor immunity remains unknown. Analysis of publicly available transcriptomic data from two cohorts of CRC patients revealed an association between high DCIR gene expression and improved survival of patients. In this context, the principal objective of my PhD thesis was to determine the role played by DCIR in the immune response during CRC development. First, I developed an orthotopic syngeneic pre-clinical CRC mouse model consisting in the intra-caecal injection of engineered MC38 tumor cells expressing firefly luciferase (MC38-fLuc+) in C57BL/6 mice. Monitoring of the tumor growth by bioluminescence revealed that, despite an initial growth of solid tumors in all the mice, only 30% of mice developed a progressive lethal CRC, while the remaining animals spontaneously rejected their solid tumor and survived more than 100 days. No rejection of tumors was observed in the absence of adaptive immunity, nor when MC38-fLuc+ cells were injected in other anatomical locations (i.e., liver and skin). Immunophenotyping by transcriptomic and flow cytometry showed that mice with progressive CRC tumors exhibited a pro-tumor immune response, characterized by a regulatory T cell pattern, discernible shortly post-tumor implantation, as well as myeloid suppressor cells that are well-known to favor tumor growth. By contrast, tumor-rejecting mice presented an early pro-inflammatory response and an anti-tumor microenvironment enriched with CD8+ T cells. Taken together, our results demonstrate a preponderant role of the colon-specific microenvironment in regulating the balance between anti- or pro-tumor immune responses and underline the importance of using orthotopic mouse models for in vivo studies. In a second part of my thesis, we used this CRC mouse model to compare the tumor development in wild-type (WT) C57BL/6 mice or mice deficient for mDcir1 (mDcir1-KO), a murine homologue of human DCIR. While the lack of mDCIR1 has no impact on the percentage of mice developing or rejecting CRC tumors, we observed that mDcir1-KO animals developed bigger tumors than their WT counterparts. In line with this result, we found a lower infiltration of cytotoxic CD8+ and decreased activation of both CD4+ and CD8+ T cells (i.e., T-BET+, CD44high, CTLA-4+) in CRC tumors from mDcir1-KO mice compared to WT mice. Altogether, our data point to a protective and anti-tumor role of DCIR during CRC development, probably due to a dysregulation of the balance existing between the tumor and the immune response. Overall, this study paves the way for the potential future development of pharmacological biomolecules targeting DCIR to trigger an efficient anti-tumor immune response in the context of CRC and beyond