Dissertationen zum Thema „Microbiological screening“

All viruses encode for at least one viral interferon (IFN) antagonist, which is used to subvert the cellular IFN response, a powerful antiviral innate immune response. Numerous in vitro and in vivo studies have demonstrated that IFN antagonism is crucial for virus survival, suggesting that viral IFN antagonists could represent promising therapeutic targets. This study focuses on Respiratory Syncytial Virus (RSV), an important human pathogen for which there is no vaccine or virus-specific antiviral drug. RSV encodes two IFN antagonists NS1 and NS2, which play a critical role in RSV replication and pathogenicity. We developed a high-throughput screening (HTS) assay to target NS2 via our A549.pr(ISRE)GFP-RSV/NS2 cell-line, which contains a GFP gene under the control of an IFN-stimulated response element (ISRE) to monitor IFN- signalling pathway. NS2 inhibits the IFN-signalling pathway and hence GFP expression in the A549.pr(ISRE)GFP-RSV/NS2 cell-line by mediating STAT2 degradation. Using a HTS approach, we screened 16,000 compounds to identify small molecules that inhibit NS2 function and therefore relinquish the NS2 imposed block to IFN-signalling, leading to restoration of GFP expression. A total of twenty-eight hits were identified; elimination of false positives left eight hits, four of which (AV-14, -16, -18, -19) are the most promising. These four hit compounds have EC₅₀ values in the single μM range and three of them (AV-14, -16, -18) represent a chemically related series with an indole structure. We demonstrated that the hit compounds specifically inhibit the STAT2 degradation function of NS2, not the function of NS1 or unrelated viral IFN antagonists. At the current time, compounds do not restrict RSV replication in vitro, hence hit optimization is required to improve their potency. Nonetheless, these compounds could be used as chemical tools to determine the unknown mechanism by which NS2 mediates STAT2 degradation and tackle fundamental questions about RSV biology.

La conservation et la sécurité des aliments font partie des préoccupations majeures du secteur agroalimentaire. Le gaspillage alimentaire, dû à la détérioration et à la contamination microbienne, a un fort impact économique. De plus, les agents pathogènes d'origine alimentaire posent un risque sérieux pour la santé des consommateurs. Les techniques conventionnelles de conservation des aliments et d'analyse microbienne présentent des limites qui nécessitent d'innovation. Cette thèse a pour objectif de développer des solutions pratiques et durables pour améliorer la qualité et la sécurité des aliments. Les nanoparticules (NPs) métalliques et d'oxyde métallique sont des matériaux polyvalents, en raison de leurs propriétés uniques, telles que leurs activités antioxydantes, antimicrobiennes, optiques et catalytiques. Ils peuvent être ajoutés aux films d'emballage pour inhiber la croissance microbienne et prolonger la conservation des aliments. Dans cette étude, des NPs ont été développées en dopant le TiO2 avec du fer. Les NPs Fe2TiO5 obtenues n'ont pas été trouvées cytotoxiques, comme démontré sur les cellules Caco-2. De plus, il n'y avait pas de migration d'ions de fer ou de titane vers des simulants alimentaires des films incorporant Fe2TiO5 dans de l'alginate. Ceci suggère leur sécurité en tant que matériau d'emballage. Une forte efficacité antioxydante a également été montrée par les Fe2TiO5, confirmée par un test de conservation des fruits frais avec le film d'alginate contenant les Fe2TiO5. L'alginate, matériau biodégradable, offre une alternative aux plastiques pétroliers, favorisant une préservation alimentaire durable.Deux solutions différentes ont été étudiées pour développer de nouveaux tests de dépistage des pathogènes alimentaires. La première consistait en un test colorimétrique pour détecter les spores de B. cytotoxicus, qui posent un risque sérieux pour les consommateurs, en raison de leur résistance aux traitements lors de la production industrielle. Le principe de détection repose sur l'activité catalytique des nanoparticules d'or (AuNPs) similaire à celle de la peroxydase, amplifiée par les spores. La plateforme de détection comprend un microtube contenant des AuNPs et des particules magnétiques (MPs), toutes deux conjuguées avec un aptamère sélectionné pour sa spécificité envers les spores de B. cytotoxicus. Lors de l'ajout de l'échantillon, la présence des spores est déterminée par le changement de couleur accru de la solution, dû à l'oxydation de la tétraméthylbenzidine en présence de H2O2. Le test développé a permis une détection à l'œil nu, rapide et spécifique, des spores cibles directement dans les denrées alimentaires telles que le lait ou la purée de pommes de terre. Le deuxième test consistait en un génocapteur électrochimique pour détecter Campylobacter, la cause la plus fréquente de zoonose d'origine alimentaire. La détection était basée sur l'hybridation entre une séquence d'ADN de Campylobacter avec une sonde ADN complémentaire, immobilisée sur une électrode en or sérigraphiée. Une passivation avec du mercaptohexanol a été réalisée pour réduire les phénomènes d'adsorption des molécules d'ADN sur l'électrode, et éviter les signaux non spécifiques. L'étude présentait des capacités prometteuses de détection. Cependant, des défis concernant la passivation de la surface et la stabilité du signal de détection, soulignant la nécessité d'optimisations supplémentaires. Dans l'ensemble, la thèse vise à améliorer la qualité et la sécurité des aliments, contribuer à un système alimentaire plus durable et stimuler la recherche et le développement technologique
Food conservation and safety are major concerns in the agri-food sector. Food lost and waste, due to deterioration and microbial contamination, have a significant economic impact. Additionally, foodborne pathogens pose serious health risks to consumers. Conventional methods for food preservation and microbial analysis have limitations that urgently require innovation. This thesis aims to develop practical and sustainable solutions to enhance food quality and safety. Metallic and metal oxide nanoparticles (NPs) are versatile materials known for their unique properties such as antioxidant, antimicrobial, optical, and catalytic activities. They can be incorporated into packaging films to inhibit microbial growth and extend food shelf life. In this study, NPs were developed by doping TiO2 with iron to obtain Fe2TiO5 NPs, which were found non- cytotoxic as demonstrated on Caco-2 cells. Furthermore, films incorporating Fe2TiO5 into alginate showednomigrationofironortitaniumionsintofood simulants, suggesting their safety as packaging materials. Fe2TiO5 also exhibited strong antioxidant efficacy, confirmed by a fresh fruit preservation test using alginate films containing Fe2TiO5. Alginate, a biodegradable material, offers an alternative to petroleum-based plastics, promoting sustainable food preservation. Two different solutions were studied to develop new methodologies for detecting foodborne pathogens. The first involved a colorimetric test to detect B. cytotoxicus spores, which pose a serious risk due to their resistance to industrial treatments. The detection principle is based on the peroxidase-like catalytic activity of gold nanoparticles (AuNPs) enhanced by the spores. The detection platform consists of a tube containing AuNPs and magnetic particles, both conjugated with an aptamer selected for its specificity towards B. cytotoxicus spores. Upon addition of the sample, the presence of spores is indicated by an increased color change of the solution, due to the oxidation of tetramethylbenzidine (TMB) in the presence of H2O2. The developed test enabled rapid and specific naked-eye detection of target spores directly in food items such as milk or mashed potatoes. The second test involved an electrochemical genosensor to detect Campylobacter, the most common cause of foodborne zoonoses. Detection was based on hybridization between a Campylobacter DNA sequence and a complementary DNA probe immobilized on a screen-printed gold electrode. After DNA probe immobilization, passivation with mercaptohexanol was carried out to reduce DNA molecule adsorptionphenomenaontheelectrodeandavoid nonspecific signals The study demonstrated promising detection capabilities. However, challenges regarding surface passivation and detection signal stability underscored the need for further optimizations. Overall, the thesis aims to improve food quality and safety, contribute to a more sustainable food system, and stimulate technological research and development

Leishmaniasis is a vector-borne disease caused by an intracellular parasite of the genus Leishmania. The clinical features of leishmaniasis include a wide range of manifestation from asymptomatic infections to different levels of disease severity. In most cases individuals do not develop clinical symptoms, but Leishmania parasites can persist lifelong in the host after an acute infection and easily reactivate under immunosuppressive conditions, causing severe disease with high mortality rate. The aim of this study was to identify Leishmania infection in selected groups of immunocompromised (IC) patients, including newly diagnosed HIV infected individuals, patients receiving kidney transplant (KT) and patients undergoing immunosuppressive therapies for immune-mediated diseases (IMD). Our study focused on the validation of a combination of methods to be used for the screening of asymptomatic Leishmania infection. The selected methods included high sensitive Real-Time PCR for detection of parasitic kinetoplast (k)DNA in peripheral blood, Western Blot (WB) for detection of specific IgG and Whole Blood Assay (WBA) to evaluate the anti-leishmanial T-cell response by quantifying the production of IFN-γ, IL-2 and IP-10 after stimulation of patients’ blood with Leishmania specific antigens. The methods have been validated on a cohort of immunocompetent individuals living in an endemic area of the Bologna province. Among 145 individuals recruited and screened with WB, Real-Time PCR and WBA, 24 subjects tested positive (17%) to one or more methods, thus confirming the high circulation of the parasite in the selected area. Given the high prevalence of asymptomatic infection in immunocompromised patients in endemic regions such as Italy, it seems essential to develop a plan for screening and follow-up of Leishmania infection. The screening algorithm that we tested in this study appears to be effective to identify accurately quiescent parasitic infection.

Mestrado em Microbiologia
O desenvolvimento de florescências de microalgas e de cianobactérias em ambientes aquáticos, marinhos e de água doce, pode ter consequências nefastas para os ecossistemas e para a saúde animal e humana. A prevenção e o combate à formação destas florescências envolve frequentemente a aplicação de agentes químicos com propriedades algicidas. Contudo, estes agentes são, na sua generalidade, inespecíficos, actuando não apenas sobre os organismos alvo mas também sobre a restante comunidade fitoplanctónica. A bacillamida é um composto natural recentemente isolado a partir de uma bactéria associada ao declínio de florescências de dinoflagelados marinhos. A sua toxicidade natural contra estas microalgas, associada a um baixo custo de produção em laboratório, apontam para a possível utilização deste composto como agente algicida no combate a proliferações algais nocivas. Neste trabalho avaliou-se o efeito da bacilamida e de um conjunto de compostos análogos no crescimento de diferentes estirpes de cianobactérias e de microalgas em cultura, com o objectivo de testar a aplicabilidade destes compostos na prevenção e no combate ao desenvolvimento de florescências. As culturas, inoculadas em microplacas de 96 pocetos, foram expostas a uma série crescente de concentrações de cada um dos compostos testados e incubadas numa câmara de culturas durante 216h. O crescimento algal foi seguido ao longo do período de incubação através da medição diária da densidade óptica (450nm) nos pocetos. As percentagens de inibição do crescimento foram calculadas a partir das curvas de crescimento obtidas em cada condição e as concentrações inibitórias IC50-216h foram calculadas por regressão das curvas de inibição através de análise de probits. A selectividade na acção tóxica de cada um dos compostos testados para as diferentes espécies foi estimada por comparação das concentrações inibitórias IC50- 216h obtidas nas diferentes culturas. Para além dos efeitos no crescimento, os efeitos na morfologia e ultrastrutura foram analisados por observação das células expostas ao microscópio óptico e ao microscópio electrónico de transmissão. Os resultados obtidos revelaram que as cianobactérias tóxicas Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon gracile, Anabaena circinalis e Anabaenopsis circularis são mais susceptíveis à bacilamida do que as algas verdes Ankistrodesmus falcatus e Scenedesmus obliquus. Assim, um tratamento com bacilamida a 80µg.L-1 deverá afectar o crescimento destas cianobactérias sem afectar o desenvolvimento das algas verdes. Resumo Contudo, outras cianobactérias, tais como, Nodularia spumigena, Leptolyngbya sp. e Plankthotrix rubescens, exibiram níveis de tolerâncias à bacilamida semelhantes aos obtidos para a maioria das algas eucarióticas testadas. Resultados semelhantes foram obtidos com a bromobacilamida e a clorobacilamida. A metoxibacilamida, por seu lado, revelou-se particularmente tóxica para as cianobactérias Anabaena e Aphanizomenon (IC50-216h= 42 e 85 µg.L-1, respectivamente) em concentrações que não afectaram o crescimento de nenhuma das restantes culturas testadas. A fluorbacilamida e a iodobacilamida revelaram um espectro de acção tóxica mais amplo contra cianobactérias, afectando o crescimento destes organismos em concentrações mais baixas (IC50-216h = 20-40 µg.L-1) do que os restantes análogos testados. No entanto, a estas concentrações, estas bacilamidas afectaram também a maior parte das algas eucarióticas testadas, revelando-se portanto inespecíficas na sua acção tóxica. De todos os compostos testados, a triptamina (percursor da bacilamida) revelou ser o mais tóxico, afectando o crescimento da maioria das cianobactérias testadas em concentrações muito inferiores (IC50-216h = 1,1-4,1 µL-1) às necessárias para afectar o crescimento das clorófitas (IC50-216h = 6,9-10,2 µL-1). As diatomáceas foram contudo igualmente afectadas pela triptamina (IC50-216h = 0,5-2,5 µL-1) pelo que a sua aplicação em ambientes co-habitados por estes dois tipos de organismos fitoplanctónicos pode resultar em efeitos nocivos para ambos. Por outro lado a cianobactéria Planktothrix rubescens revelou-se bastante mais resistente à triptamina que as restantes cianobactérias testadas. As diferentes sensibilidades exibidas pelas diferentes culturas cianobacterianas a cada um dos compostos testados, demonstram que as bacilamidas e a triptamina não devem ser considerados algicidas de largo espectro contra cianobactérias. Contudo a aplicação de distintas bacilamidas no combate ao desenvolvimento de determinadas espécies cianobacterianas em particular, pode revelar-se eficaz desde que o tipo e concentração de bacilamida aplicada não afectem as restantes microalgas que compõem a comunidade fitoplactónica. A decisão sobre o tipo e quantidade de bacilamida a aplicar na prevenção do desenvolvimento de uma dada fluorescência deve portanto ter em conta não só a espécie cianobacteriana dominante mas também considerar a composição relativa de toda a comunidade fitoplanctónica, de modo a não afectar os organismos benéficos para o equilíbrio e produtividade do ecossistema.
Cyanobacterial blooms are of major concern to environmental and human health as they cause water deteoration and produces neuro and hepatotoxins. Bacillamide, a natural algicide produced by the marine bacteria Bacillus sp., and several newly synthesized analogues and also its precursors, were screened for selective antialgal activity against different cyanobacteria and eukaryotic algae. Its selective natural toxicity towards algal bloom-forming species and its possible low-cost synthetic production in the laboratory makes it one of the most promising compounds to pursue for use as a selective algicide against harmful algal blooms. A rapid 96-well microplate bioassay was used for screening selective antialgal activity of newly synthesized bacillamides and related compounds against different cyanobacterial and microalgal cultures. Aliquots of exponential growing stock cultures were inoculated in triplicate into the microplate wells previously filled with serial dilutions of each compound in the culture medium. The plates were steadily incubated in an algal culture chamber and daily optical measurements were used to estimate cultures growth over a 216h period. Inhibition values (%) were calculated from the estimated growth curves and inhibitory concentrations IC50-216h were obtained from the sigmoidal inhibition curves fitted by probit regression analysis. The effects of bacillamide and tryptamine on cell morphology and ultrastructure were also analysed by light and transmission electron microscopy. Results showed that the toxic cyanobacteria Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon gracile, Anabaena circinalis and Anabaenopsis circularis were much more sensitive to bacilamide then the chlorophytes Ankistrodesmus falcatus and Scenedesmus obliquus. However, clear signs of morphological and ultrastructural changes induced by bacillamide could be observed on both cyanobacteria and chlorophytes. Other cyanobacteria, namely the Nostocales Nodularia spumigena and the Oscillatoriales Leptolyngbya sp. and Plankthotrix rubescens, exhibit higher tolerances to bacillamide, similar to the ones shown by different non-toxic algae. Thus, the use of bacillamide to control/remediate cyanobacterial blooms, should take into account the species composition in the phytoplankton community in order to avoid noxious effects on harmless phytoplankton. Among the other derivates tested, Fluor- and Chlorine-bacillamide showed similar results, while Metoxibacillamide seemed much less effective and Iodine-bacillamide strongly affected the growth of all the algae tested with no apparent selectivity. Concerning the bacillamide precursors, tryptamine showed much higher toxicity than bacillamides towards all the test organisms, while the 2-acethyl-1,3- thiazole-4-carboxyic acid had no growth effects on both the cyanobacteria and the microalgae screened.

Mestrado em Microbiologia Molecular
Actualmente, é cada vez mais frequente a associação de bactérias oportunistas e comensais resistentes a antibióticos com infecções nosocomiais. Este problema clínico tornou-se preocupante e deve-se ao uso indiscriminado de antibióticos. Perante esta pressão selectiva, as bactérias desenvolvem diferentes mecanismos de resistência a estes compostos. A presença de estruturas capazes de transportar genes de resistência, designadas por integrões, que contribuem para a disseminação destes genes bem como a sua associação com o perfil de resistência de bactérias constitui o objectivo do presente trabalho. Assim, foram recolhidas amostras de superfícies das instalações sanitárias, do serviço de Medicina II, do Hospital Infante D. Pedro, Aveiro. Após o isolamento das bactérias em meio selectivo para Gramnegativas (MacKonkey), todos os isolados foram sujeitos a tipagem molecular por BOX-PCR. O perfil de bandas obtido após electroforese foi analisado com o programa GelCompar II software (Applied Maths, Kortrijk, Belgium), permitindo distinguir diferentes grupos clonais. De cada grupo clonal foi seleccionado um isolado para os estudos posteriores, resultando num total de 45 isolados distintos. A pesquisa de integrões classe 1 iniciou-se por um “screening” para o gene da integrase. Nos 25 isolados positivos para este gene, foi amplificada e caracterizada a respectiva região variável. A sequência nucleotídica dos amplicões foi comparada com outras depositadas na base de dados. Os resultados mostraram a presença de integrões em diferentes espécies (Pseudomonas putida, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas mendocina, Proteus mirabillis e Morganella morganii). As regiões variáveis apresentavam diferentes tamanhos e diferentes arranjos de genes. Em geral, predominam gene cassettes que conferem resistência aos aminoglicosídeos, trimetoprime e metalo-β- lactamases. A localização destas estruturas no genoma bacteriano foi efectuada por “southern blot”; o DNA genómico foi digerido com a enzima S1, e sujeito a hibridação com sondas para os genes 16S e da integrase revelando que a maioria dos integrões estão localizados em plasmídeos. Como conclusão geral, verifica-se a prevalência de isolados contendo determinantes genéticos de resistência em superfícies inanimadas do ambiente hospitalar (53.33%), os quais podem constituir um potencial risco para os pacientes, uma vez que se trata de bactérias oportunistas. O facto de estes genes de resistência estarem associados a elementos genéticos móveis, nomeadamente transposões e muitas vezes plasmídeos, facilita a sua disseminação no ambiente hospitalar, principalmente por transferência horizontal de genes.
Currently, it is becoming frequent the association of antibiotic resistant opportunistic and commensal bacteria with nosocomial infections. This is a clinical problem of concern and is based on the indiscriminate use of antibiotics. Given the selective pressure within the hospital environment, bacteria develop different resistance mechanisms to these compounds. The presence of structures, referred as integrons, that carry and disseminate these resistance genes among bacteria and their association with the bacteria resistance profile constitutes the aim of the present study. To this end we collected samples from surfaces of sanitary facilities, of the Medicine II service of the Hospital Infante D. Pedro, Aveiro. After bacteria isolation on a selective medium (MacKonkey) for Gram negatives, all the isolates were molecular typed by BOX-PCR. After electrophoresis, the banding pattern was analysed with the GelCompar II software (Applied Maths, Kortrijk, Belgium), which allowed for the selection of different clonal groups. One isolate was selected from each group for further studies. Forty five isolates were selected for the screening of class 1 integrons. In the twenty-five positive isolates respective variable region was amplified and characterized. Amplicons nucleotide sequences were compared with others deposited in databases. The results revealed the presence of integrons in different species (Pseudomonas putida, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas mendocina, Proteus mirabillis e Morganella morganii). Different lenghts of variable regions and different genes arrays were found. Generally gene cassettes conferring resistance to aminoglycosides trimethoprim and metallo-β-lactamases were predominante. Southern hybridization of S1 digested genomic DNA with 16 rDNA and integrase genes labeled probes revealed that the majority of the integrons are located in plasmids. To conclude, is important to refer that there is a prevalence of opportunistic bacteria possessing integrons in inanimate surfaces within the hospital environment, which can constitute risk to the debilitated patients. Moreover, these structures are associated with mobile genetic elements, mainly transposons and many times plasmids, which facilitates the dissemination of these antibiotic resistance genes in the hospital environment, mainly by horizontal gene transfer.

Made available in DSpace on 2016-01-13T13:27:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-07. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-13T13:32:50Z : No. of bitstreams: 1 000856194.pdf: 1439281 bytes, checksum: 5fe9509ffb73bb1a03c287f13ce29f09 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
O câncer é um conjunto de doenças que têm em comum o crescimento celular desordenado que invade os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo (metástase). Uma série de mudanças genéticas e epigenéticas, que são associadas ao DNA que influenciam a expressão genética, ocasionam o câncer. Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior convertendo-se em um evidente problema de saúde pública mundial, sendo uma das principais causas de morte no mundo. O desenvolvimento de fármacos para o tratamento do câncer é possível de forma expressiva através da triagem de moléculas utilizando linhagens celulares tumorais ou métodos alternativos que reduzam o número de animais de experimentação. Em uma segunda etapa, ensaios in vivo em modelo convencional deverão garantir a segurança toxicológica e confirmar a biodisponibilidade da molécula. Desta forma, este estudo tem como objetivo, avaliar a atividade proliferativa frente às linhagens tumorais (HepG2, HeLa, MDA-MB-231, K-562, DU 145), o perfil mutagênico, a toxicidade em linhagem celular normal (MRC-5), pelo método alternativo (Artemia salina L.) e em camundongos BALB/c e a biodisponibilidade oral in vivo de compostos de coordenação (Mn, Co e Zn). Embora, todas as moléculas estudadas tenham apresentado efeito sobre as linhagens tumorais, os complexos de cobalto [Co(atc-Et)2]Cl e [Co(atc-Ph)2]Cl apresentaram os melhores Índices de Seletividade (IS). No ensaio de toxicidade aguda em Artemia salina L. apenas os três complexos [Mn(atc)2], [Mn(atc-Me)2] e [Co(atc-Ph)2]Cl se mostraram tóxicos para o microcustáceo, enquanto que na toxicidade aguda em camundongos apenas um complexo [Mn(atc-Me)2]. Os parâmetros bioquímicos analisados (enzimas ALT e AST), bem como o peso relativo dos órgãos dos animais, não mostraram diferença estatística significativa. No teste de Ames foi observado mutagenicidade apenas de três complexos de manganês...
Cancer is a group of diseases that have in common the uncontrolled cell growth that invades the tissues and organs and can spread to other parts of the body (metastasis). A number of genetic and epigenetic changes, that are associated with DNA and influence gene expression, cause cancer. In the last decades, cancer has gained a bigger dimension becoming an evident problem of global public health and is one of the leading cause of death worldwide. The development of drugs for the treatment of cancer is possible through screening of molecules using tumor cell lines or alternative methods that reduce the number of experimental animals. In a second step, in vivo assays in conventional model should ensure toxicological safety and confirm the bioavailability of the molecule. Thus, this study aims to evaluate the antiproliferative activity against the tumor cell lines (HepG2, HeLa, MDA-MB-231, K-562, DU 145), the mutagenic profile, toxicity in normal cell line (MRC-5) through the alternative method (Artemia salina L.) and BALB/c mice, and also, the coordination compound (Mn, Co and Zn) in vivo oral bioavailability. Although all the molecules studied have presented effect on tumor cell lines, and the cobalt complexes [Co(atc-Et)2]Cl and [Co(atc-Ph)2]Cl showed the best selectivity index (SI). In the acute toxicity test in Artemia salina L. only three complexes [Mn(atc)2], [Mn(atc-Me)2] and [Co(atc-Ph)2]Cl proved to be toxic to the microcrustacean, while that the acute toxicity in mice only one complex ([Mn(atc-Me)2]) presented toxic effect. Quantitative biochemical parameters (ALT and AST), as well as the relative weight of the organs of the animals showed no statistical difference. In the Ames test mutagenicity was observed only in three manganese complexes [Mn(atc-Me)2], [Mn(atc-Ch)2] and [Mn(atc-Ph)2]. As regards the quantification of the via ICP-OES oral bioavailability of plasma ...

Orientador: Fernando Rogério Pavan
Banca: Victor Marcelo Deflon
Banca: Rosilene Fressatti Cardoso
Resumo: O câncer é um conjunto de doenças que têm em comum o crescimento celular desordenado que invade os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo (metástase). Uma série de mudanças genéticas e epigenéticas, que são associadas ao DNA que influenciam a expressão genética, ocasionam o câncer. Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior convertendo-se em um evidente problema de saúde pública mundial, sendo uma das principais causas de morte no mundo. O desenvolvimento de fármacos para o tratamento do câncer é possível de forma expressiva através da triagem de moléculas utilizando linhagens celulares tumorais ou métodos alternativos que reduzam o número de animais de experimentação. Em uma segunda etapa, ensaios in vivo em modelo convencional deverão garantir a segurança toxicológica e confirmar a biodisponibilidade da molécula. Desta forma, este estudo tem como objetivo, avaliar a atividade proliferativa frente às linhagens tumorais (HepG2, HeLa, MDA-MB-231, K-562, DU 145), o perfil mutagênico, a toxicidade em linhagem celular normal (MRC-5), pelo método alternativo (Artemia salina L.) e em camundongos BALB/c e a biodisponibilidade oral in vivo de compostos de coordenação (Mn, Co e Zn). Embora, todas as moléculas estudadas tenham apresentado efeito sobre as linhagens tumorais, os complexos de cobalto [Co(atc-Et)2]Cl e [Co(atc-Ph)2]Cl apresentaram os melhores Índices de Seletividade (IS). No ensaio de toxicidade aguda em Artemia salina L. apenas os três complexos [Mn(atc)2], [Mn(atc-Me)2] e [Co(atc-Ph)2]Cl se mostraram tóxicos para o microcustáceo, enquanto que na toxicidade aguda em camundongos apenas um complexo [Mn(atc-Me)2]. Os parâmetros bioquímicos analisados (enzimas ALT e AST), bem como o peso relativo dos órgãos dos animais, não mostraram diferença estatística significativa. No teste de Ames foi observado mutagenicidade apenas de três complexos de manganês...
Abstract: Cancer is a group of diseases that have in common the uncontrolled cell growth that invades the tissues and organs and can spread to other parts of the body (metastasis). A number of genetic and epigenetic changes, that are associated with DNA and influence gene expression, cause cancer. In the last decades, cancer has gained a bigger dimension becoming an evident problem of global public health and is one of the leading cause of death worldwide. The development of drugs for the treatment of cancer is possible through screening of molecules using tumor cell lines or alternative methods that reduce the number of experimental animals. In a second step, in vivo assays in conventional model should ensure toxicological safety and confirm the bioavailability of the molecule. Thus, this study aims to evaluate the antiproliferative activity against the tumor cell lines (HepG2, HeLa, MDA-MB-231, K-562, DU 145), the mutagenic profile, toxicity in normal cell line (MRC-5) through the alternative method (Artemia salina L.) and BALB/c mice, and also, the coordination compound (Mn, Co and Zn) in vivo oral bioavailability. Although all the molecules studied have presented effect on tumor cell lines, and the cobalt complexes [Co(atc-Et)2]Cl and [Co(atc-Ph)2]Cl showed the best selectivity index (SI). In the acute toxicity test in Artemia salina L. only three complexes [Mn(atc)2], [Mn(atc-Me)2] and [Co(atc-Ph)2]Cl proved to be toxic to the microcrustacean, while that the acute toxicity in mice only one complex ([Mn(atc-Me)2]) presented toxic effect. Quantitative biochemical parameters (ALT and AST), as well as the relative weight of the organs of the animals showed no statistical difference. In the Ames test mutagenicity was observed only in three manganese complexes [Mn(atc-Me)2], [Mn(atc-Ch)2] and [Mn(atc-Ph)2]. As regards the quantification of the via ICP-OES oral bioavailability of plasma ...
Mestre

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Made available in DSpace on 2018-11-22T19:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Liany Figuerêdo de Andrade Melo.pdf: 5680979 bytes, checksum: 26509ea8aef8d1d77265831744059bb7 (MD5) Previous issue date: 2017-09-12
FACEPE
Palythoa caribaeorum (baba-de-boi) é um cnidário marinho que secreta um muco viscoso o qual apresenta propriedades farmacológicas e abriga uma série de bactérias com potencial de aplicação biotecnológica. No presente trabalho, objetivou-se obtenção desses micro-organismos associados ao muco de populações do zoantídeo oriundas da praia de Porto de Galinhas, litoral sul de Pernambuco, para fins de prospecção de produtos naturais. Foram isoladas 281 bactérias das quais 55 cepas se mantiveram viáveis após o subcultivo e preservação. A identificação dos isolados foi realizada a partir do sequenciamento dos genes 16S rDNA e rpoB, resultando na obtenção de 18 espécies pertencentes aos filos Firmicutes (37 isolados, 67%), Actinobacteria (11 isolados, 20%), Proteobacteria (5 isolados, 9%) e Bacteroidetes (2 isolados, 4%). Exiguobacterium aurantiacum correspondeu à espécie mais abundante com 9 isolados, enquanto o gênero Bacillus se apresentou como o mais diverso, totalizando 19 isolados distribuídos em 8 espécies distintas. Os isolados de Bacillus spp. foram selecionados para investigação do potencial de produção de 8 enzimas em meio sólido. Todas as cepas produziram pelo menos 4 das enzimas investigadas, com gelatinase sendo a mais frequente (19 isolados), seguida por esterase (18), caseinase (17), amilase (12), poligalacturonase (12), pectato liase (12), celulase (11) e lipase (11). Os isolados B. thuringiensis BCLTHR-01 e B. subtilis BCLSUB-02, 03 e 04 foram os melhores produtores enzimáticos, com resultados positivos em todos os ensaios. A cepa BCLTHR-01 também foi investigada quanto ao potencial biolarvicida contra Aedes aegypti. Para produção das toxinas, foi desenvolvido um processo fermentativo em biorreator operando em batelada com um meio de cultura desprovido de carboidratos como fonte de carbono. A biomassa tóxica concentrada (10⁹ UFC/mL) obtida após 48h de fermentação mostrou atividade biológica com valores de CL₅₀ de 0,849 ppm (intervalo de 0,792 a 0,900 ppm) e de CL₉₀ de 1,285 ppm (intervalo de 1,190 a 1,434 ppm), comprovando o potencial de aplicação deste isolado para o controle do vetor. As bactérias marinhas associadas a P. caribaeorum são potencialmente excelentes fontes de metabólitos bioativos. A presença de espécies capazes de degradar hidrocarbonetos, fixar nitrogênio, metabolizar enxofre e produzir enzimas e toxinas com diversas propriedades sugere que o zoantídeo se beneficia através da assimilação de compostos complementares ao seu metabolismo e através da aquisição de um mecanismo adicional de defesa contra patógenos. A complexidade do ambiente marinho induz à adaptação dos micro-organismos, resultando na produção de uma diversidade de moléculas com propriedades únicas que lhes permitem suportar as condições severas dos processos industriais, tornando-as interessantes objetos para aplicação industrial e biotecnológica.
Palythoa caribaeorum (baba-de-boi) is a marine cnidarian that secretes a viscous mucus which presents pharmacological properties and harbors several bacteria with potential for biotechnological application. In the present work, we aimed to obtain these microorganisms associated with the mucus of zoanthid populations from the beach of Porto de Galinhas, south coast of Pernambuco, to prospect for natural products. 281 bacteria were isolated, of which 55 strains remained viable after subculture and preservation. The identification of the isolates was done by sequencing the 16S rDNA and rpoB genes, resulting in 18 species belonging to the Firmicutes (37 isolates, 67%), Actinobacteria (11 isolates, 20%), Proteobacteria (5 isolates, 9 %) and Bacteroidetes (2 isolates, 4%). Exiguobacterium aurantiacum corresponded to the most abundant species with 9 isolates, while the genus Bacillus was the most diverse, totaling 19 isolates distributed in 8 different species. The isolates of Bacillus spp. were selected to investigate the potential to produce 8 enzymes in solid medium. All strains produced at least 4 of the investigated enzymes, with gelatinase being the most frequent (19 isolates), followed by esterase (18), caseinase (17), amylase (12), polygalacturonase (12), pectate lyase (12), cellulase (11) and lipase (11). The isolates B. thuringiensis BCLTHR-01 and B. subtilis BCLSUB-02, 03 and 04 were the best enzymatic producers, displaying positive results in all the assays. The strain BCLTHR-01 was also investigated for its biolarvicidal potential against Aedes aegypti. To produce the toxins, a fermentation process was developed in bioreactor batching with a culture medium devoid of carbohydrates as carbon source. The concentrated toxic biomass (10⁹ CFU/mL) obtained after 48h of fermentation showed biological activity with LC₅₀ value of 0.849 ppm (range of 0.792 to 0.900 ppm) and CL₉₀ value of 1.285 ppm (range of 1.190 to 1.434 ppm), proving the application potential of this isolate for vector control. Marine bacteria associated with P. caribaeorum are potentially excellent sources of bioactive metabolites. The presence of species capable of degrading hydrocarbons, fixing nitrogen, metabolizing sulfur and producing enzymes and toxins with different properties suggests that the zoanthide benefits through the assimilation of compounds complementary to its metabolism and through the acquisition of an additional mechanism of defense against pathogens. The complexity of the marine environment induces the adaptation of microorganisms, resulting in the production of a diversity of molecules with unique properties that allow them to withstand the harsh conditions of industrial processes, making them interesting objects for industrial and biotechnological application.

Durante la mia tesi di dottorato ho selezionato nuovi potenziali ceppi probiotici, combinando l'approccio convenzionale con l’utilizzo di piattaforme di nuova concezione. Mi sono concentrata inizialmente sul cosiddetto "screening tradizionale" finalizzato all'isolamento di nuovi ceppi batterici di lattobacilli e bifidobatteri e alla valutazione della loro sicurezza per il consumo umano e della loro efficacia. I ceppi selezionati sono stati quindi sottoposti ad uno screening più specifico, a seconda dell'applicazione a cui sarebbero stati destinati. In questa fase sono stati utilizzati sia test in vitro che modelli animali, al fine di valutare l'applicabilità dei ceppi di recente selezionati come probiotici per la promozione della salute umana e il loro possibile impiego in campo alimentare. Ho valutato il potenziale utilizzo dei ceppi nell’integrazione alimentare di soggetti che seguono diete ad alto contenuto proteico per ridurre il rischio di accumulo intestinale di ammine biogene, e ho individuato un ceppo di Lactobacillus con presunta attività ammino-degradativa. L'obiettivo principale di un’altra attività di screening è stato lo studio degli effetti immunomodulanti di nuovi ceppi: combinazioni di probiotici sono risultati buoni candidati per il trattamento delle malattie infiammatorie e autoimmuni (miastenia grave e sclerosi multipla) nel modello di topo. Infine, i ceppi sono stati sottoposti a screening per una potenziale applicazione in campo alimentare, finalizzata ad indagare la possibilità di produrre formulazioni di probiotici “atomizzati” da utilizzare insieme alla base commerciale del gelato.
During my PhD thesis I screened new potential probiotic strains by combining conventional approach to newly designed platforms. I focused first on the so-called "conventional screening” aimed to the isolation of new bacterial strains of lactobacilli and bifidobacteria and to assess their safety for human consumption and their efficacy by in-vitro methods. Selected strains were then submitted to a targeted screening by specifically designed models, depending on the application to which they would be destined. These models combined in vitro tests and animal models in order to assess the applicability of newly selected strains as probiotics for the promotion of human health and their possible use in food field. I evaluated the potential use of strains in the food supplementation of subjects that follow high-protein diets to reduce the risk of intestinal accumulation of biogenic amines, and I identified a strain of Lactobacillus with alleged amino degradative activity. The main objective of another screening activity was the study of the immunoregulatory effects of new strains: combinations of probiotics resulted good promising candidates for the treatment of inflammatory and autoimmune diseases (myasthenia gravis and multiple sclerosis) in rat model. Finally, strains were screened for a potential application in food field, in order to investigate the possibility of producing spray-dried probiotic formulations to be used together with commercial ice-cream bases.

Durante la mia tesi di dottorato ho selezionato nuovi potenziali ceppi probiotici, combinando l'approccio convenzionale con l’utilizzo di piattaforme di nuova concezione. Mi sono concentrata inizialmente sul cosiddetto "screening tradizionale" finalizzato all'isolamento di nuovi ceppi batterici di lattobacilli e bifidobatteri e alla valutazione della loro sicurezza per il consumo umano e della loro efficacia. I ceppi selezionati sono stati quindi sottoposti ad uno screening più specifico, a seconda dell'applicazione a cui sarebbero stati destinati. In questa fase sono stati utilizzati sia test in vitro che modelli animali, al fine di valutare l'applicabilità dei ceppi di recente selezionati come probiotici per la promozione della salute umana e il loro possibile impiego in campo alimentare. Ho valutato il potenziale utilizzo dei ceppi nell’integrazione alimentare di soggetti che seguono diete ad alto contenuto proteico per ridurre il rischio di accumulo intestinale di ammine biogene, e ho individuato un ceppo di Lactobacillus con presunta attività ammino-degradativa. L'obiettivo principale di un’altra attività di screening è stato lo studio degli effetti immunomodulanti di nuovi ceppi: combinazioni di probiotici sono risultati buoni candidati per il trattamento delle malattie infiammatorie e autoimmuni (miastenia grave e sclerosi multipla) nel modello di topo. Infine, i ceppi sono stati sottoposti a screening per una potenziale applicazione in campo alimentare, finalizzata ad indagare la possibilità di produrre formulazioni di probiotici “atomizzati” da utilizzare insieme alla base commerciale del gelato.
During my PhD thesis I screened new potential probiotic strains by combining conventional approach to newly designed platforms. I focused first on the so-called "conventional screening” aimed to the isolation of new bacterial strains of lactobacilli and bifidobacteria and to assess their safety for human consumption and their efficacy by in-vitro methods. Selected strains were then submitted to a targeted screening by specifically designed models, depending on the application to which they would be destined. These models combined in vitro tests and animal models in order to assess the applicability of newly selected strains as probiotics for the promotion of human health and their possible use in food field. I evaluated the potential use of strains in the food supplementation of subjects that follow high-protein diets to reduce the risk of intestinal accumulation of biogenic amines, and I identified a strain of Lactobacillus with alleged amino degradative activity. The main objective of another screening activity was the study of the immunoregulatory effects of new strains: combinations of probiotics resulted good promising candidates for the treatment of inflammatory and autoimmune diseases (myasthenia gravis and multiple sclerosis) in rat model. Finally, strains were screened for a potential application in food field, in order to investigate the possibility of producing spray-dried probiotic formulations to be used together with commercial ice-cream bases.

Cervical cancer is the fourth most common cancer in women and the cytological screening represents the most diffuse method of prevention. Human papillomavirus (HPV) is an established essential etiological factor for this cancer. Persistence of HPV infection, particularly by those belonging to the high-risk types (HR-HPV), is associated with an increased risk for cervical cancer development. Low-risk HPV (LR-HPV) types are more often associated with benign warts. Most invasive carcinomas are caused by two HR-HPV types: HPV16 and 18. Recently, HPV tests are used as an adjunct test to decrease the falsenegative rate of cytological screening with Papanicolaou test (PAP Test), especially HR-HPV DNA detection tests are useful for primary screening of cervical cancer and for triage of patients with equivocal cytological findings. However, the roles and contributions of other uncommon and rare genotypes remain uncertain, especially in specific geographic areas or populations. Recently, microarray biochip technology has been introduced into the clinical laboratory for HPV detection. One such test is the ProDect® CHIP HPV TYPING KIT (bcs Biotech Srl, Italy), which has the ability to identify 19 HPV types (all HR-HPV and most common LR-HPV types) and detect the generic presence of E6/E7 HR-HPV sequences. The aim of this pilot study was design a new biochip (CHIP PLUS) for the cervical cancer screening able to detect a large number of HPV anogenital types (HR- and LR-HPV) using two regions of the viral genome (L1 and E6/E7 sequences) as targets. This report also presents the results of a preliminary validation study in preparation for an extended clinical validation of the medical diagnostic ProDect® CHIP HPV TYPING PLUS employing the above CHIP PLUS designed both for the simultaneous detection of 31 HPV types (both common and uncommon HPV types) and for the characterization of three E6/E7 consensus sequences belonging to the principal groups of HR-HPV. The preliminary results of the ProDect® CHIP HPV TYPING PLUS KIT validation had higher concordance and/or greater compatibility with those of the reference tests, underlining the importance of searching for uncommon HPV types, enabling good prevention of cervical cancer using HPV DNA as test screening.

La ricerca di microrganismi fermentanti in grado di migliorare le proprietà microbiologiche, fisiche, chimiche, sensoriali e organolettiche delle bevande alcoliche fermentate come vino, birra, idromele, sidro, è considerata ad oggi un punto chiave per lo sviluppo del settore. Negli ultimi anni, l'aumento della domanda al consumo di nuove bevande fermentate ha causato un enorme bisogno di tecnologie di produzione innovative al fine di ottenere diverse tipologie di prodotti caratterizzati da proprietà sensoriali peculiari. Per raggiungere tale obiettivo, l’impiego di nuovi microrganismi, sia fermentanti che non fermentanti, in grado di conferire al prodotto caratteristiche organolettiche peculiari ed uniche, può rappresentare una valida alternativa ai classici ceppi attualmente in commercio. Il settore vitivinicolo-enologico risulta quello in cui la ricerca ha sviluppato conoscenze sufficienti ad applicare nuove specie e nuovi ceppi di lieviti su scala industriale. La ricerca di lieviti non convenzionali applicabili alle bevande alcoliche che nell’Europa meridionale sono considerate secondarie rispetto al vino, ovvero birra, sidro ed idromele, risulta essere ancora poco investigata, essendo scarsi gli studi disponibili sulla fermentazione di queste bevande. In particolare, il settore birrario sta riscoprendo un rinnovato interesse nei confronti di lieviti isolati da matrici territoriali, considerati responsabili del miglioramento e della creazione di bouquet particolari, che consentono di ottenere produzioni legate al territorio e differenziate su un mercato in forte espansione. Analogamente alla produzione di birra artigianale, la produzione di idromele sta attualmente vivendo un interesse a livello amatoriale e professionale in tutto il mondo. Sebbene non sia una bevanda molto popolare, il suo consumo in Europa è in costante crescita. Anche in questo settore la letteratura scientifica risulta limitata, specialmente in ambito microbiologico, dato che per condurre le fermentazioni alcoliche sono spesso usati ceppi di S. cerevisiae di origine enologica. Diversamente dal mosto d’uva, il mosto-miele risulta carente in fattori nutrizionali che limitano la crescita microbica. Per tale motivo, la ricerca di lieviti appropriati in grado di crescere e fermentare queste matrici risulta essere un punto cruciale per mantenere un elevato standard qualitativo di questa bevanda. Sulla base di queste premesse, durante il triennio di Dottorato di ricerca è stata condotta uno studio inerente: l’ecologia microbica di matrici zuccherine; l’isolamento, la caratterizzazione genotipica e tecnologica di lieviti, sia Saccharomyces che non-Saccharomyces; la loro applicazione, sia singolarmente che in combinazione, durante le fermentazioni sperimentali di mosto di birra e mosto-miele; la valutazione della cinetica di fermentazione, metaboliti secondari, composti organici volatili ed analisi sensoriale dei prodotti ottenuti.

Epidemiologia e tipizzazione molecolare su 135 ceppi di Staphylococcus aureus meticillino resistenti isolati secondo il programma di screening del sistema di sorveglianza su ceppi multi resistenti e su emocoluture. 94 ceppi solati da tamponi faringei e rettali e 41 da emocolture del policlinico di Verona " G. Rossi.SLa ricerca in questo ambito si occupa dello studio di nuove strumenti diagnostici e terapia salvavita che permettano di individuare velocemente ceppi multi-resistenti, in campioni clinici riducendo i tempi di refertazione, per dare garanzia di una corretta e immediata terapia. STudio di una triplex real time home-made che indivia direttamente da campione la specie,la resistenza alla meticillina e la presenza della tossina PVL.Abbiamo inoltre caratterizzato la cassetta cromosomica mobile SCCmec e le rispettive correlazione con i diversi profili di antibiotico resistenza tra 6 spa-type più rappresentativi quali: t032 CC22, t1036 CC22, t1214 CC22 ,t022 CC22, t041 CC5 ,t121 CC8, ricercati su 135 ceppi di MRSA provenienti da tamponi faringei, rettali e emocolture di cui rispettivamente 94 da tamponi rettali e faringei e 41 da emocolture. 128 ceppi sono stati ritrovati appartenenti al tipo SCCmec IV e 7 appartenenti al tipo t041 appartenenti a SCCmec I, rispettivamente tutti tutti di classe B. Abbiamo notato inoltre che nei 41 ceppi isolati da emocolture mancano gli spa-type t1036 e t022 considerati tra i “6 rappresentativi” ritrovati in questo studio. Il nostro pensiero, per le ricerche future sarà quello di aumentare il numero di ceppi isolati da emocolture. Abbiamo individuato un nuovissimo spa-type t16026 CC22 sottomesso nell’anno 2016.Possiamo quindi concludere che i ceppi di MRSA isolati presso i reparti di anestesia e rianimazione, terapia intensiva, medicina interna, oncologia, pediatria, centro ustioni del policlinico di Verona “G. Rossi” hanno un profilo molecolare attribuibile per definizione ai ceppi comunitari CA-MRSA ma un profilo di multi- resistenza tipico dei ceppi ospedalieri e solo 6 ceppi presentano il gene pvl.Quindi possiamo ipotizzare ad un cambiamento epidemiologico e microbiologico di ceppi di MRSA isolati in questa parte dell’Italia e si potrebbe inoltre proporre un cambiamento di definizione dei CA-MRSA.Un altro obiettivo è stato quello di studiare una Real-time PCR che rilevasse rapidamente la resistenza alla meticillina , il fattore di virulenza PVL direttamente da un campione clinico e il gene nuc (specie -specifico) . Questa tecnica presentata in questo studio può identificare e differenziare MRSA, MSSA, resistente alla meticillina, Stafilococchi negativi alla coagulasi (MR-CNS) con un significato diagnostico e terapeutico di notevole importanza e una riduzione dei tempi di refertazione dalle 48h ad 1h 30 minuti. Questa tecnica automatizzata e standardizzata ha come risultato una concordanza del 100% con le tecniche molecolari standard , il 100% di specificità e una sensibilità di 514 UFC/ml.tudio del profilo antibiotico.

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
Antibiotics are one of the most successful forms of chemotherapy and saved million of lives placing most bacterial infectious diseases under control. However, this success has been compromised the continuous selective pressure exerted by antibiotics use has resulted in multi-resistance bacteria bearing resistance mechanisms to several antibiotics. Nowadays, there is an increased recognition that not only clinical settings constitute resistance reservoirs. The soil is a vast reservoir of resistance mechanisms and their associated genes, so understanding the resistant determinants present in the soil, the soil resistome, will provide information about antibiotic resistance frequencies and also emergence of new resistance mechanisms. Quinolones are an important group of synthetic antibiotics, recently plasmid mediated quinolone resistance mechanisms were established, some originated in environmental reservoirs. In this work the main goal was to study a collection of (fluoro)quinolone resistant environmental isolates, in terms of their ciprofloxacin MIC and screen them for the presence of qnr genes. With a smaller group of isolates the phenotypic impact of ciprofloxacin in growth curves/cellular viability was studied and finally detected and characterized induced variations of cell protein profiles, to study how ciprofloxacin affects, at a molecular level these bacteria. Results showed that ciprofloxacin MIC values had similar distributions in the soil samples from the two sample types from where these strains were isolated; in terms of resistance determinants results point that a qnrS gene was found in a Comamonas testosteroni isolate. In the second part of this work, Stenotrophomonas maltophilia response to ciprofloxacin was studied, and the growth curves/cellular viabilities results showed that S. maltophilia cells tolerate/resist ciprofloxacin action when in stationary growth. Significant differences were observed between cell total protein profiles from cells exposed to ciprofloxacin and the control. That study can help understand bacterial general response to fluoroquinolones, in addition to more classical genetic mutation, and also what intracellular pathways this antibiotic might trigger.
A utilização de antibióticos permitiu salvar milhões de vidas e controlar inúmeras doenças infecciosas, contudo a eficácia destes fármacos está hoje em risco. A utilização generalizada dos antibióticos levou ao aparecimento e disseminação de diversos mecanismos de resistência aos antibióticos que comprometem a eficácia dos mesmos. As bactérias multi-resistentes estão a tornar-se um grave problema de saúde pública, pois possuem mecanismos de resistência para várias classes de antibióticos, restando assim poucos antibióticos eficazes para a sua terapêutica. Durante as últimas décadas, o estudo da resistência aos antibióticos focou-se sobretudo nos meios clínicos e em microrganismos patogénicos. Mas, recentemente, tem sido reconhecido que outros ambientes e microrganismos não patogénicos também contribuem largamente para o processo de desenvolvimento e disseminação de mecanismos de resistência. Um dos ambientes cuja importância em termos de reservatório de resistência tem sido reconhecida é o solo. É um ecossistema complexo onde os antibióticos e os seus genes de resistência sempre estiveram presentes devido aos microrganismos produtores de antibióticos. Contudo, diversas actividades antropogénicas provocam a contaminação do solo com antibióticos e microrganismos resistentes o que influencia não só a estrutura da microbiota do solo como contribui para o desenvolvimento de mecanismos de resistência aos antibióticos. Num estudo recente, em que se analisou o nível de resistência de bactérias do solo a diversas classes de antibióticos, verificou-se que a maioria delas é multi-resistente e são resistentes mesmo a antibióticos sintéticos como as quinolonas. Este e outros estudos contribuíram para o reconhecimento da importância do solo como um reservatório para a emergência de mecanismos de resistência e bactérias resistentes. Surgiu assim um novo conceito, o resistoma do solo que consiste no conjunto de determinantes de resistência presentes no solo. As quinolonas são um grupo de antibióticos sintéticos que inibe a replicação e transcrição do DNA bacteriano conduzindo à morte celular. Durante muitos anos, pensou-se que a resistência às quinolonas se devia apenas a mutações que modificassem as enzimas alvo (topoisomerases tipo II) ou activassem a expressão de bombas de efluxo. Contudo, nos últimos anos novos mecanismos de resistências às quinolonas codificados em plasmídeos têm sido identificados. Um desses mecanismos é o gene qnr, codifica uma proteína que protege o DNA e as topisomerases tipo II do efeito das quinolonas. Recentemente a proteómica tem sido utilizada como uma nova abordagem no estudo da resposta bacteriana a diversos estímulos do meio, entre os quais podemos considerar a exposição aos antibióticos. O proteoma é o conjunto de proteínas produzidas por uma bactéria num determinado momento; ao contrário do genoma, o proteoma é dinâmico e varia rapidamente em função dos diferentes estímulos do ambiente onde as bactérias se encontram. A comparação entre perfis proteicos de bactérias não expostas e expostas a antibióticos está a ser utilizada no estudo dos mecanismos de resistência e resposta das bactérias aos antibióticos ou no modo de acção dos mesmos. O objectivo geral deste trabalho foi estudar uma colecção de bactérias ambientais resistentes às (fluoro)quinolonas, isoladas de solos provenientes de dois tipos de locais, quintas de produção animal e margens do rio Tejo, onde diversos factores podem contribuir para o desenvolvimento de resistências. Primeiro, esta colecção de isolados foi caracterizada em termos da sua resistência à ciprofloxacina e foi feita uma triagem do gene qnr. Para a execução do segundo objectivo deste trabalho realizaram-se curvas de crescimento e viabilidades para estudar de que forma a ciprofloxacina afecta o crescimento de Stenotrophomonas maltophilia. Perfis protéicos totais de culturas de S. maltophilia crescidas sem ou com ciprofloxacina foram comparados para determinar variações que possam reflectir as mudanças fisiológicas desencadeadas por este antibiótico. O nível de resistência dos isolados foi estabelecido pela determinação da sua CMI (concentração mínima inibitória) para a ciprofloxacina. Comparando os valores de CMI obtidos entre os isolados provenientes dos dois tipos de locais de amostragem, margens do rio Tejo e quintas de produção de animais, verificamos que são semelhantes, sendo que a maioria das CMI é entre 1 e 8 μg/ml. Para pesquisar a presença de isolados qnr-positivos nesta colecção de bactérias ambientais efectuamos um PCR multiplex com três conjuntos de primers previamente descritos, desenhados para amplificar as principais famílias do gene qnr estudadas até agora: qnrA, qnrB e qnrS. Dos 112 isolados só para um, mais tarde identificado como Comamonas testosteroni, se obteve amplificação positiva. Contudo estes resultados apresentam alguma reserva pois a amplificação não foi totalmente específica e só estudos adicionais permitirão confirmar se este se trata ou não do primeiro gene qnr encontrado em C. testosteroni. Para a realização do segundo objectivo principal deste trabalho o grupo de estirpes em estudo foi reduzido. Primeiro, os isolados com maior CMI para a ciprofloxacina foram identificados por galerias API®. Estes 16 isolados pertencem a 4 géneros diferentes, Comamonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas e Aeromonas. Seguidamente para os isolados seleccionados foram determinadas as CMI e os halos de inibição para alguns antibióticos da classe dos β-lactâmicos. Os resultados revelaram que os isolados S. maltophilia são os que apresentam maior nível de resistência a esta classe de antibióticos. Com base em todos os resultados obtidos previamente optou-se por utilizar os oito isolados de S. maltophilia para a realização do segundo objectivo principal deste trabalho. Primeiro foram realizadas curvas de crescimento em que diferentes quantidades de ciprofloxacina, correspondentes a 1/2MIC, MIC e 2xMIC de cada isolado, eram adicionadas a culturas de S. maltophilia durante a fase exponencial de crescimento ou durante a fase estacionária de crescimento. Em paralelo, diluições da cultura foram plaqueadas para testar como a ciprofloxacina estava a afectar a viabilidade celular. Em conjunto estes resultados permitiram verificar que as curvas de crescimento por OD não reflectem o efeito que a ciprofloxacina está a ter nas células S. maltophilia. Quando a ciprofloxacina é adicionada, durante a fase exponencial, a viabilidade celular decresce significativamente comparativamente ao controlo mas tal descida não se reflecte numa descida de OD600nm nas curvas de crescimento. A análise dos resultados obtidos quando a ciprofloxacina é adicionada a bactérias que já se encontram em fase estacionária indica que nesta fase estas toleram e/ou resistem à presença de ciprofloxacina pois o tratamento com este antibiótico não provoca morte celular. Perfis proteicos de culturas de S. maltophilia crescidas em diferentes condições foram obtidos por SDS-PAGE. Primeiro num sistema de mini géis com o qual os géis obtidos não permitiram uma suficiente discriminação do padrão mas revelaram uma clara distinção entre os perfis de células em fase exponencial ou estacionária. Visto as células de S.maltophilia serem afectadas pela ciprofloxacina, quando em crescimento exponencial, os perfis proteicos das células nestas condições foram repetidos em géis de maiores dimensões. Deste modo, foi possível obter perfis proteicos com maior resolução e comparar os perfis proteicos das células em condições controlo com as expostas à ciprofloxacina. Esta comparação revelou diferenças significativas, especialmente para o caso do isolado S. maltophilia 4 indicando que os perfis proteicos reflectem o ambiente de crescimento das bactérias e nomeadamente o stress induzido pela ciprofloxacina. O estudo mais pormenorizado destas variações do proteoma, recorrendo a técnicas como géis 2D e espectofotometria de massa, está em curso e permitirá identificar proteínas com potencial relevância nos processos de resistência ou no modo de acção da ciprofloxacina.