Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Méthylation intragénique de l'ADN“

Le diabète a atteint des proportions épidémiques dans le monde entier. Des éléments de preuves suggèrent qu’il y a une interaction complexe entre les gènes et l'environnement pouvant ainsi jouer un rôle majeur dans la pathogénie multifactorielle de cette maladie et ses complications évoquant ainsi, un résultat de l'implication des facteurs épigénétiques. De récentes études montrent que les facteurs épigénétiques, y compris la méthylation de l'ADN et les modifications de l’histone, peuvent affecter la sensibilité ainsi que l’évolution des complications du diabète de type 2. Toutefois, nos connaissances sur les mécanismes moléculaires reliés aux facteurs environnementaux et le diabète de type 2 restent limitées.

L'épigénétique est communément définie comme l’étude de l'ensemble des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’expression des gènes qui sont réversibles et transmissibles au cours du développement et parfois entre générations, sans altérer la séquence de l'ADN. Plusieurs mécanismes épigénétiques sont maintenant bien connus, comme la méthylation de l'ADN, les variants et modifications post-traductionnelles des histones, ainsi que certains ARN non codants. Grâce au développement technologique du séquençage tout-génome, ces « marques » épigénétiques peuvent être étudiées à l'échelle du génome entier. Il est aujourd’hui clairement établi que l’épigénome, c'est-à-dire l'ensemble des marques épigénétiques d'un tissu, est sensible aux fluctuations de l’environnement, notamment la température ou l’alimentation. Des stratégies de programmation précoce des phénotypes reposant sur ces mécanismes épigénétiques sont ainsi envisagées comme levier pour adapter le phénotype ultérieur des individus à leurs conditions de vie. Par ailleurs, au cours des dernières décennies, la sélection génétique a contribué à l’amélioration considérable des performances des animaux. Bien que la composante génétique puisse être estimée avec précision, une grande partie de la variabilité phénotypique n'est pas directement accessible par les approches actuelles. Dans un contexte de diversification des environnements de production (changement climatique, modes de production plus respectueux du bien-être et de l'environnement), il est nécessaire de comprendre l'impact de l'environnement sur la variabilité phénotypique via les marques épigénétiques, pour optimiser les systèmes d'élevage et mieux prédire le phénotype d'un animal. Comme la sélection génomique il y a quelques années, l'apport de la recherche en épigénétique pourrait contribuer à rendre les systèmes de production avicole plus efficaces et plus durables.

Comme toutes les espèces de rente, les oiseaux d'élevage ont été sélectionnés génétiquement afin d’augmenter leurs performances. Cependant, de nombreuses études ont montré que le phénotype d’un individu n’est pas le simple résultat de son patrimoine génétique. En effet, il est également sensible aux variations de l’environnement (température, nutrition…) qui peuvent notamment induire des altérations de marques épigénétiques aboutissant à des changements durables des programmes d’expression de gènes. Il est donc essentiel de comprendre comment les épigénomes sont régulés afin d’envisager de futurs leviers ou marqueurs d’adaptation des animaux. Aujourd’hui, le séquençage à haut-débit est devenu relativement abordable et les outils bio-informatiques matures pour envisager l’étude des marques épigénétiques à l'échelle du génome. Chez les oiseaux, un nombre croissant d'études utilisent ces technologies à haut-débit pour explorer les mécanismes épigénétiques impliqués dans des processus tels que l'immunité ou l'adaptation à l’environnement. Dans cette synthèse, nous décrivons en quoi ces technologies ont contribué à enrichir les connaissances sur l'épigénome aviaire et plus particulièrement celui du poulet, en nous focalisant sur les deux types de modifications épigénétiques les plus étudiées, la méthylation de l'ADN et les modifications post-traductionnelles des histones. Nous présentons également les concepts nécessaires à la conception et la réalisation des analyses haut-débit des épigénomes aviaires. En plus des connaissances fondamentales fortement attendues par la communauté scientifique, une meilleure compréhension des mécanismes épigénétiques à l’origine de la régulation de l’expression génique en réponse aux modifications environnementales chez l’oiseau pourrait contribuer au développement d’une production avicole durable.

L'épissage alternatif de l'ARN précurseur est un processus co-transcriptionnel qui affecte la grande majorité des gènes humains et contribue à la diversité des protéines. Le dérèglement d'un tel processus est impliqué dans diverses maladies, y compris la tumorigènes. Cependant, les mécanismes qui régulent ces processus restaient à caractériser. Dans cette étude, nous avons montré que les perturbations de l'épissage alternatif étaient corrélées aux dérèglements de la transcription convergente et de la méthylation de l'ADN. Une transcription convergente peut être générée entre des paires de gènes voisins en en orientation opposée, ou entre des amplificateurs intragéniques et leur gène hôte. CENPO et ADCY3 ont été identifiés comme une paire de gènes de transcription convergentes. Nous avons constaté, dans un modèle de progression tumorale du cancer du sein, que le changement d'épissage de l'exon22 variant d'ADCY3 était corrélé à une augmentation de sa transcription qui allait contre celle de CENPO. En utilisant le système de répression ciblée de la transcription CRISPRi, nous avons démontré que l’inhibition de la transcription de CENPO ne pouvait pas inverser l'altération d'épissage alternatif d'ADCY3 dans les cellules cancéreuses (DCIS). Un activateur intragénique actif a été identifié dans l'intron16 du gène CD44, en aval de ses exons alternatifs. En utilisant le système d'activation ciblée de transcription CRISPRa, nous avons montré que l’augmentation de la transcription de CD44 ne pouvait pas modifier l'épissage alternatif de CD44 dans les cellules DCIS. Ces résultats suggèrent que la modification de transcription convergente par des changements d’activité des promoteurs ne permet pas d’altérer l'épissage alternatif de ADCY3 et CD44 dans les cellules DCIS. Cependant, en remplaçant l'amplificateur intragénique par un promoteur inductible, nous avons constaté que l'activation de la transcription intragénique augmentait le niveau d'inclusion de plusieurs exons alternatifs de CD44 dans les cellules HCT116. Ce résultat suggère que la transcription convergente local pourrait avoir un impact direct sur l'épissage alternatif de CD44. De plus, en utilisant le système de méthylation de l'ADN ciblée CRISPR/dCas9-DNMT3b, nous avons démontré que la méthylation de l'ADN au niveau des exons variants pouvait modifier l'épissage alternatif de CD44. Ce travail de thèse a également exploré les limites et la faisabilité de l'étude de l'épissage alternatif avec des outils moléculaires basés sur le système CRISPR
Alternative splicing of precursor RNA is a co-transcriptional process that affects the vast majority of human genes and contributes to protein diversity. Dysregulation of such process is implicated in various diseases, including tumorigenesis. However, the mechanisms regulating these processes were still to be characterized. In this study, we showed that perturbations of alternative splicing correlated with dysregulations of convergent transcription and DNA methylation. Convergent transcription could be generated between pairs of neighboring genes in opposite orientation, or between intragenic enhancers and their host gene. CENPO and ADCY3 was identified as a convergent transcription gene pair. We found, in a tumor progression model of breast cancer, that the splicing change of the ADCY3 variant exon22 correlated with an increase of its transcription that went against that of CENPO. By using targeted transcription repression system CRISPRi, we demonstrated that downregulating the transcription of CENPO could not reverse the alternative splicing alteration of ADCY3 in cancer cells (DCIS). An active intragenic enhancer was identified in the intron16 of CD44, at the downstream of its alternative exons. By using targeted transcription activation system CRISPRa, we showed that upregulating the transcription of CD44 could not alter the alternative splicing of CD44 in DCIS cells. These results suggest that convergent transcription modulation through changes of promoter activity does not alter the alternative splicing of ADCY3 and CD44 in DCIS cells. However, through replacing the intragenic enhancer by an inducible promoter, we found that intragenic transcription activation increased the inclusion level of several alternative exons of CD44 in HCT116 cells. This result suggested that local convergent transcription could have a direct impact on the alternative splicing of CD44. Furthermore, by using targeted DNA methylation system CRISPR/dCas9-DNMT3b, we showed that DNA methylation at variant exons could directly modify CD44 alternative splicing. This thesis work also explored the limitation and feasibility of studying alternative splicing with repurposed CRISPR systems

La méthylation de l’ADN est la marque épigénétique la plus connue. Elle consiste en l’ajout d’un groupement méthyle au niveau de la cytosine, produisant la 5-méthyl-cystosine (5mC). Cette réaction chimique est catalysée par des ADN méthyltransférases : DNMT1, DNMT3A et DNMT3B. Peu de choses sont connues concernant les changements de 5mC au cours des lignages cellulaires dans l’embryon et comment cette marque contribue à l’établissement ou au maintien de l’identité cellulaire. Nous avons cherché à mieux comprendre ces mécanismes en étudiant la 5mC dans deux lignages cellulaires : les cellules primordiales germinales (PGCs) et les cellules souches hématopoïétiques (HSCs). Nous avons généré les premiers méthylomes de ces cellules au cours de leur développement chez la souris. Chez les PGCs, nous avons mis en évidence l’existence de deux phases de reprogrammation de la 5mC. Une première phase entre E9,5 et E13,5, où le génome des PGCs se déméthyle et une phase de reméthylation entre E14,5 et E17,5, chez les gamètes mâles uniquement. Néanmoins, certaines régions, dont notamment les éléments transposables sont résistants à la vague de déméthylation. L’utilisation de souris conditionnellement, nous a permis de mettre en évidence l’implication des protéines DNMT1 et UHRF2 dans le maintien de la 5mC au niveau de ces séquences. Concernant les HSCs, nous avons mis en évidence qu’elles acquièrent un profil de 5mC qui leur est propre lors de deux phases. La première a lieu dès l’apparition des HSCs dans l’organisme tandis que l’acquisition de la signature hématopoïétique définitive se déroule à l’âge adulte dans la moelle osseuse. L’utilisation de souris conditionnelles, nous a permis de mettre en exergue l’implication de DNMT3A et DNMT3B dans la mise en place de ces profils, avec un rôle prépondérant de DNMT3B lors de la phase d’acquisition précoce et de DNMT3A lors du verrouillage de leur profil de 5mC
The methylation of DNA is a well-known epigenetic mark. It consists in adding a methyl group to a cytosine producing the 5-methylcytosine (5mC). This is catalysed by the DNA methyltransferase (DNMT) family: DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. Little is known about the changes in DNA methylation that follow lineage decisions in the embryo and how these contribute, establish or maintain cellular identities. We are addressing these questions using as a model the specification of mouse primordial germ cells (PGCs) and mouse hematopoietic stem cells (HSCs) in the mouse embryo. We generate the first genome-wide maps of 5mC during their development. These maps highlight two waves of DNA methylation in PGCs. The first one takes place between E9,5 and E13,5, where the genome demethylates while the second one corresponds to a remethylation phase only in male PGCs between E14,5 and E17,5. Nevertheless, some regions, notably the transposable elements, are resistant to this demethylation wave. We demonstrate the implication of DNMT1 and UHRF2 in maintaining the 5mC on these regions using transgenic mice presenting specific deletion in PGCs. In HSCs, the 5mC maps highlight two wave of DNA methylation. The first one correlates with the first appearance of the HSCs in early embryos while the second one corresponds to their migration to the bone marrow and seems to act as a definitive lock for their hematopoietic identity. Using transgenic mice presenting specific deletions in HSCs, we prove the implication of DNMT3A and DNMT3B in hematopoietic stem cells, with a major role in locking HSC identity of DNMT3B during the first wave and a DNMT3A during the second one respectively

Le cancer du pancréas est la quatrième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. Ce cancer implique des changements dans les profils de méthylation de l'ADN ainsi que la surexpression des enzymes responsables de sa mise en place : les méthyltransférases de l'ADN. Cependant, le rôle exact joué par ces protéines dans la carcinogénèse restent à être prouvés. Nous avons d'abord cherché à déterminer l'évolution des profils de méthylation de l'ADN à travers l'étude de l'expression d'un microARN particulier : miR-148a. Nous avons confirmé la répression de miR-148a par la hyperméthylation dans plusieurs lignées cellulaires dérivées de cancer du pancréas ainsi que dans des échantillons de tumeurs humaines, et nous avons montré l'utilité de cette marque pour le diagnostic différentiel entre cancer du pancréas et pancréatite chronique. Nous avons de plus évalué le potentiel thérapeutique de miR-148a par transfert de gènes in vitro et in vivo. Nous n'avons observé aucun changement significatif dans le comportement des cellules/tumeurs surexprimant miR-148a. Ceci indique que sa répression est une altération mineure accompagnant la cancérogenèse plutôt qu'un phénomène crucial du développement tumoral. Nous avons enfin élargi notre étude pour déterminer si la seule surexpression de méthyltransférases de l'ADN est capable de transformer des cellules pancréatiques normales. Nous avons observé que la surexpression stable de ces protéines affecte considérablement le comportement des cellules in vitro, ainsi que leur profil de méthylation et d'expression génique. Ces résultats suggèrent fortement que la méthylation de l'ADN facilite la carcinogénèse, mais n'est pas suffisante pour déclencher la formation de tumeurs. Ces travaux contribuent à une meilleure compréhension de la carcinogénèse pancréatique, du rôle joué par la méthylation de l'ADN, et ouvrent de nouveaux horizons concernant le rôle potentiellement oncogène de la méthylation de l'ADN
Pancreatic cancer is the fourth leading cause of cancer death in Western countries. This cancer involves changes in DNA methylation patterns and overexpression of enzymes responsible for its implementation : the DNA methyltransferases. However, the exact role of these proteins in carcinogenesis remains to be proven. We first aimed to determine the changing in the DNA methylation pattern through the study of the expression of a specific microRNA : miR- 148a. We confirmed the repression of miR- 148a by DNA hypermethylation in several cell lines derived from pancreatic cancer as well as in human tumor samples, and we shown the usefulness of this mark in the differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. We also evaluated the therapeutic potential of miR- 148a gene transfer in vitro and in vivo. We observed no significant changes in the behavior of cells / tumors overexpressing miR- 148a. This indicates that its repression is a minor alteration accompanying carcinogenesis rather than a crucial phenomenon of tumor development. Finally, we extended our study to determine whether the single overexpression of DNA methyltransferases can transform normal pancreatic cells. We observed that the stable overexpression of these proteins significantly affects the behavior of cells in vitro, their methylation patterns and gene expression. These results strongly suggest that DNA methylation facilitates carcinogenesis, but is not sufficient to trigger the formation of tumors. This work contributes to a better understanding of pancreatic carcinogenesis, the role of DNA methylation and open new horizons for the potential oncogenic role of DNA methylation

Le lymphome anaplasique à grandes cellules (LAGC) est le lymphome T pédiatrique le plus fréquent. Majoritairement de phénotype CD4, il exprime,dans environ 80% des cas, la tyrosine kinase oncogénique NPM-ALK. A partir d'un séquençage à haut débit de cellules humaines de LAGC NPM-ALK(+) traitées par la décitabine, ou transfectées avec un siARN anti-ALK, j'ai montré que NPM-ALK, STAT3 et l'ADN méthyltransferase(DNMT1), induisent l'hyperméthylation du gène MIR125. In vitro, l'inhibition de l'ADN topoisomérase II par la doxorubicine empêche la fixation de la DNMT1 sur le promoteur du gène MIR125B et induit son expression. En utilisant une approche par purification de microARN-biotinylé l'ARNm BAK1 a été identifié comme cible de miR125b. Chez les patients,miR125b et la protéine pro-apoptotique BAK1 sont associés à une rechute après chimiothérapie. Parallèlement, j'ai généré des modèles cellulaires de LAGC NPM-ALK(+) à partir de lymphocytes T CD4 humains (CD4/NPM-ALK(+)). Une analyse intégrant des données de méthylome, et de transcriptome,a montré que les CD4/NPM-ALK(+) et les patients LAGC NPM-ALK(+)présentent des profils semblables, proches des précurseurs thymiques et éloignés de celuides lymphocytes CD4 normaux. L'analyse préliminaire du miRNome suggère également que les CD4/NPM-ALK(+)) sont différents des lymphocytes CD4 normaux. De plus, mes données mettent en avant une diminution d'expression, par méthylation de l'ADN, de facteurs de transcription essentiels à la différenciation des précurseurs thymiques. Une augmentation de facteurs de transcription de pluripotence est également observée. Defaçoncohérente, j'aiobservé une corrélation entre l'hypométhylation du promoteur du gène EPAS1 et la surexpression de la protéine HIF2a, connue pour affecter la différenciation et la survie des précurseurs hématopoïétiques. Le potentiel thérapeutique des antagonistes de HIF2a en tant que traitement potentiel des LAGCest proposé.En conclusion,nous suggérons queNPM-ALK via la méthylation de l'ADN i) peut réprimer l'expression de microARN impliqué dans la résistance à la chimiothérapie etii) que dans les lymphocytes T périphériques matures il pourrait restaurer des caractéristiques analogues à un progéniteur thymique
Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL) is the most common pediatric T lymphoma. Mostly CD4(+), in about 80% of cases ALCL expresses the oncogenic tyrosine kinase NPM-ALK. Using a high-throughput sequencing of human NPM-ALK(+) ALCL treated with decitabine, or transfected with siRNA against ALK, I have shown that NPM-ALK, STAT3, and methyltransferase DNA 1 (DNMT1), induce hypermethylation of the MIR125 genes. In vitro, inhibition of topoisomerase II activity by doxorubicin inhibits the fixation of DNMT1 at the MIR125B gene promoter. Using microRNA-biotinyled purification we identified BAK1 mRNA as target of miR125b. In primary ALCL, miR125b and the pro-apoptotic protein BAK1 were correlated with relapse risk after chemotherapy. Moreover, I developed cellular NPM-ALK(+) ALCLmodels by transduced human CD4 lymphocytes (CD4/NPM-ALK(+)). Integrative analysis of methylome and transcriptome showed that CD4/NPM-ALK(+) and primary NPM-ALK(+) ALCLhave similar profile, close to thymic precursors but different to normal CD4 lymphocytes. Preliminary miRNome analysis also suggests that CD4/NPM-ALK (+) are different from normal CD4 cells. In addition, we observed a expression decrease by DNA methylation of transcription factors essential to the differentiation of T precursors. An increase of expression of pluripotency transcription factors is also observed. Coherent way, we noted a correlation between the hypomethylation of the EPAS1 gene promoter and the overexpression of the HIF2a protein which affects the differentiation and survival of hematopoietic precursors. We have highlighted the therapeutic potential of HIF2a antagonists as potential treatments. Altogether, our findings suggest that NPM-ALK through DNA methylation i) represses expression of microRNA implicated in chemotherapy resistanceand ii) could restore progenitor-like features in mature peripheral T-cells in keeping with a thymic progenitor-like pattern

La protéine UHRF1 est impliquée dans le maintien et la transmission des modifications épigénétiques. Lors du processus de réplication, elle recrute la méthyltransférase de l’ADN Dnmt1 au niveau des sites CpG hémi-méthylés via son domaine SRA (SET and RING Associated), favorisant la duplication des profils de méthylation. La structure tridimensionnelle du complexe SRA/ADN révèle que la protéine induit un basculement de la méthylcytosine qui permet un ancrage spécifique de la protéine sur les sites hémim éthylés, facilitant le recrutement de la Dnmt1 au niveau de ces positions stratégiques. Dans ce contexte, notre projet vise à comprendre les mécanismes d’interaction du domaine SRA de UHRF1 avec l’ADN hémi-méthylé. Des oligonucléotides doubles brins ont été marqués à la 2-aminopurine, un analogue nucléosidique fluorescent sensible à l’environnement, à différentes positions au voisinage d’un unique site de reconnaissance CpG hémi-méthylé. Les mesures de spectroscopie de fluorescence à l’état stationnaire et résolues en temps de ces duplexes liés au domaine SRA nous ont permis de caractériser de manière site spécifique les changements conformationnels induits par la liaison du domaine SRA. En accord avec la structure tridimensionnelle du complexe SRA/ADN, nos données suggèrent que le domaine SRA est capable de basculer la méthylcytosine tout en préservant la structure des autres bases dans le duplexe. Le domaine SRA semble se lier selon le même mécanisme aux duplexes hémi-méthylés, bi-méthylés et non-méthylés. La protéine UHRF1 jouerait ainsi un rôle de “lecteur“ capable de scanner la séquence d’ADN à la recherche de sites hémi-méthylés
The UHRF1 protein plays a key role in the maintenance and transmission of epigenetic modifications. Duringthe replication process, it recruits the DNA methyltransferase Dnmt1 to hemi-methylated CpG sites via itsSRA (SET and RING Associated) domain, promoting the duplication of the methylation profiles. Thetridimensional structure of the SRA/DNA complex revealed that the protein induces a base-flipping of themethylcytosine that enables a specific anchoring of the protein to hemi-methylated sites facilitating therecruitment of Dnmt1 to this strategic position. In this context, our project was aimed to further understand themechanism of interaction of the SRA domain with hemi-methylated DNA. To this end, oligonucleotideduplexes were labeled by 2-aminopurine, a fluorescent nucleoside analogue sensitive to environment, atvarious positions close to the single hemi-methylated CpG recognition site. Steady-state and time-resolvedfluorescence spectroscopy measurements of these duplexes bound to the SRA domain enabled us to sitespecificallycharacterize the conformational changes induced by the binding of this domain. In agreement withthe tridimensional structure of the SRA/DNA complex, our data suggest that the SRA domain is able to flip themethylcytosine while preserving the structure of the surrounding bases in the duplex. The SRA domain wasshown to bind with the same mechanism to hemi-methylated, fully-methylated and non-methylated duplexes.Our data suggest the UHRF1 protein plays a role of “reader” that scans the DNA sequence for hemimethylatedsites

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et la première cause de mortalité par cancer chez la femme dans le monde [1]. De nombreux facteurs participent au développement de cette maladie et les gènes BRCA1 et BRCA2 sont particulièrement impliqués. En effet, des mutations dans ces deux oncosuppresseurs sont responsables de 5 à 10% des cancers du sein héréditaires [2]. De plus, une baisse de leur expression est retrouvée dans un grand nombre de cancers du sein sporadiques [3]. Les mutations héréditaires des gènes BRCA1 et BRCA2 sont également à l’origine de cancers de l’ovaire [4]. Ce cancer est beaucoup moins fréquent que le cancer du sein, mais il est associé à un mauvais pronostic. En plus de ces facteurs génétiques, des facteurs hormonaux semblent également intervenir dans les processus de carcinogenèse mammaire et ovarienne, mais aussi des facteurs environnementaux et plus particulièrement l’alimentation. En effet, la consommation de soja, fréquente dans certaines régions de l’Asie serait responsable d’une diminution du risque de développer un cancer du sein dans les pays Asiatiques par rapport aux pays Occidentaux. Ce sont les phyto-oestrogènes contenus dans le soja qui agiraient, grâce à leur similarité de structure avec le 17-β-oestradiol de la femme [5]. Les phyto-oestrogènes du soja pourraient également agir sur le développement du cancer de l’ovaire puisque celui-ci est un cancer oestrogéno-dépendant, comme le cancer du sein. L’équipe Nutrition et Cancer du Département d’Oncogénétique du Centre Jean Perrin étudie les effets potentiellement préventifs des phyto-oestrogènes du soja dans le processus de cancérogenèse. Une première étude, menée au sein de l’équipe, a montré que l’expression des gènes BRCA1 et BRCA2 dans la glande mammaire pouvait être modulée par la consommation de soja chez des rates ovariectomisées [6]. Aussi, des études transcriptomiques, ont montré que les conséquences de l’inactivation des oncosuppresseurs BRCA1 et BRCA2 par l’utilisation d’un petit ARN interférent dans les cellules mammaires pouvaient être contrées par un traitement avec les phyto-oestrogènes du soja [7, 8]. Suite à l’émergence de travaux montrant des effets des phyto-oestrogènes du soja sur la méthylation de l’ADN, et la présence de méthylation dans le promoteur des gènes BRCA1 et BRCA2 dans les cancers sporadiques du sein, nous avons voulu voir si les phyto-oestrogènes du soja pourraient agir directement sur la méthylation de ces deux oncosuppresseurs, que nous avons au préalable mis en évidence dans les cancers du sein et de l’ovaire
Breast cancer is the most common cancer and the leading cause of cancer death among women worldwide [1]. Many factors contribute to the development of this disease and the BRCA1 and BRCA2 genes are particularly involved. Indeed, mutations in these two oncosuppressors are responsible for 5 to 10% of hereditary breast cancers [2]. In addition, a decrease in their expression is found in a large number of sporadic breast cancers [3]. Hereditary mutations of the BRCA1 and BRCA2 genes are also at the origin of ovarian cancers [4]. This cancer is much less common than breast cancer, but it is associated with a poor prognosis. In addition to these genetic factors, hormonal factors also seem to be involved in the processes of breast and ovarian carcinogenesis, but also environmental factors and more particularly food. Soybean consumption, which is common in some parts of Asia, is thought to reduce the risk of developing breast cancer in Asian countries compared to Western countries. It is the phytoestrogens contained in soy that act, thanks to their similarity of structure with the 17-β-estradiol of the woman [5]. Soy phytoestrogens may also affect the development of ovarian cancer since it is an estrogen-dependent cancer, such as breast cancer. The Nutrition and Cancer team of the Department of Oncogenetics at the Jean Perrin Center is studying the potentially preventative effects of soy phytoestrogens in the carcinogenesis process. A first study, conducted within the team, showed that the expression of BRCA1 and BRCA2 genes in the mammary gland could be modulated by the consumption of soy in ovariectomized rats [6]. Also, transcriptomic studies have shown that the consequences of the inactivation of BRCA1 and BRCA2 oncosuppressors by the use of a small interfering RNA in mammary cells could be countered by treatment with soy phytoestrogens [7, 8]. Following the emergence of studies showing the effects of soy phytoestrogens on DNA methylation, and the presence of methylation in the BRCA1 and BRCA2 gene promoter in sporadic breast cancers, we wanted to see if the soy phytoestrogens could directly affect the methylation of these two oncosuppressors, which we have previously identified in breast and ovarian cancers

Les modifications épigénétiques participent au contrôle de l'expression génique. Il a été montré que la méthylation des désoxycytidines (dC) de l'ADN joue un rôle clé dans la régulation épigénétique chez les mammifères. Cette modification correspond à la marque épigénétique la plus stable. Elle a lieu sur des résidus CpG regroupés en ilôts, essentiellement situés au niveau des séquences promotrices, des séquences répétées et des séquences encadrants les ilôtsCpG. L'hyperméthylation des promoteurs induit une inhibition de l'expression des gènes, tandis qu'une hypométhylation est associée à une expression. Les enzymes responsables de la méthylation de l'ADN sont les méthyltransférases d'ADN (DNMTs). Deux familles de DNMTscatalytiquement actives ont été identifiées: on distingue la DNMT1, principalement responsable de la maintenance de la méthylation de l'ADN lors de la réplication, et les DNMT3A et 3B, qui sont responsables d'une méthylation de l'ADN dite de novo. L'altération des profils de méthylation de l'ADN conduit à diverses maladies telles que le cancer. Les cellules cancéreuses présentent souvent un profil de méthylation de l'ADN différent des cellules saines, on observe en particulier une hyperméthylation spécifique des gènes dits suppresseurs de tumeur. Une restauration de leur expression par l'inhibition de la méthylation de l'ADN représente ainsi une stratégie thérapeutique attrayante. Plusieurs inhibiteurs de DNMTs ont été décrits et deux analogues de nucléosides sont approuvés par la FDA pour traiter certaines leucémies: la 5-azacytidine (VidazaTM) et la 5-azadeoxycytidine (Dacogene(r)). Notre laboratoire développe depuis plusieurs années de nouveaux inhibiteurs non nucléosidiques de DNMTs qui ciblent leur site catalytique. J'ai étudié ici les effets pharmacologiques de ces inhibiteurs catalytiques des DNMTs, en utilisant plusieurs lignées cellulaires cancéreuses (issues d'une leucémie, d'un lymphome et d'un cancer du côlon). J'ai utilisé pour cela différentes technologies permettant d'analyser la méthylation de l'ADN, l'accessibilité de la chromatine, les modifications des histones et l'expression des gènes. Ces nouvelles thérapies épigénétiques visent à la reprogrammation des cellules cancéreuses, c'est pourquoi j'ai exploré les modifications à long terme induites par ces nouveaux composés. Nous avons montré que ces composés sont des inhibiteurs puissants de DNMT3A et qu'ils sont capables d'induire l'expression d'un gène raporteur (la luciférase) sous le contrôle du promoteur CMV, par une déméthylation de ce promoteur et une ouverture de la chromatine. Enfin, ces nouveaux inhibiteurs de DNMTs déméthylent la région promotrice de gènes suppresseurs de tumeurs et induisent leur ré-expression
Epigenetic modifications participate to the control of gene expression. Methylation of deoxycytidines (dC) in the DNA was shown to play a key role in epigenetic regulation in mammals. It is the most stable epigenetic mark and occurs at CpG sites, which are grouped in islands and essentially located in promoters, repeated sequences and CpG island shores. Hypermethylation of promoters induces gene silencing while hypomethylation is associated to gene expression. Enzymes responsible for DNA methylation are the DNA methyltransferases (DNMTs). Two families of catalyticallyactive DNMTs have been identified: DNMT1, mainly responsible for DNA methylation maintenance during replication; and DNMT3A and 3B that perform de novo DNA methylation and support maintenance. Alteration of DNA methylation patterns lead to various diseases such as cancer. Cancerous cells often present aberrant DNA methylation, in particular a specific hypermethylation of tumor suppressor genes is observed. Restoring their expression by inhibition of DNA methylation represents an attractive therapeutic strategy. Several DNMTs inhibitors have been described. Two nucleoside analogs are FDA approved to treat leukemia: 5-azacytidine (VidazaTM) and 5-azadeoxycytidine (Dacogene(r)). Our laboratory develops since several years new inhibitors of DNMT, non-nucleoside analogs, targeting the catalytic site. Here, I studied the pharmacological effects of these DNMTs catalytic inhibitors using several cancer cell lines (leukemia, lymphoma and colon cancer) and different technologies to follow DNA methylation, chromatin accessibility, histone modifications and gene expression. Since epigenetic therapies aim at the reprogramming of cancer cells, I explored the long-term modifications induced by the compounds. We show that these novel compounds are potent inhibitors of DNMT3A and able to induce the expression of a reporter gene (luciferase) under the control of a methylated CMV promoter by demethylation of the promoter and opening of the chromatin. Finally, these new DNMTs inhibitors demethylate the promoter region of tumor suppressor genes and induce their re-expression

La méthylation de l’ADN est une modification épigénétique qui prend place durant le développement embryonnaire sur le génome des Mammifères. Durant ma thèse, j’ai déterminé les cinétiques de mise en place de la méthylation de l’ADN sur le génome murin au cours de l’embryogénèse précoce. J’ai identifié les rôles spécifiques et redondants des ADN méthyltransférases DNMT3a et DNMT3b dans ce processus. J’ai également étudié le rôle de deux facteurs dans la mise en place de la méthylation de l’ADN dans l’embryon. Premièrement, j’ai déterminé que l’enzyme G9a joue un rôle essentiel pour la répression et le recrutement de la méthylation de l’ADN à des sites spécifiques du génome, incluant en particulier des promoteurs à ilots CpG de gènes méiotiques. Deuxièmement, l’étude du facteur E2F6 m’a permis de montrer que cette protéine est elle aussi impliquée dans le recrutement de la méthylation de l’ADN, et ce à des promoteurs de gènes méiotiques distincts de ceux régulés par G9a
DNA methylation is an epigenetic modification which is established during embryonic development on the mammalian genome. In my thesis, I determined the kinetics of DNA methylation acquisition on the mouse genome during early embryogenesis, and determined the specific and redundant roles of the DNA methyltransferases DNMT3a and DNMT3b in this process. I also studied the roles of two factors involved in setting up DNA methylation in embryos. First, I determined that the G9a enzyme plays an essential role for the in vivo repression and DNA methylation of specific genomic sites, including in particular the CpG island promoters of germline genes. Second, the study of the E2F6 factor allowed me to show that this protein is also involved in recruiting DNA methylation at a set of germline gene promoters than are distinct from those regulated by G9a

Photorhabdus luminescens est une entérobactérie retrouvée en symbiose avec les nématodes du genre Heterorhabditis. Dans les sols, ce complexe némato-bactérien est pathogène d’insectes ravageurs et est utilisé en contrôle biologique. Le nématode pénètre dans l’insecte et libère la bactérie dans l’hémolymphe. Photorhabdus va ensuite se multiplier et secréter divers facteurs de virulence comme des toxines. L’insecte meurt de septicémie puis le nématode et la bactérie vont se nourrir du cadavre. Une fois les ressources épuisées, le complexe némato-bactérien va se reformer et sortir du cadavre à la recherche d’une nouvelle cible. Plusieurs exemples d’hétérogénéité phénotypique ont été décrits chez cette bactérie amenant chacun à la présence de sous-populations dans une culture bactérienne. Cette hétérogénéité phénotypique peut-être causée par des mécanismes épigénétiques et plus précisément par la méthylation de l’ADN. Chez les entérobactéries, la méthyltransférase Dam est très conservée. Elle méthyle les adénines des sites GATC et est impliquée dans la réparation des erreurs lors de la réplication de l’ADN, la régulation du cycle cellulaire mais aussi la régulation de divers gènes. Cette méthyltransférase est en compétition avec certain régulateurs transcriptionnel. Selon qui de la méthyltransférase ou du régulateur se fixera en premier, le gène sera ou non exprimé donnant naissance à deux sous-populations. Cette thèse a pour objectif de mettre en évidence les rôles de la méthyltransférase Dam chez Photorhabdus luminescens. Dans un premier temps, j’ai montré que la surexpression de Dam (Dam+) amène une diminution de la mobilité et du pouvoir pathogène de la bactérie mais à l’inverse augmente sa capacité à former des biofilms. Une analyse transcriptomique (RNAseq) a montré des différentiels d’expression de certains gènes impliqués dans les phénotypes observés. En recombinant la souche de Photorhabdus Dam+ avec les nématodes hôtes, l’effet sur la pathogénicité a été augmenté en comparaison des résultats après injection de la bactérie seule. L’établissement de la symbiose némato-bactérienne avec cette souche Dam+ n’est pas significativement impacté par rapport à la souche sauvage. Enfin l’analyse du méthylome (détection de tous les sites méthylés sur le génome grâce à la technique SMRT) de Photorhabdus dans diverses phases de croissance nous a permis de déterminer que la méthylation par Dam semble être stable aux différents temps de la croissance bactérienne testés chez Photorhabdus. Le méthylome de la souche Dam+ a confirmé l’hypothèse que cette surexpression augmentait le taux de méthylation des sites GATC sur le génome. La comparaison combinée entre le RNAseq et les sites GATC différentiellement méthylés entre la souche contrôle et Dam+ a mis en évidence certains gènes candidats ressortant de ces deux analyses. En effet, certains gènes sont différentiellement exprimés dans les deux souches et ont un différentiel de méthylation au niveau de sites GATC dans leur région promotrice, l’étude détaillée de leur régulation par la méthylation fait maintenant partie des perspectives et permettront peut-être d’expliquer une partie des phénotypes observés chez Photorhabdus luminescens
Photorhabdus luminescens is an Enterobacteriaceae found in soils in symbiosis with a nematode from the genus Heterorhabditis. This nemato-bacterial complex is highly pathogenic against insect pest crops and so used in biocontrol. The nematode enters into the insect and releases Photorhabdus in the hemolymph of the insect. Photorhabdus multiplies and produces diverse virulence factors as toxins. Insect die from septicemia and both nematodes and bacteria feed on the nutrients in the cadaver. Once nutrients are lacking, the nematodes and the bacteria reassociate and exit from the cadaver to find new insects to infect. Photorhabdus is switching between pathogenic and symbiotic state. This bacterium displays phenotypic heterogeneity as we observe subpopulations coexisting in a same bacterial culture. Phenotypic heterogeneity can be explained by epigenetic mechanisms such as DNA methylation. In Enterobacteriaceae, Dam methyltransferase is broadly distributed. It methylates the adenine of GATC sites. Dam is involved in post-replicative mismatch repair, cell-cycle regulation and also gene transcription regulation. This methyltransferase can be in competition with some transcriptional regulators. Depending on which will bind first on the promoter region, gene will be expressed or not, leading to the rise of two subpopulations. This thesis aims to understand roles of Dam in Photorhabdus luminescens. Overexpression of the methyltransferase leads to a decrease in motility and pathogenicity of Photorhabdus Dam+ strain whereas it increases biofilms formation. A transcriptomic analysis (RNAseq) revealed differential expression of genes involved in the observed phenotypes. Symbiosis establishment does not seem to be strongly impacted in Dam+ strain as the only difference observed when compared to the nematode associated with the control strain is the same as with bacteria alone (a delayed virulence). A methylome analysis was also done (screening of all methylated sites in the genome using SMRT sequencing) in several growth conditions which revealed that DNA methylation is stable over growth kinetics. Dam+ strain methylome analysis confirmed the hypothesis that Dam overexpression increases GATC methylation over the genome. Comparative analysis of methylome and RNAseq experiments between control and Dam+ strains highlighted several common genes. In fact, some genes are differentially expressed between both strains and also have GATC sites differentially methylated in their promoter region. Their transcription regulation by methylation is a future aim and may give some explanation for a part of the phenotypes observed in Photorhabdus luminescens