Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Méthylation ARN“

Les ARN du virus de l’immunodéficience humaine sont décorés par des marques épitranscriptomiques, dont des 2′-O-méthylations internes. Ces marques ajoutées par une enzyme cellulaire, FTSJ3, sont des marqueurs du « soi ». Elles ont des effets proviraux en protégeant l’ARN viral de la détection par le senseur de l’immunité innée MDA5, et en limitant sa dégradation par l’exonucléase cellulaire ISG20, induite par l’interféron. Ces méthylations ont également un effet antiviral, dans la mesure où elles perturbent la rétrotranscription du génome ARN du virus, in vitro et dans des cellules quiescentes. Un équilibre subtil existe donc entre les effets proviraux et antiviraux des 2′-O-méthylations, assurant ainsi une réplication optimale du virus. Ces découvertes ouvrent des perspectives d’optimisation des ARN thérapeutiques à effet antiviral, par la méthylation sélective de certains nucléotides.

L'épigénétique est communément définie comme l’étude de l'ensemble des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’expression des gènes qui sont réversibles et transmissibles au cours du développement et parfois entre générations, sans altérer la séquence de l'ADN. Plusieurs mécanismes épigénétiques sont maintenant bien connus, comme la méthylation de l'ADN, les variants et modifications post-traductionnelles des histones, ainsi que certains ARN non codants. Grâce au développement technologique du séquençage tout-génome, ces « marques » épigénétiques peuvent être étudiées à l'échelle du génome entier. Il est aujourd’hui clairement établi que l’épigénome, c'est-à-dire l'ensemble des marques épigénétiques d'un tissu, est sensible aux fluctuations de l’environnement, notamment la température ou l’alimentation. Des stratégies de programmation précoce des phénotypes reposant sur ces mécanismes épigénétiques sont ainsi envisagées comme levier pour adapter le phénotype ultérieur des individus à leurs conditions de vie. Par ailleurs, au cours des dernières décennies, la sélection génétique a contribué à l’amélioration considérable des performances des animaux. Bien que la composante génétique puisse être estimée avec précision, une grande partie de la variabilité phénotypique n'est pas directement accessible par les approches actuelles. Dans un contexte de diversification des environnements de production (changement climatique, modes de production plus respectueux du bien-être et de l'environnement), il est nécessaire de comprendre l'impact de l'environnement sur la variabilité phénotypique via les marques épigénétiques, pour optimiser les systèmes d'élevage et mieux prédire le phénotype d'un animal. Comme la sélection génomique il y a quelques années, l'apport de la recherche en épigénétique pourrait contribuer à rendre les systèmes de production avicole plus efficaces et plus durables.

Epigenetics deals with heritable alterations in gene expression that is not based on changes n DNA sequence. It was thought that DNA methylation and chromatin-encoded epigenetic information were the only epigenetic marks transmitted to the following generations. Recently, our group described the role of RNA in hereditary epigenetic variation, paramutation in mice. The role of RNA was demonstrated by the establishment of a heritable phenotype following microinjection into one-cell embryos of Kit heterozygous sperm RNA. It was further confirmed by induction of hereditary phenotypes after microinjection of an oligoribonucleotide with a Kit RNA sequence or small noncoding RNAs (miR-222 and miR-124). We now report that, Dnmt2, a RNA methyltransferase, is required for induction by small non-coding RNAs of hereditaty epigenetic variation of expression of the Kit and Sox9 genes, inactivation of the Dnmt2 gene precluded their occurrence. Kit* paramutants, which maintain a mutant phenotype with a Kit+/+ genotype, were not observed in the progeny of crosses between Dnmt2-/- Kittm1al∫+ heterozygotes, no were they generated by microinjection in fertilized eggs of RNAs of the Dnmt2-negative Kit heterozygotes. The Sox9 “giant” phenotype was similary not generated by miR-124 RNA in Dnmt2-/- embryos. Interaction of the Dnmt2 protein with Kit RNA was evidenced by co-immunoprecipitation assays. Bisulfite sequencing assays detected Dnmt2-dependent cytosine methylation in Kit RNA, exclusively in embryos undergoing the modification. RNA methylation effected by Dnmt2 appears as a key feature of the induction of epigenetic variations by non-coding RNAs. In the other hand, growing evidence indicates thet ncRNAs play a key role in regulation of basal transcription machinery. Several studies have recently revealed that noncoding RNAs such as B2RNA, 7SK and U1 snRNA are involved in the regulation of CTD phosphorylation of RNA polymerase II by modulating kinase activity of Cyclin H/T1. Here we reported cardiac hypertrophy in Dnmt2 mutant mice which is accompanied by enhanced activity of RNA polymerase II. Our results showed significant changes in the expression profiles of B2 RNA abd ASK in wild type compare to Dnmt2 mutant mice. In this study, we are attempting to determine that methyl transferase activity of Dnmt2 has a potential role in epigenetic inheritance and pathology.

La différenciation sexuelle est un mécanisme complexe, où une gonade indifférenciée, va se développer en testicule chez les mâles ou en ovaire chez les femelles. Le sexe chromosomique est à l'origine de la détermination sexuelle, en activant des voies de signalisation sexe-spécifique. Découvert en 1990, le gène SRY, présent sur le chromosome Y des mâles, est un gène qui a longtemps été décrit comme le régisseur de toute la différenciation sexuelle. En sa présence, les embryons XY se différencient en mâles, mais son absence est suffisante pour induire la différenciation femelle, « par défaut ». Or, la détermination du sexe est bien plus complexe, impliquant l'expression de nombreux gènes, dont les niveaux d'expression équilibrés activent la voie ovarienne et répriment simultanément la voie testiculaire ou vice versa. Le développement d'un ovaire ou d'un testicule repose sur la présence des cellules somatiques ainsi que des cellules germinales, les seules cellules capables de réaliser la méiose.La méiose, découvert en 1883, est également un événement dépendant de la détermination du sexe, étant donné qu'elle se produit pendant le développement embryonnaire chez la femelle, et en post-natal chez les mâles. Encore une fois, de nombreux gènes doivent être finement régulés pour l'initiation et le déroulement correct de la méiose. En effet, les cellules germinales prolifèrent activement, puis doivent perdre leur pluripotence et entrer en méiose chez les femelles, tandis qu'elles restent pluripotentes et rentrent en quiescence chez les mâles. Cette transition s'opère par un changement de programme génétique, qui n'est pas encore totalement compris.L'étude des différents acteurs régulant la différenciation sexuelle, autant au niveau somatique que germinale, est alors une priorité de mon équipe, spécialiste du développement gonadique embryonnaire.La méthylation en position 6 de l'adénine des molécules d'adénosine de l'ARN (m6A) est un mécanisme émergent et encore peu compris de la régulation de l'expression des gènes. Pourtant elle est la modification de l'ARN la plus courante et la plus conservée chez les eucaryotes, et son importance est soulignée par différentes pathologies résultant des dysfonctionnements de cette méthylation. A l'heure actuelle, elle est connue pour réguler des processus très variés comme des processus de métaboliques, de développement, de différenciation cellulaire ou de réponse au stress.C'est alors que nous avons décidé d'étudier le rôle de Wtap, un acteur du complexe de méthylation m6A, dans la détermination du sexe et la méiose. Mes recherches ont permis de comprendre dans un premier temps que Wtap est bien exprimé dans les différents types cellulaire de la gonade, et ce, pendant la fenêtre critique de la différenciation sexuelle. Dans un second temps, grâce à un modèle murin perte de fonction pour Wtap spécifiquement dans les cellules somatiques, nous avons pu montrer que ce gène est crucial pour la différenciation des cellules somatiques mâles et femelles. En effet, les cellules de Sertoli et de la granulosa semblent pour la majeure partie, bloquées dans un stade pré-cellules de soutient. Enfin, dans un dernier temps, cette fois ci avec un modèle murin permettant l'inactivation de Wtap dans les cellules germinales uniquement, nous avons également analysé une diminution de leur différenciation. Les cellules germinales ne sont plus totalement en capacité d'induire la méiose chez les femelles, et de rentrer en quiescence chez les mâles.Ces résultats indiquent que Wtap, est un acteur clé pour la régulation de la différenciation des cellules somatiques et germinales, autant chez le mâle que chez la femelle
Sexual differentiation is a complex mechanism where an undifferentiated gonad develops into a testis in males or an ovary in females. Chromosomal sex is at the origin of sexual determination, by activating sex-specific signaling pathways. Discovered in 1990, the Sry gene, found on the Y chromosome of males, has long been described as the regulator of all sexual differentiation. In its presence, XY embryos differentiate into males, but its absence is sufficient to induce female differentiation, “by default”. However, sex determination is far more complex, involving the expression of numerous genes, whose balanced expression levels activate the ovarian pathway and simultaneously repress the testicular pathway, or vice versa. The development of an ovary or testis relies on the presence of somatic cells as well as germ cells, the only cells capable of meiosis.Meiosis, discovered in 1883, is also a sex-determining event, as it occurs during embryonic development in females, and post-natal in males. Once again, many genes must be finely regulated for meiosis for correct initiation and progressing. Germ cells proliferate actively, then lose their pluripotency and enter meiosis in females, while they remain pluripotent and enter quiescence in males. This transition takes place by a change in the genetic program, which is not yet fully understood.The study of the various actors regulating sexual differentiation, at both somatic and germline levels, is therefore a priority for my team, which specializes in embryonic gonadal development.N6-methyladenosine (m6A) is an emerging and still poorly understood mechanism of gene expression regulation. Yet it is the most common and most conserved RNA modification in eukaryotes, and its importance is underlined by various pathologies resulting from dysfunctions of this methylation. It is currently known to regulate a wide variety of processes, including metabolism, development, cell differentiation and stress response.We therefore decided to investigate the role of Wtap, an actor in the m6A methylation complex, in sex determination and meiosis. Firstly, my research showed that Wtap is well expressed in different gonadal cell types during the critical window of sexual differentiation. Secondly, using a loss-of-function mouse model for Wtap specifically in somatic cells, we were able to show that this gene is crucial for the differentiation of male and female somatic cells. Indeed, most Sertoli and granulosa cells appear to be blocked in a pre-supporting state. Finally, using a mouse model in which Wtap is inactivated in germ cells only, we also analyzed a decrease in germ cell differentiation. Germ cells are no longer fully able to induce meiosis in females, and enter quiescence in males.These results indicate that Wtap is a key player in the regulation of somatic and germ cell differentiation in both males and females

Les C/D snoRNAs sont des guides de methylation sur le 2’-O-ribose des RNAs. Ils se caractérisent par une structure secondaire qui se forme par appariement de deux séquences répétées inversées terminales. De plus ces C/D snoRNAs présentent des séquences conservées correspondantes aux boîtes C (RUGAUGA) et D (CUGA) localisé aux extrémités 5’ et 2’ respectivement. Dans certains cas on trouve aussi des boîtes internes C’ et D’ qui sont moins conservées. Chaque C/D snoRNA possède une séquence guide de methylation juste en amont de la boîte D ou D’. Cette séquence guide est complémentaire au RNA cible dirige la methylation spécifique du 5’ nucléotide situé en amont de la boîte D. Les snoRNAs agissent comme des guides de methylation au sein d’un complexe C/D snoRNP formé par l’association avec quatre protéines nucléolaires conservées : la fibrillarine, Nop56p, Nop58p et Snu13p. La fibrillarine est la RNA methylase qui utilise le SAM comme donneur de groupements methyls. La formation du complexe C/D snoRNP est initié par l’interaction de Snu13p avec les boîtes C/D qui forment une structure appellé de type k-turn. En plus de ces quatre protéines le C/D snoRNP interagit de manière transitoire avec les protéines p50 et p55. Ces protéines sont conservées phylogénétiquement et présentent une activité hélicase qui serait nécessaire pour la biogenèse des snoRNPs dans le nucléoplasme. Les gènes de C/D snoRNAs présentent une grande diversité dans leur organisation génomique selon les différents organismes. Essentiellement on trouve des snoRNAs codés par des gènes individuels transcrits à partir de leur propre promoteurs, des snoRNAs introniques localisés dans les introns de gènes codant des protéines ou des gènes polycistroniques. Chez les animaux la grande majorité des snoRNAs sont de type introniques mais il n‘y a pas de gènes polycistroniques. Chez la levure la majorité des C/D snoRNAs sont codés par des gènes individuels, mais il y a aussi quelques introniques et 4 gènes polycistroniques. Chez les plantes les trois types de gènes existent mais la grande majorité sont des gènes polycistroniques. Ceux-ci sont pour la plupart des gènes indépendants transcrits à partir de leur propre promoteur mais il existe aussi des polycistron qui se trouvent dans les introns de gènes codants pour des protéines
The small nucleolar RNAs belong to a large family of small non-coding RNAs, found in eukaryotes and archaea, that participates in the processing and modification of other RNAs. In the model plant Arabidopsis, more than 180 C/D snoRNA genes have been identified. In spite of the large number of genes identified, information about of the regulation of C/D snoRNAs expression is still scarce. The general aim of this thesis is to contribute to the knowledge about organization and expression of C/D snoRNA genes in Arabidopsis thaliana. For this, we proposed as specific aims to identify C/D snoRNA genes in the Arabidopsis genome and to characterize their expression mechanism. In this thesis we obtained a cDNA library of small RNAs, from which we identified 19 C/D snoRNAs that have rRNAs as target RNA. For a group of these genes we determined that stress treatments do not alter their expression. Furthermore, in this work we identified 23 new C/D snoRNA genes by analysis of the genomic context of C/D snoRNA genes previously identified, and we determined that these C/D snoRNAs have an unknown RNA as a target. From genes identified in the cDNA library and obtained from the snoRNA database, we selected 5 C/D snoRNA genes, snoR9-2, snoR10-2, snoR102-1, snoR108-1 and snoR201-1. These genes are localized in intergenic regions of the Arabidopsis genome, being therefore from independent expression. We detected and characterized their transcripts, by using primer extension, RT-PCR and 5’-3’ RLM-RACE. We determined that these genes are expressed as a monocistronic precursor, for snoR108-1, and as dicistronic precursors, for snoR9-2/snoR10-2 and snoR201-1/snoR102-1. These precursors show modifications such as a CAP in their 5’ end and a poli-adenilated tail in their 3’ end, suggesting that they are transcribed by the RNA polimerase II. Furthermore, we determined the transcription start site for the 3 precursors and we defined a putative promoter sequence, with the aim to identify promoter elements that could guide their expression. In the promoter of the 28 C/D pre-snoRNA analyzed we identify three associations of promoter elements: TATA/USE, TATA/SEE and TATA/GCCCR/TELO. We selected the snoR9-2/snoR10-2 promoter, as a model for the functional analysis of the elements TATA/GCCCR/TELO. For functional analysis of the elements found in the promoter of the snoR9-2/snoR10-2 precursor, we generated a C/D snoRNA reporter gene and evaluated the in vivo function of the promoter in a wt version and in 4 mutated versions, by using semi-quantitave RT-PCR. Results obtained in this thesis give us valuable information about the mechanisms involved in the expression of independent C/D snoRNA genes

La croissance ovocytaire comprend l’établissement de projections transzona les formant un réseau de communication entre le gamète et les cellules somatiques entourant ce dernier. Une accumulation des ARNm dans le cytoplasme se produit lors des premiers stades de croissance de l’ovocyte afin de soutenir la maturation durant le silence transcriptionnel qui perdure jusqu’à l’activation du génome embryonnaire. Selon l’espèce, cette période peut durer des jours voir des semaines nécessitant une grande stabilité des ARNm maternels. Il est connu que la communication entre l’ovocyte et les cellules somatiques ainsi que l’utilisation des réserves d’ARNm sont essentielles pour l’acquisition des compétences de l’ovocyte afin de soutenir la fécondation et le développement embryonnaire précoce. Des modifications chimiques connues comme ayant un rôle stabilisateur, tel que la méthylation, ont également été détectées sur les ARNm. L’hypothèse est que des modifications chimiques de l’ARNm, soit l’ajout de groupements méthyles, sont impliquées dans la stabilisation des transcrits au sein de l’ovocyte durant le silence transcriptionnel. Le réseau de communication pourrait jouer un rôle en faisant le transfert de protéines permettant la méthylation de l’ARNm. Les objectifs sont de détecter les différentes modifications chimiques ayant lieu dans le transcriptome de l’ovocyte ainsi que localiser et caractériser les protéines ayant pour rôle de catalyser, détecter et inverser les modifications chimiques identifiées sur l’ARN. Différents types de modifications post-transcriptionnelles ont été détectées au sein de l’ovocyte et les résultats montrent que m6A et m5C sont les modifications les plus abondantes. La caractérisation des protéines impliquées dans ces modifications dans l’ovaire et l’ovocyte de la souris, du porc et du bovin montre une activité de méthylation différente selon l’espèce durant la folliculogenèse et l’ovogenèse. De plus amples recherches devront être réalisées afin de bonifier la compréhension des mécanismes impliqués dans la production d’un ovocyte de qualité. Les travaux présentés contribuent à l’avancement de ces connaissances.
Oogenesis, which occurs within the ovarian follicle, is a process closely link tofolliculogenesis. The oocyte growth mainly involves the establishment of a communication network between the gamete and surrounding somatic cells. During the early stages ofoocyte growth, the gamete accumulates mRNAs in its cytoplasm to support maturation and first cell division during transcriptional silencing until the embryonic genome activation.This period can last from days to weeks depending on the species requiring long stability from maternal mRNAs. It is known that communication between oocyte and somatic cellsand use of mRNA reserves are essential for oocyte competence acquisition to sustain fertilization and early embryogenesis. Chemical modifications known to have stabilizing role, such as methylation, have also been detected on the mRNAs. The main hypothesis is the chemical modifications of mRNA, by the addition of methyl groups, that are involved in stabilizing and managing transcripts within oocyte during transcriptional silencing. The communication network could have a role in enabling proteins transfer from cumulus cells allowing mRNA methylation. Objectives are to detectvarious chemical modifications taking place in oocyte transcriptome and to locate and characterize proteins having role of managing the chemical modifications identified on RNA. Many post-transcriptional modifications have been detected within the oocyte and results have shown that m6A and m5C are modifications with higher abundant expression. Proteins characterization involved in these post-transcriptional modifications in ovary and oocyteof mouse, swine and bovine showed methylation activity during folliculogenesis and oogenesis. More research is needed to improve understanding of mechanisms involved inoocyte competences acquisition, but the present study has contributed to the advancement of this knowledge.

Il est maintenant clairement établi que la biogenèse des ribosomes est l’un des nombreux processus cellulaires qui voit sa régulation profondément modifiée au cours de la transformation cellulaire.Toutefois, si il est bien décrit que le taux synthèse des ribosomes est augmenté au cours du processus tumoral, de plus en plus de données suggèrent que les étapes posttranscriptionnelles peuvent aussi être altérées. Dans ce contexte biologique, les objectifs de cette thèse sont de déterminer si : i) la maturation de l’ARNr est altérée en plus de l’augmentation de sa synthèse ; ii) cette altération peut conduire à la synthèse de ribosomes modifiés dont la fonction est altérée ; iii) ces modifications participent directement à la dérégulation traductionnelle observée dans les cellules cancéreuses. Pour cela, nous avons étudié les principales étapes de la biogenèse des ribosomes ainsi que la composition des ribosomes et leurs capacités fonctionnelles dans différents modèles de progression et/ou d’agressivité tumorale. Les résultats obtenus montrent qu’en plus de l’augmentation du taux de synthèse des ribosomes, les étapes post-transcriptionnelles sont modifiées, en particuliers le niveau de méthylation de l’ARNr. Ces modifications sont associées à des défauts importants de traduction (saut de codon stop, incorporation erronée des acide-amines) et particulièrement à une augmentation de la traduction IRES-dépendante de facteur clefs de la tumorigénèse. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que les modifications de la biogenèse des ribosomes pourraient être une étape clef de la cancérogenèse, en modifiant les capacités traductionnelles des ribosomes cytoplasmiques
Ribosome biogenesis is a fundamental and extremely complex cell process. In mammals, ribosome synthesis coordinates the assembly of 80 proteins and 4 rRNA to form the two ribosomal sub-units. The maturation of the ribosome is a multi-step post-transcriptional process essential to obtain functional ribosomes. It is now well demonstrated that ribosome biogenesis and its regulation is altered during transformation process. However, if the increase of ribosome synthesis in cancer cell is well documented, there are numerous recent data suggesting that post-transcriptional steps could also be altered. In this biological context, the objectives of my Ph.D were to determine if: i) the maturation of rRNA is altered during the increase of ribosome synthesis; ii) these alterations could modify the ribosomes and alter their function and iii) these modifications directly participate to the deregulation of translation observed in cancer cells. We have explored the major steps of ribosome biogenesis as well as the structure of the cytoplasmic ribosomes and their functional capacity in different cellular models of tumor progression and/or aggressively. The results obtained show that in addition of the increase of the level of ribosome synthesis, post-transcriptional modifications are altered, particularly the level of rRNA methylation. These modifications are associated with strong defect of translation (stop codon bypass, misincorporation of amino-acid) and an increase of the IRES-dependant translation of important factors playing a crucial role in tumorigenesis. These results suggest that modifications of ribosome biogenesis could be a key step of cancer cell transformation

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr 5S, transcrits par l'ARN polymérase III, sont présents à environ 1 000 copies regroupées en blocs situés au niveau de l'hétérochromatine péricentronique des chromosomes 3, 4, et 5. Le chromosome 5 porte un locus d'ADNr 5S transcrits. La population d'ARNs 5S est hétérogène chez Arabidopsis et se caractérise par la présence d'un ARNr 5S dit "majoritaire", représentant plus de 90% des transcrits 5S de la cellule, et d'ARNr 5S "minoritaires" différant du transcrit 5S majoritaire par une ou deux substitutions nucléotidiques. Dans le cadre de l'étude de la transcription des gènes d'ARNr 5S chez Arabidopsis, nous avons montré de le taux de méthylation de l'ADN forme un gradient depuis l'euchromatine vers l'hétérochromatine péricentrique. La méthylation des cytosines situées en contexte asymétrique est majoritairement restreinte aux séquences répétées hétérochromatiques incluant l'ADNr 5S. L'analyse du profil de méthylation par modification de l'ADN au bisulfite de sodium a révélé que les loci d'ADNr 5S transcrits et non-transcrits posèdent le même taux important de méthylation de l'ADN. Il existe toutefois des gènes d'ADNr 5S moins méthylés. Au sein des loci transcrits, les gènes 5S identiques ou non à des ARNr 5S présentent le même profil de méthylation. De plus un gène 5S méthylé est transcrit efficacement in vitro, indiquant que la méthylation de l'ADN n(est pas suffisante en elle-même à ma répression de l'expression des gènes d'ARNr 5S. Une partie de l'ADNr 5S forme des boucles euchromatiques qui émanent des chromocentres hétérochromatiques. Ces boucles représentent la fraction transcrite de l'ADNr 5S. Elles contiennent des gènes d'ARNr 5S moins méthylés au niveau ADN et sur la lysine 9 des histones H3. Nous avons montré que le mutant ddm 1, la transcription de gènes d'ARNr 5S minoritaires additionnels s'accompagne d'une méthylation moindre de l'ADNr 5S et de la formation de boucles euchromatiques de taille plus importante. Ceci suggère que la transcription des gènes d'ARNr 5S est contrôlée de manière épigénétique par la formation de structures chromatiques spécifiques. Nous avons aussi mis en évidence que l'hétérochromatine est une structure dynamique durant le développement précoce de la plante qui se met en place entre les jours 2 et 4 après germination de la graine. Enfin, nous avons identifié, cloné et caractérisé le facteur de transcription IIIA d'Arabidopsis, AtTFIIIA. Cette étude rapporte la première caractérisation de TFIIIA chez une plante