Dissertationen zum Thema „Lymphome primitif de séreuses“

Les cellules tumorales de lymphome primitif des séreuses (PEL) sont infectées de façon latente par l'herpèsvirus humain-8 (HHV-8), et co-infectées par le virus d'Epstein-Barr (EBV) dans la majorité des cas. 1. Une analyse moléculaire de la clonalité lymphoïde B et virale EBV montre la présence d'un réarrangement monoclonal des gènes des immunoglobulines dans tous les prélèvements tumoraux de PEL étudiés (n=15), et un profil monoclonal des épisomes d'EBV dans tous les cas EBV+ (n=10). L'analyse de la clonalité virale HHV-8 révèle un profil monoclonal des épisomes d'HHV-8 dans cinq prélèvements tumoraux, et un profil biclonal ou oligoclonal dans les dix autres cas. 2. Au sein de la protéine LANA-1 d'HHV-8, deux épitopes dotés d'une bonne affinité pour la molécule HLA-B*0702, ont un potentiel immunogène chez les souris transgéniques HLA-B*0720. Leur défaut de présentation à partir de la protéine endogène suggère l'existence de mécanismes d'échappement à la réponse immunitaire de l'hôte
Primary effusion lymphoma (PEL) tumor cells are latently infected with human herpesvirus-8 (HHV-8) and co-infected in most cases, with Epstein-Barr virus (EBV). HHV-8 and EBV genomes persist in the nucleus as covalently closed episomes. 1. Molecular analyses of lymphoid and episome clonalities showed monoclonal IgH gene rearrangements in all PEL tumors analysed (n=15), and a monoclonal pattern of EBV episomes in all EBV-positive cases (n=10). However, five cases were found to be monoclonally infected with HHV-8 whereas ten cases contained a biclonal or oligoclonal pattern of HHV-8 episomes. 2. Two epitopes from the HHV-8 latency-associated nuclear antigen-1 (LANA-1) protein were able to blind HLA-B*0702 molecules with a strong affinity, and induced specific cytotoxic T-cell responses (CTL) into HLA-B*0702 transgenic mice. However, these peptides failed to be naturally processed from the endogenous protein, suggesting the existence of immune escape mechanisms

Le lymphome primitif du système nerveux central (LPSNC) est une tumeur agressive qui représente 1 à 4% des tumeurs cérébrales primitives. Il s'agit d'une tumeur rare dont les présentations cliniques et radiologiques sont variées rendant son diagnostic difficile. Le LPSNC est une forme agressive de LMNH B, son pronostic est plus sévère que celui des autres localisations extra nodales de lymphomes alors que leurs caractéristiques histologiques sont similaires, concernant notamment l'expression d'un marqueur B spécifique (le CD20) retrouvé dans 95% des cas. Le LPSNC atteint de manière combinée ou isolée plusieurs structures qui sont les méninges, le parenchyme cérébral, la moelle épinière ou l'oeil. La localisation purement oculaire de la maladie est dénommée Lymphome Primitif Intra Oculaire (LPIO). L'incidence du LPIO est difficile à estimer mais l'atteinte oculaire est d'emblée présente chez 10 à 25% des patients en cas de LPSNC et 50 à 80% des patients porteurs de LPIO développent une atteinte du SNC. L'incidence du LPSNC a plus que triplé ces dernières décades. Le pronostic vital des patients atteints de ce type de lymphome s'est amélioré avec la réalisation de chimiothérapies type CHOP associées à une radiothérapie. Néanmoins le pronostic reste péjoratif avec une médiane de survie de 2 à 4 ans selon les études au prix d'une morbidité conséquente notamment chez les sujets âgés. Le Rituximab (RTX) est un anticorps monoclonal anti-CD20 produit par génie génétique (fusion des portions constantes d'immunoglobuline humaine et d'une portion variable d'anticorps murin anti CD20). La fixation du RTX sur sa cible entraîne une déplétion systémique en lymphocytes B et une action sur les cellules tumorales qui est principalement due à l'activation de la lyse complément dépendante (CDC), il existe également plus modestement une action directe avec induction d'apoptose et une cytotoxicité médiée par les anticorps (ADCC). Le traitement conjoint par chimiothérapie et anticorps monoclonal est devenu le standart de référence dans la prise en charge des hémopathies malignes B. Utilisée par voie intraveineuse, cette association n'a pas amélioré le pronostic des LPSNC, certainement en raison d'une mauvaise pénétration des anticorps dans le SNC (masse moléculaire élevée). En alternative à cette administration systémique, la voie locale pourrait permettre d'obtenir in situ une concentration d'anticorps élevée qui serait alors suffisante pour produire un effet thérapeutique. C'est à cette fin que nous avons décidé d'élaborer un modèle animal de LPSNC. Nous avons choisi d'implanter des cellules tumorales d'une souris immunocompétente (C3H/HeN). Deux lignées lymphomateuses ont été utilisées : la lignée 38C13 native et son variant transfecté pour le CD20 humain (38C13CD20+). Pour assurer la pertinence des modèles, le profil d'expression antigénique CD20 de la lignée transfectée a été comparé en cytométrie en flux à celui de deux lignées lymphomateuses humaines. Pour calquer au mieux les tableaux rencontrés dans la pathologie clinique, trois modèles lymphomateux ont été mis au point: LPSNC par injection ce cellules lymphomateuses dans le parenchyme cérébral en conditions stéréotaxiques, LPIO par injections dans le vitré et enfin méningite lymphomateuse par injections dans le LCR intraventriculaire en conditions stéréotaxiques. Après validation des techniques d'injections, des cinétiques de survie ont été réalisées avec la lignée native ou CD20+ pour chaque modèle. Après avoir vérifié l'absence de fixation de fixation non spécifique du RTX sur les cellules cibles, des injections répétées de RTX ont été réalisées dans l'oeil, le parenchyme cérébral ou le LCR ventriculaire en fonction des implantations tumorales préalables. Un anticorps témoin irrelevant était utilisé pour les injections contrôles. Ces expérimentations ont montré une efficacité significative du RTX injecté localement en monothérapie pour traiter le LPSNC comme les formes oculaire ou méningée. La réponse thérapeutique étant incomplète, nous avons cherché à optimiser le traitement en y adjoignant une immunomodulation locale. L'oeil et le SNC sont des sites immunologiquement protégés par de multiples mécanismes. Par exemple, dans le SNC et l'oeil, les ganglions lymphatiques sont absents mais il existe des cellules microgliales (ou des cellules de Müller au niveau de la rétine). Il existe dans l'oeil des cellules présentatrices d'antigènes qui sont maintenues immatures ou peu actives par un environnement cytokinique spécifique. Sachant que les oligodesoxynucléotides de synthèse (ODN) sont capables de stimuler ces cellules présentatrices d'antigènes, nous les avons introduits dans notre démarche thérapeutique. Les ODN sont des fragments d'ADN bactérien absents du génome des organismes pluricellulaires qui sont immédiatement reconnus par les acteurs de l'immunité innée comme marqueur d'agression bactérienne, induisant une puissante immunostimulation. Après avoir vérifié la présence du récepteur classique des ODN (TLR9) sur les membranes des cellules microgliales de la souris C3H, nous avons recherché le type d'ODN le plus efficace à l'aide d'expérimentation de modulation de production de cytokines puis nous l'avons injecté (ODN type C) en intra oculaire. Nous avons constaté une inflammation importante, certes potentiellement intéressante dans une stratégie thérapeutique mais également potentiellement délétère pour la fonction rétinienne. Parallèlement, nous avons cherché à améliorer l'action du RTX en y adjoignant du complément sachant d'une part que le mode d'action principal du RTX est une lyse médiée par le complément et d'autre part que le taux de complément dans le SNC est cent fois moindre qu'en systémique. L'utilisation alternative pour nos expérimentation de la lignée native ou CD20+ avec traitement soit par le RTX et sérum ou anticorps irrelevant et sérum a prouvé la synergie entre le RTX et le complément par une diminution de l'incidence des exophtalmies pour le modèle oculaire et une diminution de l'incidence des envahissements arachnoïdiens sur les IRM cérébrales sériées pour le modèle de méningite. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension et le traitement du LPSNC/PIOL, cette pathologie reste une affection grave, de pathogénie mal connue et de traitement difficile. Ces modèles permettent de reproduire les différentes formes cliniques qu'elles soit cérébrale, méningée ou oculaire, et ce pour évaluer dans chacune ces conditions particulières les thérapeutiques expérimentales. Ainsi nous avons démontré l'efficacitédu RTX en injection locale pour le traitement du LPSNC et de ses variants oculaires et méningés. L'ajout de sérum, source de complément, permet de renforcer l'efficacité du RTX seul. Les bases scientifiques nous semblent autoriser la conception d'un essai clinique de phase I concernant le traitement par injection intraventriculaire de RTX et de sérum autologue de patients en récidive de LPSNC

Le lymphome cutané primitif (LCP) CD30+ est une lymphoprolifération maligne de phénotype T. Son oncogenèse reste à ce jour inconnue. Le but de ma thèse est d'identifier des gènes exprimés spécifiquement dans les LCP CD30+ afin de comprendre les mécanismes d'oncogenèse et également d'identifier des marqueurs diagnostics ou thérapeutiques. Des banques d'ADNc soustraites sont réalisées par SSH « Suppressive Subtractive Hybridisation » entre des LCP CD30+ et des lymphocytes sanguins. Ces banques sont ensuite criblées par des techniques de Dot Blot avec des sondes radiomarquées spécifiques des échantillons étudiés. Les clones sélectionnés sont enfin validés par PCR en temps réel. Nous avons ainsi mis en évidence cinq gènes surexprimés dans les LCP CD30+ : THW, p120caténine, SPARC, PTTG1, CD30 et cinq gènes sousexprimés : humanine, CIN85, Bcl11B, CD30 L et CD30s. Il reste à vérifier si ces gènes sont responsables de l'oncogenèse ou s'ils sont uniquement des phénotypes des LCP CD30+.

L'exportine-1 (ou XPO1) joue un rôle clé dans le transport de nombreux ARN et près de 200 protéines cargos. La mutation « hot-spot » XPO1-E571K est présente chez près de 25% des patients atteints par le lymphome primitif du médiastin (PMBL) et la forme classique du lymphome de hodgkin (cHL), et à plus faible fréquence dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) (3%). Des mutations touchant la voie JAK2/STAT6 sont aussi retrouvées dans le PMBL et le cHL. C’est pourquoi nous avons étudié l’implication de XPO1 dans la voie JAK2/STAT6. Nous avons montré que STAT6 est une protéine cargo de XPO1 par les technique immunofluorescence et PLA (Proximity Ligation Assay). Nous avons montré que le traitement au selinexor induit une accumulation nucléaire de STAT6 sauvage et mutée et que STAT6 peut interagir avec les formes mutée et sauvage de XPO1.Afin de rechercher l’impact fonctionnel de la mutation E571K de XPO1 nous avons comparé plusieurs paramètres physiologiques entre les trois lignées de PMBL. Aucune différence n’a été observée. En effet, la présence de l’amplification de l’allèle sauvage dans la lignée présentant la mutation E571K (MedB1) pourrait masquer les éventuels effets de la mutation. De plus, dans la cohorte de patients que nous avons étudiée la mutation n’est jamais retrouvée à l’état homozygote ou hémizygote indiquant l’importance du dosage génique. Nos expériences de CRISPR-Cas9 sur la lignée U2940 dont le gène XPO1 est sauvage ont confirmé notre hypothèse. De manière intéressante, la présence de la mutation E571K modifie l’affinité de XPO1 pour le selinexor. En effet, le KO de l’allèle muté dans la lignée de cHL UH-01 rend les cellules moins sensibles au selinexor. Nous avons conclu que la balance entre l’allèle sauvage et l’allèle muté est un élément clé pour définir les propriétés oncogéniques de XPO1. Dans une étude préliminaire, une étude protéomique dans les lignées PMBL indique que XPO1-E571K est liée à l’importine-β1 ce qui pourrait modifier la localisation subcellulaire de XPO1.Nous avons montré que la localisation cytoplasmique de cycline D1 contrôle le mécanisme d’invasion et de migration dans cellules de lymphome à cellules du manteau (MCL). Cycline D1 étant une protéine cargo de XPO1 nous avons recherché d’éventuelles anomalies de XPO1 dans les lignées de MCL. Aucune anomalie d’expression de localisation ou de fonction de n’a été observée. Il pourrait être intéressant de déterminer la localisation subcellulaire de cycline D1 au moment du diagnostic afin de proposer une meilleure prise en charge pour les patients. De plus, bien que le selinexor soit toujours en essai clinique, son utilisation pour le traitement du MCL pourrait être envisagée dans les cas les plus agressif où cycline D1 est cytoplasmique
Exportin-1 (or XPO1) plays a key role in the nuclear export of several RNAs and more than 200 proteins. The XPO1-E571K "hot-spot" mutation is present in nearly 25% of patients with primary mediastinal B-cell lymphoma (PMBL), and the classical form of Hodgkin lymphoma (cHL) but at a lower frequency (3%) in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Mutations affecting the JAK2/STAT6 pathway are common in PMBL and cHL. We first studied the role of XPO1 in the nuclear export of STAT6 in PMBL cell lines. Using immunofluorescence and proximity ligation assay (PLA) techniques, we showed that STAT6 is a cargo of XPO1. We also showed that a selinexor treatment induced a nuclear accumulation of wild-type and mutant STAT6 whatever the XPO1 status.In order to investigate the functional impact of the XPO1-E571K mutation, we compared several physiological parameters between the three PMBL cell lines bearing or not the mutation. No differences were observed despite the expression of the XPO1E571K allele. However, in the cell line harboring the XPO1 mutation (MedB1), the wild-type (wt) allele was amplified possibly masking the effects of the mutation. In addition, in the cohort of patients we studied, the mutation was never found in the homozygous or hemizygous state indicating the importance of the gene dosage. CRISPR-Cas9 experiments allowing the introduction of the mutation in the U2940 wt cell line confirmed our hypothesis. Interestingly, the presence of the E571K mutation changed the affinity of XPO1 for selinexor. Indeed, the knockout of the mutated allele in the cHL UH-01 line decreased its sensitivity to selinexor. We concluded that the balance between the wt and the mutated alleles is a key element in defining the oncogenic properties of XPO1. In a preliminary study, we conducted a proteomic analysis to identify XPO1E571K partners in the PMBL lines. Our results showed that XPO1E571K interacts with the importin-β1 which could modify the subcellular localization of XPO1.Mantle cell lymphoma (MCL) cells are characterized by the overexpression of cyclin D1. Cyclin D1 being an XPO1 cargo protein, we looked for possible XPO1 abnormalities in several MCL cell lines. No abnormalities in the expression, localization neither function of XPO1 were observed. But, we showed that the cytoplasmic portion of cyclin D1 controlled the invasion and migration of MCL cells. It might be interesting to determine the subcellular localization of cyclin D1 at the time of diagnosis in order to offer a better treatment management for MCL patients. In addition, although selinexor is still in clinical trials, its use for the treatment of MCL could be considered in the most aggressive cases where cyclin D1 is cytoplasmic

Les lymphomes à grandes cellules B primitifs du médiastin (PMBL) partagent des caractéristiques pathologiques avec les lymphomes diffus à grandes cellules B (DLBCL), et des caractéristiques moléculaires communes aux lymphomes de Hodgkin classiques (cHL). Le cluster oncogénique miR-17-92, localisé au niveau du chromosome 13q31, est un gène amplifié dans les DLBCL. Dans notre étude, nous avons comparé le niveau d’expression de chaque membre du clustermiR-17-92 dans une série de prélèvements de patients de 40 PMBL, 20 DLBCL et 20 cHL, et étudié les gènes cibles liés aux microARN dérégulés dans les PMBL. Nous avons montré un niveau plus élevé de miR-92a dans les PMBL que dans les DLBCL, mais pas dans les cHL. La combinaison d’une analyse in silico prédictive des cibles de miR-92a et d’une analyse transcriptomique nous a permis d’identifier FOXP1 comme la cible principale de miR-92a dans les PMBL, un résultats qui n’avait jusqu’alors pas été établi. Cette observation a été confirmée par le test 3’UTR, le niveau d’expression ARN et protéique dans les lignées cellulaires transduites. Les études in vivo sur les souris à partir des cellules transduites nous a permis de démontrer l’effet tumeur suppresseur de de miR-92a et l’effet oncogénique de FOXP1. L’expression plus élevée de miR-92a et la sous-expression de FOXP1 au niveau ARN et protéique a également été retrouvé dans les prélèvements humains de PMBL, alors que le niveau d’expression de miR-92a était bas et FOXP1 était haut dans les DLBCL. Nous en avons conclu à une régulation post-transcriptionnelle de FOXP1 par miR-92a dans les PMBL, avec une relevance clinico-pathologique pour mieux caractériser les PMBL
Primary mediastinal large B-cell lymphoma (PMBL) shares pathological features with diffuselarge B-cell lymphoma (DLBCL), and molecular features with classical Hodgkin lymphoma (cHL). The miR-17-92 oncogenic cluster, located at chromosome 13q31, is a region that is amplified in DLBCL. Here we compared the expression of each member of the miR-17-92 oncogenic cluster insamples from 40 PMBL patients versus 20 DLBCL and 20 cHL patients, and studied the target genes linked to deregulated miRNA in PMBL. We found a higher level of miR-92a in PMBL than in DLBCL, but not in cHL. Acombination of in silico prediction and transcriptomic analyses enabled us to identify FOXP1 as a main miR-92a target gene in PMBL, a result so far not established. This was confirmed by 3’UTR, and RNA and protein expressions in transduced cell lines. In vivo studies using the transduced cell lines in mice enabled us to demonstrate a tumor suppressor effect of miR-92aand an oncogenic effect of FOXP1. The higher expression of miR-92a and the down regulation of FOXP1 mRNA and proteinwere also found in human samples of PMBL, while miR-92a expression was low and FOXP1was high in DLBCL. We concluded to a post-transcriptional regulation by miR-92a through FOXP1 targeting in PMBL, with a clinico-pathological relevance for better characterisation of PMBL

Les Lymphomes Primitifs Vitréo-Rétiniens (LPVR) représentent un sous-type de Lymphome Primitif du Système Nerveux Central (LPSNC). Ces hémopathies très rares sont caractérisées par leur localisation anatomique atypique, dans des sites physiologiquement dépourvus de lymphocytes B. Les lymphomes du SNC sont rattachés histologiquement aux Lymphomes B Diffus à Grandes Cellules (LBDGC) de type post-germinatif (ABC). L’objectif de notre étude était de définir le répertoire immunologique (chaînes lourdes et légères) des LPVR et des LPSNC, et de les comparer aux LBDGC. Nous avons mené une étude immunologique détaillée de ces tumeurs afin de rechercher des éléments de réponse expliquant ces localisations ectopiques. Notre projet, réalisé sur la plus grande série de LPVR à ce jour, a mis en évidence un biais de répertoire majeur, avec une sur-représentation massive du gène IGHV4-34 (63,6% des cas), significativement plus utilisé dans les LPVR comparativement aux LPSNC et aux LBDGC systémiques. Bien que la proportion de ce gène soit élevée dans d’autres SLP, cette fréquence n’a jamais été atteinte. Un subset a été décrit pour 50% des LPVR utilisant le gène IGHV3-7. Ces données suggèrent fortement l’implication d’un antigène dans leur développement. En conclusion, le LPVR représente un modèle surprenant et singulier de lymphome dirigé par l’antigène, dont l’identification offrirait des perspectives physiopathologiques et thérapeutiques prometteuses
Primary vitroretinal lymphoma (PVRL) is a high-grade lymphoma considered as a subtype of primary central nervous system lymphoma (PCNSL). Unusual localization is a feature of these rare entities. The vast majority of cases are diffuse large B cell lymphoma (DLBCL), mostly of activated B-cell (ABC). To investigate whether PVRLs display a specific IG repertoire contributing to explain their unusual localization, we analysed in detail the IG heavy and light chain sequences from PVRL and PCNSL cases, and we compared their repertoire to that of a publicly available IG heavy chain sequences dataset from systemic ABC-type DLBCLs. Our study was carried out on the largest PVRL series reported to date and showed that PVRL displayed a strikingly biased repertoire as the IGHV4-34 gene was used in 63.6% of cases. The frequency was significantly higher in PVRL compared to PCNSL and DLBCL. This gene has been repeatedly found to be preferentially used in various B-cell malignancies, but never to such an extent. Half of PVRL cases expressing the IGHV3-7 gene had stereotyped VH CDR3 features (subset). Altogether our data showed that PVRLs display a very biased IG repertoire strongly suggesting that antigen selection plays a major role in their development. Thus, PVRL display a highly restricted IG repertoire indicative of antigen selection, and distinct from that of PCNSL. Antigen(s) identification may provide promising perspectives in physiopathology concepts and therapeutic approaches