Dissertationen zum Thema „Inhibiteurs directs“

La tuberculose, bien que maladie très ancienne, est toujours une des causes majeures de mortalité due à un agent infectieux unique. En 2021, 10 millions de personnes ont contracté la maladie et 1.5 millions de décès étaient directement imputables à cette dernière. Malgré la disponibilité de toute une panoplie d'antibiotiques, peu d'entre eux s'avèrent efficaces contre l'agent pathogène responsable de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis. Cette inefficacité est principalement due au caractère imperméable de l'enveloppe cellulaire mycobactérienne, composée majoritairement d'acides mycoliques. L'isoniazide, l'antituberculeux de première ligne le plus utilisé, cible la biosynthèse de ces acides mycoliques via la protéine InhA. L'isoniazide agit comme une pro-drogue nécessitant une activation par la protéine KatG. Cependant, l'émergence de résistances lors de l'étape d'activation de l'isoniazide implique la nécessité de développer des inhibiteurs directs d'InhA. Les travaux réalisés durant cette thèse avaient pour objectif de développer de nouveaux inhibiteurs directs d'InhA. Ces derniers ont été développés autour de la structure d'un motif diaryl éther, connu pour sa capacité à inhiber l'enzyme. La chimie combinatoire dynamique combinée à la cristallographie aux rayons X a été utilisée comme méthode de criblage de fragments pour découvrir de nouveaux inhibiteurs. Trois adduits, visualisés directement à l'intérieur du site actif de la protéine, ont ainsi été caractérisés et montrent des interactions avec le portail majeur de la protéine. Dans un autre projet, une nouvelle famille de diaryl éthers comportant trois pharmacophores a été conçue afin d'occuper entièrement le site de liaison du substrat. Une des molécules synthétisées possède une activité inhibitrice inférieure au micromolaire contre InhA. La structure du complexe correspondant a été résolue par cristallographie aux rayons X, mettant en évidence une ouverture inédite d'une des régions de la protéine, appelée portail mineur. Enfin, des approches multi-cibles, ciblant à la fois InhA et le complexe déshydratase HadABC du système FAS II, ont également été développées durant cette thèse. Plusieurs molécules duales ont été produites et montrent une inhibition de l'activité d'InhA de l'ordre du nanomolaire. Ces molécules montrent également une inhibition de la croissance de différentes souches mycobactériennes
Tuberculosis, despite being a very ancient disease, remains one of the major causes of mortality due to a single infectious agent. In 2021, 10 million people contracted the disease and 1.5 million deaths were directly attributable to it. Despite the availability of a variety of antibiotics, few of them prove effective against the pathogen responsible for tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis. This ineffectiveness is primarily due to the impermeable nature of the mycobacterial cell envelope, composed mainly of mycolic acids. Isoniazid, the most widely used first-line antitubercular drug, targets the biosynthesis of these mycolic acids through the protein InhA. Isoniazid acts as a pro-drug requiring activation by the protein KatG. However, the emergence of resistance during the activation stage of isoniazid necessitates the development of direct inhibitors of InhA. The work carried out during this thesis aimed to develop new direct inhibitors of InhA. These inhibitors were designed basedon the structure of a diaryl ether motif, known for its ability to inhibit the enzyme. Dynamic combinatorial chemistry combined with X-ray crystallography was used as a fragment screening method to discover new inhibitors. Three adducts, visualized directly within the active site of the protein, were characterized and showed interactions with the major portal of the protein. In another project, a new family of diaryl ethers with three pharmacophores was designed to fully occupy the substrate binding site. One of the synthesized molecules exhibited sub-micromolar inhibitory activity against InhA. The structure of the corresponding complex was resolved by X-ray crystallography, highlighting a wider opening of one of the protein's regions, called the minor portal. Finally, multi-target approaches, targeting both InhA and the dehydratase complex HadABC of the FAS II system, were also developed during this thesis. Several dual molecules were produced, showing inhibition of InhA activity in the nanomolar range. These molecules also demonstrated inhibition of the growth of different mycobacterial strains

Le traitement du VHC connaît une évolution rapide avec le développement d'antiviraux à action directe plus efficaces et mieux tolérés qui vont modifier les stratégies thérapeutiques, les facteurs prédictifs de réponse et les modalités de suivi des patients. Notre travail s'intéresse aux paramètres de suivi du traitement que sont les dosages pharmacologiques de ribavirine et le suivi des cinétiques virales lors d'une trithérapie. L'étude d'une cohorte prospective incluant 186 patients sous trithérapie par IP montre que 60% d'entre-eux présentent une SVR12 et que les facteurs prédictifs sont le génotype de l'IL28B et la réponse au précédent traitement. Une diminution de la filtration glomérulaire réversible est également observée. La mesure du taux résiduel de ribavirine permet de réduire les risques hématologiques chez des patients insuffisants rénaux, la réalisation de l'ASC témoigne d'une moins bonne exposition à la ribavirine chez des patients co-infectés par le VIH/VHC et la biodisponibilité de la ribavirine et la sévérité des anémies augmentent chez des patients traités par télaprévir. Au sein de la cohorte CUPIC, la négativation ou la diminution >50-70% de la charge virale initiale à S2 de trithérapie sont fortement prédictives de la SVR12. Cette mesure à S2 permet aussi de dépister les échappements viraux précoces. La place de la ribavirine est importante dans les associations thérapeutiques actuelles et futures. Sa surveillance pharmacologique peut avoir un intérêt au cours de futures multi-thérapies exposant à d'éventuelles interactions médicamenteuses
The rapid development of new direct antiviral agents (DAA) against HCV gives hope of more potent and well tolerated treatments. These new compounds will deeply modify therapeutic schedules, virological response prognostic factors and patients’ monitoring. The aim of our work was to define the relevance of ribavirin plasma concentration and viral kinetics monitoring during triple therapy. The study of a prospective cohort including 186 patients under triple therapy showed an SVR12 rate of 60%. Associated predictive factors were IL-28B genotype and previous treatment response. A reversible decrease of glomerular filtration rate was also observed. Ribavirin plasma concentration monitoring reduced hematological risks among patients with renal insufficiency. Early ribavirin plasma exposure showed an underexposure among HIV/HCV patients and ribavirin biodisponibility with severe anemia increased among telaprevir-treated patients. Within the CUPIC cohort, the initial viral load undetectability or decrease up to 50% or 70% at week 2 of triple therapy were predictive of SVR12. Moreover, this week 2 viral load assessment allowed the detection of early viral breakthrough. Ribavirin still plays a major role in current and future therapeutic strategies. Ribavirin monitoring could also be important during future multi-drug therapy that could be associated with drug interactions

La famille TAM regroupe trois tyrosines kinases transmembranaires : Tyro3, Axl et Mer. Ces trois protéines sont impliquées dans de nombreux mécanismes de signalisation et de régulation cellulaire, notamment de croissance et d’apoptose. La famille TAM a été identifiée comme nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de certains cancers, de maladies auto-immunes et d’infections virales. Toutefois, il n’existe que peu de molécules ayant été spécialement conçues comme inhibiteurs de TAM, la plupart s’intéressant à Axl ou Mer. La première partie de ce manuscrit est consacrée à l’optimisation d’inhibiteurs de TAM basés sur le noyau imidazo[4,5-b]pyridine. La conception par modélisation moléculaire, la synthèse et l’évaluation biologique seront discutées. Pour contourner les problèmes de sélectivité inhérents aux protéines kinases, nous avons choisi d’appliquer le concept de la photopharmacologie. Cette stratégie permet de contrôler spatialement et temporellement l'activité de la drogue uniquement dans la zone à traiter par l’utilisation de la lumière, et donc d’éviter les effets secondaires. L’approche utilisant les groupements photo-labiles (GPL) consiste à masquer une fonction chimique importante pour l’activité thérapeutique, ce qui rend la molécule temporairement inactive. L’irradiation du composé induit le clivage du groupement et ainsi la restauration de l’activité inhibitrice. Nous avons introduit différents groupements photo-labiles (GPL) sur l’azote N3 de nos inhibiteurs. Le choix du groupement, la synthèse, l’étude du photo-clivage et l’évaluation biologique des composés seront présentés dans le deuxième chapitre. Enfin, nous avons développé une méthodologie de sulfénylation directe d’imidazopyridines utilisant le DABCO.(SO₂)₂, un précurseur de dioxyde de soufre comme source de soufre
The TAM family consists in 3 tyrosine kinases : Tyro3, Axl and Mer. These proteins are involved in many cellular processes and pathways. The TAM family has been identified as a new promising target for cancer therapy, autoimmune diseases and viral infections. However, only a few inhibitors have been developped for this family. The first chapter of this manuscript is dedicated to the conception, synthesis and biological evaluation of new inhibitors for the TAM family. To bypass the maindrawback of protein kinase inhibitors, selectivity, we chose to apply the concept of photopharmacology. This strategy enable spatial and temporal control of the drug activity upon irradiation. By blocking a key position of the inhibitor with a photoremovable group, we can inactivate the molecule, and restore the activity upon irradiation. We introduced different photoremovable protecting groups on our inhibitors. The choice of the groups, the synthesis, the photo-cleavage and the biological evaluation will be discussed in chapter 2.Finally, we also developped a methodology for direct sulfenylation of imidazopyridines using DABCO.(SO₂)₂ as sulfur source

La dengue est une maladie virale tropicale transmise par le moustique (Acedes aegypti). Chaque année, elle cause 500 000 hospitalisations et provoque le décès de 25 000 personnes. D’autre part 2,5 milliards d’individus vivent dans la région endémique du moustique et sont susceptibles d’être touchés par la maladie. A ce jour, il n’existe aucun traitement, ni vaccin, ni chimiothérapie. Afin de lutter contre la maladie, il est nécessaire de proposer des molécules inhibant la réplication virale. . La polymérase NS5 du virus de la dengue est très importante pour la réplication et constitue une bonne cible pour une chimiothérapie. L’équipe du Docteur Canard à Marseille a étudié la polymérase et à développé un test rapide afin de cribler des chimiothèques. Ainsi, la chimiothèque de l’institut Curie/CNRS riche de > 10 000 composés a été testée et a révélé 3 molécules, des « hits », possédant une bonne activité. Le but de la thèse a été de développer une chimie moderne permettant la production rapide de composé analogues des hits. Dans ce but, des réactions d’arylation, d’alcénylation et d’alcynylation directes d’azotes catalysées par le palladium ou le cuivre ont été développées. Une grande collection de molécules a été produite et certains composés ont donné des résultats intéressants sur l’inhibition de la polymérase, notamment en test cellulaire
The dengue is a mosquito-borne viral disease. Every year, 500 000 persons are being hospitalized because of this disease and 25 000 die from severe infections. The mosquito is found in subtropical area where 2,5 billion people live. Nearly half the population of the earth is at risk of beinf infected. Today, there is absolutely no treatment nor vaccination available. To fight against the disease molecules inhibiting the multiplication of the virus are required. The viral polymerase NS5 is very important for this replication and is an excellent target for drug development. Dr Canard group in Marseille has studied the polymerase for years and has designed a test in order to screen libraries of compound an find inhibitors of NS5. Therefore, the Curie/CNRS library (>10000 molecules) has been screened and 3 molecules called “hits” have shown interesting activities. The aim of this work was to develop modern chemistry that allows the rapid production of analogs of those 3 hits. To this end. Palladium and copper catalysed direct arylation, alkenylation and alkynylation of azole have been carried out. Many molecules were synthesized and some of them gave interesting results on the isolated polymerase but also in infested cells

Les hydrogénases ont été identifiées comme des protéines clé de la corrosion induite par les microorganismes (CIM) mais leur réel impact est encore sujet à controverses. Bien qu’elles soient présentes dans la plupart des microorganismes impliqués dans la biocorrosion anaérobie, leur participation dans un transfert électronique direct a rarement été démontrée. L’objectif de ce travail est d’étudier l’influence de l’hydrogénase sur la corrosion anaérobie de l’acier en approfondissant la compréhension des phénomènes interfaciaux qui régissent son action. Il s’agit en particulier d’étudier l’incidence des centres Fe-S présents dans la protéine et qui s’étaient révélés être des acteurs majeurs lors de précédents travaux au LGC. Pour cela, différents types d’hydrogénases ont été conçus, élaborés en collaboration avec l’équipe EAD3 du LISBP, INSA Toulouse, et étudiés : la native et des mutants possédant un nombre plus ou moins important de centres Fe-S. Dans un premier temps, le choix des matériaux a été réalisé sur la base des résultats de caractérisation et d’étude du comportement électrochimique dans le milieu Tris-HCl. L’acier doux S235JR a été choisi car c’est le matériau le plus réactif pour mettre en évidence l’influence de l’hydrogénase. Par la suite, les premières études en présence de divers types d’hydrogénases (native et mutants) ont révélé que la présence de certaines molécules additionnelles dans le milieu de purification ne permet pas d’obtenir un saut du potentiel d’abandon et une vitesse de corrosion exclusivement liés aux enzymes. Le protocole de purification des enzymes a donc été optimisé pour permettre un meilleur rendement de purification avec une activité enzymatique haute, tout en ayant le moins possible d’impact sur les signaux électrochimiques. Enfin, l’utilisation d’un sac de dialyse pour concentrer l’hydrogénase au voisinage de l’électrode de travail a permis d’exacerber l’effet de l’enzyme : une augmentation du potentiel d’abandon ainsi que de la vitesse de corrosion a été observée. La spectroscopie d’impédance couplée à des analyses de surface a également confirmé le fort pouvoir corrosif de l’hydrogénase. En outre, les électrolyses réalisées à potentiel cathodique ont mis en évidence la catalyse de la réaction de réduction par transfert électronique direct entre l’hydrogénase et la surface de l’acier. Le moteur responsable de la prise d’électrons est le centre catalytique de l’enzyme, les centres Fe-S jouant seulement un rôle de transfert des électrons au sein de la protéine.

L'otamixaban est un nouvel inhibiteur direct du FXa, en développement pour le traitement intraveineux de la thrombose artérielle. L'objectif de ce travail de pharmacologie clinique vise l'étude des propriétés pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PD) de l'otamixaban ainsi que l'élaboration de modélisations et simulations (M&S) en support des études de Phase II/III à partir des données chez le sujet sain et chez le patient coronarien chronique. Une "empreinte PK/PD des marqueurs de l'effet anticoagulant" a été genérée, incluant les mesures d'activité anti-FXa, des temps de coagulation (aPTT, PT, dPT, RVVT et HCT), et de l'inhibition de la génération de thrombine. La non-proportionalité de la pharmacocinétique de l'otamixaban à la dose a été explorée et intégrée dans les modèles pharmacocinétiques. L'absence d'effet majeur sexe et age sur les paramètres PK et PD a été démontrée. Enfin, l'absence d'interaction médicamenteuse et la complémentarité des effets anticoagulants de l'otamixaban et des effets anti-plaquettaires des modificateurs de la fonction plaquettaires a été demontrée pour le tirofiban et pour l'acide acétyle salicylique.
Otamixaban, is a novel direct FXa inhibitor for the treatment of arterial thrombosis. This clinical pharmacology work aims the study of the pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) properties of otamixaban as well as the development of modeling and simulations (M&S) to support the Phase II/III studies using data in healthy subjects and in chronic coronary patients. A “fingerprint of PK/PD markers for anticoagulant effect” was generated, including the measurements of anti-FXa activity, of clotting times (aPTT, PT, dPT, RVVT et HCT) and of the inhibition of thrombin generation. The non-dose proportional pharmacokinetics of otamixaban was investigated and built into the pharmacokinetic models. The lack of a major gender and age effect on the PK and PD parameters was demonstrated. Finally, the absence of any drug-drug interactions and the complementarities of the anticoagulant effect of OTAM and of the anti-platelet effects of modifiers of the platelet function has been reported for tirofiban and acetyl salicylic acid

Les télomères sont des brins d’ADN situés aux extrémités des chromosomes et de séquences riches en guanines. A chaque division cellulaire, ils perdent des parties de leurs séquences jusqu’à une taille limite entrainant la mort cellulaire. Dans le cas des cellules cancéreuses, il existe une enzyme suractivée, la télomérase, capable de recréer les séquences télomériques perdues. Ainsi, les télomères n’atteignent pas leur taille limite et les cellules deviennent immortelles. Afin d’inhiber indirectement l’activité de la télomérase, il est possible de structurer l’ADN télomérique en un G-quadruplexe grâce aux guanines présentes dans la séquence, par la présence de ligands. Parmi ces ligands de quadruplexe, le plus puissant est la télomestatine : la synthèse totale de cette molécule naturelle comporte plus de trente étapes. La difficulté vient de la formation des divers oxazoles qui la constituent. Notre stratégie consiste à préparer des analogues de la télomestatine afin d’évaluer leur activité biologique. Après différentes études préliminaires, il a été pensé de synthétiser des oligopyridyloxazoles par arylation directe. De plus, afin de macrocycliser l’hepta-aryle possédant deux oxazoles à ses extrémités, des études de dimérisation ont été étudiées. Parmi les composés synthétisés, l’hepta-aryle présente des propriétés intéressantes. Afin de les comprendre, des études physico-chimiques ont été réalisées : titrations fluorimétriques, FID, dichroïsme circulaire. En collaboration avec l’équipe de Jean-Louis Mergny (Muséum National d’Histoires Naturelles), des tests de FRET-melting et de déplacement de la protéine POT1 ont également été étudiés
Telomere is a section of DNA with a single-stranded overlap located at the extremities of the chromosomes and composed of repeating sequences (TTAGGG)n in humans. During each cell division, a number of base pairs is lost until a critical telomere length is reached. In cancer cells, the enzyme telomerase is over-expressed and allows telomere length to be maintained. The subsequent lack of critical limits leads to anarchic proliferation of immortal cancer cells. The guanine-rich telomere DNA can fold upon itself to form a quadruplex conformer and such a structure may be stabilized with certain small-molecule ligand. Telomestatin is currently the most active known ligand but its recently reported total synthesis requires more than 30 steps. We proposed to prepare heterocyclic analogues of telomestatin in order to analyze their biological properties. After differents preliminary studies, oligopyridyloxazole were synthetised by direct arylation. To macrocylise the hepta-aryle compound with two terminal oxazoles, studies of oxazole dimerisation were studied. Among all the prepared analogues, one of them has interesting properties. For more complete understanding, differents physico-chemical studies has been done: UV-visible and fluorimetric titrations, FID, circular dichroism. In collaboration with the equip of Jean-Louis Mergny (Muséum National d’Histoires Naturelles), FRET-melting test and test of binding-POT1 has been also studied

Etant au quatrième rang des cancers les plus fréquents chez l'homme, le cancer de la vessie représente un enjeu médical important. Pourtant, à ce jour, seuls des traitements chirurgicaux handicapants et/ou chimiothérapiques non spécifiques peuvent être envisagés. Le projet de thèse s'inscrit dans le cadre de la recherche de thérapies ciblées du cancer de la vessie en ayant pour objectif le blocage, au niveau moléculaire et de manière sélective, des voies de signalisation mises en œuvre par la tyrosine kinase Tyro3 au sein des cellules cancéreuses. La mise en évidence de la surexpression de ce récepteur membranaire dans la majorité des tumeurs de vessie et son rôle dans la survie des cellules cancéreuses ont en effet permis de valider Tyro3 comme cible thérapeutique pour ce type de cancers. Le projet peut se diviser en trois parties : le développement de nouvelles méthodologies de synthèse autour du motif imidazo[4,5-b]pyridine, la synthèse d'une librairie de candidats inhibiteurs en utilisant les méthodes mises au point et enfin l'étude des relations structure-activité vis-à-vis de la protéine kinase Tyro3
Bladder cancer is a major medical issue, being the fourth most frequent cancer in men and treatable only with heavy surgery and/or broad-spectrum chemotherapy. This thesis project deals with the discovery of new targeted therapies of bladder cancer by blocking specifically, at a molecular scale in cancer cells, the signaling pathways in which protein kinase Tyro3 is involved. Indeed, its overexpression in most bladder cancers and the major part it plays in cancer cells survival have led to the validation of protein kinase Tyro3 as a therapeutic target for the treatment of bladder cancer. This thesis project can be divided into three main parts: the development of new synthetic methods around the imidazo[4,5-b]pyridine scaffold, the synthesis of a library of compounds using these methods and eventually the study of structure-activity relationships of these compounds versus Tyro3

Chez certains pathogènes, les flavohémoglobines (flavoHbs) jouent un rôle important dans le système de défense des microorganismes en leur conférant une résistance contre le stress nitrosant généré par les cellules du système immunitaire. Dans la mesure où ces protéines sont absentes chez l’homme, plusieurs études ont été réalisées en vue de comprendre le fonctionnement des flavoHbs au niveau moléculaire en les considérant comme des cibles attractives potentielles pour des inhibiteurs sélectifs. L’inactivation de ces enzymes chez les pathogènes entraîne une perte de virulence. Des composés chimiques (dérivés azolés) ont été identifiés comme étant capables d’inhiber leur activité enzymatique et d’affecter les facteurs de virulence bactérienne. Si ces composés sont très utilisés dans le traitement d’infections fongiques cutanées invasives, leur activité antibactérienne potentielle n’est pas encore exploitée.Typiquement, les flavoHbs sont composées de trois domaines : un domaine à hème de type globine, un domaine de site de fixation d’une flavine et un domaine de fixation du substrat de l’enzyme, le NADH. Les structures cristallographiques des flavoHbs montrent que ce sont des protéines capables d'adopter des conformations différentes selon la nature et la présence de ligand de l’hème mais aussi selon l’organisme d’origine. Ces différentes conformations se traduisent par une mobilité d’un seul des trois domaines sans modification majeure des deux autres domaines. Nous avons entrepris, dans ce travail, l’étude de la flavoHb d’une bactérie pathogène, Staphyloccocus aureus (pathogenic bacteria), peu étudiée dans la littérature et sa comparaison avec celle issue de Ralstonia eutropha (bactérie non pathogène), mieux caractérisée, afin de tenter d’apporter des informations nouvelles voire plus spécifiques de leur fonctionnement chez les pathogènes.Le travail présenté dans ce manuscrit décrit tout d’abord la caractérisation fonctionnelle et biochimique de la flavoHb de S.aureus, et approfondi celle de R. eutropha. Du fait de l’absence de structure cristallographique de la flavoHb de S. aureus, nous avons construit un modèle structural théorique en se basant sur l’homologie de séquence forte entre la séquence d’acide aminée de S. aureus et celle de Saccharomyces cerevisiae dont la structure 3D a été récemment déterminée. Dans l’hypothèse où le mécanisme enzymatique des flavoHbs implique une transition entre différentes conformations, les flavoHbs de R. eutropha et S. aureus ont été modifiées génétiquement au niveau du résidu phénylalanine suggéré par l’analyse structurale comme pouvant jouer un rôle dans la transition entre les différentes conformations. Les conséquences de la mutation de Phe396 en Ser ou Ala ont été analysées au regard des activités catalytiques et des propriétés biochimiques de l’enzyme mais aussi des propriétés des transferts d’électrons intramoléculaires entre les groupements prosthétiques (hème et flavine) par différentes techniques spectroscopiques. Ce travail a permis de montrer que l’effet de la substitution du résidu Phe sur les propriétés enzymatiques diffère selon la flavoHb considérée et révèle dans certains cas un site de fixation de substrat autre que le substrat natif. L’effet d’inhibiteurs (dérivés azolés) mais aussi des quinones et de composés aromatiques nitrés sur le fonctionnement des protéines natives et modifiées génétiquement ont été également étudiés dans ce travail, ces derniers composés pouvant agir en tant que "substrats subversifs" pour les flavoHbs, transformant leurs fonctions de protection en fonctions cytotoxiques.L’ensemble de ce travail a montré que, malgré des structures et des séquences protéiques très voisines, les flavoHbs issues de bactéries différentes sont susceptibles de se comporter différemment vis-à-vis de l’introduction d’une même mutation, de l’effet d’un même inhibiteur et peuvent le cas échéant présenter aussi des cycles catalytiques sensiblement différents
For some pathogens, flavohemoglobins (FlavoHbs) play an important role in the defense of microorganisms by conferring them a resistance against nitrosative stress generated by the immune system cells. Since these protein are absent in human, several studies have been conducted in order to understand the functioning of these proteins at the molecular level, considering them as potential attractive targets for selective inhibitors. Their inactivation results a loss of virulence. Chemical compounds such as azole derivatives have been identified as being capable of inhibiting their enzymatic function and thereby affecting the bacterial virulence factors. If these compounds are widely used in the treatment of invasive fungal skin infections, their potential antibacterial activity is not yet operated.Typically, flavoHbs are composed of three domains: an N-terminal globin domain which harbors a single heme b and a C-terminal ferredoxin reductase-like FAD- and NAD-binding module. The crystallographic structures of flavoHbs show that these proteins are able to adopt different conformations depending on the nature and the presence of heme ligand but also depending on different organisms they are coming from. The different conformations are characterized by a rigid body motion of one of the three domains. We have undertaken in this work, the study of the Staphyloccocus aureus flavoHb, poorly studied in the literature, and compared it to the Ralstonia eutropha flavoHb (non pathogenic bacteria) to provide new and more specific information on behaviors of these proteins derived from pathogens.This PhD work describes first the functional and biochemical characterization of the S. aureus flavoHb. Due to the lack of its crystallographic structure, a theoretical structural model was designed based on the strong sequence homology between the amino acid sequence of S. aureus and Saccharomyces cerevisiae for which the 3D structure was recently determined. We hypothesized that the relative movement of protein domains could be a way to regulate its enzymatic activity by controlling the substrate accessibility. The Phe396 residue (nomenclature according to R. eutropha), suggested by the structural data to play an important role in the enzyme functioning, but also in the equilibrium between different conformations, was substituted by the Ala or Serine amino acids. The effects of the punctual mutations were investigated with respect to the enzyme functioning and biochemical properties. The mutations effect on the internal electron transfer between flavoHbs cofactors (heme and FAD) was also studied by spectroscopic techniques. This work showed that the impact of Phe substitution on the enzymatic properties is different, depending the considered flavoHb and revealed an additional binding site for other substrate than the native one. The effects of azole derivative inhibitors and also quinones and nitroaromatic compounds have been studied on native and genetically modified enzymes functioning. The latter compounds may act as the ‘subversive substrates’ for flavoHb, converting its protective functions into the cytotoxic ones.Taken as a whole, this work showed that, although the protein structures and sequences are similar, the flavoHbs from different bacteria may behave differently towards an identical mutation, an identical inhibitor and could display different catalytic cycles

L'actinomycine d (actd) et -amanitine sont des inhibiteurs frequemment utilises pour inhiber la transcription. De facon inattendue, la transcription a partir du promoteur ltr du virus de l'immunodeficience humaine acquise de type 1 (vih-1) est activee au niveau de l'elongation dans des cellules humaines et murines traitees avec ces drogues, alors que les promoteurs du cytomegalovirus humain et du gene de choc thermique hsp70 sont reprimes. L'activation du ltr-vih-1 ne fait pas intervenir les sequences b et tar presentes dans le promoteur et coincide avec une phosphorylation du domaine c-terminal (ctd) de la plus grande sous-unite de l'arn polymerase ii, rpb1. L'activation du ltr-vih-1 et la phosphorylation du ctd sont toutes deux inhibees par des inhibiteurs de ctd-kinases et en particulier par le 5,6-dichloro-1--d-ribofuranosyl-benzimidazole. L'efficacite avec laquelle ces composes bloquent la phosphorylation du ctd et la transcription in vivo est correlee avec leur capacite d'inhiber la kinase cdk9/pitalre in vitro. Ainsi le facteur positif de l'elongation de la transcription p-tefb contribuerait-il a la phosphorylation du ctd in vivo et a l'activation du ltr-vih-1 induite par l'actinomycine d.

La fibrillation atriale (FA) est l’arythmie cardiaque la plus fréquente. Elle se caractérise par une contraction désorganisée des oreillettes ainsi que des modifications structurelles du myocarde. La dysfonction endothéliale entretenue par une inflammation active la coagulation et la production de thrombine, favorisant la formation de thrombus intra-auriculaire. La prévention des accidents thromboemboliques est donc un enjeu majeur dans la prise en charge de la FA et se fait par prescription d’anticoagulants oraux dont un inhibiteur direct de thrombine (IDT), le dabigatran. Notre hypothèse est que la thrombine en excès entretient les modifications structurelles myocardiques via le récepteur PAR-1 (Protease activated receptor-1) des cellules circulantes et myocardiques. L’objectif est d’identifier la voie de signalisation de la thrombine impliquée dans le remodelage atrial. Dans un modèle de dilatation atriale associée à un substrat arythmogène et une hypercoagulabilité, l’administration d’IDT ou d’antagonistes du PAR-1 réduisent la dilatation et la susceptibilité arythmique de l’oreillette gauche. Ces traitements inhibent l’induction des marqueurs de réponse hypertrophique myocytaire, β-MHC et BNP et de remodelage matriciel, PAI-1 et CTGF. Avec des cultures d’explants d’oreillettes gauches, nous montrons que ces modifications phénotypiques sont induites par la voie Rho/ROCK et le facteur de transcription STAT3. Nos résultats indiquent aussi que l’expression et l’activité des récepteurs ErbB, connus pour être transactivés via le PAR-1, sont modifiées au cours du développement de la dilatation atriale. La thrombine participe à ces variations uniquement lorsque le remodelage atrial est établi. Ces résultats montrent que la thrombine participe au remodelage atrial associé à un substrat arythmogène, et que les IDT et les antagonistes PAR-1 sont des agents thérapeutiques potentiels pour prévenir le développement de la dilatation atriale
Atrial fibrillation (AF) is the most common cardiac arrhythmia. It is characterized by a disorganized and ineffective contraction of the atria and structural changes of the myocardium. Endothelial dysfunction, maintained by inflammation, activate the coagulation cascade and thrombin generation, promoting intra-atrial thrombus formation. Prevention of thromboembolism is a major issue in the management of AF and is done by long-term prescription of oral anticoagulants among which a direct thrombin inhibitor, dabigatran. Our hypothesis is that excess thrombin maintains structural changes in the myocardium via the PAR-1 receptor (protease activated receptor-1) of circulating and myocardial cells. The objective is to identify the signaling pathway of thrombin involved in the atrial remodeling. In an atrial dilatation model associated with arrhythmogenic substrate and hypercoagulability, administration of direct thrombin inhibitors or antagonists of PAR-1 oral reduce expansion and arrhythmic susceptibility of the left atrium. These treatments inhibit the induction of myocyte hypertrophic response markers, β-MHC and BNP and remodeling of the extracellular matrix markers, CTGF and PAI-1. With explant of left atria culture, we show that these phenotypic changes are induced by the Rho pathway / ROCK and STAT3 transcription factor. Our results also indicate that the expression and activity of ErbBs receptors known to be transactivated via PAR-1, are modified during development of atrial dilatation. Thrombin participates in these changes only when the atrial remodeling is established. These results show that thrombin participates in atrial remodeling associated with an arrhythmogenic substrate, and direct thrombin inhibitors and PAR-1 antagonists are potential therapeutic agents to prevent the development of atrial dilation

Le virus de l'hépatite C (HCV) représente un problème de santé publique à l'échelle mondiale. Les thérapies actuelles ne permettent pas de guérir tous les patients infectés par le HCV et certains antiviraux ont des effets secondaires importants. Dans la première partie de ma thèse, nous avons identifié des combinaisons d'antiviraux à action directe (DAA) et d'inhibiteurs d'entrée caractérisés par un effet synergique dans la prévention et le traitement du HCV dans des modèles de culture cellulaire et les souris uPA-SCID avec un foie chimérique. Ceci représente une nouvelle stratégies de lutte contre l'infection par le HCV. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que le mode de transmission du HCV de cellule à cellule est la voie de transmission dominante dans les modèles de culture cellulaire. De plus, les virus résistant aux DAA se propagent efficacement grâce à la transmission de cellule à cellule. L'inhibition de la transmission de cellule à cellule en utilisant des inhibiteurs d'entrée est un moyen efficace pour empêcher l'émergence de virus résistant aux DAA et pour potentialiser l'efficacité antivirale des DAA pour éradiquer l'infection par le HCV
Hepatitis C virus (HCV) poses a threat to global health with infecting about 170 million people. Current therapies cannot cure all the patients infected with HCV and have obvious side effects. In the first part of my thesis, we uncovered combinations of direct-acting antivirals (DAAs) and entry inhibitors caracterized by a synergistic effect in prevention and treatment of HCV infection using HCV cell culture models and human liver chimeric uPA-SCID mice, thereby providing a new strategy to control HCV infection. In the second part of my thesis, we demonstrated that HCV cell-cell transmission is the dominant transmission route in cell culture models and that DAA-resistant HCV spread efficiently through cell-cell transmission to develop viral resistance. Blocking cell-cell transmission using entry inhibitors allows to prevent the emergence of DAA-resistant virus and potentiates the antiviral efficacy of DAAs to clear HCV infection. In summary, we provide novel strategies to enhance antiviral efficacy by combining entry inhibitors and DAAs and to prevent viral resistance by blocking viral cell-cell transmission

Les deux virus d’ARN VIH et VHC attirent beaucoup d’attention de la santé publique parce qu’ils partagent des mêmes facteurs de risque de transmission par le sang et par des contacts sexuels. En plus, les maladies associées aux infections par le VIH et par le VHC sont des causes principales de mortalité et de morbidité globalement. Néanmoins, grâce à l’introduction des thérapies d’antirétroviraux pour le traitement de l’infection par le VIH et les antiviraux à action directe (AADs) pour le traitement de l’infection par le VHC, les patients infectés par ces virus constatent une amélioration significative de leur qualité de vie. Cependant, le taux de réplication élevé et l'absence de mécanisme de correction d'erreur de ces virus génèrent une population virale diversifiée appelée des quasi-espèces. Sous la pression sélective de traitement, les quasi-espèces virales sélectionnent des variants de résistance au médicament correspondant et rendent la thérapie inefficace, en particulier dans les cas où une surveillance appropriée du traitement n'est pas assurée. Afin de réserver un large choix de traitement antirétroviral tout au long de la vie chez les patients infectés par le VIH et, parallèlement, de réduire le coût de traitement des infections par le VIH et le VHC, il est fondamental de mener des recherches ciblées sur la détection, la surveillance et la transmission des mutations de résistance aux antiviraux. Dans cette thèse, nous avons utilisé les technologies de séquençage haut-débit (UDS) ou de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour chercher des variants de résistance minoritaires (MiRVs) qui sont classiquement considérés comme représentant moins de 15%-25% de la population virale et ne sont pas trouvés par la technique de séquençage Sanger. La présence des MiRVs à baseline est responsable possiblement de l'échec de traitement et leur présence à l'échec peut limiter les options des traitements ultérieurs. Dans cette thèse, nous avons évalué la prévalence et l’impact clinique des MiRVs sur le gène de l’intégrase chez les patients infectés par le VIH qui ont été en échec d’un régime thérapeutique contenant un inhibiteur de l’intégrase. Nous avons également évalué l’impact des MiRVs chez les patients infectés par le VHC de génotype 3 et de génotype 4 et ayant échoué aux AADs. De plus, nous avons utilisé la technique UDS pour identifier et caractériser les chaines de transmission du VHC parmi une population clé d'hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes, co-infectés par le VIH ou ayant un risque élevé d'acquisition du VIH. Nous avons également observé plusieurs cas d’infections mixtes de génotype du VHC dans cette population, probablement à cause du risque élevé de multiples expositions au VHC. Les questions sur l’avantage de l'UDS dans la recherche en virologie et l'applicabilité de cette technique en clinique ont été posées et vérifiées au travers de multiples types de projets dans cette thèse. L’UDS n’a pas été établi de manière concluante comme étant plus intéressant et bénéfique que la technique de séquençage de Sanger pour prévenir l’échec au traitement chez les patients infectés par le VIH ou le VHC et pour identifier les chaînes de transmission à grande échelle si le coût et le temps de l’expérience pour l’analyse des données sont pris en compte. Cependant, le développement dynamique des nouvelles technologies de l’UDS et les efforts sans cesse afin d’optimiser des procédures d'analyse montrent un rôle prometteur de l’UDS. Et l'applicabilité de l'UDS en pratique clinique devra encore être élucidée dans différents types de projets de recherche
The two RNA viruses HIV and HCV are getting a lot of public health concerns because both of them have overlapping risk factors for transmission through direct blood and sexual contacts. Furthermore, HIV and HCV infections are the leading cause of mortality and morbidity globally due to related diseases. However, with the introduction of antiretroviral therapy (ART) for the treatment of HIV infection and direct-acting antivirals (DAAs) for the treatment of HCV infection, patients infected by these viruses are witnessing significant improvement in their quality of life. However, the high replication rate and the lack of error correction mechanism of these viruses result in a diverse viral population referred to as quasispecies. Under drug- selective pressure, the viral quasispecies select resistance variants against corresponding drug and render the therapy ineffective especially in cases an appropriate treatment monitoring is not ensured.To reserve a wide range of possibilities for a life-long ART in HIV-infected patients and in parallel to reduce cost for treatment of both HIV and HCV infection, research focusing on detection, surveillance and transmission of resistance mutations is fundamental to prevent treatment failure on antivirals. In this PhD, we employed the ultra-deep sequencing (UDS) or next-generation sequencing (NGS) technologies to look for minority resistant variants (MiRVs) which are conventionally considered to represent less than 15%-25% of viral population and undetectable by Sanger sequencing. The presence of MiRVs at baseline is possibly responsible for the treatment failure and their presence at failure may limit options for subsequent therapies. In this PhD, we evaluated the prevalence and clinical impact of MiRVs on integrase gene in HIV-infected patients failing an integrase inhibitor containing regimen. We also evaluated the impact of MiRVs in HCV genotype 3 and genotype 4-infected patients failing DAAs. Furthermore, we used the UDS technique to identify and characterize the HCV transmission networks among a key population of men having sex with men either co-infected with HIV or at high risk of HIV acquisition. We also discovered several cases of mixed HCV genotype infections in this population probably for their high risk of multiple HCV exposures. The advantages of UDS in virology research and the applicability of this technique in clinic have been questioned and verified throughout multiple types of projects in this PhD. UDS has not been conclusively established to be more interesting and beneficial than Sanger sequencing in prevention of treatment failure in patients infected by HIV or HCV and in identifying the viral transmission networks at large scale if taking into account the experiment cost and time for data analysis. However, the dynamic development of UDS technologies and the continuing attempts in optimizing analysis procedures display a promising role of UDS. And the applicability of UDS in clinical practice still needs to be elucidated in different kinds of research projects

Malgré les bénéficies cliniques considérables de la prise en considération du contexte moléculaire tumoral, les thérapies ciblées présentent certaines limitations majeures. La première partie de ces travaux se concentre sur l’étude des inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant l’EGFR dans les cancers bronchiques non à petites cellules. L’amélioration des méthodes de détection des biomarqueurs a été complétée par la caractérisation in vitro d’un mécanisme de résistance acquise non précédemment identifié. L’exposition de cellules pulmonaires à un agent mutagène puis une pression de sélection a ainsi mis en évidence la signature TBK1 et l’effet synergique de la co-inhibition s’est révélé intéressant. Le deuxième aspect concernent les inhibiteurs de PARP, incontournables dans la prise en charge des cancers de la sphère gynécologique. Ces thérapies reposant sur le principe de létalité synthétique, la présence de mutations pathogènes de BRCA1/2 est un pré-requis, illustrant la problématique des variants de signification inconnue. Face à la nécessité de leur caractérisation fonctionnelle, une étude transcriptionnelle des variants d’épissage par extraction de l’ARNm depuis les prélèvements FFPE a d’abord été réalisée. Puis, afin d’évaluer tous les variants, l’édition génomique a été développée comparant les efficacités d’édition d’un variant d’intérêt et d’un variant silencieux dans un contexte haploïde où ces gènes sont essentiels. La signification biologique de variants de BRCA1/2, et la généralisation de notre approche à l’ensemble des gènes suppresseurs de tumeur essentiels de nos cellules, peut ainsi être évaluée en 3 semaines, délai compatible avec les impératifs cliniques
Despite significant clinical benefit from the consideration of molecular context, targeted therapies are still challenging. First part of this work focused on tyrosine kinase inhibitors targeting EGFR in non small cell lung cancers. Thus, improvement of biomarkers detection methods was completed by in vitro characterization of an unreported mechanism of acquired resistance. Briefly, pulmonary cells were exposed to a mutagen agent and a selection pressure was applied with EGFR inhibitors allowing the detection of TBK1 signature. Finally, synergic effect of that co-inhibition was highlighted. Now essentials in gynaecological cancers management, PARP inhibitors represent the second part of that work. Those targeted therapies are based on synthetic lethality. Consequently, BRCA1/2 pathogenic mutations are required for their administration, illustrating the issue of variants of uncertain significance. Toward their functional characterization necessity, a transcriptional analysis of splicing variant was first conducted on mRNA extracted from FFPE samples. Then, to evaluate functional signification of all types of variants, genomic edition was developed. Editing efficiencies of the unknown variant and a silent control one were compared in a haploid model where those genes are essentials. Functional signification of BRCA1/2 variants, and thereby mutations from all essential tumor suppressor genes in our model, can be evaluated in three weeks which is compatible with clinical management

Nous avons aborde la caracterisation du systeme transcriptionnel plastidial nep grace a une approche in vitro utilisant le promoteur de l'operon plastidial rrn, pc, et des extraits plastidiaux contenant la nep. Dans un premier temps, nous avons verifie que le promoteur pc, utilise dans les chloroplastes d'epinard, est un promoteur nep. Nous avons ensuite separe et caracterise trois activites transcriptionnelles a partir d'extraits chloroplastiques d'epinard partiellement purifies, et en grande partie grace a la mise au point d'un systeme de transcription in vitro. La premiere correspond a la pep. La seconde, appelee nep-2, reconnait le promoteur pc in vitro et la troisieme, ou nep-1, pourrait etre une arnp de 110 kda de type phagique codee par un gene rpot. En ce qui concerne la nep-2, nous avons observe qu'elle n'est pas inhibee par la tagetitoxine tandis qu'elle l'est partiellement par la rifampicine a une concentration elevee d'une part, et d'autre part, qu'elle semble reconnaitre le promoteur t7. Nous en avons deduit que la nep-2 est probablement une arnp de type phagique. Le fait que la nep-1 pourrait elle aussi etre une arnp de type phagique resulte des observations suivantes : elle est reconnue par un anticorps dirige contre une proteine deduite d'un gene rpot, son poids moleculaire apparent est de 110-120 kda et le test alpa montre qu'elle a les proprietes d'une arnp. Ainsi, non pas une, mais deux arnps de type phagique pourraient partager la transcription du genome plastidial avec la pep ! enfin, nous avons demontre que cdf2 est un facteur d'initiation de la transcription conferant a la nep-2 la capacite de reconnaitre specifiquement le promoteur pc.

Chaque année, plus de 150 000 décès sont associés aux cancers épithéliaux de l’ovaire dans le monde, notamment en raison du développement d’une résistance à la chimiothérapie. Environ la moitié de ces cancers présentent des altérations moléculaires provoquant une déficience de la réparation de l’ADN par recombinaison homologue (HRD) qui les sensibilise à l’action des inhibiteurs de la protéine PARP (PARPi). A ce jour, il n’existe pas de test capable d’appréhender le phénotype HRD dans sa globalité, limitant ainsi l’accès à ces traitements. Dans ce contexte, nous avons entrepris de mettre au point des tests fonctionnels basés sur l’utilisation d’explants tumoraux tranchés puis sur l’utilisation d’organoïdes tumoraux dérivés de tumeurs ovariennes de patientes chimio-naïves ou antérieurement traitées. La culture d’explants s’est révélée inappropriée pour la réalisation de ces tests et nous avons alors focalisé nos travaux sur les organoïdes tumoraux. Ces derniers ont été exposés au carboplatine (traitement de 1e ligne) et à deux inhibiteurs de PARP (l’olaparib et le niraparib) utilisés en traitement d’entretien. En parallèle, nous avons collecté les données cliniques des patientes (survie, intervalle sans platine, RECIST, traitements) afin d’évaluer le potentiel prédictif de ces modèles. Les organoïdes tumoraux établis ont répondu de façon hétérogène aux différents médicaments testés, et nos résultats montrent que les tests réalisés sur les organoïdes sont capables d’identifier des patientes présentant un niveau de résistance élevé au carboplatine, suggérant que ce test fonctionnel pourrait présenter un intérêt prédictif vis-à-vis de ce médicament. Concernant le potentiel prédictif des organoïdes vis-à-vis des PARPi, des profils de sensibilité variés ont été identifiés, mais la corrélation avec la réponse clinique reste à établir par des études menées sur des échantillons de tumeurs issus de patientes traitées par ces médicaments
Worldwide each year, more than 150 000 women die from epithelial ovarian cancer largely due to emergence of resistance to chemotherapy. Approximately half of these cancers display molecular alterations that cause deficiency of DNA repair via homologous recombination (HRD), which confer sensitivity to PARP protein inhibitors (PARPi). To date, there is no test capable of fully identifying the HRD phenotype, thus limiting access to these treatments. In this context, we are developing functional assays based on the use of tumor explant slices and then, on the use of tumor organoids derived from ovarian tumors of chemotherapy-naive or previously treated patients. The culture of explants was unsuitable for this application and we then focused our work on tumor organoids. Tumor organoids were exposed to carboplatin (first-line treatment) and two PARP inhibitors (olaparib and niraparib) used for maintenance therapy. In parallel, we collected clinical data from patients (survival, platinum-free interval, RECIST, treatments) to evaluate the predictive potential of these models. The established tumor organoids responded heterogeneously to different drugs, and our results show that the organoid-based assay is capable of identifying patients highly resistant to carboplatin, suggesting that this functional assay could have a predictive value for patients treated with carboplatin. Regarding the potential of organoids in predicting PARPi response, multiple sensitivity profiles have been identified, but the correlation with clinical response has yet to be determined by studies conducted on tumor samples from patients treated with these drugs