Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Inhibiteur de bêta-lactamase“

Le peptidoglycane (PG) forme un réseau covalent comprenant de chaînes glycanes reliées par des peptides. Le PG est une cible validée pour développer de nouveaux antibiotiques parce que c’est un composant spécifique et essentiel des bactéries. En effet, les antibiotiques appartenant à la famille des β-lactamines inactivent les protéines de liaisons à la pénicilline (PLP) qui catalysent la dernière étape de polymérisation du PG. Un mécanisme répandu de résistance est la production de β-lactamases (βL) qui inactivent les β-lactamines. Une première génération d’inhibiteurs de βL a été basée sur le noyau β-lactame suivi par les diazabicyclooctanes (DBO) entrés sur le marché en 2015 avec l’avibactam. L’émergence de mutations compromettant l’efficacité des DBO nous a incités à étudier une série de dérivés obtenue par chimie click qui contenait un groupement triazole. Ce dernier s’est avéré défavorable en raison de l’absence de la liaison hydrogène reliant le carboxamide des DBO commercialisés au résidu conservé N132 des βL. Cependant, la fonctionnalisation du triazole a partiellement restauré l’efficacité des DBO sans altérer leur pénétration. Les PLP peuvent être remplacées par des L,D-transpeptidases (LDT) entrainant une résistance aux β-lactamines. Nous avons étudié le mode d’insertion de nouvelles sous-unités dans le PG en expansion en développant une nouvelle méthode basée sur le marquage avec des isotopes lourds et la spectrométrie de masse. Nous rapportons les modes de polymérisation du PG dans des souches utilisant des PBP et une LDT, seules ou en combinaison, et en présence ou en absence de β-lactamine, ainsi que la participation du recyclage au métabolisme du PG
Bacterial peptidoglycan (PG) is a mesh like structure comprising glycan strands cross-linked by peptide stems. Since PG is a specific and essential component of bacterial cells it is an attractive and validated target for antibacterial agents. Indeed, the first antibiotic in clinical use - the β-lactam penicillin - targets the enzymes catalyzing the final transpeptidation step of PG synthesis - the Penicillin-Binding-Proteins (PBPs). A prevalent mechanism of resistance to β-lactams is the production of β-lactamases (βLs) that inactivate the drugs. A first generation of β-lactamase inhibitors (BLIs) was based on the β-lactam core followed by diazabicyclooctanes (DBOs), which entered the market in 2015 with avibactam. Emergence of mutations compromising the efficacy of DBOs prompted us to study a series of triazole-substituted DBOs that were obtained by click chemistry. The triazole ring was found to be disfavored due to the absence of a hydrogen bond connecting the carboxamide of marketed DBOs to the conserved N132 residue of βLs. However, functionalization of the triazole partially restored inhibition efficacy without impairing drug penetration. Besides the major cross-links formed by PBPs, alternative cross-links are formed by the structurally distinct l,d-transpeptidases (LDTs) mediating resistance to several β-lactams. We investigated the mechanisms of insertion of new subunits into the expanding PG mesh by developing a method based on labeling with heavy isotopes and mass spectrometry. We report the modes of PG polymerization in strains relying on PBPs and LDTs for PG cross-linking in the presence or absence of β-lactams together with the extent of PG recycling

Mycobacterium abscessus, une mycobactérie à croissance rapide, est responsable d'infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose. Le traitement recommandé comprend une phase initiale basée sur l'association d'un carbapénème (imipénème), d'un macrolide (azithromycine), d'un aminoside (amikacine) et d'une glycylcycline (tigécycline). L’équipe a étudié l’optimisation des traitements impliquant les β-lactamines et a démontré que l’avibactam, un inhibiteur de β-lactamases de 2ème génération appartenant à la famille du diazabicyclooctane, inhibe le β-lactamase BlaMab produit par M. abscessus et augmente de manière significative l’efficacité de l'imipénème à la fois in vitro, dans les macrophages et dans le modèle de poisson zèbre. L'expression du gène de la β-lactamase s'est avérée être induite dans les macrophages infectés. L'objectif du projet de thèse était d'évaluer l'efficacité de nouvelles combinaisons comprenant des d'inhibiteurs de β-lactamase et d'étudier la régulation de la β-lactamase dans les macrophages. Dans la première partie de la thèse, de nouvelles combinaisons d'antibiotiques ont été évaluées in vitro et dans des macrophages infectés par M. abscessus. La rifabutine, habituellement utilisée dans le traitement d'infections dues à d'autres mycobactéries, a montré une activité synergique avec l'imipénème in vitro, mais l'association n'était pas bactéricide. Dans les macrophages infectés, la rifabutine a renforcé l'activité de l'imipénème et l'ajout d'avibactam a entraîné une diminution du nombre de bactérie intracellulaire. Le tédizolide, développé pour le traitement des infections à staphylocoques, a montré une faible synergie in vitro mais pas d’activité bactéricide contre M. abscessus. Dans les macrophages, le tédizolide augmentait l'activité de l'imipénème et la quadruple combinaison imipénème-tédizolide-rifabutine-avibactam permettait de diminuer le nombre de bactéries intracellulaires de 91%. Enfin, l'association de l'imipénème avec le relebactam, un nouvel inhibiteur de β-lactamases développé en association avec l'imipénème, s'est révélée aussi active que la combinaison imipénème-avibactam à la fois in vitro et dans les macrophages. La deuxième partie de la thèse était focalisée sur l'identification du stress responsable de l'induction de la production de β-lactamase dans les macrophages. Dans ce but, M. abscessus a été cultivée in vitro dans différents milieux de culture mimant des conditions de stress aux quelles la bactérie est potentiellement confrontée dans les macrophages. L'activité spécifique de la β-lactamase a été déterminée en utilisant comme substrat une β-lactamine chromogène, la nitrocéfine. Aucune des conditions physicochimiques testées n'a conduit à une induction, incluant un pH acide, de fortes concentrations de métaux, un stress oxydatif ou la présence de β-lactamines. Le dernier objectif était d’étudier l’impact du polymorphisme N versus G situé dans le motif conservé SDN des β-lactamases sur l’activité des combinaisons comprenant une β-lactamine et un inhibiteur de β-lactamase. BlaMab de M. abscessus contient le motif SDN alors que BlaC de M. tuberculosis contient le motif SDG, un polymorphisme qui détermine l'efficacité de l'inhibition de BlaMab par l'avibactam de BlaC par le clavulanate in vitro. Deux souches isogéniques de M. abscessus ont été construites par échange allélique. Comparativement à la souche sauvage, la souche produisant BlaMab avec la substitution N vers G était moins sensible aux combinaisons comprenant l’avibactam avec, en parallèle, un gain d’efficacité pour les combinaisons comprenant le clavulanate. Dans le contexte de BlaC, la substitution de G vers N a potentialisé l'inhibition par l'avibactam. Ces résultats établissent que le polymorphisme SDN/SDG détermine en partie l'efficacité des β-lactamines associées à l'avibactam ou au clavulanate, en accord avec les études cinétiques précédemment réalisées in vitro avec des β-lactamases purifiées
Mycobacterium abscessus, a rapidly growing mycobacteria, is responsible for pulmonary infections in cystic fibrosis patients. The recommended treatment consists in an initial phase with the combination of a carbapenem (imipenem), a macrolide (azithromycin), an aminoglycoside (amikacin), and a glycylcycline (tigecycline). The team has investigated the optimization of treatments involving β-lactams and have demonstrated that avibactam, a 2nd generation β-lactamase inhibitor belonging to the diazabicyclooctane (DBO) family, inhibits the β-lactamase BlaMab produced by M. abscessus and substantially increases the efficacy of imipenem both in vitro, intracellularly, and in a zebrafish model. Expression of the β-lactamase gene was found to be induced in infected macrophages. The aim of my PhD project was to evaluate the efficacy of new β-lactam-β-lactamase inhibitor combinations and to investigate β-lactamase regulation in macrophages. In the first part of the thesis, new antibiotic combinations were evaluated in vitro and in macrophages infected by M. abscessus. Rifabutin, usually used in the treatment of infections due to other mycobacteria, showed synergistic activity with imipenem in vitro but the combination was not bactericidal. In infected macrophages, rifabutin enhanced the activity of imipenem and the addition of avibactam led to increased killing. Tedizolid, developed for the treatment of staphylococcal infections, displayed weak synergy in vitro but no bactericidal activity against M. abscessus. In macrophages, tedizolid enhanced the activity of imipenem and the imipenem-tedizolid-rifabutin-avibactam quadruple combination afforded 91% intracellular killing. Finally, the association of imipenem with relebactam, a new β-lactamase inhibitor developed in combination with imipenem, was found to be as active as the imipenem-avibactam both in vitro and in macrophage model. The second part of the thesis was focused on the identification of the stressor triggering the induction of β-lactamase production in macrophages. M. abscessus was grown in vitro in different culture media mimicking stress conditions thought to prevail in macrophages. The β-lactamase specific activity was determined using a chromogenic β-lactam (nitrocefin) as the substrate. None of the physicochemical conditions that were tested led to induction, including acidic pH, high concentrations of metals, oxidative stress or β-lactams. The last objective was to study the impact of the N versus G polymorphism located in the conserved SDN motif of mycobacterial β-lactamases on activity of β-lactam-β-lactamase inhibitor combinations. BlaMab from M. abscessus contains motif SDN whereas BlaC from M. tuberculosis contains motif SDG, a polymorphism that determines efficacious inhibition by either avibactam of clavulanate, respectively. Two isogenic strains of M. abscessus were constructed by allelic exchange. In comparison to the wild-type enzyme, the strain producing BlaMab with the N to G substitution was less susceptible to the β-lactam-avibactam combinations but more efficaciously inhibited by combinations comprising clavulanate. In the context of BlaC, the G to N substitution potentiated inhibition by avibactam. These results establish that the SDN/SDG polymorphism determines the efficacy of combinations comprising a β-lactam and avibactam or clavulanate, as expected from previous kinetic studies performed with purified β-lactamases. N to G and G to N substitutions might be mechanisms of resistance acquisition in M. abscessus and M. tuberculosis, respectively

L'augmentation des résistances aux antibiotiques ces dernières années et le faible nombre de nouveaux antibiotiques récemment approuvés ont suscité un intérêt considérable pour les associations médicamenteuses. Parmi celles-ci, les associations β-lactamine-inhibiteur de β-lactamases, comme l’aztréonam-avibactam (ATM-AVI), visent à surmonter la résistance due à la production de β-lactamases, l'un des principaux mécanismes de résistance chez les bactéries à Gram négatif. Cependant, les interactions PD entre molécules associées peuvent être complexes. Afin de mieux comprendre la PK/PD de l’ATM-AVI, deux problématiques ont été abordées dans cette thèse :i. La PK de l’ATM-AVI au site infectieux. Une étude de microdialyse réalisée chez le rat avec ou sans péritonite a montré que la distribution de l’ATM-AVI dans le liquide péritonéal était rapide et que les concentrations au site infectieux pourraient être prédites à partir des concentrations sanguines.ii. L’interaction PD entre ATM et AVI. Des études de checkerboard analysées avec un modèle Emax ont permis de caractériser l’effet de l’AVI sur la CMI de l’ATM en termes d’efficacité et de puissance en présence de souches multi-résistantes. Pour compléter ces résultats, un modèle PK/PD a été développé à partir de données in vitro afin d’évaluer l’évolution de l’effet combiné de l’ATM-AVI au cours du temps et d’étudier la contribution individuelle de chacun des effets de l’AVI à l’activité combinée. Selon les résultats de cette modélisation, l’activité bactéricide de l’association serait principalement expliquée par l’effet potentialisateur de l’AVI et ce malgré sa capacité à prévenir la dégradation de l’ATM de manière efficace
The rapid increase in antibiotic resistance during the last decades and the few numbers of recently approved new antibiotics lead to a significant interest to drug combinations. Among these combinations, the β-lactam-β-lactamase inhibitor combination, such as aztreonam-avibactam (ATM-AVI), is one strategy that aims to overcome the resistance due to β-lactamases production, one of the most relevant mechanisms of resistance in Gram-negative bacteria. However, drug interactions can be complex. To better understand the PK/PD of ATM-AVI, two issues have been addressed in this thesis: i. ATM-AVI PK at the infection site. A microdialysis study performed in rats with or without peritonitis showed that ATM and AVI distribution in intraperitoneal fluid was rapid and that concentrations at the target site could be predicted from blood concentrations.ii. PD interaction between ATM and AVI. Checkerboard experiments analyzed with an Emax model have been used to characterize AVI effect on ATM MIC in terms of efficacy and potency in the presence of various multi-drug resistant strains. A PK/PD model was developed based on in vitro data to describe the time-course of ATM-AVI combined effect and to investigate the individual contribution of each of the AVI effects to the combined activity. According to the modeling results, the combined bactericidal activity was mainly explained by AVI enhancing effect, even though AVI demonstrated high efficiency to prevent ATM hydrolysis

Cette etude a porte sur les cephalosporinases chez le genre serratia. Elles sont inductibles et presentent une grande heterogeneite dans leurs constantes cinetiques et leurs points isoelectriques. Dans un but prospectif, des variants resistants synthetisant une cephalosporinase constitutive ont ete obtenus chez differentes enterobacteries, apres exposition a un agent mutagene. La frequence de ces mutants est la plus elevee pour enterobacter cloacae et citrobacter freundii, aussi bien in vitro qu'in vivo. Ils entrainent une resistance plus ou moins importante a l'ensemble des beta-lactamines, a l'exception du mecillinam, de la nf-thienamycine et du cm 40874. La selection d'un mutant constitutif a haut niveau de serratia liquefaciens a permis de determiner les constantes cinetiques de toutes les beta-lactamines. Les antibiotiques non hydrolyses ont ete testes comme inhibiteurs. Le processus d'inactivation de la cephalosporinase par l'aztreonam et le latamoxef est caracteristique des inhibiteurs suicides. L'etude des inhibiteurs de penicillinases a montre que le sulbactam etait egalement un inhibiteur irreversible des cephalosporinases. Contrairement a l'acide clavulanique, il n'est pas inducteur de cephalosporinase et presente une fixation differente sur les proteines de liaison a la penicilline. Dans le cas des etudes immunologiques, seules les methodes de neutralisation de l'activite enzymatique presentent une haute specificite. L'obtention d'anticorps monoclonaux apporte un nouvel interet dans la comparaison phylogenique de beta-lactamases

Cette thèse sur articles collige six travaux évaluant in vitro et in vivo, dans le modèle d'endocardite aortique chez le lapin, l'activité de différents antibiotiques vis à vis de bactéries nosocomiales multi-résistante. Trois travaux consacrés aux entérobactéries productrices de β -lactamases à spectre étendu (BLSE). L'activité du sulbactam, inhibiteur de β-lactamases, est évaluée in vivo en association avec la ceftriaxone,β -lactamine hydrolysée par les BLSE, vis à vis de deux souches. La combinaison se montre active in vivo vis à vis d'une souche d'E. Coli productrice de SHV-2, mais inactive vis à vis d'un isolat de K. Pneumoniae sécréteur de TEM-3. Cette discordance est attribuée à une production de β -lactamases au sein de la végétation cardiaque très importante dans le second cas. L'activité de la gentamicine est démontrée in vivo vis à vis d'une souche de K. Pneumoniae productrice de BLSE, par ailleurs résistante in vitro aux quinolones, aux phénicolés, aux cyclines, aux sulfamides, et aux aminoglycosides à l'exception de la gentamicine. Les entérocoques résistants aux β- lactamines et aux glycopeptides font l'objet de trois autres travaux. La daptomycine, nouvel antibiotique de la classe des lipopeptides, présentant l'avantage théorique de rester actif in vivo sur les cocci à Gram positif résistants aux glycopeptides, produit des résultats décevants in vivo, probablement en raison d'un important effet-sérum. Un effet synergique et bactériostatique de l'association pénicilline-vancomycine et un effet synergique et bactéricide de la triple combinaison pénicilline-vancomycine-gentamicine sont observés in vivo et in vitro vis à vis de deux souches d'Entrococcus faecium résistantes à haut niveau aux glycopeptides. Pour une souche modérément résistante à la pénicilline, l'association pénicilline à forte dose gentamicine se montre moins active que la triple combinaison utilisant de la pénicilline à faible dose. Par contre, pour une autre souche résistante à haut niveau à la pénicilline, seule la triple-combinaison est efficace aussi bien in vivo que in vitro.

Les métallo-β-lactamases sont des enzymes qui confèrent aux bactéries qui les synthétisent une résistance aux antibiotiques. La classe B représente les β-lactamases, dans lesquelles le site actif contenant un ou deux atomes de Zn favoriserait l'hydrolyse des antibiotiques. La dégradation des antibiotiques par les enzymes bactériennes est un mécanisme majeur de résistance. L’objectif de ce travail de thèse est de mettre en œuvre des outils de modélisation fondés sur des méthodes de mécanique quantique en vue de déterminer les structures de métallo-β-lactamases avec des inihibiteurs, étape nécessaire pour comprendre ultérieurement quels sont les mécanismes de réaction favorisant la dégradation d’un inhibiteur par des métallo-β-lactamases et fournir des informations qui serviront à mieux interpréter les phénomènes biologiques.Nous avons tout d’abord déterminé les géométries et la stabilité de complexes de coordinations métalliques de systèmes modèles contenant du Zn, comme dans les sites métalliques des métallo-β-lactamases, ou du Cu, complexés à des histidines coordonnées par les Nπ ou Nτ, afin de voir s’il y a une préférence géométrique pour l’une ou l’autre des deux coordinations et voir l’influence de ces différentes coordinations possibles sur les paramètres géométriques au niveau du site métallique. Enfin la présence d’eau et l’influence du solvant aqueux a été étudiée. Grâce à ces méthodes de chimie quantique fondées sur la théorie de la fonctionnelle de la densité, nous avons montré comment ces méthodes permettent d’avoir des informations structurales sur la symétrie adoptée par les centres métalliques, du Zn2+ et du Cu2+. Cette étude structurale nous a permis de mettre en évidence des différences structurales entre ces deux ions métalliques et de déterminer les spectres vibrationnels. Ces investigations nous ont permis de mettre en évidence la nature des liaisons métal-ligand grâce à des approches topologiques. Nous avons montré que ces études préliminaires nous ont permis de choisir la meilleure méthode de calculs DFT pour étudier des centres à zinc dans des structures de β-lactamases.Pour compléter l’étude de structures de métallo-β-lactamases, nous avons déterminé la structure de l’enzyme native L1 (β-lactamase) qui a permis de reproduire les paramètres géométriques des structures expérimentales de L1. Nous avons montré que l’approche combinant des études quantiques et classiques (QM/MM) permet de reproduire avec une très bonne confiance les paramètres structuraux de sites actifs de l’enzyme L1.Enfin, nous avons déterminé les structures de certains sites actifs de la famille B3 des Métallo-β lactamases (Enzyme L1) pour comparer les affinités de différentes familles d’inhibiteurs synthétisées à l’IBM de Montpellier (Institut des Biomolécules de Montpellier) et prédire la structure possible de L1 avec différents inhibiteurs par des méthodes QM/MM pour voir si cette stratégie pourra être appliquée à d’autres inhibiteurs pour des métallo-β-lactamases
Metallo-β-lactamases are enzymes that give the bacteria that synthesize them antibiotic resistance. B Class represents the beta-lactamases, wherein one or two Zn atom(s) promote(s) β-lactams (antibiotics) hydrolysis. The major resistance mechanism is the degradation of the β-lactams by bacterial enzymes called β-lactamases. One major approach to overcome this resistance deals with combination therapy in which a β-lactam drug is given along with a β-lactamase inhibitor, which protects the former from inactivation. The objective of this thesis is to implement modeling tools based on quantum mechanical methods to determine metallo-β-lactamase structures with inhibitors, a step necessary to understand at a later stage the mechanisms of response to the degradation of the inhibitor by β-lactamases and to provide information that will serve to better interpret biological phenomena.We have first determined the geometries and the stability of metal coordination complexes of model systems containing Zn, as in the metallo-β-lactamase metal sites, or Cu, complexed to histidines coordinated by Nπ or Nτ, in order to see if there is a geometric preference for one or the other of the two coordination’s and to see the influence of these different possible coordination’s on the geometrical parameters at the metallic site. Finally, the presence of water and the influence of the aqueous solvent were studied. Using these methods of quantum chemistry based on the density functional theory, we have shown how these methods provide structural information on the symmetry adopted by the metallic centers of Zn2 + and Cu2 +. This structural study allows us to demonstrate structural differences between these two metal ions and to determine the vibrational spectra. These investigations were able to demonstrate the nature of the metal-ligand bonds through topological approaches. We have shown that these preliminary studies have conducted us to choose the best method of DFT calculations for studying zinc centers in β-lactamase structures.To complete the study of metallo-β-lactamase structures, we have determined the structure of the native enzyme L1 (β-lactamase) which permitted to reproduce the geometric parameters of the experimental structures of L1. We have shown that the combination of quantum and classical approaches (QM/MM) allows to reproduce with very good confidence the structural parameters of the L1 enzyme active sites.Finally, we have determined the structures of certain active sites in the B3 family of Metallo-β lactamases (Enzyme L1) to compare the affinities of different families synthesized at IBM in Montpellier (Institute of Biomolecules of Montpellier) and to predict the possible structure of L1 with different inhibitors by QM / MM methods to see if this strategy can be applied to other inhibitors for metallo-β-lactamases