Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Ingénierie d'anticorps“

Les anticorps monoclonaux murins IgG 9C2 et IgG 4C1 reconnaissent les trois neurotoxines AahI, AahIII et AahII responsables de la toxicité du venin du scorpion androctonus australis hector chez les mammifères. Les ADNc de ces anticorps, ont été clonés puis assemblés en gènes qui codent pour des fragments monospécifiques (Fab, scFv, diabody) ou bispécifiques (scFv en tandem). Les protéines recombinantes conservent les propriétés des anticorps parents et neutralisent les neurotoxines. Le diabody a une activité protectrice quand il est injecté par voie intrapéritonéale à des souris expérimentalement envenimées avec la toxine AahI. Un immunoconjugué recombinant a également été conçu afin de détecter de façon rapide et sensible la toxine AahI (0,6 ng/ml). Les anticorps recombinants ouvrent ainsi de nouvelles perspectives pour le diagnostique et le traitement des envenimations
9C2 and 4C1 are murine monoclonal IgG that participate in the neutralization of androctonus australis hector scorpion venom. They recognize AahI, AahIII and AahII, three main neurotoxins responsible for almost all the toxicity of the venom when injected into mammals. We cloned the antibody variable region coding genes from 9C2 and 4C1 hybridoma cells and constructed genes encoding monospecific fragments (Fab, scFv (single-chain Fragment variable), diabody) or bispecific fragments (Tandem scFv). The antibody fragments reproduce the properties of the parent antibody and neutralize the scorpion neurotoxins. The diabody demonstrated protective activity when injected intraperitonally in mice experimentally envenomed with toxin AahI. Ain addition an immunoconjugate was designed to develop rapid and sensitive immunoassays for the detection of the toxin AahI accurately to 0. 6 ng/ml. Thus recombinant antibodies open up new perspectives for the diagnosis and the treatment of envenomation

Le pronostic de certains cancers s'est considérablement amélioré avec l'arrivée sur le marché des anticorps thérapeutiques. Devant l'essor de ces nouveaux médicaments associé à l'identification de nouveaux biomarqueurs, de nouvelles perspectives émergent pour l'imagerie moléculaire in vivo. En effet, disposer de nouveaux traceurs moléculaires spécifiques de ces biomarqueurs permettra de caractériser l'hétérogénéité des cellules cancéreuses, de suivre l'expression de ces marqueurs au cours de l'évolution de la tumeur, mais également de suivre l'efficacité d'un traitement sur la régression tumorale du patient. Pour répondre à cette évolution de diagnostic moléculaire in vivo, il convient de développer de nouvelles sondes moléculaires. L'objectif de ma thèse répond à ce nouveau besoin avec l'ingénierie et le marquage d'un format d'anticorps recombinant adapté à l'imagerie in vivo : le diabody 12G4 dirigé contre le récepteur de l'hormone antimüllérienne (AMH), marqueur de certains cancers de la sphère génitale.

Les anticorps recombinants (Ac) de primates non humains (PNH) représentent une approche très prometteuse en vue de la prise en charge médicale d'agents du risque biologique provoqué (« armes biologiques »). Nous avons montré les avantages de cette approche et ses particularités méthodologiques. Un scFv neutralisant la toxine létale de B. Anthracis (2LF : KD= 1,02 nM), et dirigé contre la sous-unité « facteur létal », a été isolé à partir d'une banque immune de scFv de PNH exposée à la surface de phages, et caractérisé. Un autre scFv, 43RCA, neutralisant la ricine, a été isolé par la même technique puis évalué (en particulier : KD= 40 pM). Cette approche peut aussi s'appliquer à des pathogènes n'appartenant pas au risque biologique provoqué, puisqu'un scFv dirigé contre Aspergillus fumigatus a aussi été isolé (MS130i-IIIC3 : KD= 0,96 nM). Les outils d'analyse de séquences disponibles en ligne sur le site IMGT® ont permis de montrer la grande similarité de ces scFv avec leurs homologues humains. Des travaux d'ingénierie de fragments d'Ac ont aussi été réalisés, dont une maturation d'affinité in vitro (KD initial = 3,4 nM ; KD final = 0,18 nM). Une approche particulière de l'humanisation ("germline humanization") utilisant les régions charpentes (FR) d'IgM (rencontrés chez tous les sujets à la différence des FR d'IgG) et la standardisation IMGT® a été implémentée pour assurer une tolérance optimale de l'un de nos scFv. Des essais in vivo d'une IgG primatisée ont démontré ses capacités prophylactique et thérapeutique
Recombinant antibodies isolated from non-human primates represent very promising medical countermeasures against bioweapons. The advantages and methodological aspects of this approach have been described. An scFv, neutralizing the lethal toxin of Bacillus anthracis (2LF: KD= 1. 02 nM) and directed against the “lethal factor” subunit was isolated from a phage-displayed immune library, and characterised. Another scFv, 43RCA, neutralizing ricin, was obtained with the same methodology and tested (in particular: KD= 40 pM). This approach may also be used beyond bioweapons, as an scFv directed toward Aspergillus fumigatus was also isolated (MS130i-IIIC3: KD= 0,96 nM). On-line sequence analysis with IMGT tools allowed to show the high degree of similarity between these scFvs and their human counterparts. Antibody fragments were engineered, including an in vitro affinity maturation (KD initial = 3. 4 nM; KD final = 0. 18 nM). Utilizing IMGT standardisation and on-line tools, a “germline humanization” - utilizing FR derived from IgM, encountered by every Human, as opposed to IgG FR - was realized in order to ensure an optimal tolerance for one of our scFvs. A primatized IgG was tested in vivo and showed therapeutic and prophylactic capacities

L'objectif de cette thèse est de concevoir un nouveau type d’anticorps thérapeutiques bispécifiques pour éliminer de manière ciblée des facteurs solubles pro-tumoraux du microenvironnement tumoral selon un mécanisme de sweeping antibody via le ciblage du récepteur de la transferrine (TfR1). Le TfR1 est un récepteur surexprimé dans de nombreuses tumeurs. Il permet l’apport cellulaire en Fer selon un mécanisme FcRn-like. Le facteur soluble à éliminer choisi pour cette preuve de concept est l’interleukine (IL-6), une cytokine multifonctionnelle impliquée dans la progression tumorale. Trois formats d’anticorps différents bispécifiques ont été conçus à partir d’anticorps antagonistes internalisants ciblant le TfR1 et d’un anticorps anti-IL-6 non neutralisant à liaison pH-dépendante. Nous avons mis en évidence que (1) les 3 formats d’anticorps bispécifiques conservent les propriétés de liaison à l’IL-6 (liaison à pH physiologique mais pas à pH acide) et au TfR1 des anticorps parentaux (blocage de l’internalisation du ligand holo-transferrine via le TfR1) et (2) qu’ils permettent l’internalisation de l’IL-6 via le TfR1. L’activité sweeping a été évaluée in vitro par une comparaison des activités inhibitrices des anticorps bispécifiques et de la combinaison des anticorps parentaux sur des lignées cellulaires à croissance IL-6 dépendante (myélome XG-6 et XG-7) ou non (lymphome RAJI). L’élimination de l’IL-6 a également été mise en évidence in vivo en monitorant la concentation d’IL-6 dans le plasma de souris xénogreffées avec une lignée de cancer du pancréas productrice d’IL-6. Les résultats de cette thèse montrent qu’il est possible d’obtenir une activité sweeping TfR1-dépendante ce qui ouvre un large panel d’applications thérapeutiques dans le ciblage de facteurs solubles pro-tumoraux par l’utilisation de récepteurs tumeurs spécifiques-TfR1-like
The objective of this thesis is to design a new type of bispecific therapeutic antibodies to selectively eliminate soluble pro-tumoral factors from the tumor microenvironment by a sweeping antibody mechanism by targeting the transferrin receptor (TfR1). TfR1 is an overexpressed receptor in many tumors. It allows iron cell supply by a FcRn-like mechanism. The soluble factor chosen for this proof of concept is interleukin (IL-6), a multifunctional cytokine involved in tumor progression. Three different bispecific antibody formats have been developed based on internalizing antagonistic antibodies targeting TfR1 and a pH-dependent non neutralizing anti-IL-6 antibody. We highlight that (1) the 3 formats of bispecific antibodies retain the binding properties to IL-6 (binding at physiological pH but not at acidic pH) and TfR1 of parental antibodies (blocade of holo transferrine internalization) and (2) allow the internalization of IL-6 via TfR1. Sweeping activity was evaluated in vitro, by comparing the inhibitory activities of bispecific antibodies and the combination of parental antibodies on cell lines with IL-6 growth dependent (myeloma XG-6 and XG-7) or not (lymphoma RAJI). IL-6 elimination was also demonstrated in vivo by monitoring IL-6 elimination in the plasma of xenografted mice with an IL-6-producing pancreatic cancer line. The results of this thesis show that it is possible to obtain a TfR1-dependent sweeping activity, which opens up a wide range of therapeutic applications in the targeting of pro-tumor soluble factors by the use of specific TfR1-like tumor receptors

Le récepteur ILT4 est un point de contrôle immunitaire, principalement exprimé par les cellules myéloïdes du système immunitaire. Dans le contexte cancéreux, ILT4 participe au développement tumoral en maintenant un microenvironnement immunitaire protumoral et en activant directement la prolifération tumorale. L’activation d’ILT4 par la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I non-classique HLA-G induit des cellules myéloïdes tolérogènes. De plus, l’expression ectopique d’ILT4 a été rapportée dans plusieurs types de cancers. L’interaction entre l’angiopoiétine-like2 (ANGPTL2) et l’ILT4 promeut la prolifération de cellules de cancer du poumon non à petites cellules et inhibe leur apoptose. Cibler ce nouveau point de contrôle immunitaire par des anticorps bloquants est donc une approche prometteuse en immunothérapie. A la lumière de certaines limitations des anticorps conventionnels bloquants en thérapies des tumeurs solides, nous avons investigué le potentiel d’inhibiteurs basés sur des VHH. Ce petit format d’anticorps, dérivé des anticorps homodimériques de camélidés, allie les propriétés de spécificité des anticorps à celles des petites molécules. Grâce au criblage par phage-display d’une banque immunologique obtenue par immunisation d’un alpaga, nous avons sélectionné un VHH hautement affin et spécifique pour ILT4, qui inhibe l’interaction entre le récepteur et ses deux ligands. Nous avons démontré l’effet biologique antagoniste du VHH in vitro sur des modèles de cellules tumorales et de macrophages de type M2 protumoraux issus de monocytes. Ces premiers résultats de caractérisation supportent le développement futur de ce nouveau format d’anticorps VHH bloquant ILT4 en immunothérapie antitumorale
ILT4 (Immunoglobulin-Like Transcript 4) is an immune checkpoint receptor mainly expressed by myeloid immune cells. In cancer context, ILT4 participates in tumor development by maintaining a protumoral immuno-microenvironment and directly promoting tumor cell proliferation. ILT4 interaction with the non-classical MCH class I molecule HLA-G induces an immunosuppressive microenvironment by promoting tolerogenic myeloid cells. Moreover, the ectopic expression of ILT4 has been reported in several solid tumors. The activation of ILT4 by Angiopoietin-like-2 (ANGPTL2) promotes non-small cell lung tumor cell proliferation and inhibits cell apoptosis. Targeting this new immune checkpoint with blocking antibodies is therefore a promising cancer immunotherapy approach. In light of several drawbacks of classical IgG blocking antibodies in solid cancer, we investigated the potential of VHH-based inhibitors. This small monoclonal antibody format, derived from camelid homodimeric antibodies, combine the binding capacities of antibodies to the properties of small molecules. After immunization of an alpaca and phage-display screening, we selected a VHH with high affinity and specificity to ILT4 that inhibits the interaction of the receptor with both ligands. We validated the VHH’s biological antagonist activity on tumor cells and monocyte-derived pro-tumoral M2 like macrophages in vitro. These results support the potential of this new VHH-based antibody targeting ILT4 in cancer immunotherapy