Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Imagerie par résonance de plasmon de surface“

Dépistage du VIH, test de grossesse, mais également surveillance des eaux, détection de contaminants agro-alimentaires : la biodétection est au coeur des problématiques de santé actuelles. Dans ce contexte, les biocapteurs plasmoniques connaissent depuis quelques années un essor particulièrement important : de plus en plus de sociétés, telles que HORIBA Scientific, proposent des prototypes commerciaux, destinés tant à des utilisateurs du domaine de la recherche que de l'industrie. Basée sur le phénomène de résonance des plasmons de surface (communément appelé SPR) la biodétection plasmonique repose sur l'extrême sensibilité d’une onde évanescente se propageant à l’interface entre un film d’or, la biopuce, et le milieu diélectrique couvrant, siège des interactions biomoléculaires étudiées. De manière plus concrète, toute adsorption de matériel biologique se produisant à cette interface entraîne une modification importante des propriétés optiques d’un faisceau de lumière réfléchi par la biopuce : le principe de transduction par SPR consiste alors à mesurer directement ces variations. A l'heure actuelle, différents modes d'interrogation, offrant des performances intéressantes, mais également des limitations propres à chaque configuration. Pour répondre aux exigences de précision et de dynamique de mesure posées par de nombreuses applications, un développement théorique et instrumental, présenté dans ce document, a été initié dans le but de proposer un nouveau un nouveau mode d'interrogation des biopuces plasmoniques : l'interrogation multi-spectrale. Les résultats obtenus par cette technique ont été exploités pour concevoir et réaliser une source multi-spectrale à base de LEDs, particulièrement avantageuse vis-à-vis des configurations existant à l'heure actuelle. La caractérisation du système développé dans le cadre du diagnostic génétique (mucoviscidose) et celui du cancer, ouvre la voie à une nouvelle génération de biocapteurs performants, compacts et de coût relativement raisonnable, présentant un potentiel industriel certain
Biodetection is at the core of the current health concerns, as shown through the variety of applications to HIV screening, food contaminant analysis or water quality monitoring. In this field, plasmonic biosensing is a well-established label-free technique on the market: commercial systems from HORIBA Scientific are currently available for both research and industrial users.Based on the surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, plasmonic biodetection uses the high sensitivity of an evanescent wave propagating along a metallic film (forming the biochip) and the surrounding dielectric medium interface. More specifically, the adsorption of biomolecules onto the metal surface induces a strong change in the optical properties of a light beam reflected by the biochip: the main principle of plasmonic transduction consists in measuring these physical changes. Several interrogation techniques have therefore been developed to access such optical information, but they fail in meeting the most demanding user requirements for precise, real-time, high-throughput measurement.Initiated by these issues, the instrumentation work presented in this document has led to the development of a novel SPR interrogation technique, referred to as multi-spectral interrogation. Moreover, the promising results obtained have been pushed forward to propose a multi-spectral illumination system based on LEDs, providing attractive performances compared to existing configurations. The biosensing potential of the developed system, demonstrated through applications to genetic diagnosis and cancer detection, opens the door to a new generation of compact, high-performance, low-cost SPR sensors

Une nanostructure est dite chirale si elle ne possède pas de plan de symétrie, autrement dit si ses images miroirs sont non superposables. Les objets chiraux interagissent de manière différente avec la lumière polarisée circulairement. Le champ proche exalté induit par ces structures est accordable en longueur d’onde et permet d’amplifier les effets chiroptiques, ces caractéristiques leurs attribuent une place importante dans le domaine de la biodétection. De ce fait, l’exploration de ce champ proche consiste l’axe principal de notre étude. Pour ce faire, on utilise une sonde locale, le PMMA-DR1. Ce copolymère est formé d’un groupe azoïque DR1 qui est attaché latéralement du côté de son groupe donneur au polymère PMMA par une liaison covalente. Sous irradiation adéquate (appartenant au spectre d’absorption du DR1), le champ proche de la nanoparticule active le cycle d’isomérisation de la molécule qui transforme cette énergie électromagnétique en un mouvement mécanique pour passer de l’état Trans à l’état Cis. Le déplacement de matière induit est suivi par des observations AFM. Plusieurs travaux sur l’imagerie photochimique ont été effectués au sein de notre laboratoire sur différentes structures. Récemment, cette méthode a été utilisée pour comprendre le comportement chiral d’une nanostructure parfaitement symétrique qui ne présentait aucun dichroïsme circulaire au champ lointain. Notre contribution consiste à sonder le comportement chiral de structures parfaitement asymétriques par cette méthode d’imagerie
Chiral nanostructures interact differently with right and left circularly polarized light. Moreover, they exhibit enhanced electric and magnetic near-fields leading to the so-called superchirality. This effect can be used for the detection of chiral biological objects with high enantio-sensitivity. Indeed, the optical chirality C is correlated with the rate of excitation of the chiral molecule, so that increasing the optical chirality at the location of the molecule can significantly improve its detection. We present here a subwavelength imaging approach that is based on the interaction between the highly exalted near-field of chiral nanoparticles and an azobenzene molecule (DR1, disperse red 1) grafted to a polymeric chain (i.e. PMMA). Under illumination, the azobenzene molecules (DR1) undergo photo-isomerization cycles, which induce a displacement of matter inducing measurable topographical modifications that can be tracked using atomic force microscopy. Therefore, we obtain in the polymer a map of the near-field of the chiral nanostructures. We recently demonstrated that chiral effects and field dissymmetry in plasmonic nanostructures can be imaged with this technique. Here, we apply photochemical imaging to chiral metallic nanostructures, such as chiral coupled nanorods. We show that the near-field chiral response can be imprinted in the photopolymer

L'ADN étant le support de l'information génétique, les lésions de l'ADN provoquées par différents stress physiques ou chimiques sont un défi pour les systèmes de réparation cellulaire. Parmi ceux-ci le système de réparation par excision de bases (BER) implique plusieurs enzymes dont les objectifs sont la reconnaissance et le retrait de la base lésée, fonctions bien connues pour deux glycosylases : Fpg Procaryote et OGG1 Eucaryote. De nombreuses approches ont été décrites pour étudier les interactions ADN/protéine in vitro. Avec la résonance plasmonique de surface par imagerie (SPRi), nous disposons d'une technique d'analyse en temps réel, sans marquage avec laquelle nous avons pu observer des interactions parallélisées d'une même protéine enzymatique purifiée (Fpg, OGG1, EndoIV ou Ape1) vis-à-vis de différentes lésions sur des oligonucléotides de synthèse immobilisés sur une surface d'or. Les dommages étudiés sont une base oxydée (8-oxoG), une base cyclisée (cycloadénine) et des analogues de sites abasiques (THF et C3). Nous avons également étudié l'action de ces mêmes enzymes sur des lésions multiples, en tandem, associant les bases 8-oxoG et 8-oxoA sur le même brin d'ADN. L'originalité de notre dispositif associe l'analyse directe de l'interaction ADN/protéine et l'approche indirecte de sa conséquence par une stratégie d'hybridation et d'amplification du signal après une rampe thermique. Les résultats obtenus permettent d'envisager l'utilisation de notre technique pour observer la réparation simultanée de certaines lésions par des extraits cellulaires pour des travaux de biochimie ou des extraits tissulaires humains pour des travaux de biologie médicale
DNA is the carrier of genetic information. DNA damage caused by various physical or chemical stresses is a challenge for cellular repair systems. These include the base excision repair system (BER) which involves several enzymes whose objectives are the recognition and removal of damaged bases, well-recognised functions for two glycosylases: prokaryotic Fpg and eukaryotic OGG1. Many approaches have been described to study DNA / protein interactions in vitro. With surface plasmon resonance imaging (SPRi), we have a real-time technique, without labeling, with which we can observe interactions in parallel for a single protein purified enzyme (Fpg, OGG1, EndoIV or Ape1) vis-à-vis various injuries to synthetic oligonucleotides immobilized on a gold surface. The damages studied were an oxidized base (8-oxoG), a cyclised base (cycloadenine) and analogues of abasic sites (THF and C3). We also studied the action of these enzymes on multiple lesions, in tandem, combining the 8-oxoG and 8-oxoA bases on the same strand of DNA. The originality of our system combines the direct analysis of the DNA / protein interaction with the indirect approach of observing its outcome by hybridization and amplification of the signal after a thermal ramp. The results obtained enable us to consider the use of our technique to observe the simultaneous repair of certain lesions by cell extracts for biochemical work, or by human tissue extracts for bio-medical work

Ces dernières décennies, on a assisté à l’augmentation du nombre de technologies et de concepts permettant l’analyse des interactions intermoléculaires. Dans ce contexte, les puces à fluorescence restent les plus fréquemment utilisées. Cependant, cette technologie bien que très sensible et multiplexée, ne permet pas d’avoir accès aux paramètres cinétiques, indispensables au calcul des constantes d’affinité et la recherche de systèmes alternatifs s’impose. Dans cette optique, la résonance plasmonique de surface par imagerie (SPRi) est considérée comme une véritable option. Cette technologie se caractérise par l’absence de marquage et permet de suivre en temps réel d’infimes variations de masses consécutives à des interactions intermoléculaires sur la surface du prisme. L’obtention de constantes d’affinité est ainsi possible. En revanche, la SPRi présente un certain nombre de limites, principalement au niveau de la sensibilité et du multiplexage. Les objectifs de la thèse ont ainsi consisté à combler en partie ces différentes limites. La chimie de greffage basée sur l’utilisation d’oligonucléotides modifiés par un thiol a permis d’améliorer le multiplexage et de déposer plus de 1000 spots par cm² sur la surface d’or du prisme. Dans le même temps, la modification de la surface avec des colloïdes d’or et des dendrimères a permis pour des interactions ADN/ADN, d’atteindre une limite de détection de 2 nM (d’où un gain de 200%). En parallèle de ces travaux, diverses applications biologiques ont été effectuées. Une première étude a consisté à rechercher des ligands spécifiques des structures G-quadruplex des télomères. Une seconde étude s’est portée sur le complexe de partition bactérien. Par des études de criblage les bases impliquées dans l’interaction avec une protéine indispensable à la partition du plasmide F chez E.coli ont été identifiées. L’ensemble de ces travaux ont montré le fort potentiel de la SPRi et les applications potentielles qui en découlent sont nombreuses
During the last decades a large number of technologies have been developed to analyze intermolecular interactions. In this context, the fluorescence biochips remain the most frequently used. Although this technology is very sensitive and multiplexed, it does not allow access to the kinetic parameters, essential to the calculation of the constants of affinity. Therefore, the research for alternative systems is essential. In this way, the Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) is considered as an opportunity. It is an optical detection process that can occur when a polarized light hits a prism covered by a thin metal layer. Under certain conditions free electrons at the surface of the biochip absorb incident light photons and convert them into surface plasmon waves. Perturbations at the surface of the biochip, such as an interaction between probes immobilized on the chip and targets, induce a modification of resonance conditions which can be measured. It is a label free technology which allows intermolecular interactions in real time and gives access to the kinetics parameters. However, SPRi is limited in sensitivity and multiplexing. The objectives of my PhD were to circumvent these various limits. Thus, we validated the immobilization of DNA probes on gold surface using thiol-modified oligonucleotide probes. Deposition carried out on non-modified gold surface, does not require electrical stimulation and expensive specific robotic devices. The thiol modification of the probes was shown to be very stable at room temperature, contrary to pyrrole and diazonium probes that need to be prepared just prior to their spotting. We demonstrate that thiol-modified oligonucleotide probes spotted on a gold surface of the SPRi-prisms are very robust and reproducible. We also demonstrated that this simple chemistry is compatible with high density arrays fabrication bearing more than 1000 spots using a classical spotter. Furthermore, the modification of the prism surface with gold colloids and dendrimers allowed for DNA/DNA interactions, to reach a detection limit of 2 nM. In parallel of this work, various biological applications were carried out and validate our previous developments. A first study was to screen G-quadruplex specific ligands to inhibit telomerase activity. We demonstrated that SPRi technology is particularly well adapted to the screening of interaction of small molecules with DNA probes and is sensitive enough to permit distinction between interactions with different DNA structures. The second study was on the bacterial partition complex. We study the DNA binding requirement involved in SopB-sopC specific interactions and analysed at the nucleotide level the bases involved in the binding efficiency and essential for the partition All this PhD work improved the SPRi technology and demonstrated its great potential in biological applications

L'élaboration de nouveaux médicaments repose sur les études pharmacologiques, dont le rôle est d'identifier de nouveaux composés actifs ou de nouvelles cibles pharmacologiques agissant entre autres au niveau cellulaire. Récemment, la détection basée sur la résonance des plasmons de surface (SPR) a été appliquée à l'étude de réponses cellulaires. Cette méthode de détection, permettant d'observer des variations d'indice de réfraction associés à de faibles changements de masse à la surface d'un métal, a l'avantage de permettre l'étude d'une population de cellules vivantes en temps réel, sans nécessiter l'introduction d'agents de marquage. Pour effectuer la détection au niveau de cellules individuelles, on peut employer la microscopie SPR, qui consiste à localiser spatialement la détection par un système d'imagerie. Cependant, la détection basée sur la SPR est une mesure sans marquage et les signaux mesurés sont attribués à une réponse moyennée des différentes sources cellulaires. Afin de mieux comprendre et identifier les composantes cellulaires générant le signal mesuré en SPR, il est pertinent de combiner la microscopie SPR avec une modalité complémentaire, soit l'imagerie de fluorescence. C'est dans cette problématique que s'insère ce projet de thèse, consistant à concevoir deux plates-formes distinctes de microscopie SPR et de fluorescence optimisées pour l'étude cellulaire, de sorte à évaluer les possibilités d'intégration de ces deux modalités en un seul système. Des substrats adaptés pour chaque plate-forme ont été conçus et réalisés. Ces substrats employaient une couche d'argent passivée par l'ajout d'une mince couche d'or. La stabilité et la biocompatibilité des substrats ont été validées pour l'étude cellulaire. Deux configurations permettant d'améliorer la sensibilité en sondant les cellules plus profondément ont été évaluées, soit l'emploi de plasmons de surface à longue portée et de guides d'onde à gaine métallique. La sensibilité accrue de ces configurations a aussi été démontrée pour un usage en biodétection cellulaire. Une plate-forme permettant de mesurer la spectroscopie SPR simultanément avec l'acquisition d'images de fluorescence a été réalisée. Cette plate-forme a ensuite été validée par l'étude de réponses cellulaires suite à une stimulation pharmacologique. Puis, un système basé sur la microscopie SPR a été conçu et caractérisé. Son emploi pour l'étude de réponses au niveau de cellules individuelles a été démontré. Finalement, les forces et faiblesses des substrats et des plates-formes réalisées au cours de la thèse ont été évaluées. Des possibilités d'amélioration sont mises de l'avant et l'intégration des modalités de microscopie SPR et de fluorescence suite aux travaux de la thèse est discutée. Les réalisations au cours de cette étude ont donc permis d'identifier les composantes cellulaires impliquées dans la génération du signal mesuré en biodétection SPR.

Les puces à ADN sont devenues en l'espace d'une décennie des outils incontournables du paysage scientifique actuel. Situées à l'interface des disciplines traditionnelles, elles ont trouvé. Des applications dans des domaines aussi variées que l'expression des gènes, la détection des SNP ou l'évolution de l'espèce humaine au cours du temps. Le travail présenté ici utilise pour la première fois la technique d'imagerie de résonance des plasmons de surface (SPRi) alliée à un contrôle de la température - allant de 20°C à 80°C - pour l'étude des puces à ADN. Dans une première partie, le processus d'hybridation sur support solide est étudié en détail à l'aide du modèle de Langmuir, tant des points de vue cinétique que thermodynamique. Les paramètres ΔH et ΔS, caractéristiques des séquences utilisées, sont estimés et présentent une évolution inhabituelle en fonction de la longueur des sondes, probablement due à des problèmes d'accessibilité sur la puce. Dans une seconde partie, une technique de détection de mutations ponctuelles basée sur l'utilisation de rampes de température a été développée. Les résultats obtenus sur deux cas modèles (K-ras et Cycline D1) présentent un excellent accord avec les prédictions théoriques en solution et permettent d'envisager l'application de cette méthode pour la détection des SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sur des échantillons biologiques. Une dernière application à l'étude des interactions entre l'ADN-glycosylase Fpg et l'ADN lésé est finalement présentée. Deux lésions de l'ADN, la 8-oxo-guanine et la 5',8-Cyclo-2'desoxyadénosine, ont été étudiées. Une activité catalytique a été détectée par une méthode thermique originale uniquement pour la lésion 8-oxoG
Ln the space of one decade, DNA-chips became tools which cannot be ignored in the present scientific context. Placed at the interface between traditional disciplines, th. Ey are currently used for gene expression studies, SNP detection or who le genome analysis. This work uses for the first time surface plasmon resonance imaging coupled with tempe rature control - from 20°C to 80°C - applied to DNA-chip studies. Ln the first part, we study the DNA hybridization process on a solid support from a both kinetic and thermodynamic point of view, assuming the theoretical Langmuir model, ΔH and ΔS parameters are estimated as a function of probes length and show a non-conventional behaviour compared to the theoretical prediction. We assume that it could be due to a lack of accessibility on the DNA-chip surface. The second part is dedicated to point mutation detection using tempe rature scan technique. Our results, obtained with two models (K-ras and Cycline D1), are in good agreement with theoretical predictions in solution and let assume that this method could be applied for SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) detection on biological samples. A last application concerns the DNAglycosylase Fpg interactions with damaged DNA duplexes. Two lesions, 8-oxo-guanine and 5',8Cyclo-2'-desoxyadenosine, are used and Fpg enzymatic activity is only detected for the first one using an original thermal method

Le travail de thèse est consacré aux interactions spatio-, temporo- et spectro- résolue de laser avec des tissus biologiques. L'objectif de cette thèse était d'étudier l'influence des nanoparticules colloïdales embarqués dans les tissus biologiques multicouches sur leurs propriétés optiques afin de fournir plus profond et / ou plus précise de sondage. Pour ce faire, les paramètres spectroscopiques intégrales et durée de vie de fluorophore dans les environs de nanoparticules métalliques ont été analysées théoriquement et expérimentalement. L’autre partie de l'étude était de proposer de nouvelles solutions algorithmiques pour l'amélioration de la performance du processus d'estimation des valeurs des propriétés optiques de la résolution spatiale des mesures spectroscopiques. La dernière partie de la thèse est la modélisation expérimentale et théorique de la cinétique de fluorophores en présence des nanoparticules d'or colloïdales. La composante ultra-courte pico-seconde (environ 100 ps) a été résolue et a été corrélée à champ dipolaire forte des nanoparticules qui compense le dipôle de la molécule
The thesis work is devoted to spatially-, temporally- and spectrally- resolved laser and biological tissue interactions. The aim of the present thesis was to investigate the influence of colloidal nanoparticles embedded into multilayered biological tissues on their optical properties in order to provide deeper and/or more precise probing. To do so, the integral spectroscopic parameters and lifetime of fluorophore in vicinity of metal nanoparticles were analyzed theoretically and experimentally. Another part of the study was to propose new algorithmic solutions for improving the performance of the estimation process of the optical properties values from spatially resolved spectroscopic measurements. The last part of the thesis was the experimental and theoretical modelling of fluorophore’s kinetics in presence of colloidal gold nanoparticles. The ultra-short pico-second component (around 100 ps) was resolved and correlated to strong nanoparticles dipole field which is compensating the molecule’s dipole

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des nanovésicules circulantes (30 à 100nm de diamètre) libérées dans l'espace extracellulaire par la plupart des cellules humaines, suite à leur activation ou à leur apoptose. Les VEs se divisent en 3 grandes catégories ; les exosomes (Exo), les microparticules (MPs) et les corps apoptotiques (cAPO). Les VEs sont présentes à l'état physiologique dans les différents fluides biologiques du corps humain et jouent un rôle majeur dans différents processus physio-pathologiques. De nos jours, plusieurs techniques, certaines en routine, sont utilisées pour étudier les VEs. Cependant, aucune d'entre elles ne permet de déterminer à la fois leur concentration, leur taille et leurs caractéristiques biochimiques. Un consensus existe sur la nécessité de combiner des techniques pour disposer enfin d'une caractérisation fine et complète des VEs. Il est d'un intérêt majeur de développer des plateformes analytiques dédiées à ces VEs en vue d'améliorer la qualification des échantillons biologiques et de découvrir de nouveaux biomarqueurs de pathologies humaines ou de bio-indicateurs de suivi thérapeutique.Notre projet consiste à développer une plateforme NanoBioAnalytique (NBA) combinant trois techniques : l'imagerie par Résonance des Plasmons de Surface (SPRi), la Microscopie à Force Atomique (AFM) et la Spectrométrie de Masse (MS). L'enjeu est de développer une interface biopuce-instruments qui permettra d'effectuer des investigations multiphysiques et multiéchelles apportant, en une stratégie globale, les informations plus complètes sur les différentes populations de VEs.[...]Ces travaux ont montré la capacité de notre plateforme à détecter sélectivement, et simultanément, différentes sous-populations des VEs co-existantes dans un échantillon complexe tel que du plasma, en s'appuyant sur l'expression différentielle des marqueurs protéiques membranaires. Les taux de capture se sont avérés être directement corrélés à la concentration des vésicules dans l'échantillon injecté. L'analyse AFM a permis de déterminer la distribution en taille de différentes sous-populations de VEs et permettre une analyse différentielle de la distribution en taille sur la gamme 20 nm - 1000 nm. Enfin, des études protéomiques "sur-puce" ont été également engagées afin de caractériser la composition en protéines des VEs libérées sous différentes conditions. Cette analyse a permis d'établir des premiers profils protéomiques différentiels des VEs dans les échantillons étudiés.La plateforme NBA est une méthode efficace pour caractériser et quantifier les VEs, sans marquage et avec une grande sensibilité, sur une large gamme dynamique (environ 10(7) à 10(12) particules/mL) cohérente avec celle existante en fluide physiologique et sur une plage de taille couvrant 2 décades. Elle s'inscrit parmi les approches les plus prometteuses pour l'investigation des VEs en complément de la cytométrie en flux. La grande adaptabilité de cette méthode d'analyse des VEs ouvre de larges perspectives de déploiement dans les secteurs de la Santé, de l'Environnement et de l'Agro-alimentaire
Extracellular vesicles (EVs) are small vesicles (30 to 1000 nm) released from different cell types, upon activation or apoptosis, and present in most body fluids (Blood, Urine….). Based on the current state of knowledge of their biogenesis and biochemical properties, EVs can be devided into three distinct populations: exosomes (EXO), microparticles (MPs) and apoptotic bodies (APOb). EVs have been found to play important biological roles and are also biomarkers of different pathologies. […] The first step consists of the injection of the samples containing EVs onto the biochip surface. This step is accomplished by SPR technique that allows label-free monitoring of EVs immunocapture onto the surface of a biochip presenting different specific bioreceptors. Following the capture of EVs, a nanometrological investigation of the biochip surface by AFM is engaged to characterize the physical properties of captured vesicles (size, morphology, etc..). Owning a nanometrical resolution, AFM can discriminate between individual EVs and vesicles or protein aggregates, leading to an accurate characterization of individual vesicles. The coupling of SPR technique with AFM was adapted to offer a representative global view of each array of bioreceptors and to measure the size of thousands of individual EVs. A proteomic investigation was also engaged to characterize the proteomic compositions of the different subpopulations of EVs. Such an investigation could contribute to the understanding of EVs biogenesis, biology and pathophysiology. To evaluate the potential of our platform to detect, quantify and characterize nanoparticles, two calibration particles, which cover the lower and upper size range of EVs, were chosen: (i) virus-like particles of 50 nm of diameter, also called CP50, and (ii) protein-functionnalized synthetic beads of 920 nm of diameter, called CP920. The capture tests in SPR showed a specific capture of these two calibration particles with their specific bioreceptors, immobilized onto the biochip surface, regardless the complexity of the media in which they were diluted. Also, a positive correlation was obtained between the capture level, measured by SPR, and the particle 9

Les puces à ADN, ont vu le jour à la fin du vingtième siècle. L'utilisation de l'Imagerie par Résonance des Plasmons de Surface dans de tels outils est très prometteuse. En effet, cette technique permet de suivre en temps réel et en parallèle, sans l'usage de marqueur, différentes interactions se déroulant sur une surface métallique. Elle nous a servi pour analyser les interactions ADN/ADN dans le but du diagnostic génétique. Pour cela nous avons fixé des molécules d'ADN biotinylées sur une surface d'or par l'intermédiaire d'une structure auto-assemblée composée successivement un acide thiolé, d'un polymère chargé positivement et de l'ExtrAvidine. L'analyse des interactions ADN/ADN montre que le système employé permet de distinguer la formation d'un double brin d'ADN totalement complémentaires de celle d'un double brin avec une mutation. Cette distinction est nette pour une délétion. Le cas plus subtil d'une substitution nous a poussé à examiner l'effet de la longueur des ADN sur la réponse optique du système. Cette étude a fait ressortir l'influence de la température de fusion des séquences sur le signal obtenu. La représentation des résultats en fonction de ce dernier paramètre a permis de les modéliser, d'expliquer la différence de comportement des diverses molécules utilisées et de prédire le résultat des hybridations entre oligonucléotides quelconques. Ainsi, pour valider notre modèle, nous avons conçu un ensemble de séquences capable de révéler six des plus fréquentes mutations de la mucoviscidose. Les résultats expérimentaux sont en bon accord avec les résultats théoriques. Les premiers essais de diagnostic génétique sont prometteurs.

La plupart des microscopies impliquées dans l'étude d'échantillons ou de processus biologiques utilise des marqueurs ou des sondes, qui peuvent modifier artificiellement, plus ou moins fortement, les échantillons observés.Afin de proposer une alternative à ces techniques, un microscope haute résolution à plasmons de surface (le SSPM) a été développé. Les plasmons sont des oscillations collectives des électrons libres d'un métal, dont les conditions de résonance sont très sensibles à la variation d'indice diélectrique à la surface de ce métal. L'utilisation d'un objectif à forte ouverture numérique permet la focalisation de la lumière incidente dans une petite zone de l'interface métal/milieu d'observation, et entraîne ainsi la localisation et la structuration de ces ondes. Enfin, un balayage de la surface est réalisé, permettant de détecter les variations locales d'indice diélectrique de l'échantillon. Tout d'abord, nous présentons le principe expérimental du SSPM, mais aussi la modélisation de sa réponse par l'intermédiaire d'une résolution 3D des équations de Maxwell. Dans un deuxième temps, nous étudions la structure des couches minces d'or déposées par évaporation thermique sur des substrats de verre, et utilisées lors des expériences de microscopie SSPM. Puis nous visualisons dans l'air et dans l'eau, des nanoparticules métalliques et diélectriques, de 10 à 200 nm de diamètre, et montrons qu'il est possible de les différencier suivant leur taille ou leur indice diélectrique. Enfin, nous imageons des nucléosomes (complexes nucléoprotéiques d'environ 10 nm de diamètre) non marqués, ainsi que des fibroblastes dont nous résolvons certaines des sous structures.