Dissertationen zum Thema „Histone désacétylases“

Nos travaux ont débuté par une étude bibliographique portant sur le rôle des HDAC dans la carcinogenèse et l’utilisation des inhibiteurs en thérapeutique. L’implication des histones désacétylases (HDAC) dans le processus de carcinogenèse de certains cancers digestifs est maintenant bien établie. Cependant leur rôle dans le cancer du pancréas n’a a ps encore été exploré. Le but de la première partie du travail a été d’évaluer le niveau d’expression des histones désacétylases dans 4 lignées cellulaires de cancer du pancréas et de déterminer leur niveau de sensibilité à différents inhibiteurs d’histones désacétylases (HDIs) : TSA, Nicotinamide, et Sirtinol. Les niveaux d’expression des gènes HDACs sont légèrement différents entre lignées cellulaires. De même, la PCR quantitative en temps réel a montré que les niveaux d’expression de ces gènes sont en deçà de celui d’un gène de ménage. En revanche, Le niveau de synthèse des protéines HDACs semble être comparable. Par ailleurs, les inhibiteurs des HDACs exercent une activité anti-proliférative sur les lignées pancréatiques. En utilisant différentes techniques, nous avons observé que les HDIs induisaient une fragmentation de l’ADN, une altération du cycle cellulaire, une externalisation des groupements phosphatidyl-sérine, et une perte du potentiel mitochondrial, l’ensemble conduisant à une mort cellulaire par apoptose. Nos résultats suggèrent que la sensibilité des cellules aux inhibiteurs n’est pas en relation avec le niveau d’expression des HDACs mais dépend vraisemblablement d’autres gènes parmi eux probablement ceux qui contrôlent le cycle cellulaire. La deuxième partie du travail a porté sur l’évaluation du niveau d’expression des gènes codant pour des membres de différentes classes de HDAC (Classe I, II, III) dans les tissus pancréatiques prélevés sur des pièces opératoires. L’extraction d’ARN a été réalisée sur 11 adénocarcinomes du pancréas (AP) de différents stades : 0 (n=1), IB (n=1), IIB (n=6), III (n=1), IV (n=2); 4 tumeurs bénignes [1 cystadénome séreux (CS), une tumeur intracanalaire mucineuse pancréatique (TIPMP), une pancréatite chronique (PC), et un pancréas normal obtenu lors d’un prélèvement d’organe. La RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction) et la PCR quantitative nous ont permis d’évaluer le niveau d’expression des gènes d’intérêt. Une analyse semi-quantitative du niveau de synthèse des protéines HDAC a été réalisée par Western blot et leur localisation par étude immunohistochimique sur coupes de tissu pancréatique. L’analyse par Western bot de la réactivité des extraits tissulaires vis-à-vis d’anticorps spécifiques dirigés contre des membres de la famille des HDAC de classe I, II et III, montre un certain degré de complexité des polypeptides immunoréactifs. Cependant, une forte immunoréactivité des anticorps anti-HDAC7 est observée dans près de 81% des adénocarcinomes (9/11) comparativement aux tumeurs bénignes (CS, TIPMP, PC) et pancréas normal. Cette forte synthèse d’HDAC7 est corroborée par les résultats de la PCR quantitative en temps réel qui montre une forte augmentation de l’expression du gène HDAC7 dans les 9 adénocarcinomes du pancréas. En revanche, des prélèvements proches ou à distance de la tumeur pancréatique ont montré des niveaux d’expression des gènes HDAC similaires au pancréas normal. L’étude immunohistochimique sur coupe d’adénocarcinome pancréatique montre une forte réactivité des anticorps anti-HDAC7. Conclusion: Ces observations sont en faveur de l’expression différentielle du gène HDAC7 dans le cancer du pancréas et suggèrent que HDAC7 pourrait constituer un marqueur potentiel. Des travaux récents ont montré que le vorinostat, un inhibiteur des HDAC, cible spécifiquement HDAC7. Nos résultats, s’ils sont confirmés sur une large série d’adénocarcinomes de différents stades, pourraient constituer une base solide pour envisager le développement de stratégie thérapeutique ou adjuvante nouvelle pour le cancer du pancréas
In the first part of the work we analyze some of the current data related to the deacetylase enzymes as a possible target for drug development in cancer. Given the structural differences among members of this family of enzymes, development of specific inhibitors will not only allow selective therapeutic intervention, but may also provide a powerful tool for functional study of these enzymes. In the second step, attempts were made for the first time to explore the level of expression of members of histone deacetylase encoding genes (HDACs) in four pancreatic tumor cell lines: Panc-1, BxPC-3, SOJ-6 and MiaPaCa-2; and two non-related tumor cells: Jurkat and HeLa. The possible relationship between the levels of HDACs expression and the sensitivity/resistance to HDAC inhibitors (TSA, Nicotinamide and Sirtinol) was further analyzed. Although a slight variation in the profiles of gene expression among cell lines could be evidenced, HDACs protein synthesis seem to be similar. Furthermore, the cells were equally sensitive to inhibition by Sirtinol whereas some variation in the IC50 could be seen in the case of TSA. We also demonstrate that the drugs had the capacity to induce the death of cells by apoptosis. Taken together, our data support the notion that the level of cell sensitivity to the HDIs might be related to the level of expression of genes such as those encoding proteins playing a role in cell cycle checkpoints control but not HDAC per se. In a third part of work, we have evaluated the expression levels of members of class I, II and III in a set of surgically resected pancreatic tissues. Total RNA was isolated from 11 pancreatic adenocarcinomas (PA): Stage 0 (n=1), IB (n=1), IIB (n=6), III (n=1), IV (n=2), one serous cystadenoma (SC), one intraductal papillary mucinous tumor of the pancreas (IMPN), one complicating chronic pancreatitis (CP) and normal pancreatic biopsy (NP) obtained during donor liver transplantation. In addition, four samples of control tissues taken from the surgical specimens from different patients with PA, and two samples from patients with adenocarcinomas of biliary duct (BD) were also included in this study. Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was conducted and gene expression was quantified by qPCR. Protein expression levels were analyzed by Western blot and their localization by immunohistochemistry analyses of cancer tissues sections. The expression of class I and II members of HDACs showed that all the samples from PA, CP, SC and IMPN had decreased levels of HDAC 1, -2, -3 and -4 transcripts. Remarkably, 9 of the 11 PA (≅ 81%) showed significant increase of HDAC7 mRNA levels. The Western blot analysis showed increased expression of HDAC7 protein in 9 out of 11 PA samples in agreement with the qPCR data. Most of the PA tissue sections examined showed intense labeling in the cytoplasm when reacted against antibodies to HDAC7. The data showed alteration of HDACs gene expression in pancreatic cancer. Therefore, increased expression of HDAC7 discriminates PA from other pancreatic tumors

L'acétylation/désacétylation des histones joue un rôle important dans la régulation de divers processus du développement des plantes et de leur réponse au stress. Par contre, la régulation de l’activité des histone-desacétylases (HDAC) par des signaux cellulaires et la relation fonctionnelle entre les différentes HDAC au cours de la réponse au stress oxydatif et d'une élévation de la température ambiante restent encore mal connus. Mon travail de thèse a comporté : 1) l’analyse de la modification post-traductionnelle de la protéine HDA19, régulée par redox et celle des conséquences sur la régulation de l’expression de gènes et la réponse à l’acide salicylique (SA) ; 2) l'étude fonctionelle de HDA9, HDA15 et HDA19 dans la réponse à une élévation de la température ambiante. Dans la première partie, nous montrons que le changement redox induit par SA régule l’accumulation nucléaire de la protéine HDA19 via une S-nitrosylation réversible. Le traitement à SA, ou au donneur physiologique d’oxyde nitrique, S-nitrosoglutathione, augmente les marques d'acétylation des histones d'HDA19 dans des plantules d’Arabidopsis. Des lignées mutantes d’hda19 présentent un état plus oxydé avec une augmentation de l’expression de gènes associés au ROS/RNS, ainsi qu'une accumulation de nicotinamide adénine dinucléotide et de glutathionne. Ces résultats suggèrent que SA induit la S-nitrosylation d’HDA19, réduit son accumulation nucléaire et par conséquent augmente l’acétylation des histones. Dans la seconde partie, nous montrons que HDA9, HDA19 et HDA15 sont toutes impliquées dans la réponse de la plante à l’élévation de la température ambiante. Des mutants hda15 montrent une réponse constitutive à des températures élevées dans des conditions normales, alors que les mutants hda19 et hda9 ont des phénotypes insensibles à la température élevée. L’analyse de l’expression de gènes par RT-PCR et RNA-seq révèle que la mutation d’HDA15 provoque une augmentation de transcrits des gènes impliqués dans le métabolisme primaire et cellulaire lorsque les plantules sont transférées de 20°C à 27°C pendant 4 heures. Par contre, la mutation d’HDA19 conduit à l’induction de gènes impliqués dans des réponses au stress, alors que les gènes induits par la mutation d’HDA9 après le transfert à 27°C ne semblent pas concerner des catégories fonctionnelle spécifiques. Il semble donc que la réponse des plantes à l’élévation de la température soit régulées par HDA9 et HDA19 par différentes voies. Ces résultats suggèrent que de différents membres d’HDAC ont des rôles distincts ou opposés dans la réponse à l’élévation de la température, en affectant l’expression de gènes de différentes catégories. Les travaux de ma thèse apportent un éclairage nouveau sur la fonction des HDAC, en enrichissant la compréhension de la régulation de l’expression génique chez la plante
Histone acetylation/deacetylation play important roles in a diverse range of developmental processes and stress-responsive pathways in plants. However, little is known regarding the regulation of HDACs themselves by environmental signals, which may alter their function in the regulation of gene expression. Also HDACs functions in plant sensing of environmental conditions such as redox stresses and warm ambient temperature need to be precized. My thesis work focuses on: (1) The analysis of redoxregulated posttranslational modifications and theirconsequences on HDA19 function in gene regulation and in salicylic acid (SA)-mediated stress response; (2) The study of the function of HDA9, HDA15, and HDA19 in plant responses to warm temperature and thermal-related genes expression. In the first part, we show that SA-induced redox changes negatively regulate HDA19 nuclear accumulation through a reversible S-nitrosylation. Treatment with SA, as well as with the physiological nitric oxide donor Snitrosoglutathione, increases the abundance of several histone acetylation marks of HDA19 in Arabidopsis seedlings. hda19 mutant lines display a more oxidative status with increased ROS/RNS-related genes expression, as well as nicotinamide adenine dinucleotide and glutathione levels. These results suggest that SA affects histone acetylation by decreasing the nuclear accumulation of HDA19, resulting in histone hyperacetylation. The second part of the study showed that HDA9, HDA15, and HDA19 are involved in modulating plant adaptation to higher ambient temperatures in Arabidopsis. Mutation of HDA15 displayed a constitutive warm temperatureresponsive phenotype under normal temperature, whereas HDA9 and HDA19 mutants were shown insensitive to warming-temperature. Genes expression and RNA sequencing analysis revealed that HDA15 mutation led to the up-regulation of many genes involved in primary and cellular metabolic process when the seedlings were transferred from 20 °C to 27 °C for 4 h. On the other hand, hda19 mutation resulted in up-regulation of genes mainly involved in stressresponses at both normal (20 °C) and warmer (27 °C) temperatures. However, up-regulated genes in hda9-1 mutants did not appear enriched for any particular gene functional category when shifted from 20 °C to 27 °C. Likely, HDA9 and HDA19 positively regulate thermosensory elongation through distinct mechanisms. Our study suggested that the dynamics of histone acetylation regulated by HDA9, HDA15, and HDA19 plays an important role for plant adaptation to warm temperature, which involves distinct regulatory pathways of gene expression. Taken together, my thesis work brought in a few new elements to the current understanding of HDACs functions in the regulation of gene expression in plants

Le pancréas permet le maintien de l'homéostasie glucidique, via la sécrétion d'hormones telles que l'insuline et la somatostatine par les cellules endocrines ß et δ, respectivement. Les anomalies de fonctionnement du tissu endocrine peuvent aboutir au diabète. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes qui régulent la différenciation des cellules endocrines pour le développement de thérapies du diabète. L'objectif de ma thèse a été de caractériser le rôle des histones désacétylases (HDACs) au cours du développement pancréatique. Les HDACs sont des facteurs épigénétiques qui contrôlent l'expression des gènes en modulant l'état de compaction de la chromatine. Nous avons d'abord utilisé une stratégie globale d'inhibition des HDACs, par des inhibiteurs sur des explants pancréatiques, pour montrer que les HDACs interviennent à des points clés du développement du pancréas. En particulier nous avons montré que les inhibiteurs des HDACs de classe I amplifient le pool de cellules progénitrices endocrines. Afin de déterminer le rôle particulier de certains HDACs, nous avons analysé leur profil d'expression et montré que HDAC4, 5 et 9 sont spécifiquement exprimés dans les cellules endocrines ß et δ. Nous avons également étudié le phénotype pancréatique d'embryons de souris délétés pour Hdac4, 5 et 9 et développé une méthode de transfert de gène médiée par lentivirus afin de surexprimer ces HDACs dans les explants pancréatiques. Nous avons ainsi pu montrer que HDAC4, 5 et 9 contrôlent le lignage des cellules ß/δ. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes épigénétiques qui contrôlent la différenciation des cellules pancréatiques
The pancreas maintains glucose homeostasis, through hormones secretion such as insulin and somatostatin by ß and δ endocrine cells, respectively. The abnormal function of the endocrine tissue can lead to diabetes. Consequently, it is crucial to understand the mechanisms that control endocrine cell differentiation in order to develop new diabetes therapies. The objective of my thesis was to characterize the role of histone deacetylases (HDACs) during pancreas development. HDACs are epigenetic factors that control gene expression by modulating chromatin compaction state. First, we used a global strategy of HDAC inhibition, using HDAC inhibitors on pancreatic explants, to demonstrate that HDACs act at key points during pancreas development. Particularly, we showed that class I HDACs inhibition amplifies the pool of pancreatic endocrine progenitors. In order to identify the role of specific HDACs, we analyzed their expression profile and found that HDAC4, 5 and 9 are specifically expressed in ß and δ cells. Next, we studied the pancreatic phenotype of embryos from mice with a deletion of Hdac4, 5 or 9. We also developed a new model of gene transfer mediated by lentivirus to overexpress these HDACs in pancreatic explants. We demonstrated that HDAC4, 5 and 9 control the differentiation of the ß/δ endocrine lineage. These results allow to better understand the epigenetic mechanisms that control pancreatic cell differentiation

Legionella pneumophila est une bactérie intracellulaire qui sécrète plus de 300 protéines dans la cellule hôte. L'un de ces effecteurs, RomA, s'est avéré modifier directement la chromatine de l'hôte en méthylant la lysine 14 de l'Histone H3(H3K14), un résidu généralement acétylé. Afin de savoir comment la désacétylation de cette marque pourrait se produire pendant l'infection, une recherche bioinformatique approfondie du genome de L. pneumophila a conduit à l'identification d'une protéine qui devrait coder pour une histone désacétylase (HDAC), nommée LphD. Au cours de ma thèse j'ai montré que LphD est sécrétée dans la cellule hôte lors de l'infection et cible spécifiquement le noyau, où elle présente une activité désacétylase avec une efficacité élevée pour H3K14. En effet, j'ai montré que LphD désacétyle H3K14 pendant l'infection, et que son activité influence directement les niveaux de méthylation de H3K14 dans les cellules infectées, mettant en évidence une synergie entre LphD et RomA. J'ai également pu montrer que LphD et RomA ciblent un complexe de liaison à la chromatine endogène contrôlant l'état d'acétylation de H3K14 (HBO1/KAT7). Des RNAseq de cellules infectées soit par des bactéries de type sauvage, soit par le knockout LphD et RomA, ont mis en évidence l'influence de ces effecteurs bactériens sur le paysage transcriptionnel de l'hôte. Le modèle que je propose est que les deux effecteurs sécrétés, LphD et RomA, travaillent ensemble pour détourner la machinerie épigénétique de l'hôte afin de faciliter la subversion de la réponse immunitaire et favoriser la réplication intracellulaire de L. pneumophila
Legionella pneumophila is an intracellular bacterium that secretes over 300 proteins in the hostcell through a specialized type 4 secretion system. One of these secreted L. pneumophila effectors, RomA, was shown to directly modify the host chromatin by methylating lysine 14 of Histone H3 (H3K14), a usually acetylated residue. This led to the question how deacetylation of this mark might happen during infection. An in-depth bioinformatics search led to the identification of a protein predicted to code for a histone deacetylase (HDAC), named LphD. During my PhD, I showed that LphD is secreted into the host cell during infection and specifically targets the host cell nucleus, where it exhibits deacetylase activity with high efficiency for H3K14. Indeed, I showed that LphD deacetylates the H3K14 residue also during infection, and that the activity of LphD directly influences the levels of H3K14 methylation in infected cells, highlighting the synergy between LphD and RomA. I also could show that LphD and RomA target an endogenous chromatin binding complex, named HBO1, that contains the histone acetyltransferase KAT7, controlling the acetylation status of H3K14. RNAseq of cells infected with either wild type bacteria or the LphD and RomA knockout assessed the influence of these bacterial effectors on the host’s transcriptional landscape, in particular on genes related to immune response. The model I propose is that the two secreted effectors, LphD and RomA, work together to hijack the host’s epigenetic machinery in order to facilitate the subversion of the host immune response and promotes the intracellular replication of L. pneumophila

La consommation de substances illicites, telles que la cocaïne, constitue un problème important de santé publique. Les puissants effets renforçants de la cocaïne conduisent certains individus à une consommation abusive voire à une dépendance. Au sein du circuit de récompense, la cocaïne bloque la recapture présynaptique des monoamines, ce qui est à l’origine d’une plasticité neuronale impliquant la transcription de nombreux gènes. Des études récentes ont montré que la transcription de ces gènes était sous le contrôle de mécanismes épigénétiques, concernant essentiellement la méthylation de l’ADN et les modifications post traductionnelles des histones dont l’acétylation. Au cours de cette étude, nous avons montré d’abord que l’inhibition des histones désacétylases par divers composés pharmacologiques dont la trichostatine A (TsA) diminuait les propriétés renforçantes de la cocaïne et la motivation des rats à en consommer, sans affecter les effets récompensants du saccharose. La TsA bloque aussi la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne et diminue le comportement de recherche de cocaïne après une période de sevrage. Les effets de la TsA sur l’auto-administration de cocaïne sont accompagnés par la modification de l’expression du facteur de liaison à l’ADN méthylé Mecp2, de l’histone désacétylase HDAC11 et du facteur de transcription MEF2C. Nous avons procédé à l’analyse du transcriptome chez des rats, au niveau du cortex cingulaire antérieur et du noyau accumbens, afin de caractériser un ensemble de gènes sous-jacents aux modifications comportementales. Parmi ceux-ci figurent les gènes Lissencephaly gene-1 et Reeline, deux gènes qui, lorsqu’ils sont mutés chez l’homme, sont à l’origine d’une lissencéphalie caractérisée par la désorganisation des couches corticales résultant d’un défaut de migration neuronale. L’auto-administration de cocaïne induit l’expression des deux gènes. La TsA potentialise l’induction dans le cortex, mais la bloque dans le noyau accumbens. Il apparaît que l’administration répétée de cocaïne réenclenche des mécanismes déjà utilisés lors du développement du cortex cérébral, afin de mettre en place une plasticité synaptique. Cette plasticité est susceptible de participer au développement de la dépendance aux drogues. Notons que l’ensemble de ces mécanismes est sous le contrôle étroit de facteurs épigénétiques, notamment des histones désacétylases
Cocaine is an addictive stimulant drug abused by humans and self-administered by rats. Drug addiction is a chronic brain disease characterized primarily by a compulsive drug-seeking and drug-taking behavior. A unique characteristic of drug addiction, from a clinical point of view, is the persistence of relapse risk long after a person has stopped taking drugs, which constitutes a major obstacle to successful treatment. Cocaine blocks the monoamine transporters, resulting in increased synaptic levels of the amines. The dopaminergic system in particular is thought to represent a key pathway by which psychostimulants produce reinforcement. On the other hand, cocaine administration has been shown to elicit induction in neurons of several immediate early genes that encode transcription factors. Recent data have shown that gene transcription is controlled by epigenetic mechanisms that include DNA methylation and modifications of histones such as acetylation. We show here that injection of several histone deacetylase inhibitors, like trichostatin A (TsA), to rats was sufficient to reduce the reinforcing properties of cocaine and decrease the motivation of the animals to self-administer cocaine but not sucrose. The data also report the blockade of behavioral sensitization by TsA, as well as the reduction of cocaine-seeking behavior induced after a withdrawal period. The effect of TsA on cocaine self-administration was associated with an alteration of the expression of Mecp2 (methyl CpG binding protein 2), of the histone deacetylase HDAC11 and of the transcription factor MEF2C. Modification of the selfadministration behavior in response to TsA was accompanied by extensive changes in gene expression in the cingulate cortex and in the nucleus accumbens, as assessed by cDNA microarray technology. Among the genes induced by cocaine self-administration, we found Lissencephaly gene-1 and Reelin, gene that belong to the same transduction pathway. Mutations within both genes are causing lissencephaly. TsA caused their expression to increase in the cortex and to decrease in the nucleus accumbens. Our results suggest that mechanisms important for the formation of cortical layers during development are used again during adulthood to establish brain plasticity in response to cocaine. The mechanisms, which are under the control of epigenetic factors, especially histone deacetylases, may participate in the development of drug dependence

En raison de l’efficience des traitements, le taux de survie globale à 5 ans des patients avec un cancer gastrique (CG) est d’environ 15%. A l’heure actuelle, il n’existe pas de stratifications des patients permettant de prescrire un protocole de traitements efficace. Durant ma thèse, j’ai établi le rôle de HDAC4 dans la sensibilité des cellules de CG au Cisplatine. J’ai montré que cette réponse semble dépendre du type de CG (intestinal ou diffus) et du statut p53 des cellules cancéreuses. J’ai souligné l’intérêt de combiner un inhibiteur des HDACs (SAHA) avec les chimiothérapies à base de dérivés de platine (PDC : Cisplatine, Oxaliplatine) afin de promouvoir leurs effets cytotoxiques. De manière intéressante, j’ai observé que la réponse aux traitements combinés est différente suivant le statut p53 des cellules cancéreuses. Ces résultats permettent d’ouvrir de nouvelles perspectives dans l’utilisation des traitements combinés PDC + SAHA dans la thérapie du CG. En particulier, le facteur p53 qui est souvent muté dans les CG, pourrait être un marqueur thérapeutique pour un tel protocole de traitement
Due to the efficiency of treatments, the 5-year overall survival rate for patients with gastric cancer (GC) is approximately 15%. Currently, there is no stratification of patients to prescribe an effective treatment protocol.During my thesis, I established the role of HDAC4 in the sensitivity of GC cells to Cisplatin. I have shown that this response seems to depend on the type of GC (intestinal or diffuse) and the p53 status of cancer cells. I emphasized the interest of combining an HDAC inhibitor (SAHA) with platinum derivative chemotherapies (PDC: Cisplatin, Oxaliplatin) to promote their cytotoxic effects. Interestingly, I observed that the response to combination treatments is different depending on the p53 status of the cancer cells.These results open new perspectives in the use of PDC + SAHA combination therapies in GC. The p53 factor that is often mutated in GC could be a therapeutic marker for a such treatment protocol

Les résultats insuffisants de la radiochimiothérapie conventionnelle dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) ont motivé l’évaluation d’une nouvelle stratégie de modulation pharmacologique de la radiosensibilité tumorale basée sur les modifications épigénétiques. Pour cela nous avons évalué la combinaison de la radiothérapie et d’un nouvel pan-inhibiteur des histones déacétylases (HDACi), l’abexinostat en préclinique in vitro et in vivo sur deux modèles de CBNPC puis en phase clinique précoce chez l’homme dans le cadre d’un essai de phase I. Nous avons d’abord montré que l’abexinostat augmente la radiosensibilité des cellules de CBNPC de manière dépendante de la séquence thérapeutique en normoxie et en hypoxie en augmentant l’apoptose caspase dépendante ainsi que les cassures doubles brins radio-induites et en réduisant la signalisation et la réparation de ces dommages de l’ADN. L’abexinostat potentialise également le retard de croissance tumorale induit par la radiothérapie in vivo dans des xénogreffes sous-cutanées de CBNPC avec un profil de toxicité acceptable. Nous avons également montré pour la première fois que la triple combinaison de radiothérapie, abexinostat et cisplatine potentialise le retard de croissance tumorale in vivo.Les premiers résultats in vitro et in vivo confortant le rationnel pour la combinaison abexinostat-radiothérapie nous avons réalisé étude de phase I exploratoire d’escalade de dose combinant l’abexinostat à la radiothérapie palliative hypofractionnée standard délivrant 30y en 10 fractions pour des tumeurs solides métastatiques. Parmi les 58 patients traités, d’âge médian 61 ans (20-82), on note 71% de stade M1 et 88% de patients ayant déjà reçu des traitements préalables par chimiothérapie et/ou radiothérapie et/ou chirurgie. La dose recommandée pour un essai de phase 2 que nous avons établie est de 90mg/m². Sur les 51 patients évaluables, on observe un taux de réponse globale de 7,8% (1 réponse complète (RC) et 3 réponses partielles (RP)) et un taux de réponse locorégionale de 11,8% (1 RC et 5 RP) avec un suivi médian de 16 semaines. Les patients présentant des lésions (cibles ou non) cérébrales ont présenté des taux de réponse encourageant avec notamment un patient en RC. Nous avons retrouvé peu d’effets secondaires de grade ≥3, les plus fréquents étant la thrombopénie (17,2%), la lymphopénie (12,1%) et l’hypokaliémie (6,9%). Au total, 6 patients (10%) ont interrompu leur traitement du fait des effets secondaires. Nous n’avons pas observé de prolongation de l’intervalle QTc de grade ≥3 et il n’y a pas eu d’interruption de traitement en rapport avec cet effet secondaire. Dans l’ensemble nos données in vitro et in vivo montrent une potentialisation de l’effet antitumoral par la combinaison d’abexinostat et radiothérapie. Chez les patients présentant des tumeurs solides avancées l’abexinostat oral en combinaison à la radiothérapie est bien toléré. Cette combinaison pourrait avoir un potentiel particulièrement intéressant dans le traitement des métastases cérébrales.De plus nos travaux précliniques suggèrent pour la première fois un effet prometteur d’une triple combinaison avec HDACi, cisplatine et radiothérapie qui justifie de plus amples investigations et pourrait guider de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les CBNPC.Nos travaux s’inscrivent dans une stratégie de recherche translationnelle et montrent l’importance de la recherche préclinique pour les études d’association aux rayonnements ionisants. Seuls un développement préclinique rationnel et un développement clinique méthodique permettront l’émergence de combinaisons modulant la radiosensibilité tumorale de manière suffisamment efficace pour modifier nos standards de traitement et améliorer le pronostic de nos patients
Insufficient results of conventional chemoradiotherapy in non-small cell lung carcinomas (NSCLC) have encouraged assessment of new pharmacological strategies for modulation of radiosensitization based on epigenetic changes. We have investigated the combination of radiotherapy and a novel pan-histone deacetylase inhibitor (HDACi), abexinostat in vitro and in vivo in two NSCLC models and in an early phase clinical trial. Our findings demonstrate that abexinostat enhances radiosensitivity of NSCLC cells in a time dependent way in vitro in normoxia and hypoxia increasing radio-induced caspase dependent apoptosis and persistent DNA double strand breaks associated with decreased DNA damage signaling and repair. Interestingly, abexinostat potentiates tumor growth delay in vivo in combined modality treatments associating not only abexinostat and irradiation but also in the triplet combination of abexinostat, irradiation and cisplatin.We conducted an exploratory phase 1, dose-escalation study of abexinostat in combination with standard hypofractionated radiotherapy (30Gy in 10 fractions) in patients with advanced solid tumors treated in a palliative setting. Among 58 treated patients, the median age was 61.5 years (range, 20-82); 47% of the patients had M1 stage disease, and 95% had received previous chemotherapy alone or chemotherapy in combination with surgery and/or radiotherapy. The recommended phase 2 dose was determined to be 90 mg/m2. Of the 51 patients evaluable for response, best overall response was 8% (1 complete response [CR], 3 partial responses [PRs]), and best loco-regional response was 12% (1 CR and 5 PRs) at a median follow-up of 16 weeks. Of note, patients with target or non-target brain lesions showed encouraging responses, with 1 patient achieving a best loco-regional response of CR. Treatment-emergent grade ≥3 adverse events (AEs) were few, with most common being thrombocytopenia (17%), lymphopenia (12%), and hypokalemia (7%). Six patients (10%) discontinued treatment due to AEs. No grade ≥3 prolongation of the QTc interval was observed, with no treatment discontinuations due to this AE.Altogether, our data demonstrate in vitro and in vivo a potentiation of anti-tumor effect by abexinostat in combination with irradiation in NSCLC. Oral abexinostat combined with radiotherapy was well tolerated in patients with advanced solid tumors. The combination may have potential for treatment of patients with brain lesions.Moreover, our work suggest for the first time to our knowledge promising triple combination opportunities with HDACi, irradiation and cisplatin which deserves further investigations and could be of major interest in the treatment of NSCLC.Our studies which are part of a translational research strategy highlight the importance of preclinical investigations in the area of radiotherapy and drug combination research. Only rationale preclinical development and methodologically well conducted clinical development will allow new standards of treatment to emerge and improve patient’s prognostic

Les histones désacétylases de type 2 (HD2) ont été caractérisées chez le tabac comme étant des régulateurs négatifs de la mort cellulaire associée à la réponse hypersensible induite par la cryptogéine, un éliciteur protéique.Les principaux objectifs de cette thèse sont d’accroître nos connaissances générales sur les HD2 et de caractériser leur rôle dans la voie de signalisation induite par la cryptogéine.Nous nous sommes tout d’abord intéressé à l’évolution des HD2 au sein des Viridiplantae et nous avons défini deux groupes de HD2. Nous nous sommes ensuite focalisés sur l’évolution des HD2 dans le genre Nicotiana. Nous avons identifié chez le tabac six gènes codant sept isoformes de HD2. Les quatre isoformes de HD2 de Gr1 seraient redondants fonctionnellement.Pour mieux comprendre le mode d’action des HD2 à l’échelle moléculaire et étant donné que nous n’avons pas pu détecter d’activité enzymatique chez les HD2, nous avons tenté d’identifier les gènes cibles et les partenaires protéiques potentiels des HD2.Des expériences de puces à ADN nous ont permis d’identifier des gènes régulés par la cryptogéine de manière HD2 dépendante, parmi lesquels ERF3 qui pourrait constituer un gène majeur impliqué dans l’initiation de la mort cellulaire.Des expériences de co-immunopurification combinées à des analyses par spectrométrie de masse nous ont permis d’identifier des partenaires protéiques des HD2 dont l’histone H4.De manière générale, les résultats obtenus au cours de cette thèse soulèvent la question de savoir si les HD2 possèdent une activité HDAC intrinsèque et nous ont permis de mieux comprendre le rôle des HD2 dans la signalisation nucléaire induite par la cryptogéine
Type 2 histone deacetylases (HD2s) have been characterized in Nicotiana tabacum as negative regulators of hypersensitive response (HR)-associated cell death induced by cryptogein, a proteinaceous elicitor secreted by Phytophthora cryptogea.The main objectives of this thesis are to increase our general knowledge about HD2s and to characterize their role in the signaling pathway induced by cryptogein.We first examined the evolution of HD2s in green plants and defined two groups of HD2s. We then focused on the evolution of HD2s in the genus Nicotiana. Six genes coding seven isoforms of HD2s were identified in N. tabacum. The four Gr1 HD2 isoforms are functionally redundant in the response to salt stress.To better understand the mode of action of HD2s at the molecular level, and since we – as well as other research groups – were unable to detect any enzymatic activity from HD2s, we tried to identify target genes and potential protein partners of HD2s.Microarray experiments allowed us to identify genes that are regulated by cryptogein in a HD2-dependant fashion. Among these genes, ERF3, coding an ethylene-responsive factor, could be a major gene involved in the initiation of HR-associated cell death.Co-immunopurification experiments combined with mass spectrometry analyses permitted us to identify protein partners of HD2s such as histone H4.Globally, the results obtained during this thesis call into question whether HD2s do have an HDAC activity themselves, or are associated into complexes containing HDACs from the RDP3/HDA1 family. These results also permitted us to better understand the role of HD2s in the nuclear signaling pathway induced by cryptogein in tobacco

L'acétylation des lysines est une modification post-traductionnelle des protéines dont l’ajout et l’élimination sont catalysés respectivement par les histones acétyltransférases (HAT) et les désacétylases d'histones (HDAC). Cette modification joue un rôle majeur dans la régulation de processus cellulaires tels que l'expression génique, la mobilité cellulaire et le métabolisme. Il est maintenant bien établi qu'une altération de l'activité des désacétylases, entrainant ainsi une dérégulation de l'acétylome, est associée au développement tumoral. Par conséquent, les HDAC sont considérées comme des cibles prometteuses en thérapie anti-cancéreuse ce qui a conduit au développement de nombreux inhibiteurs de HDAC. Cependant, la recherche de nouvelles molécules avec un potentiel anti-cancéreux accru et moins d’effets secondaires est indispensable. Nous avons identifié cinq acides 4-hydroxybenzoïques comme nouveaux inhibiteurs de HDAC, trois inhibiteurs qui ciblent plusieurs HDAC et deux inhibiteurs spécifiques de HDAC6. Les inhibiteurs qui ciblent plusieurs HDAC induisent l'acétylation de certaines lysines des histones H3 et H4 dans les cellules de leucémie myéloïde chronique humaine K-562. Le traitement des cellules induit un arrêt de la progression du cycle cellulaire associé à la modulation de l'expression des cyclines et l'activation de la transcription du gène codant p21. Enfin, les trois composés qui inhibent plusieurs HDAC induisent une mort par apoptose qui est confirmée par l'observation du clivage et de l'activation des caspases. Les inhibiteurs spécifiques de HDAC6 induisent une hyperacétylation importante de la tubuline-α corrélée à une condensation des microtubules dans les cellules cancéreuses adhérentes de prostate (cellules PC-3 et LNCaP). Ces composés induisent une mort par apoptose des cellules cancéreuses en suspension K-562 accompagnée du clivage des caspases et de l'activation de la protéine pro-apoptotique BAX. Enfin, les molécules altèrent la fonction de la protéine chaperonne HSP90α observée par une forte diminution de l'expression de ses protéines clientes: Bcr-Abl et le récepteur aux androgènes. Par ailleurs, les cinq composés n'affectent pas la viabilité des cellules saines. L'ensemble de ce travail révèle que les acides 4-hydroxybenzoïques sont des molécules prometteuses pour le développement de nouveaux composés ayant des propriétés anti-tumorales intéressantes
Lysine acetylation is a post-translational modification characterized by addition and removal acetyl group by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), respectively. This modification plays a crucial role in multiple cellular processes including gene expression, cell motility and metabolism. It is now well established that disruption of deacetylase activity, leading to a pathological acetylation profile, is associated to cancer development. Consequently, HDACs are considered as promising targets for anticancer therapy, which led to the development of novel HDAC inhibitors. However, discovery and synthesis of new molecules is essential to increase anticancer potential and decrease adverse health effects of already known compounds. We identified five 4-hydroxybenzoic acids as new HDAC inhibitors: three pan-HDAC inhibitors and two HDAC6-specific inhibitors. Pan-HDAC inhibitors induce acetylation of selected lysines within histones H3 and H4 in human chronic myeloid leukemia K-562 cells. Treatment of cells induces cell cycle arrest associated with increased cyclin expression and the transcriptional activation of p21. Finally, these pan-HDAC inhibitors induce apoptotic cell death further confirmed by the cleavage and activation of caspases. HDAC6-specific inhibitors induce hyperacetylation of α-tubulin in correlation with microtubule condensation in adherent prostate cancer cells (PC-3 and LNCaP cells). These compounds induce apoptotic cell death in K-562 cells accompanied by caspase cleavage and the activation of the pro-apoptotic protein BAX. Furthermore, these molecules alter the chaperon function of HSP90α, which is observed through the robust decrease of the expression of its client proteins (i.e. Bcr-Abl and androgen receptor). Noteworthy, the five compounds did not affect healthy cell viability. Taken together these results revealed that 4-hydroxybenzoic acids are attractive molecules for the development of new compounds with promising anticancer properties

L'expression des facteurs de transcription C/EBPs est induite dans les cellules épithéliales intestinales lorsque celles-ci sont stimulées avec certaines cytokines. Cette famille de facteurs de transcription joue un rôle très important dans l'élaboration de la phase aiguë de la réponse inflammatoire (APR) dans plusieurs tissus en régularisant l'expression de certains gènes de réponse inflammatoire. Nous avons déjà démontré que différents domaines de l'isoforme C/EBP[minuscule delta] sont impliqués dans le contrôle de son activité transcriptionnelle, mais très peu de choses sont connues sur la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. L'objectif de notre recherche était de déterminer le rôle des histones désacétylases dans la régulation négative de C/EBP[minuscule delta]. Nous avons observé par essai d'interactions in vitro et in vivo, que deux histones désacétylases, HDAC1 et HDAC3, interagissent avec les domaines N et C-terminaux de C/EBP[minuscule delta]. L'intégrité du bZIP (région basique et leucine zipper) est nécessaire pour la liaison de HDAC1 et HDAC3 au domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Les acides aminés 70 à 85 de C/EBP[minuscule delta] sont importants pour la liaison à HDAC1, ainsi que les acides aminés 50 à 60. Il y a un site de liaison de HDAC3 entre les acides aminés 60 à 70 de C/EBP[minuscule delta] et un autre entre les acides aminés 108 à 164. Nos résultats suggèrent que la liaison de HDAC1 à C/EBP[minuscule delta] est indirecte et pourrait être en partie médiée par la protéine mSin3A puisque ce co-répresseur lie le domaine C-terminal de C/EBP[minuscule delta]. Par ailleurs, nous avons également montré qu'une histone désacétylase de classe II, soit HDAC4, pouvait également interagir avec C/EBP[minuscule delta] par ces deux domaines. Nos observations suggèrent que l'interaction des histones désacétylases avec C/EBP[minuscule delta] pourrait impliquer d'autres protéines que celles jusqu'à maintenant identifiées. Nous montrons également par transfections transitoires et essai luciférase que HDAC1 et HDAC3 modulent négativement l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de l'haptoglobine. Ces deux histones désacétylases de classe I pourraient donc jouer un rôle prépondérant dans la régulation négative de l'activité transcriptionnelle de C/EBP[minuscule delta] sur le promoteur de gènes cibles.

Les recherches s‘intensifient aujourd’hui sur la découverte de nouveaux traitements contre l’hypercholestérolémie. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés à deux acteurs qui jouent un rôle important dans la régulation de la transcription de l’enzyme Cyp7A1, enzyme qui joue un rôle clé dans la dégradation du cholestérol en acides biliaires. Ces deux acteurs sont le récepteur nucléaire HNF4-α et l’enzyme histone désacétylase HDAC7. Ainsi le travail a permis de découvrir des molécules capables d’activer le récepteur nucléaire HNF4-α. Nous avons démontré par RMN qu’un de nos composés (le 7-hydroxy-2-nitronaphto[2,1-b]furanne) interagissait directement avec le récepteur nucléaire. Notre étude a également permis de découvrir des composés intéressants pour la recherche d’inhibiteurs spécifiques de l’enzyme HDAC7. La synthèse de tétrapeptides a également été réalisée dans le but de démontrer une possible désacétylation du récepteur nucléaire HNF4-α par l’enzyme HDAC7. Enfin une étude fonctionnelle autour du noyau phényle d’un inhibiteur générique (SAHA) des HDACs a été réalisée et a montré que des petites modifications fonctionnelles (petits groupements alkyls) autour du phényle du SAHA ont un effet important sur l’efficacité des composés
The research on the discovery of new treatments against high cholesterol is currently intensified. As part of this work, we focused on two actors which play an important role in regulating transcription of the enzyme Cyp7A1, an enzyme that plays a key role in the degradation of cholesterol into bile acids. These actors are the nuclear receptor HNF4-α and the enzyme histone deacetylase HDAC7. In this work, we discovered molecules that can activate the nuclear receptor HNF4-α. Using NMR, we show interaction between one of our compound (7-hydroxy-2-nitronaphto[2,1-b]furan) and HNF4-α. We synthesized and discovered also interesting compounds for the research of specific inhibitors of the enzyme HDAC7. The synthesis of tetrapeptides was also conducted to demonstrate a possible deacetylation of nuclear receptor HNF4-α by enzyme HDAC7. Finally, a functional study around the phenyl ring of a generic HDACs inhibitor (SAHA) was performed and showed that small functional changes around the phenyl group of the SAHA have a large effect on the efficiency of compounds

Le déséquilibre HAT/HDAC aurait une influence sur le développement de certains cancers ainsi que dans l’addiction à l’alcool ou à la cocaïne. En inhibant les histones désacétylases, le taux d'acétylation de la chromatine augmente ce qui permet l’accès aux facteurs de transcription et l'expression des gènes. Aujourd'hui, il existe de nombreux inhibiteurs d'HDAC de structures diverses, mais ils ne sont pas spécifiques et présentent des effets secondaires importants. Les inhibiteurs d'HDAC comme le butyrate de sodium ou le MS-275 ont montré une modification de la dépendance à l'alcool chez le rat. MS-275 inhibe principalement la classe I de HDAC et conformément à ces observations nous nous intéressons aux inhibiteurs les plus sélectifs de la classe I tels que le Largazole thiol et le RedFK228. Notre but est de synthétiser de nouveaux cyclodepsipeptides analogues afin d'obtenir un inhibiteur sélectif de la classe I. Les HDAC de la classe I sont Zn-dépendants, ces analogues auront un groupement sulfonylhydrazide ayant une bonne affinité pour l’ion Zn2+ (ZBG). Il sera relié au cyclodepsipeptide par un bras espaceur dont la longueur sera adaptée (n = 2, 3). Une autre pharmacomodulation concerne l'incorporation d’hétérocycles différents (oxazole, thiazole et pyridine). Les inhibitions de ces composés ont pu être testées sur HDAC1, HDAC3 et HDAC6. Un composé a une spécificité pour HDAC3 et un autre a une spécificité pour HDAC1. Les tests sur des rats "binger" permettent de penser que HDAC1 est impliqué dans ce model de consommation et non HDAC3
The imbalance HAT/HDAC would influence the development of cancers and alcohol or cocaine addiction. HDAC inhibition allows increase of both acetylation rate and gene expression. Today, there are many structurally diverse potent, but non-specific HDAC inhibitors displaying important side-effects. HDAC inhibitors such as sodium butyrate or MS-275 have been shown to alter the alcohol dependence in the rat. MS-275 inhibits mainly class I of HDAC and in line with these observations we are interested in more selective class I inhibitors such as Largazole thiol and RedFK228. Our purpose is to synthesize new cyclodepsipeptides analogues in order to obtain selective class I inhibitor. HDAC class I is a Zn-dependent enzyme and our target molecules have sulfonylhydrazide function as efficient Zinc binding group (ZBG). Additional pharmacomodulations concern the incorporation of different heterocycles (oxazole, thiazole, pyridine) and varying linker lengths (n = 2, 3). Inhibitions of these compounds have been tested on HDAC1, HDAC3 and HDAC6. A compound has specificity for HDAC3 and another has specificity for HDAC1. Tests on rats "binger" suggest that HDAC1 is involved in this model of consumption and not HDAC3

L’infection par HIV-1 représente un des problèmes de santé publique majeurs de notre société actuelle. Le traitement HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy) inhibe le cycle réplicatif viral mais ne permet pas l’éradication du HIV-1. La principale cause de cet échec thérapeutique est la persistance de réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HIV-1, qui, lors de l’arrêt du traitement HAART, sont à l’origine d’un rebond de la charge plasmatique virale. Le défi actuel est donc de découvrir de nouvelles méthodes d’élimination des cellules réservoirs. Une des stratégies envisagées est de forcer l’expression virale dans les cellules infectées de manière latente afin d’entraîner leur destruction suite à leur détection par le système immunitaire ou suite aux effets cytopathiques viraux. Parallèlement, le traitement HAART serait maintenu afin de limiter la propagation des virions néo-synthétisés. Plusieurs éléments sont impliqués dans la répression transcriptionnelle associée à la latence post-intégrationnelle du virus HIV-1 :la nature du site d’intégration ;l’absence de facteurs cellulaires inductibles tels que NF-κB ;la structure chromatinienne du provirus et les modifications post-traductionnelles des histones ;l’absence de niveaux suffisants de la protéine trans-activatrice Tat. De plus, notre laboratoire a précédemment mis en évidence un lien entre deux de ces éléments, en démontrant, dans une lignée modèle de latence post-intégrationnelle, que la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un activateur de la voie de signalisation NF-κB, permet une réactivation synergique de l’expression virale combinée à l’inhibiteur d’histone-désacétylases (HDACI) TSA. Cependant, l’utilisation thérapeutique du TNFα et de la TSA est inenvisageable en raison de leurs toxicités.

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Doctorat en Sciences
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Résumé

L’objectif de ce travail a été d’évaluer la toxicité du butyrate de sodium (NaBu), un inhibiteur des

histones désacétylases (HDACs), et ses mécanismes d’action sur les cellules de cancer du sein

humain, les cellules MCF-7 déficientes pour la caspase-3, et lignées dérivées :les cellules MCF-

7/caspase-3, et les cellules VCREMS résistantes à la vincristine, et dans une moindre mesure à la

doxorubicine. La contribution de l’apoptose dans la létalité induite par le NaBu a été recherchée

dans les cellules MCF-7wt en estimant l’exposition de la phosphatidylsérine ainsi que le clivage de

la PARP. La présence de caspase-3, n’a ni amplifié ni accéléré l’apoptose qui a impliqué le

rhéostat Bax/Bcl-2 en faveur d’une induction de Bax. La cytostasie du NaBu dans les cellules

MCF-7 s’est manifestée par un blocage des cellules en phase G2/M. L’évaluation du niveau

d’expression des régulateurs du cycle cellulaire dans les cellules MCF-7wt et MCF-7/caspase-3 a

montré une surexpression de p21, de façon indépendante de p53. L’action cytostatique du NaBu

a été associée à une accumulation légère et modeste des formes non-phosphorylées de pRB, un

facteur dont la phosphorylation par les complexes cycline D/cdk4,6 et cycline E/cdk2 est

nécessaire à la transition G1/S. Dans ces conditions, les niveaux de cdk2 et de Cdc25A, une

oncoprotéine activatrice de cdk2, sont restés stables. Le NaBu est une molécule à effet

pléïotropique, l’utilisation de la trichostatine A, inhibiteur par excellence des HDACs, a permis

d’établir la relation de causalité entre l’inhibition des HDACs et la toxicité du NaBu. La plupart

des inhibiteurs des HDACs induisent l’apoptose en perturbant le métabolisme oxydatif de la

mitochondrie ce qui pourrait modifier le statut redox cellulaire. Nous avons cherché une

implication du métabolisme du glutathion (GSH), le thiol anti-oxydant non-protéique majoritaire

de la cellule, dans la toxicité induite par le NaBu. Les résultats montrent que le NaBu induit une

déplétion du GSH dans les cellules MCF-7wt et dérivées de façon dose-dépendante, corrélée avec

la mortalité cellulaire. Devant l’éventualité d’une consommation accrue de GSH par les enzymes

associées à son métabolisme, nous avons évalué le niveau des activités des enzymes glutathion

peroxydase, glutathion réductase et glutathion S-transférases. Dans les cellules MCF-7, le NaBu a

induit de façon significative ces enzymes anti-oxydantes, à l’exception des GSTs, de même que la

catalase, une enzyme indépendante de ce système. Les expériences visant à libérer le pool de

GSH lié aux protéines ont montré que la déplétion du GSH intracellulaire est parallèle à celle du

GSH lié aux protéines. Par conséquent, la consommation du GSH est réellement la cause de la

chute du niveau de GSH générant un stress oxydant. La doxorubicine, un inhibiteur des

topoisomérases, a une utilisation clinique limitée en raison de ses effets secondaires irréversibles

(cardiotoxicité entre autres). Dans le but d’améliorer son efficacité, nous avons expérimenté des

combinaisons NaBu/doxorubicine sur les cellules VCREMS et MCF-7, étant donné la capacité

du NaBu à induire l’expression des topoisomérases et favoriser la conformation déployée de la

chromatine. L’utilisation de la technique isobologramme nous a permis de déterminer les index

de combinaison pour une application simultanée ou séquentielle des drogues. Les résultats

indiquent que le NaBu sensibilise les cellules VCREMS et MCF-7 à l’action de la doxorubicine.

Dans les cellules VCREMS, cet effet s’est produit en dépit de la stimulation des enzymes de

détoxication, GSTs et GPX. L’ensemble de ces résultats indique que l’utilisation du NaBu en

combinaison avec certains anticancéreux constitue une stratégie très intéressante en

cancérothérapie.
Doctorat en sciences biomédicales
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Le récepteur des oestrogènes (RE) peut moduler l’expression de gènes impliqués dans les processus de prolifération et d’apoptose cellulaires. Cette régulation est possible par le recrutement de complexes corégulateurs. Dans ces complexes, l’activité répressive s’explique essentiellement par la présence d’histones désacétylases (HDAC). Cette famille de protéines est composée de 18 membres classés en 4 groupes. Cette répartition est due aux similarités structurales et de fonctions de ces enzymes. Il y a la classe I (HDAC 1, -2, -3, -8), la classe II (HDAC 4, -5, -6, -7, -9, -10) et la classe IV (HDAC 11) qui ont une activité Zn2+ dépendante alors que la classe III (Sirt1-7) recense les HDAC avec une activité NAD+ dépendante. Des résultats récents du laboratoire ont montré, qu’au niveau ARNm, il y avait un important différentiel d’expression de HDAC9 entre les lignées cellulaires de cancer du sein RE positive et négative ou résistante au tamoxifène. Durant ma thèse, j’ai démontré que la régulation de HDAC9, au niveau de son expression, comme au niveau de ses fonctions, affecte la signalisation oestrogénique en modulant l’expression et l’activité transcriptionnelle de REα. De plus, de nombreuses études ont montré l’activité antiangiogénique d’inhibiteurs de HDAC (HDI) à large spectre comme la TSA (Tricostatin A). La conception et l’identification de HDI, potentiellement sélectifs, comme agents anti-tumoraux et/ou anti-métastatique représente une nouvelle approche de thérapie seule ou combinée avec les produits déjà utilisés dans le traitement du cancer. Ainsi, afin d’identifier et caractériser de nouveaux HDI, j’ai établi un outil bioluminescent pour la détection d’inhibiteurs sélectifs de HDAC. Plusieurs lignées cellulaires Gal4-VP16-HDAC ont été générées dans ce but
The estrogen receptor (ER) can modulate the gene expression with consequences in the cell proliferation, apoptosis. This modulation is possible by the recruitment of coactivator or corepressor complexes. The repression activity is in particular explained by the histones deacetylases (HDACs). This protein family is composed by eighteen members who have been classified in four groups. These HDACs are subdivided on structural and functional similarities. The class I isoforms (HDACs 1, 2, 3 and 8), class II (HDACs 4, 5, 6, 7, 9, 10) and class IV (HDAC11) are Zn-dependent enzymes, whereas class III HDACs (Sirtuins 1-7) are NAD+-dependent. Recent data from the laboratory have shown, at the mRNA level, there is an enormous expression differential of HDAC9 between breast cancer cell line ER positive and negative or OHT resistant cell line. During my thesis, I demonstrated that the regulations of the HDAC9 on the level of its expression as of its role in the various breast cancer cell lines were implicated in the estrogen signaling. This regulation takes place at the transcriptional level and in the ERet#945; activity.In addition, using broad spectrum HDAC inhibitors (HDIs) such as TSA (Tricostatin A), many studies have shown that these inhibitors had antiangiogenic activity. Thus, the design or the identification of selective and potent HDAC inhibitors as agents anti-tumoral and/or anti-metastatic can emerge in a novel opportunity used alone or in combination with the already existing agents for the treatment of cancers. In order to identify and characterize new HDIs, my thesis works consisted to establish bioluminescent cell lines for screening HDAC inhibitors. Different cell GAL4-VP16-HDACs chimeras' models were generated to determine the selectivity of HDIs for the different HDACs

Ce travail rapporte la synthèse et l'évaluation biologique des molécules hybrides de type isocombrétastatine A-4/belinostat. L'évaluation biologique de cette nouvelle série nous a permis d'identifier deux molécules inhibitrices de la polymérisation de la tubuline ainsi que de la HDAC8 possédant une puissante activité anti-proliférative dans la gamme du nanomolaire. De plus, nous démontrons que le système de catalyseur PtO2/PTSA-MeOH/H2O est très efficace pour convertir les alcynes internes et terminaux en cétones et qu’il est compatible avec une grande variété de groupes fonctionnels
In this work, we report the synthesis and biological evaluation of isocombretastatin A-4/belinostat hybrid molecules. The biological evaluation of these new series has identified two molecules with potent anti-proliferative activity in the nanomolar range, which exhibit inhibitory activity on tubulin assembly and HDAC8. Second, we demonstrate that the PtO2/PTSA-MeOH/H2O catalyst system is very efficient in converting internal and terminal alkynes to ketones and that it is compatible with a wide variety of functional groups

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire incurable encore incomplètement comprise. Elle se caractérise cliniquement par une élévation de la pression moyenne dans l’artère pulmonaire (AP) au-delà du seuil de 25 mmHg. Au niveau cellulaire, cette élévation des pressions est attribuable à une prolifération excessive et une résistance à l’apoptose accrue des cellules musculaires lisses (CML) d’AP. HDAC6 est une histone désacétylase 6 principalement cytoplasmique régulant divers mécanismes de survie surexprimée en réponse au stress dans plusieurs cancers. Étant donné les similarités entre les cellules cancéreuses et les cellules vasculaires HTAP, nous avons émis l’hypothèse qu’HDAC6 est surexprimée en HTAP et contribuait au phénotype prolifératif et anti-apoptotique des CMLAPs et au remodelage vasculaire en HTAP. À l’aide de souris génétiquement modifiées et d’approches pharmacologiques dans deux modèles animaux précliniques d’HTAP, nous avons voulu démontrer qu’HDAC6 représente une cible thérapeutique de choix. Nous faisons la démonstration qu’HDAC6 est surexprimée dans les tissus pulmonaires, les AP distales et les CML isolées de patients HTAP lorsque comparés aux donneurs sains. L’inhibition moléculaire et pharmacologique d’HDAC6 réduit la prolifération et la résistance à l’apoptose des CMLAPs HTAP, sans avoir d’effet sur les cellules contrôles. D’un point de vue mécanistique, nous démontrons qu’HDAC6 désacétyle KU70, bloquant la translocation mitochondriale de Bax pour éluder l’apoptose. L’inhibition d’HDAC6 in vivo par la tubastatine A améliore significativement les paramètres hémodynamiques et le remodelage vasculaire dans deux modèles d’HTAP précliniques. Nous montrons que l’inhibition d’HDAC6 peut être combinée de façon sécuritaire à une bithérapie HTAP approuvée présentement utilisée en clinique et que la trithérapie proposée procure un effet bénéfique additif à l’inhibition d’HDAC6 seule sur le remodelage. Finalement, nous montrons que les souris mutées pour HDAC6 ont un remodelage vasculaire et une élévation des pressions artérielles pulmonaires significativement moins grands que les souris non mutées en réponse à une hypoxie de 3 semaines. Nous démontrons pour la première fois l’implication d’HDAC6 dans le développement de l’HTAP. L’inhibition d’HDAC6 semble être une avenue thérapeutique intéressante dans le traitement de l’HTAP. La tubastatine A étant déjà en phase clinique dans le traitement de certains cancers, l’évaluation de son efficacité pour la clientèle HTAP pourrait être rapidement mise en place.
RATIONALE: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a vascular remodeling disease with limited therapeutic options. Although exposed to stressful conditions, pulmonary artery (PA) smooth muscle cells (PASMCs) exhibit a pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype. HDAC6 is a cytoplasmic histone deacetylase implicated in the regulation of multiple pro-survival mechanisms and overexpressed in response to stress in cancer cells. Due to the similarities between cancer and PAH, we hypothesized that HDAC6 expression is increased in PAH-PASMCs to face stress, allowing them to survive and proliferate, thus contributing to vascular remodeling in PAH. OBJECTIVE: Using genetically modified mice and pharmacological approaches, we aimed to demonstrate that HDAC6 inhibition is a promising strategy to improve PAH. METHODS AND RESULTS: HDAC6 is significantly up-regulated in lungs, distal PAs and isolated PASMCs from PAH patients and animal models. Molecular and pharmacological inhibition of HDAC6 reduces PAH-PASMC proliferation (Ki67 labeling) and resistance to apoptosis (Annexin V assay) in vitro sparing control cells. Mechanistically, we demonstrate that HDAC6 deacetylates Ku70, blocking the translocation of Bax to the mitochondria and preventing apoptosis. In vivo inhibition of HDAC6 (Tubastatin A) significantly improves established PAH in two experimental models (Sugen/hypoxia and monocrotaline) and can be safely given in combination with currently approved PAH therapies. Finally, Hdac6 K.O mice have significantly lower right ventricle systolic pressure in response to 3 weeks of chronic-hypoxia compared to wild-type mice. CONCLUSION: We showed for the first time that HDAC6 is implicated in PAH development and represents a new promising therapeutic target to improve PAH.

Le virus de l’immunodéficience humaine (HIV) est l’agent pathogène responsable du SIDA (Syndrome de l’ImmunoDéficience Acquise). Le HIV infecte de façon privilégiée les cellules du système immunitaire, mais le système nerveux central (SNC) constitue sa deuxième grande cible. En effet, au moins 10% des personnes infectées présentent des atteintes neurologiques associées au SIDA. Les cellules microgliales constituent les principales cibles cellulaires d’une infection virale productive dans le SNC. La transcription des gènes du HIV-1 peut-être subdivisée en deux phases, une phase initiale régulée par des facteurs de transcription cellulaires et une phase tardive principalement régulée par le puissant transactivateur viral Tat. Mon travail de thèse a consisté en l’étude de CTIP2 (COUP-TF Interacting Protein 2), un cofacteur du facteur de transcription cellulaire COUP-TF, sur la transcription des gènes du HIV-1 dans les cellules microgliales. Nos travaux nous ont permis de montrer qu’en intervenant au niveau de la transcription des gènes viraux, CTIP2 réprime la réplication du HIV-1 dans les cellules microgliales en induisant la formation de structures hétérochromatiniennes le long du provirus. En effet, CTIP2 est recruté sur le promoteur du HIV-1 par l’intermédiaire des facteurs de transcription Sp1 et COUP-TF fixés sur les boîtes GC du promoteur minimal. Une fois ancré, CTIP2 va recruter des activités histones déacétylases qui vont provoquer une déacétylation locale de l’histone H3. Le domaine central de CTIP2 va également permettre le recrutement de l’histone méthyltransférase SUV39H1 qui va méthyler de manière spécifique le résidu lysine en position neuf de l’histone H3 et ainsi créer un site de fixation pour HP1α, une protéine associée à l’hétérochromatine. La polymérisation de HP1α le long du provirus va ainsi générer un domaine hétérochromatinien inaccessible pour les facteurs cellulaires et viraux impliqués dans la régulation de la transcription des gènes du HIV-1
The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiological agent causing AIDS (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome). The central nervous system (CNS) is the second important target of HIV after the immune system. About 10% of the patients with AIDS present neurological symptoms. The macroglial cells are the major site of HIV production in the brain. HIV-1 gene transcription can be divided in two phases, an initial phase controlled by cellular transcription factors and a late phase mainly controlled by the powerful viral transcription factor Tat. My thesis work was focused on the study of CTIP2 (COUP-TF Interacting Protein 2), a cofactor of the cellular transcription factor COUP-TF, on HIV gene transcription in microglial cells. Our findings reveal the ability of CTIP2 to specifically act as a potent inhibitor of both initial and late transcriptional phases, leading to repression of viral replication in microglial cells. Indeed, CTIP2 is recruited by the cellular transcription factors Sp1 and COUP-TF fixed on the GC boxes of the minimal HIV-1 promoter. Once anchored, CTIP2 will recruit histone deacetylase activities (HDAC) leading to a local deacetylation of histone H3. The central domain of CTIP2 will also allow the recruitment of the histone methyltransferase (HMT) SUV39H1 which specifically methylate the lysine residue in position nine of histone H3 therefore creating a binding site for the heterochromatin associated protein HP1α. HP1α polymerization along the provirus will then generate a heterochromatic environment making the viral promoter inaccessible for the cellular and viral factors implicated in the regulation of HIV-1 gene transcription

La schistosomiase est la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme puisqu’en 2016, environ 200 millions de personnes ont été traitées pour cette parasitose. Plusieurs espèces de schistosomes peuvent être la cause de cette maladie dont Schistosoma mansoni, responsable de la schistosomiase intestinale. Son cycle de vie est complexe et comprend deux hôtes : un hôte définitif vertébré, l’Humain et un hôte intermédiaire qui est un mollusque d’eau douce. Actuellement, un seul médicament, le praziquantel, est utilisé contre toutes les espèces de schistosomes, mais son utilisation de façon massive et répétée à favoriser l’émergence de souches parasitaire tolérantes et/ou résistantes. La nécessité de trouver de nouveaux médicaments et de nouveaux traitements est donc devenue impérative.Les lysines désacétylases ou KDAC(s) constituent des cibles thérapeutiques intéressantes, notamment parce que ce sont des enzymes impliquées dans des processus cellulaires essentiels tels que la régulation de l'expression des gènes et du cycle cellulaire, ou encore la différenciation cellulaire. À ce jour, des inhibiteurs de KDAC(s) sont déjà approuvés dans le traitement du cancer et d’autres sont en essais cliniques.Chez S. mansoni, trois KDAC(s) de classe I ont été identifiées: HDAC 1, 3 et 8. D'autre part, l'utilisation d'inhibiteurs de KDAC(s) a démontré qu'il était possible d'induire l'apoptose et la mort des parasites en culture. Des études réalisées sur la protéine HDAC8 humaine et SmHDAC8 ont montré qu'il existait des différences significatives au niveau de la poche catalytique entre ces deux protéines. Ces données soulignent l’intérêt de développer des inhibiteurs sélectifs de SmHDAC8. Il est devenu, néanmoins essentiel de déterminer le rôle de SmHDAC8 dans la biologie du parasite et notamment ses partenaires protéiques. De ce fait, la première partie de ce travail de thèse s’est focalisé sur la mise en évidence de l’interactome de l’enzyme parasitaire SmHDAC8. Par l’utilisation du système en double hybride chez la levure et de la co-immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié plusieurs partenaires de SmHDAC8 qui sont impliqués dans des processus essentiels à la cellule tel que la régulation de la transcription et de la traduction, le cycle cellulaire, le métabolisme, la réparation de l’ADN, la protéolyse ou encore le transport des protéines. Parmi ces interactants, nous avons également retrouvé la GTPase SmRho1 suggérant que l’enzyme SmHDAC8 serait impliqué dans la modulation de l’organisation du cytosquelette.Dans une seconde partie, nous nous sommes donc intéresser à l’interaction entre SmHDAC8 et la SmRho1. Nous avons initialement démontré que cette interaction était bien présente chez le parasite et notamment chez les vers adultes et les schistosomules. L’acétylation de SmRho1 sur la lysine K136 a également été mise en évidence par spectrométrie de masse et nous avons aussi pu observer un effet de l’inhibition de SmHDAC8 sur l’organisation du cytosquelette d’actine chez le parasite.Deux isoformes de SmRho1 (SmRho1.1 et SmRho1.2) ont été identifiées et caractérisées. La technique du double hybride chez la levure et la co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, a permis de démontrer que seule SmRho1.1 pouvait interagir avec SmHDAC8. Enfin, la caractérisation des motifs d'interaction entre SmHDAC8 et SmRho1.1, par co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, suggère que le domaine C-terminal de SmRho1 serait impliqué dans cette interaction. Ces données sont en faveur d’un rôle potentiel de SmHDAC8 dans la modulation du cytosquelette d’actine via son interaction spécifique avec la GTPase SmRho1.1
Schistosoma mansoni is the major parasitic platyhelminth species causing intestinal schistosomiasis, for which around 200 million people are in need of treatment. The schistosome life cycle is complex and includes two hosts: a definitive mammalian host, mainly humans in the case of S. mansoni, and an intermediate snail host. Currently one drug, praziquantel, is the treatment of choice against all species of schistosomes, but tolerant/resistant strains have been isolated in endemic areas following its extensive use in mass treatment programs, as well as in laboratory studies. The need to find new drugs and new treatments is therefore imperative.Lysine deacetylases (KDACs) form a family of enzymes that are conserved in metazoans. They are attractive therapeutic targets in a variety of pathologies, particularly cancer, because they are involved in the regulation of gene transcription and several KDAC inhibitors have already been approved as drugs. Our previous studies identified and characterized three class I KDACS in Schistosoma mansoni: HDAC 1, 3 and 8. Invalidation of the transcription of SmHDAC8 by RNAi led to the impaired survival of the worms after the infection of mice, showing that it is a valid therapeutic target.The analysis of the 3D structure of SmHDAC8 by X-ray crystallography showed that the catalytic domain structure diverges significantly from that of human HDAC8 and this was exploited to identify selective inhibitors that induce apoptosis and death of the worms and are thus lead compounds for the development of novel anti-schistosomal drugs.The precise biological roles of mammalian or schistosomal HDAC8 are unknown and in order to determine why SmHDAC8 knockdown or inhibition causes apoptosis and death it is essential to study the cellular signaling pathways involving SmHDAC8. In the first part of the work described in this thesis, protein partners of SmHDAC8 were characterized by screening a yeast two-hybrid cDNA library and co-immunoprecipitation/mass spectrometry (MS) analysis. SmHDAC8 partners are involved in different processes, included transcriptional and translational regulation, cell cycle, metabolism, DNA repair, proteolysis or protein transport. Among the partners thus identified the schistosome orthologue of the human RhoAGTPase, suggesting that SmHDAC8 may be involved in the modulation of the organization of the cytoskeleton.The second part of the work focused on the interaction between SmHDAC8 and SmRho1. In adult worms and schistosomula S. mansoni, SmHDAC8 interacts with SmRho1 GTPase which is acetylated on lysine K136. Treatment with an SmHDAC8 inhibitor caused massive disruption of the worm and schistosomula actin cytoskeleton. We have also identified two closely related isoforms of SmRho1 (SmRho1.1 and SmRho1.2). By using two heterologous expression systems (the yeast two hybrid assay and Xenopus oocytes), we have demonstrated a specific interaction between SmHDAC8 and SmRho1.1 involving its C-terminal moiety. Our results show that SmHDAC8 is potentially involved in cytoskeleton organization via its interaction with the SmRho1.1 isoform

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le cancer hématologique le plus fréquent du monde occidental et est caractérisée par une évolution clinique hétérogène :certains patients vivent plusieurs décennies sans symptôme alors que pour d'autres le besoin de traitements est rapide et voient leur survie globale raccourcie. Il est dès lors primordial de savoir à quel type d’évolution le patient sera confronté afin d’adapter au mieux le suivi de la maladie et la précocité ou non du traitement. Ces dernières années, la génétique a mis en évidence des aberrations chromosomiques et des mutations spécifiques récurrentes dans cette maladie mais le domaine de l'épigénétque est encore peu étudié.L'épigénétique étudie les processus induisant des modifications réversibles et héritables de l’ADN sans altérer la séquence en acides nucléiques. La méthylation de l'ADN, les modifications post-traductionnelles des histones, l'interférence par ARN et l'hydroxyméthylation de l'ADN sont les mécanismes qui induisent ces modifications et ont un impact sur l'expression génique. Dans ce travail, nous traitons des histones désacétylases et des gènes TET et IDH impliqués dans l'hydroxyméthylation de l'ADN.Au cours de ce travail, nous avons dressé le profil d'expression des 18 isoenzymes HDAC dans des lymphocytes B de patients atteints de LLC. Nous avons observé une surexpression globale de celles-ci par rapport à des cellules B saines. Nous avons également démontré que HDAC3, 6, SIRT2, 3 et 6 sont corrélés avec le pronostic pour la survie sans traitement ou la survie globale. Quelques isoenzymes sélectionnées par des analyses multivariées (HDAC6, 7, 10 et SIRT3, 5 et 6) ont été combinées pour générer un score HDAC qui s'est avéré être un facteur pronostic puissant divisant significativement notre cohorte (P<0,0001).L'activité enzymatique globale des HDAC fut par la suite étudiée. Elle fut très significativement corrélée avec les deux types de survie et particulièrement avec la survie sans traitement où elle s'impose comme un facteur indépendant. Les patients avec une haute activité présentent une survie globale médiane de 137 mois alors qu'elle est supérieure à 376 mois pour une faible activité (P<0,0001). De fait elle nous permet de raffiner le pronostic en mettant en évidence des sous-groupes au sein de patients catégorisés par des facteurs pronostiques classiques.Enfin, nous nous sommes penchés sur l'hydroxyméthylation de l'ADN et les gènes associés à ce phénomène (TET et IDH) qui, pour certains, voient leur expression dérégulée dans les cellules leucémiques. TET2 et IDH1 prédisent significativement la survie sans traitement, les patients présentant une haute expression de ces gènes ayant une médiane de survie sans traitement plus grande (111 mois) que les autres (78 mois). De plus, l'expression de TET1 est diminuée alors que celle de TET3 et IDH2 est augmentée dans les lymphocytes B de patients lorsque ceux-ci sont cultivés en présence de cellules stromales mésenchymateuses, des acteurs du microenvironnement. Cependant, ces dérégulations d'expression ne sont pas associées à une modification du taux globale d'hydroxyméthylation de l'ADN.Ce travail met en avant une association évidente entre les gènes HDAC, TET et IDH et le pronostic des patients relevant dès lors la pertinence des changements épigénétiques dans la progression de la LLC.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)
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La protéine RIP140 est un cofacteur atypique , qui bien que recruté en présence de ligans, réprime l'activité transcriptionnelle de nombreux récepteurs nucléaires. Notre objectif a été de préciser le rôle et les mécanismes d'action de RIP140 dans la signalisation oestogénique. Nous avons montré que RIP140 réprime l'activité des récepteurs des oestogènes et des récepteurs apparentés ERRs lorsqu'ils sont recrutés au niveau de l'ADN. Cette activité répréssive implique les histones désacétylases ainsi que les C-terminal Binding Proteins. Nous avons également identifié deux domaines C-terminaux de RIP140, fortement répresseurs, recrutant problablement d'autres partenaires. Enfin nous avons montré que les ERRs activent la transcription de gènes via les protéines Sp1 (gène p21) et que RIP140 exerce un effet positif sur cette transactivation, impliquant les histones désacétylases. RIP140 apparait donc comme un cofacteur complexe, dont l'effet repose sur de multiples domaines et partenaires.

Dans le cadre de la poursuite de l’exploration des effets anticancéreux des complexes ferrocéniques du tamoxifène, nous avons préparé une série de complexes hybrides résultant de la substitution de la chaîne latérale du ferrocifène (FcTAM) par celle du SAHA, un inhibiteur des histones-déacétylases (HDACi) utilisé dans le traitement de certains lymphomes. A partir de la structure hybride « FcTAM-SAHA », cinq types de modifications ont été réalisées. Il s’agit [1] de la modification de la fonction acide hydroxamique (CONHOH) en fonction amide primaire (CONH2) ou acide carboxylique (COOH), [2] de la variation de la longueur de la chaîne latérale, [3] de la présence ou non d’un substituant sur le cycle aromatique, [4] de la substitution du métallocène et [5] du remplacement du groupement ferrocényle par un phényle. Les effets antiprolifératifs des nouveaux complexes ont été étudiés sur deux lignées de cancer du sein, MDA-MB-231 (lignée hormono-indépendante et triple-négative) et MCF-7 (lignée hormono-dépendante). Un effet synergique de la toxicité est observé en série FcTAM-SAHA sur les deux lignées cellulaires. De façon un peu inattendue, nous avons trouvé que l’effet antiprolifératif des hybrides phénoliques (type FcOHTAM-SAHA) et des hybrides ferrocénophaniques (type FnTAM-SAHA) était comparable voir légèrement inférieur à celui des complexes non hydroxylés (type FcTAM-SAHA). Cette observation semble indiquer que les propriétés redox des molécules ne s’expriment pas de façon identique pour les précurseurs et les hybrides. Dans tous les cas, les complexes porteurs d’une fonctionnalité chimique acide hydroxamique ou amide primaire sont plus cytotoxiques que les acides carboxyliques et ces effets sont peu influencés par la longueur de la chaîne latérale. Enfin, dans tous les cas, les complexes ferrocéniques ont des effets antiprolifératifs supérieurs à leurs analogues organiques. Cette différence souligne l’importance de la présence du motif ferrocénique et de ses propriétés redox uniques
Pursuing our exploration on anticancer activity of tamoxifen ferrocene derivatives, we have synthesized a series of hybrid complexes resulting from the substitution of ferrocifen (FcTAM) side chain with SAHA, a histone-deacetylase inhibitor (HDACi) used in the treatment of certain lymphomas. From FcTAM-SAHA hybrid, five types of modifications have been performed. They are [1] modification of the hydroxamic acid function (CONHOH) with a primary amide (CONH2) and a carboxylic acid (COOH), [2] variation of the side chain length, [3] with or without an aromatic substituent, [4] substitution of the metallocene and [5] substitution of the ferrocenyl unit with a phenyl group. The antiproliferative effects of the new complexes have been studied on two breast cancer cell lines, MDA-MB-231 (hormone-independent and triple-negative cell line) and MCF-7 (hormone-dependent cell line). A synergistic effect of the toxicity was observed in series FcTAM-SAHA on both cell lines. Surprisingly, no increase in toxicity was observed in the phenolic (FcOHTAM-SAHA-type) and in ferrocenophane (FnTAM-SAHA-type) hybrids. This observation suggests that the redox properties of the molecules are not expressed in the same way for precursors and hybrid compounds. In general, the hydroxamic acids and primary amides are more cytotoxic than carboxylic acids and these effects are not influenced by the length of the side chain. Finally, we found that the ferrocenic compounds are always more cytotoxic than their organic analogs. This difference highlights the importance of the presence of the ferrocenic moiety associated with its unique redox properties

L’alcool est la drogue la plus consommée en France, et selon l’observatoire français des drogues et des toxicomanies (OFDT), environ 10% de la population aura un usage problématique de l’alcool. L’alcoolodépendance est responsable de nombreux décès, et la mission interministérielle de lutte contre la drogue et la toxicomanie (MiLDT) estime que chaque année, plus d’un million de séjours hospitaliers sont liés à des pathologies provoquées par la consommation excessive d’alcool. Dans ce contexte, et compte tenu de la difficulté de soigner les patients alcoolodépendants, il est nécessaire de trouver de nouvelles pharmacothérapies pour traiter cette maladie chronique et hautement récidivante. Afin d’étudier de nouvelles pistes thérapeutiques, nous avons mis en place au laboratoire le modèle d’induction de la dépendance à l’alcool chez le rongeur par inhalation chronique et intermittente de vapeurs d’alcool. Ce modèle est le seul capable d’induire un syndrome de sevrage, permettant donc d’intégrer la composante motivationnelle liée au renforcement négatif. Les animaux dépendants présentent une motivation excessive pour la consommation de solutions d’alcool fortement concentrées ainsi qu’une consommation compulsive, autant pendant la période nocturne que diurne. Cette motivation peut être mesurée grâce au protocole d’auto-administration opérante. Le modèle d’inhalation de vapeurs d’alcool nous permet ainsi de tester l’efficacité d’un traitement chez des sujets réellement exposés à des quantités d’alcool suffisantes pour induire des neuroadaptations équivalentes à ce que l’on retrouve chez les patients alcoolodépendants. Deux pistes thérapeutiques ont alors été étudiées. La première visait à évaluer l’effet d’un inhibiteur de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline (IRSN), le milnacipran. Nos résultats montrent que cette molécule diminue de manière significative la consommation excessive d’alcool et prévient la rechute. Ils montrent également que les deux composantes, sérotoninergique d’une part, et noradrénergique d’autre part, sont impliquées dans l’effet comportemental observé lors du traitement au milnacipran. Dans la seconde partie de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés aux mécanismes épigénétiques mis en place lors de l’alcoolodépendance, et plus particulièrement aux modifications d’acétylation des histones. Nous avons testé les effets d’un inhibiteur des histones désacétylases (iHDAC), le butyrate de sodium (NaB), dans différents modèles de consommation excessive d’alcool ainsi que dans la rechute. Nos résultats montrent que le NaB permet de prévenir : 1) la consommation excessive d’alcool chez des rats dépendants, 2) l’escalade et le maintien d’une consommation excessive dans le modèle de consommation intermittente de 20% d’alcool, et 3) la rechute mesurée dans un protocole de privation d’alcool. De plus, la cartographie des régions cérébrales impliquées dans les mécanismes de la dépendance montre que le NaB permet de contrebalancer certaines modifications épigénétiques retrouvées chez les animaux dépendants. L’ensemble de ces résultats montre que l’inhibition double de la recapture de sérotonine et de noradrénaline, ainsi que l’inhibition des HDACs sont efficaces dans des modèles précliniques pertinents de l’addiction à l’alcool. Ces données confortent l’hypothèse d’une plus grande efficacité des traitements ciblant différents systèmes de neurotransmission voire de régulations géniques impliquées dans le développement de l’addiction, de ses comorbidités, et dans la vulnérabilité à long terme à rechuter.

Les histones acétyltransférases (HAT) et les histones désacétylases (HDAC) sont des enzymes capables d’acétyler et de désacétyler respectivement les histones, ainsi que certaines protéines non-histones. Elles agissent le plus souvent au sein de complexes multiprotéiques et jouent des rôles clés dans le remodelage de la chromatine, un mécanisme aujourd’hui largement impliqué dans le contrôle du développement des plantes. L’objectif de ce travail était d’étudier le rôle des HAT de la famille MYST, HAM1 et HAM2, et de la HDAC HDA9 au cours du développement d’Arabidopsis thaliana. Une analyse phylogénétique a permis de révéler l’existence de plusieurs clades de protéines MYST. Par une démarche de génétique inverse, nous avons pu montrer que les deux représentants de la famille MYST chez Arabidopsis, HAM1 et HAM2, étaient fonctionnellement redondants. En plus de la mise en évidence de profils d’expression similaires entre ces deux gènes, des analyses génétiques et des études cytologiques nous ont permis de révéler que la double mutation ham1 ham2 induisait des défauts importants dans la formation des gamétophytes mâles et femelles, résultant d’un arrêt de la gamétogenèse dans des étapes précoces. Parallèlement, le rôle de la HDAC HDA9 dans le contrôle de la transition florale a été précisé. Par une approche de « gènes candidats », nous avons révélé son rôle dans la répression de l’activateur de la transition florale AGL19 via des modifications de la chromatine au niveau de son promoteur
Histone acetyltransferases (HAT) and histone deacetylases (HDAC) are enzymes able to respectively acetylate and deacetylate histone and non-histone protein. They usually act within multiprotein complexes and play key roles in chromatin remodeling, a mechanism that is greatly involved in the control of plant development. The aim of this work was to study the role of MYST family of HAT, HAM1 and HAM2, and HDAC HDA9 during the development of Arabidopsis thaliana. Phylogenetic analysis revealed the existence of several clades of MYST proteins. Using a reverse genetic approach, we showed that the two MYST family members in Arabidopsis, HAM1 and HAM2, were functionally redundant. In addition to show overlapping expression pattern between these two genes, genetic analysis and cytological studies revealed that ham1 ham2 double mutation induced severe defects in the formation of male and female gametophyte, resulting in an arrest of mitotic cell cycle at early stages of gametogenesis. At the same time, the role of the HDAC HDA9 in the control of flowering time has been specified. Using a “candidate genes” approach, we revealed its role in the repression of the floral activator AGL19 through chromatin modifications on its promoter

HIC1 pour Hypermethylated In Cancer est un gène candidat suppresseur de tumeur. En effet, il est situé en 17p13. 3 une région d'ADN génomique hyperméthylée dans certains types de cancers ou délétée dans des cancers de l'ovaire. Ce gène code pour un facteur de transcription puisqu'il possède dans sa partie carboxyterminale cinq doigts de zinc de type Krüppel C2H2 capables de lier une séquence spécifique d'ADN, associés à un domaine d'interaction protéine/protéine appelé BTB/POZ en N-terminal. D'abord, nous avons montré que HIC1 est un répresseur transcriptionnel. Contrairement à deux autres protéines de la même famille BTB/POZ, BCL-6 et PLZF qui répriment la transcription en recrutant des complexes constitués de SMRT, mSin3A et HDAC, nous avons montré que le domaine BTB/POZ de HIC1 est incapable de recruter ces complexes. De plus, l'utilisation de la Trichostatine (TSA, inhibiteur des HDACS) a montré que ce domaine réprime la transcription sans recruter une activité histone désacétylase. Un crible double hybride en levure a permis d'isoler plusieurs partenaires dont une protéine possédant une activité histone méthyltransférase. Parallèlement, en réalisant un alignement entre les séquences des différentes protéines HIC1 et d'un paralogue HRG22, dans la région centrale, où l'homologie de séquence en acides aminés est faible, deux motifs peptidiques bien conservés entre les espèces ont été mis en évidence. Le motif dégénéré GLDLSKK, proche de la séquence PLDLS présente dans de nombreuses protéines qui fixent le corépresseur CtBP. HIC1 interagit avec CtBP via ce motif GLDLSKK et que cette région centrale est capable de réprimer la transcription indépendamment du domaine BTB/POZ. Pour conclure, HIC1 réprimerait la transcription de deux façons.

Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur très agressive de la plèvre principalement liée à l'exposition à l'amiante. Le manque d'efficacité des traitements conventionnels soulève la nécessité de trouver de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du MPM. Mon travail de thèse a consisté à caractériser deux alternatives distinctes pour l'amélioration des thérapies conventionnelles anti-tumorales. La première approche visait à améliorer les effets thérapeutiques des inhibiteurs d'histone déacétylases (iHDAC) en caractérisant un nouveau mode d'administration par leur vectorisation sur des nanoparticules acido-sensibles. Bien que quatre iHDAC soient actuellement approuvés en clinique, leurs propriétés pharmacodynamiques et effets secondaires sévères limitent leur utilisation chez l'homme. Ainsi, durant mon travail de thèse, j'ai caractérisé trois iHDAC vectorisés, in vitro et in vivo dans un modèle de mésothéliome malin. Ce travail apporte les preuves de l'intérêt thérapeutique d'une vectorisation des iHDAC pour traiter le MPM. La seconde approche visait à étudier la molécule naturelle de phénéthyl isothiocyanate (PEITC) pour l'amélioration du traitement de première ligne du MPM. L'approbation de molécules de synthèse pour leur application clinique est un frein majeur dans l'avancée de la recherche en santé en raison de leur toxicité sévère, et il devient prometteur de s'intéresser à des sources naturelles pour l'obtention de nouveaux composés thérapeutiques. Mon étude a donc consisté en l'évaluation d'une combinaison de cisplatine-PEITC dans un modèle de MPM, et j'ai montré en quoi cette alternative pouvait être bénéfique pour le traitement du MPM
Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a very aggressive form of tumor affecting the pleura, mainly caused by occupational exposure to asbestos. The modest efficiency of current treatments raises the necessity to develop new therapeutic approaches to treat MPM. My PhD consisted in the characterization of two distinct alternatives aiming at improving current anti-tumoral therapies. The first objective of my work focused on the characterization of the vectorization of three histone deacetylase inhibitors (HDACi) onto pH-dependent nanoparticles for specific targeting of the tumor through the enhanced permeability and retention effect (EPR) to improve their therapeutic effects. Although four HDACi are currently approved for clinical use, their pharmacodynamic properties and severe side effects limit their application in humans. During my thesis, I characterized three vectorized HDACi in vitro and in vivo in a malignant mesothelioma model. This work demonstrates the therapeutic interest of vectorizing HDACi to treat MPM. The second objective of my PhD was to study the naturally occurring compound phenethyl isothiocyanate (PEITC) to improve MPM first line treatment. Approval of synthetic molecules for their clinical use is a major concern given their severe toxicity, and it thus became interesting to consider natural sources to obtain new therapeutic compounds. This work consisted in the evaluation of the therapeutic effects of PEITC alone or in combination with cisplatine in a model of MPM, and demonstrates how this alternative therapy could be beneficial for the treatment of MPM

Le problème majeur de la chimiothérapie anticancéreuse est le manque de sélectivité des agents cytotoxiques utilisés. Dans ce cadre, la recherche contre le cancer s’oriente actuellement vers le développement de nouveaux concepts de ciblage thérapeutique. Dans cette optique, l’utilisation de prodrogues lors de protocole DEPT ou PMT a montré des résultats encourageants. Nos travaux se sont donc orientés vers la synthèse de prodrogues glucuronylées d’inhibiteurs d’HDAC tels que le SAHA ou CI-994 pouvant être activées de façon sélective par la -glucuronidase extracellulaire présente au niveau des zones nécrotiques environnant les tumeurs. Nous avons également développé un nouveau concept de ciblage thérapeutique. Ainsi, la synthèse de composé présentant quatre parties (gâchette, espaceur, drogue, marqueur de reconnaissance) a été réalisée
The major problem in cancer chemotherapy is the lack of selectivity of cytotoxic agents. Thus, the development of new concepts in order to deliver anticancer drugs selectively at the tumour site is particularly warranted. The use of non toxic prodrugs that could be activated in the course of DEPT or PMT strategies showed encouraging results. Within this framework, we have designed glucuronyl prodrugs of two HDAC inhibitors (SAHA, CI-994). These compounds have been evaluated in vitro and led to encouraging results. Moreover, we have developed a new concept based on the use of sophisticated four part tumour targeting devices designed to seek and destroy tumour cells

Les HDACs humains consistent en une famille de 18 membres différents groupés dans quatre classes. Classe I (HDAC 1-3. 8), classe II (HDAC4-7, 9,10 dont HDAC4, 5, 7 et 9 forment un sous-groupe dû à une organisation structurale commune, alors que HDAC6 est membre de classe IIb), classe III, également désignée sous le nom des sirtuines (SIRT1-7) et classe IV (HDAC11). Les classes I, II et IV partagent des caractéristiques communes, car tous leurs membres sont zinc-dépendants et montrent quelques similitudes de séquence, alors que dans la classe III HDACs il s’agit d’enzymes NAD+-dépendant sans homologie aux autres HDACs. Les pan-inhibiteurs tels que SAHA, qui est actuellement dans des essais cliniques en phase III et a été récemment approuvé pour le traitement du lymphome à cellule T cutané, bloquent les enzymes de classes I et II, alors que le MS275 est un inhibiteur sélectif de la sous-classe I et bloque les activités de HDAC 1, 2 et beaucoup moins efficacement HDAC 3. Des inhibiteurs sélectifs de la classe II ont été également produits, permettant ainsi la dissection des diverses activités de HDACs. Notamment, alors que l'induction de TRAIL semble être associée à l'inhibition des enzymes de la classe I dans les systèmes cancéreux, d'autres fonctions cellulaires dépendent de l'action des HDCAs classe II, comme la régulation de la différentiation, principalement la différentiation cardiaque. HDACis dans des systèmes de différentiation : C2C12 cellules, F9 cellules, cellules 3T3L1. Nous avons examiné MC1568, un nouvel inhibiteur des HDACs, spécifique pour la classe II, dans un modèle leucémique, les cellules U937, et divers systèmes de différentiation, tels que les cellules C2C12 pour la différentiation de muscle, les cellules F9 pour la différentiation endodermale et les cellules 3t3L1 pour la différentiation des adypocytes. De façon intéressante, nous avons constaté que dans les cellules C2C12 l'inhibiteur des HDAC classe 2 bloque l'action catalytique de la classe 2 de HDAC, mais stabilise l'interraction entre le facteur transcriptionnel MEF2D et HDAC4. MEF2D est le principal facteur transcriptionnel, responsable de la différentiation terminale de muscle, et par conséquent l’inhibition de son activité transcriptionnel bloque la différentiation du muscle. D'une manière semblable, dans les deux autres systèmes nous avons évalué l'inhibition de la différentiation et nous avons trouvé que l’activité transcriptionnelle de RAR et PPARγ, essentiels pour la différentiation des deux systèmes respectivement, a été bloqué in vitro dans le premier cas et in vivo dans le deuxième cas. Dans le cas de la différentiation induite par PPARγ, on a utilisé le système des cellules 3T3L1. Le traitement de ces cellules avec Troglitazone induit la différentiation d'adypocytes, alors que la présence du MC1568 le bloque complètement. En analysant le niveau de l'expression de PPARγ pour RT-PCR, nous avons constaté que son niveau a été fortement diminué après traitement avec MC1568. De façon intéressante, le traitement d'une souris exprimant stablement le gène de la luciferase sous le contrôle de l’élément de réponse de PPAR (PPRE-Luc), a bloqué l'activité transcriptionnelle de PPARγ, prouvant que le composé régule l'activité transcriptionnelle de récepteur nucléaire et sa transactivation. Inhibition des HDACs classe II dans des modèles de cancer - Cellules MCF7 Dans des systèmes de cancer, tels que les cellules MCF7 nous avons constaté que l'inhibiteur des HDACs classe 2, MC1568, induisait la sumoylation de HDAC4 ce qui augmente l’activité catalytique de HDAC4 comme cela a été précédemment démontré. La transfection d'un mutant spécifique empêchant la sumoylation de HDAC4 en cellules F9 a diminué la capacité de répression de RAR sur un de ces gènes cibles, le collagène IV. Nous avons démontré que le traitement avec MC1568 régule l'activité transcriptionelle des deux facteurs de transcription, RAR alpha et NF-KB, sur trois gènes cibles, IRF1, TNF et TRAIL. La sumoylation de HDAC4 par RANBP2 réprime transitoirement l'expression de ces gènes cibles. Cette répression est perdue lorsque HDAC4 est dégradé. Leucémie promyelocitaire aigüe (APL), cellules NB4 Les cellules NB4 sont un système cellulaire de leucémie promyelocitaire aigüe (APL). Cette maladie est caractérisée par la présence d'une protéine de fusion, PMLRAR alpha, avec une forte activité de répression due au recrutement augmenté des complexes corépresseurs. Les patients sont soignés avec la thérapie de différentiation par de l'acide rétinoïque (ATRA). Même si le traitement est efficace, il reste toujours les problèmes de résistance et toxicité, causés par les traitements plus longs, qui sont à l’origine du syndrome d'ATRA et des effets tératogènes. Dans les cellules NBA, nous avons constaté que la combinaison d’ATRA et MC1568 agit de manière synergique, induisant une mort indépendante de caspases. L'inhibiteur ZVAD (un pan-inhibiteur pour toutes les caspases) ne bloque pas la mort induite par le MC1568 seul ni par la combinaison des deux composés. La voie des caspases activée a été principalement celle de la caspase 8. En même temps, nous avons trouvé une importante libération du cytochrome C, démontrant la participation de la voie de mort intrinsèque dans la mort induite par ces deux composés. L'utilisation d'un inhibiteur spécifique, le NAC, réduit la mort induite par ATRA et MC1568, prouvant que la voie engagée est celle du NAC. Sachant qu'un inhibiteur de HDAC classe I comme le MS275 induit dans le même système une mort cellulaire caspase-dépendante, principalement via TRAIL, notre observation suggérerait que l'inhibition des HDAC classe 2 active une voie qui est principalement caspase-indépendante. Conclusions Dans mon travail de thèse j'ai évalué l'effet d'un inhibiteur sélectif des HDAC classe II dans plusieurs systèmes et j’ai défini ses effets sur la différenciation et l’apoptose. Cette analyse sera utile pour générer des nouveaux inhibiteurs sélectifs pour les HDACs pour le traitement contre le cancer avec un indice thérapeutique plus élevé que les pan-inhibiteurs des HDACs actuels
Human HDACs comprise a family of 18 different members which are grouped into four classes. Class I (HDAC 1-3,8), class II (HDAC4-7,9,10 of which HDAC4, 5, 7 and 9 form a class II a subgroup due to a common structural organization, while HDAC6 is member of class IIb), class III, also referred to as sirtuins (SIRT1-7) and class IV (HDAC11). Classes I, II and IV HDACs share common features, as all their members are zinc-dependent and exhibit some sequence similarities, while class III HDACs are NAD+-dependent enzymes without homology the other HDACs(1). Pan-inhibitors like SAHA, which is currently in phase III clinical trials and has recently been approved for treatment of cutaneous T cell lymphoma, inhibit both classes I and II enzymes, while MS275 is a subclass I selective inhibitor, which blocks the activities of HDAC 1, 2 and much less efficiently HDAC 3. Also class II selective inhibitors have been generated, marking the onset of a dissection of the various activities of HDACs. Notably, while induction of TRAIL appears to be associated with inhibition of class I enzymes in cancerous systems, other cellular functions involve the action of class II HDACs, like the regulation of the differentiation, mainly the cardiac differentiation. In differentiation systems: C2C12 cells, F9 cells, 3T3L1 cells. We tested a new compound HDAC inhibitor, specific for HDAC class 2 in one leukemic model, U937 cells, and various differentiation systems, such as the C2C12 cells for muscle differentiation, the F9 cells for endodermal differentiation and 3t3l1 cells for adypocyte differentiation. Interestingly we found that in C2C12 cells the HDAC class 2 inhibitor blocked the catalytic action of the HDAC class 2, but stabilized the interaction between the transcriptional factor MEF2D and HDAC4. MEF2D is the main transcriptional factor, responsible for the terminal muscle differentiation, and its transcriptional activity inhibition consequently blocked the muscle differentiation. In a similar way in both the other two systems we evaluated the differentiation inhibition and we found that transcriptional activity of RAR and PPARγ, respectively essential for the differentiation of the two systems, was blocked either in vitro in the first case either in vivo in the second case. In the case of the PPARγ induced differentiation, the experiments were assayed in the 3T3L1 cells. The treatment of these cells with Troglitazone induced adypocyte differentiation, while the presence of the MC1568 blocked it completely. Analyzing the Pparg’s expression level for RT-PCR, we found that its level was highly decreased after treatment with the MC1568. Interestingly the treatment of a mouse stably expressing a PPRE-luc, PPAR responsive elements luciferase reporter, blocked the transcriptional activity of PPARγ, showing in this case that the compound was regulating both the nuclear receptor’s transcriptional activity and the transactivation. In tumour model: MCF7 cells In cancer systems, such as MCF7 cells we found that the HDAC class 2 inhibitor MC1568 was inducing HDAC4 sumoylation, that, as previously showed (2) increases the HDAC4 catalytic action. The transfection of a specific HDAC4 sumoylation mutant in F9 cells decreased the repressory power on a note RAR target gene, Collagen IV. We were able to demonstrate that the treatment with MC1568 was regulating the activity of two transcriptional factor, RAR alpha and NF-KB, on three target genes, IRF1, TNF and TRAIL. The HDAC4 sumoylation mediated by RANBP2 repressed transiently the expression of these target genes, that were up-regulated after the complete degradation of HDAC4. Acute promyelocitic leukemia (APL), NB4 cells The NB4 cells is a cellular system of acute promyelocitic leukemia (APL). This disease is characterized by the presence of a fusion protein, PMLRAR alpha, with a strong repressory activity, mediated by the enhanced recruitment of corepressory complexes. The patients are treated with the differentiation therapy with retinoic acid (ATRA). Even if it is quite efficient to treat it, it still remains the problem of resistances, recidives and toxicity, done by the longer treatments, that give the, as said, ATRA syndrome and teratogenicity. In these cells we found that the combination among ATRA and MC1568 seems synergic, inducing a caspase independent cell death, even if in presence of caspases activation. The ZVAD inhibitor (pan-inhibitor for all caspases) failed to block the death induced by the MC1568 and by the combination among the two compounds. Analyzing the activation of the caspases it seemed that the pathway activated was mainly mediated by caspase 8. At the same time we found a strong release of cytochrome C, demonstrating the involvement of the mitochondria in the death induced by these two compounds. The use of a specific inhibitor, the NAC inhibitor, was able to reduce the death mediated by ATRA and MC1568, showing that the pathway was mainly regulated by the NAC dependent way. At this time, we are arrived to select the pathway regulated by this compound. Knowing that an HDAC inhibitor like MS275, specific inhibitor for class 1 HDACs, induce in the same system a caspase-dependent cell death, mainly regulated by TRAIL3, our observation would suggest that the class 2 HDAC inhibition is specifically regulating a pathway that is mainly caspase-independent. This observation could be usefull for treatment therapy, not only ammeliorating the treatment with retinoids, but overcoming possible resistances mediated by mutations and alteration in receptor expression in tumoral cells. Conclusions In my work I have evaluated the effect of a class 2 HDAC inhibitor in several systems, differentiative and cancerous, highlighting its effects in transcriptional regulation and cell death
Nell’uomo gli enzimi de acetilanti gli istoni appartengono ad una famiglia di 18 membri che sono raggruppati in 4 classi. La classe I (HDAC1-3,8), classe II (HDAC4-7,9,10 di cui HDAC4, 5,7,9 formano un subgruppo dovuta ad una comune organizzazione strutturale, mentre HDAC6 è un membro della classe 2), classe III, denominata come sirtuine (SIRT1-7) e classe IV (HDAC11). Le HDAC appartenenti alle classi I, II, IV sono comunemente dipendenti dallo zinco, mentre le HDAC appartenenti alla classe III sono enzimi dipendenti dal NAD +(1). SAHA, un pan inibitore delle HDAC, inibisce entrambi le classi I e II. Attualmente è in phase III clinical trials ed è stato recentemente approvato per il trattamento del linfoma cutaneo delle cellule T. MS275, invece, è un inibitore selettivo per la subclasse I, bloccando preferenzialmente HDAC1,2. Recentemente sono stati sintetizzati anche inibitori selettivi per la classe II, rendendo possibile lo studio delle varie funzioni delle differenti classi delle HDAC. Come è noto, mentre l’induzione di TRAIL sembra essere associata con l’inibizione di enzimi classe I in sistemi cancerosi, le HDAC di classe II sembrano essere coinvolte in altra funzioni cellulari, come la regolazione del differenziamento, principalmente quello cardiaco. Inibitori delle HDAC in sistemi differenziativi: le cellule C2C12, le cellule F9 e le cellule 3T3L1. Abbiamo testato un nuovo composto inibitore HDAC, specifico per la classe 2 in un modello leucemico, le cellule U937, e vari sistemi differenziativi, come le cellule C2C12 per il differenziamento cardiaco, le cellule F9 per il differenziamento endodermico e le cellule 3T3L1 per il differenziamento adipocitario. Abbiamo scoperto che nelle cellule C2C12 l’inibitore HDAC classe 2 stabilizzò l’interazione tra il fattore trascrizionale MEF2D ed HDAC4, pur bloccando l’azione catalitica delle HDAC classe II. MEF2D è il principale fattore trascrizionale resposabile del differenziamento cardiaco terminale e l’inibizione della sua attività trascrizionale conseguentemente bloccò il differenziamento muscolare. Negli altri due sistemi, similmente, noi abbiamo riscontrato l’inibizione del differenziamento ed abbiamo trovato che l’attività trascrizionale di RAR e PPARγ, essenziali per il differenziamento dei relativi sistemi differenziativi, fu bloccata sia in vitro nel primo caso che anche in vivo nel secondo. Nel caso del sistema differenziativo indotto da PPARγ, gli esperimenti furono fatti nelle 3T3L1. Il trattamento di queste cellule con Troglitazione indusse il differenziamento adipocitario, mentre la presenza dell’MC1568 lo bloccò completamente. Analizzando il livello di espressione di PPARγ per RT-PCR, abbiamo ritrovato che il suo livello era altamente decrementato dopo trattamento con MC1568. Abbiamo notato inoltre che il trattamento di un topo transgenico esprimente stabilmente il PPRE-luc, reporter luciferasi degli elementi responsivi a PPAR, bloccò completamente l’attività trascrizionale di PPARγ, mostrando in questo caso che il composto regolava sia l’attività trascrizionale del nuclear receptor sia il suo livello di espressione. In modelli cancerosi: le cellule MCF7 In sistemi cancerosi, così come le cellule MCF7 abbiamo riscontrato che lo specifico inibitore delle HDAC di classe II induceva la sumoilazione di HDAC4, che, come previamente mostrato (2) incrementa l’azione catalitica di HDAC4. La trasfezione di un mutante di HDAC4 specifico per il sito di sumoilazione nelle cellule F9 decrementò il potere repressorio su un noto target di RAR, CollagenIV. Abbiamo dimostrato che il trattamento con MC1568 regolò l’attività di due fattori trascrizionali, quali RAR alpha ed NF-KB, su tre geni target, IFR1, TNF e TRAIL. La sumoilazione di HDAC4 mediata da RANBP2 represse in modo transiente l’espressione di questi geni target, che furono up-regolati dopo la completa degradazione di HDAC4. Leucemia promielocitica acuta (APL), NB4 cells Le cellule NB4 è un sistema cellulare di leucemia promielocitica acuta (APL). Questa malattia è caratterizzata dalla presenza di una proteina di fusione, PMLRAR alpha, con un forte attività repressoria. I pazienti sono attualmente curati con la terapia differenziativa con acido retinoico (ATRA). Anche se è un trattamento molto efficiente, vi sono ancora casi di recidività, resistenze e tossicità al trattamento, dovuto principalmente ai trattamenti prolungati, dando luogo alla cosiddetta ATRA sindrome e teratogenicità. In queste cellule abbiamo scoperto il sinergismo tra ATRA e MC1568. La combinazione delle due droghe ha indotto una morte caspasi-indipendente, anche se in presenza di attivazione delle caspasi. L’inibitore ZVAD, infatti, fallì a bloccare la morte indotta dall’MC1568 e dalla combinazione tra i due composti. Analizzando l’attivazione delle caspasi, abbiamo riscontrato che il pathway maggiormente attivato è quello della caspasi 8. Allo stesso tempo abbiamo ritrovato un forte rilascio del citocromo C, dimostrando il coinvolgimento del mitocondrio nella morte indotta da questi due composti. L’uso di un inibitore specifico dei reattivi dell’ossigeno, N-acetyl-cisteina, ridusse significativamente la morte indotta, definendo il ruolo chiave dei ROS. Sapendo che un inibitore delle HDAC quale MS275, un inibitore specifico delle HDAC di classe 1, inducesse nello stesso sistema una morte caspasi dipendente, principalmente regolata da TRAIL3, la nostra osservazione suggerirebbe che l’inibizione specifica delle HDAC di classe II regola specificamente un pathway caspasi-indipendente, utile per migliorare il trattamento con retinoidi, ma soprattutto per curare quei pazienti con resistenze dovute a mutazioni o alterazione nella espressione del recettore in cellule tumorali. In Conclusione Nel mio lavoro ho studiato l’effetto di un inibitore specifico delle HDAC di classe II in svariati sistemi, differenziativi e cancerosi, concentrandomi sugli effetti nella regolazione trascrizionale e la morte cellulare

Les objectifs de ce travail de thèse ont été d'étudier les mécanismes de régulation de la stabilité et de la transactivation des récepteurs des oestrogènes (RE). Le premier volet concerne l'étude du rôle de l'oncoprotéine Mdm2 et du stress cellulaire. Il était connu que l'hormone régulait négativement l'expression du REα par le système ubiquitine/protéasome. Nous avons montré que Mdm2 participait à la régulation de la stabilité de la protéine REα. Mdm2 forme un complexe ternaire avec les protéines p53 et REα et les agents de stress cellulaire co-stabilisent la protéine p53 et le REα et abolissent ainsi la régulation négative de l'accumulation du REα par l'hormone. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que la protéolyse du REα n'est pas requise pour l'activité transcriptionnelle. Dans la deuxième partie, nous avons étudié le rôle de l'acétylation, au travers de l'action des inhibiteurs de HDAC (HDACi), sur la régulation de l'expression et de l'activité transcriptionnelle des RE. Les HDACi modulent l'activité des antioestrogènes partiels par un mécanisme dépendant de la répression de l'expression du REα engendrée par les HDACi. Contrairement à cet effet sur le REα, l'inhibition des HDAC induit l'expression du REβ. De plus, l'hormone et les HDACi agissent en synergie sur l'induction de l'activité transcriptionnelle des RE et ce, de façon plus marquée pour REβ par rapport à REα. Enfin, l'expression des RE potentialise l'activité antiproliférative des HDACi de manière plus efficace pour REβ. Nos résulats indiquent que cet effet résulte, au moins en partie, d'une régulation différentielle de l'expression de gènes du cycle cellulaire par les HDACi en présence du REα et du REβ.

L’alcoolodépendance est un problème majeur de Santé Publique. C’est une maladie chronique hautement récidivante en dépit des pharmaco- et psychothérapies existantes. Depuis plusieurs années, l’implication des mécanismes épigénétiques dans les comportements liés à l’éthanol se fait de plus en plus concrète. L’objectif de cette étude était principalement d’évaluer l’implication du mécanisme particulier d’acétylation/désacétylation des histones dans la sensibilisation comportementale à l’éthanol, un modèle de neuroadaptations apparaissant dès les premiers contacts avec l’éthanol et perdurant à très long-terme. Dans une première partie, nous avons étudié l’effet d’un inhibiteur d’histone désacétylase (HDAC), le butyrate de sodium (NaB), sur le développement et le maintien de la sensibilisation à l’éthanol 1,0 et 2,0 g/kg. Nous avons mis en évidence que le NaB prévient et inverse la sensibilisation à l’éthanol 1,0 mais pas 2,0 g/kg. Nous avons ensuite identifié, au niveau génique et protéique, certaines cibles, dont le BDNF, spécifiquement régulées lors du blocage de la sensibilisation. Dans une seconde partie, nous avons caractérisé la réponse épigénétique à l’éthanol chez des souris sensibilisées ou résistantes à la sensibilisation à 2,0 g/kg. Nous avons ainsi mis en évidence des différences de réponse à l’éthanol entre souris sensibilisées et résistantes au niveau 1/ de l’expression striatale de gènes liés aux mécanismes épigénétiques et 2/ de l’activité de plusieurs enzymes (HDAC, HAT, DNMT) dans le striatum et des taux d’acétylation de l’histone H4 dans le core du noyau accumbens. L’ensemble de ces résultats confirme l’implication des mécanismes épigénétiques, et en particulier la balance HDAC/HAT dans la sensibilisation comportementale à l’éthanol, et ce, à plusieurs niveaux. L’acétylation des histones serait un mécanisme indispensable dans le développement et le maintien de la sensibilisation à l’éthanol 1,0 g/kg ; et la réponse épigénétique à la réexposition à l’éthanol est fortement dépendante de la vulnérabilité individuelle à développer une sensibilisation à l’éthanol 2,0 g/kg.

L'ADN des cellules eucaryotes est enroulé autour de protéines appelées histones pour former la chromatine. Le niveau de compaction de la chromatine est dynamique. Ceci permet de réguler via l'accessibilité de l'ADN, les processus comme la transcription. Les histones peuvent subir des modifications post traductionnelles comme la méthylation, qui influencent le niveau de compaction de la chromatine. Par exemple, au niveau des promoteurs des gènes, la méthylation sur la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9) est associée à la répression transcriptionnelle, tandis que la méthylation sur la lysine 4 (H3K4) est associée a l'activation transcriptionnelle. Ces marques sont mises en place par des histones méthyltransférases et enlevées par des histones déméthylases qui sont spécifiques des résidus méthylés. Ma thèse a porté sur l'étude d'histone déméthylases dans la régulation transcriptionnelle de gènes clé de la prolifération cellulaire, les gènes cibles de E2F et l'ADN ribosomique. Les facteurs E2Fs régulent des gènes comme CCNE et CDC6 impliques dans l'entrée et la progression en phase S. Ces gènes sont activés au début de la phase S. Le contrôle de la transcription de ces gènes est crucial pour un cycle cellulaire normal et leur dérégulation est associée à l'apparition de cancers. La répression et l'activation des gènes cibles de E2F au cours du cycle cellulaire fait intervenir le contrôle de la méthylation des résidus H3K4 et H3K9. Cependant, les histone déméthylases impliquées sont mal connues. Nous avons montré que les histones déméthylases JARID1A et JARID1B, spécifiques de H3K4, régulent la transcription de CCNE et CDC6 en phase S. JARID1A et JARID1B sont recrutées au promoteur de ces gènes. Elles sont importantes pour limiter leur activation lors de la progression en phase S. Cette étude montre pour la première fois l'implication de ces histones déméthylases dans la régulation fine des gènes cibles de E2F au cours du cycle cellulaire. La transcription des gènes ribosomiques ou ADNr par l'ARN Polymérase I (Pol-I) est la première étape de la biogénèse des ribosomes. Elle a lieu dans les nucléoles. Ce processus est étroitement lié à la croissance et la prolifération cellulaire. Une transcription Pol-I accrue et des nucléoles hypertrophiés sont des caractéristiques communes à un grand nombre de cellules cancéreuses. La transcription Pol-I est adaptée à la disponibilité en facteurs de croissance. Ainsi, elle est réprimée lorsque les cellules sont privées en facteurs de croissance et activée en leur présence. Cette réponse est sous le contrôle de cascades de signalisation cellulaire comme la voie Phosphatidyl-Inositol-3-Phosphate (PI3K). Il est connu que des événements dynamiques de méthylation d'histones participent à cette régulation. Cependant, on sait peu de choses sur comment les voies de signalisation régulent ces événements. En collaboration avec l'équipe du Dr. Konstantin Panov, nous avons observé que l'histone déméthylase JMJD2A, spécifique de H3K9, est présente dans les nucléoles de cellules humaines. JMJD2A, via sa capacité à déméthyler H3K9, est requise pour activer la transcription Pol-I en réponse aux facteurs de croissance. Nous montrons également que PI3K régule cette réponse chromatinienne en déclenchant l'accumulation de JMJD2A dans les nucléoles en réponse aux facteurs de croissance. Cette étude indique que la régulation de la localisation subnucléraire de JMJD2A en réponse à la voie PI3K est un des mécanismes par lesquels les cellules adaptent leur capacité de synthèse protéique à la disponibilité de facteurs de croissance. Mes travaux de thèse renforcent notre compréhension des mécanismes impliquant des histones déméthylases dans la régulation de la prolifération cellulaire. Comprendre ces mécanismes est crucial et permettra de cibler ces enzymes dans le traitement des pathologies de la prolifération cellulaire comme le cancer
In eukaryote nuclei, DNA is wrapped around histone proteins. This structure is called the chromatin. The compaction level of chromatin is highly dynamic. This allows the regulation of gene transcription which requires free access to the DNA. Histone proteins undergo several post translational modifications including methylation that impact chromatin compaction. For example, at genes promoters, methylation on the lysine 9 of histone H3 (H3K9) is associated with chromatin compaction and thereby transcription repression, whereas methylation on histone H3 lysine 4 (H3K4) is associated with transcriptional activation. Histone methylation is set by enzymes called histone methyltransferases and removed by histone demethylases which are specific for methylated residues. During my PhD, I studied the role of histone demethylases in the transcriptional regulation of cell proliferation master genes, E2F-regulated genes and rDNA transcription. E2F transcription factors regulate genes like CCNE or CDC6 involved in entry and progression through S phase. Those genes must be activated at the onset of S phase. The transcriptional control of those genes is crucial for a normal cell cycle, and their deregulation is associated with cancer development. Histone methylation events are involved in the repression and activation of E2F target genes during cell cycle progression. However the histone demethylases involved are still unclear. We have shown that the H3K4-specific histone demethylases JARID1A and JARID1B are involved in the fine-tuning of CCNE and CDC6 transcription during S phase. JARID1A and JARID1B are recruited on the promoter of those genes and help limiting their activation at the beginning of S phase. This study shows for the first time the role of those histone demethylases in the fine tuned regulation of E2F targets genes during S phase. Ribosomal DNA (rDNA) transcription is the first step of ribosome biogenesis. rDNA is transcribed in the nucleolus by RNA polymerase I (Pol-I). Pol-I transcription is tightly linked to cell growth and proliferation. High levels of Pol-I transcription along with hypertrophied nucleoli is a hallmark of several cancers cells. Pol-I transcription must be regulated according to the availability of growth factors. It is repressed when the cells are deprived of growth factors and activated when growth factors are available. This regulation is under the control of cellular signaling pathways including the Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K) pathway. Histone methylation events are known to play a role in this regulation. However little is known about how the cell signaling pathways modulate the chromatin response in this process. In collaboration with the team of Dr. Konstantin Panov, we observed that the H3K9-specific histone demethylase JMJD2A is present in the nucleoli of human cells. We showed that JMJD2A, through its ability to demethylate H3K9, is required for the activation of Pol-I transcription in response to growth factors. We further show that PI3K regulate this chromatin response by triggering accumulation of JMJD2A in the nucleoli in response to growth factors. This study demonstrates a yet unknown role for JMJD2A in Pol-I transcription and suggests that the control of JMJD2A localization by the PI3K pathway is a crucial mechanism by which cells adapt protein synthesis to the availability of growth factors. My PhD work helps strengthening our understanding of the mechanisms that involve histone demethylases in the regulation of cell proliferation genes. Understanding those mechanisms is crucial as it might help targeting those enzymes for the treatment of cell proliferation-associated diseases like cancer

SIRT1, appartenant à la famille des sirtuines, est une déacétylase NAD-dépendante, jouant un rôle essentiel dans le contrôle de l'expression génique. En plus de modifier les histones, SIRT1 peut affecter l'activité de certains facteurs de transcription et leurs gènes cibles. Une question fondamentale est de comprendre le mécanisme moléculaire par lequel SIRT1 contrôle l'expression des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et le métabolisme énergétique. Pour identifier les partenaires protéiques de SIRT1, nous avons utilisé la méthode de purification TAP-TAG à partir d'une fraction nucléaire soluble et d'une fraction ancrée à la chromatine de cellules Mef exprimant stablement une copie ectopique de SIRT1 (e-SIRT1). Nous avons ainsi pu identifier un complexe SIRT1 associé à la fois au facteur de prolifération cellulaire Ki67, et à la sous-unité TFIIIC, nécessaire à l'assemblage du complexe de pré-initiation de l'ARN Polymérase III. En délétant sirt1, et en inhibant spécifiquement l'expression de Ki67, nous avons montré que la machinerie de transcription de l'ARN Polymérase III et la prolifération cellulaire étaient fortement affectées. L'ensemble de mes résultats démontre très clairement que SIRT1, Ki67, et TFIIIC sont au sein d'un même complexe protéique, SIRT1 et Ki67 agissant de manière coordonnée pour réguler le niveau d'expression des SINEs et des LINEs, transcrits issus de la machinerie de transcription de l'ARN Polymérase III.

Les histones désacétylases (HDACs) sont les principales cibles des médicaments épigénétiques anticancéreux actuellement approuvés par la FDA. Les HDACs jouent aussi un rôle important dans l'homéostasie des pathogènes eucaryotes. Par conséquent, une stratégie pour lutter contre les maladies négligées causées par ces pathogènes est de modifier les médicaments épigénétiques actuellement approuvés qui ciblent les HDACs. HDAC8 de Schistosoma mansoni (smHDAC8) est une cible médicamenteuse valable pour traiter la schistosomiase, deuxième maladie négligée mortelle après le paludisme. Les différences structurales entre les poches catalytiques des HDAC8 humaine et smHDAC8 ont permis la conception d'inhibiteurs sélectifs des schistosomes qui se lient dans une poche sélective unique à HDAC8. Ce travail de thèse montre comment cibler sélectivement des isoformes HDAC l'aide de structures à résolution atomique, et ouvre la porte à l'étude du mode d'action de HDAC8 au niveau fondamental
Histone deacetylases (HDACs) are the major targets of currently FDA-approved anti-cancer epigenetic drugs. HDACs also play an important role in the homeostasis of eukaryotic pathogens. Hence, a strategy to tackle neglected diseases caused by these pathogens is to modify currently approved epigenetic drugs targeting HDACs. HDAC8 from Schistosoma mansoni (smHDAC8) was shown to be a valid drug target to treat schistosomiasis, second deadliest tropical disease after malaria. Structural differences between human HDAC8 and smHDAC8 catalytic pocket enabled the design of schistosome-selective inhibitors that bind in a HDAC8 selective pocket, which is unique to HDAC8 among the highly conserved HDAC isozymes. This thesis work shows how to target selectively related isoforms with the help of atomic resolution structures, and opens the door to the investigation of the mode of action of HDAC8 at the fundamental level

L’apoptose neuronale peut s’enclencher de manière inappropriée lors de maladies neurodégénératives. Elle requiert un programme génétique dont l’activation résulte notamment de régulations épigénétiques comme l’acétylation des histones. L’objectif de cette thèse était d’évaluer le rôle des histone acétyltransférases (HATs)/histone déacétylases (HDACs) dans la survie et la mort neuronale. Les résultats, obtenus dans un modèle d’apoptose neuronale in vitro, et dans un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique (maladie neurodégénérative d’issue fatale affectant les motoneurones) convergent vers la perte d’une HAT particulière, CBP, et une diminution des niveaux d’acétylation, selon deux nouveaux mécanismes : clivage par la caspase-6 et répression transcriptionnelle. L’inhibition des HDACs par le valproate de sodium s’avère neuroprotectrice in vitro et in vivo, permet l’amélioration de l’état de santé des animaux et est encourageante dans le traitement des maladies neurodégénératives
Neuronal apoptosis (programmed cell death) occurs pathologically in neurodegenerative diseases. It requires a specific genetic program whose application results at least partly from epigenetic regulations such as histone acetylation. The aim of this thesis was to evaluate the role of histone acetyltransferases (HAT) and histone deacetylases (HDAC) in neuronal survival and death. Our results, obtained in a simplified cellular model of neuronal apoptosis and in a in vivo model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) (a fatal neurodegenerative disease that affects motor neurons) point to the loss of a specific HAT, CBP, and histone deacetylation, according to two new mechanisms: caspase-6-mediated proteolytic cleavage and gene repression. HDAC inhibition by sodium valproate maintains proper acetylation levels, displays neuroprotective functions both in vitro and in vivo, increases animals sate of health and is then very promising as a therapeutic strategy in neurodegenerative diseases

Les modifications post-traductionnelles des histones jouent un rôle très important au cours du cycle cellulaire et notamment au cours de la mitose. Nous avons montré que les activités histone désacétylases (HDAC) sont impliquées dans le fonctionnement du point de contrôle du fuseau mitotique. Nous avons décrit le rôle d'HDAC3 en mitose, dans la cohésion entre chromatides soeurs et la désacétylation de la lysine 4 de l'histone H3. La phosphorylation de la sérine 7 de CENP-A, un homologue de l'histone H3 uniquement présent au niveau du centromère, est également nécessaire au maintien de la cohésion entre chromatides soeurs. Ces résultats semblent mettre en évidence l'existance d'un "code histone" mitotique lié à la cohésion entre chromatides soeurs.

Les inhibiteurs des histones déacétylases sont largement évalués au cours d'essais cliniques dans le traitement de plusieurs types de cancers solides et hématologiques mais aussi dans d'autres pathologies cardiaques et neurodégénératives. En dépit de leur haut potentiel anti-tumoral, ils induisent une thrombopénie sévère qui bien que transitoire limite leur utilisation seul ou en combinaison avec d'autres inhibiteurs. Les résultats présentés dans ma première partie de thèse montrent que l'Abexinostat, un pan inhibiteur d'HDAC, affecte la génération et la maturation des MK ainsi que la formation des proplaquettes in vitro. Cet effet est principalement du à une augmentation de l'apoptose et des dommages de l'ADN par une voie p53-dépendante. Le défaut de formation des proplaquettes est quant à lui indépendant de p53 et est lié à une désorganisation du cytosquelette du MK. En effet, dans ma deuxième partie de thèse, nous avons montré pour la première fois que l'inhibition de la principale HDAC cytoplasmique, HDAC6, altère la génération des proplaquettes in vitro. Fait intéressant, nos résultats montrent que la cortactine, et non la tubuline, est le principal effecteur d'HDAC6 au cours de la génération des proplaquettes chez l'homme. Contre toute attente, l'axe HDAC6/Cortactine ne semble pas être conservé chez la souris. En effet, l'invalidation d'HDAC6 et la double délétion de la cortactine et de son homologue hématopoïétique HS1 chez la souris n'affecte pas le taux de plaquettes. Ainsi nos résultats montrent pour la première fois que HDAC6 est indispensable à la formation des proplaquettes chez l'homme mais pas chez la souris
Histone deacetylase inhibitors are extensively evaluated in clinical trials in the treatment of many solid and hematological cancers but also in other cardiac and neurodegenerative diseases. Despite their high anti-tumor activity, they induce a severe thrombocytopenia which although transient compromise their use alone or in combination with other drugs. In the present study, we show that Abexinostat, a pan HDAC inhibitor, alters the generation and maturation of MK and also proplatelets formation in vitro. This effect is mainly due to an increase in apoptosis and DNA damage by a p53-dependent pathway. The defect in proplatelets formation is independent of p53 and is rather due to a disorganization of the MK cytoskeleton. Indeed, in my second part of thesis, we showed for the first time that the inhibition of the main cytoplasmic HDAC, HDAC6, alters the generation of proplatelets in vitro. Interestingly, our results show that cortactin, but not tubulin, is the major effector of HDAC6 during proplatelets formation in humans. Surprisingly, the axis HDAC6 / cortactin does not seem to be conserved in mice. Indeed, HDAC6 depletion and the double deletion cortactin and its hematopoietic homologue, HS1, in mice do not affect platelets count. Thus our results show for the first time that HDAC6 is critical for human proplatelets formation in humans but is dispensible for mouse megakaryopoiesis

De plus en plus de données indiquent que le cancer n’est pas uniquement la conséquence d’altérations génétiques, mais résulte également en partie d’altérations épigénétiques. De façon intéressante, cette dérégulation épigénétique est réversible, faisant des enzymes responsables des cibles thérapeutiques potentielles. En effet, les enzymes de modification de la chromatine et en particulier les Histones Déacétylases (HDACs) et les ADN Méthyltransférases (DNMTs), ont récemment émergé comme de nouvelles cibles prometteuses appelées « drogues épigénétiques » pour le traitement des cancers. Le but de ce projet a été de caractériser l’activité de UVI5008, un dérivé de la psammaplin A qui a initialement été isolée de l’éponge marine Psammaplysilla. Ce composé a été synthétisé dans le laboratoire de l’un de nos collaborateurs, le professeur Angel R. De Lera (Université de Vigo, Espagne), et nous avons pu montrer que ce composé cible spécifiquement plusieurs enzymes épigénétiques et présente une activité anti-tumorale in vitro et in vivo. Nous avons évalué l’activité anti-tumorale potentielle de UVI5008 in vitro sur des lignées de cellules cancéreuses et ex vivo sur des blastes issus de patients leucémiques. Nos résultats indiquent que UVI5008 réduit la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase G1-M et l’apoptose dans des lignées cellulaires de leucémie myéloïde aiguë (AML) établies et dans des blastes issus de patients AML en culture ex vivo. Des essais enzymatiques in vitro ont permis de mettre en évidence que UVI5008 bloque l’activité de HDAC1, 4 et 6 et augmente l’acétylation globale et spécifique des histones. Outre son activité d’inhibition des HDACs, ce nouvel inhibiteur bloque également la méthylation des îlots CpG situés sur les promoteurs des gènes suppresseurs de tumeur p16/INK4 et RAR-Beta, un récepteur de l’acide rétinoïque. Enfin, nous avons observé que UVI5008 possède des capacités inhibitrices des sirtuines, le niveau d’acétylation de p53 sur le résidu lysine 382 étant augmenté suite à un traitement avec ce composé. Nous avons également pu mettre en évidence une activité antitumorale de UVI5008 in vivo dans des xénogreffes de cellules HCT116 (issues de cancer du colon humain) et de cellules MCF7 (provenant de cancer du sein humain) dans des souris nues, de même que dans un modèle murin de cancer mammaire, les souris MMTV-Myc. Dans ces différents modèles, une augmentation de l’acétylation des histones et de p53K382 a pu être observée in tumouri. De façon importante, l’activité de UVI5008 est spécifique des cellules cancéreuses et sans toxicité importante pour les cellules normales. De plus, son activité est indépendante de p53, ce qui représente un avantage, la majorité des cancers ayant une mutation ou une extinction de l’expression de p53. ErbB2 joue un rôle important dans de nombreuses pathologies humaines. Son niveau est augmenté par amplification génique ou surexpression dans environ 30 % des cancers mammaires humains, de même que dans d’autres pathologies humaines, et cette marque est associée à un mauvais pronostique pour les patients. Nous avons donc choisi de tester l’activité anti-tumorale de UVI5008 sur un autre modèle de tumorigenèse chez la souris par la surexpression de l’oncogène ErbB2 dans la glande mammaire, les souris MMTV-ErbB2, et nous avons pu montrer une efficacité similaire de UVI5008 sur ces tumeurs mammaires. À l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement qui cible simultanément l’ensemble de ces 3 familles d’enzymes que sont les HDACs, les DNMTs et les SIRTs. Nos résultats suggèrent fortement que ces enzymes peuvent être ciblées simultanément par un composé unique, ce qui pourrait représenter un avantage pour les nouvelles thérapies contre le cancer
It is becoming increasingly clear that cancer is a consequence not only of genetic but also of epigenetic alterations. Interestingly, this epigenetic deregulation is reversible making the corresponding enzymes promising drug targets. Chromatin modifying enzymes, in particular histone deacetylases (HDACs) and DNA methyltransferases (DNMTs), have recently emerged as new promising targets of the so-called “epigenetic drugs” for the treatment of cancer. The aim of this project is to characterize the activities of UVI 5008, a derivative of psammaplin A, a natural product that was originally isolated from the marine sponge Psammaplysilla sp. This compound was synthesized by one of our collaborators, Prof. Angel. R de Lera’s lab (Vigo University, Spain) and we were able to show that it targets several epigenetic effector enzymes and displays anti-tumour activity in vitro and in vivo. We have assessed the tumoricidal activity of UVI5008 both in vitro in a panel of cancer cell lines as well as ex vivo in leukemia patient’s blasts. Our results indicate that UVI5008 reduces cell proliferation by inducing G1-M arrest and apoptosis in established acute myeloid leukemia (AML) cells and AML patient’s blasts in ex vivo culture. In vitro enzymatic assays showed that UVI5008 blocks HDAC1, 4 and 6 as well as increases the global and site-specific histone acetylation. Apart from its HDAC inhibitory activity, the novel inhibitor blocks CpG island methylation of the promoters of p16/INK4 and retinoic acid receptors (RAR)-beta tumor suppressors. Moreover, we have observed that UVI5008 has sirtuin inhibitory capacity as it increases the acetylation levels of p53 on lysine 382 residue. We could also show that UVI5008 exerts its antitumor effect in vivo in HCT-116 (human colon cancer) and MCF-7 (human breast cancer) xenografted tumours in nude mice as well as in a mouse breast cancer model MMTV-myc, which was accompanied by increased histone and p53K382 acetylation in tumouri. Importantly, UVI5008 anti-tumoral activity is selective for cancer cells, without significant toxicity to normal cells and is p53-independent which is also promising, as in the majority of cancers p53 is either silenced or mutated. It is well documented that ErbB2 gene plays an important role in human malignancies. It is amplified and /or overexpressed in approximately 30% of human breast carcinomas and in many other types of human malignancies and individuals with ErbB2-overexpressing tumours have significantly poor clinical outcome. Taking into consideration this fact, we have assessed the anti tumour activity of UVI5008 in one more mouse breast cancer model MMTV-ErbB2, which revealed that UVI5008 is equally active in ErbB2 overexpressing breast tumours. To date there is not a single drug that simultaneously targets all these three families of enzymes namely HDACs, DNMTs and SIRTs. Taken together, our data strongly suggest that targeting these enzymes simultaneously by a single drug is a feasible and an attractive paradigm for new cancer therapies

Le cancer anaplasique de la thyroïde(ATC) est une des formes les plus agressives de cancer. Pour trouver une innovation thérapeutique pour le traitement de ATC, j’ai étudié les effets de deux inhibiteurs de HDAC (HDACi), MS-275 et SAHA. J’ai pu démontrer que SAHA et MS-275 induisent l’apoptose sélectivement dans les cellules thyroïdiennes complètement transformées; SAHA et MS-275 agissent en stabilisant la protéine TRAIL par la régulation/inhibition de sa dégradation par le protéasome; ce nouveau mécanisme est à la base de l’action synergique des HDACi et des inhibiteurs du protéasome. Une autre partie de mon projet de doctorat s’est focalisée sur des modèles de leucémie promyélocytaire aiguë (APL) dans lesquels des protéines de fusion sont générées par translocation chromosomique entraîne un recrutement aberrant des complexes protéiques HDACs sur des gènes cibles de l'acide rétinoïque ATRA. L’efficacité de ATRA dans les APL vient de son aptitude à relâcher le complexe répresseur HDAC et à recruter le complexe HAT sur les éléments de réponses de ATRA. Cependant, la réactivation épigénétique de la transcription génique peut également être induite par des HDACi. L’assemblage de l’acide rétinoïque avec des HDACis pourrait permettre une augmentation de l’activité anti-tumorale. Dans ce but, j’ai étudié le mécanisme d’action d’un nouveau composé appelé MC2392 dérivés de l’assemblage de la partie active de ATRA avec celle de MS-275. J’ai pu montrer que ce composé est un rétinoïde; ne montre aucune activité d'inhibition de HDAC in vitro mais inhibiez les HDACs du complexe répresseur comprenant la protéine de fusion PML/RAR; activât l’induction de FAS et d'autres mécanismes de la mort. Nos découvertes pourraient contribuer au développement d’une nouvelle approche de traitement des APL
Anaplastic thyroid carcinoma(ATC) is one of the most aggressive malignancies and to find an innovative therapy for the treatment of ATCs, I studied the effects of two potent HDAC inhibitors (HDACis),SAHA and MS-275. I showed that: SAHA and MS-275 induce apoptosis selectively in completely transformed thyroid cells; MS-275;SAHA and MS-275 act by stabilizing TRAIL protein by affecting its proteasome-mediated degradation; this novel mechanism is at the base of the synergistic action of HDACis used in combination with proteasome inhibitors. Another part of my PhD project has been centered on acute promyelocytic leukemia (APL) cell models where chromosomal translocation-generated AML fusion proteins induced an aberrant recruitment of protein complexes containing HDAC and DNA methyltransferase activities on the all-trans retinoic acid (ATRA) target genes, resulting in their transcriptional silencing. The efficacy of ATRA in APL is due to its ability to release the HDAC repressive complex and to recruit the multi-subunit HAT complex on RARE. The removal of the epigenetic block of gene transcription can also be mediated by HDACis. Other types of drugs seem to cooperate to inhibit cell growth. To this aim, I characterized the activity of a novel compound named MC2392 derived from the union of the active part of MS-275 and ATRA: it is a retinoid with similar but divergent characteristics in respect to ATRA; it shows no HDAC inhibition activity in vitro but inhibits the HDACs contained in the PML-RAR repressive complex; it induces a quick cell death, activating the extrinsic pathway of apoptosis through FAS induction and caspase 8-3 activation as well as “alternative mechanism(s)” of cell death. Therefore the MC2392, could represent a new drug for treatment of APL

Le parasite plathelminthe Schistosoma mansoni, responsable de la bilharziose intestinale, est l'une des trois espèces majeures de schistosome qui infectent 200 millions d'individus dans 75 pays des régions tropicales. Ce constat alarmant fait de la schistosomiase la deuxième endémie parasitaire mondiale après le paludisme. D'un point de vue fondamental, ce parasite représente un modèle très original pour l'étude du développement et de la différenciation car il présente 4 formes morphologiquement distinctes au cours de son cycle et deux sexes séparés au stade adulte. De plus, l'intérêt du schistosome pour l'étude de l'évolution des systèmes de signalisation et du contrôle de ces processus est renforcé par son éloignement phylogénétique (lophotrochozoaire) des modèles habituels (nématode, arthropode ou vertébré). Par ailleurs, l'émergence de souches résistantes au seul traitement actuellement utilisé (Praziquantel) doit conduire à la mise en place urgente de nouvelles stratégies de lutte avec la caractérisation de nouvelles cibles chimiothérapeutiques. Dans cette optique, l'étude des mécanismes de contrôle de l'activité transcriptionnelle, notamment des récepteurs nucléaires, constitue une approche rationnelle à la détermination et la caractérisation de nouveaux réseaux de régulation transcriptionnelle parasitaires. En effet, ces derniers sont à la base des processus évolutifs et constituent, de fait, un axe d'étude particulièrement prometteur à la fois dans un cadre fondamental et thérapeutique. Chez les métazoaires, la régulation de l'activité transcriptionnelle est assurée par des complexes multi-protéiques en mesure d'activer ou réprimer la transcription en fonction des conditions environnementales et/ou du contexte cellulaire. Au sein de cette architecture macro-moléculaire, les cofacteurs des facteurs de transcription ont un rôle prépondérant car, activateurs ou répresseurs, ces protéines autorisent le recrutement (ou son inhibition) de la machinerie transcriptionnelle. Cette régulation est, en partie, la conséquence de la mise en place de mécanismes de régulation épigénétiques permettant une modification de la structure chromatinienne. Chez le parasite S. Mansoni, l'ébauche de la caractérisation de ces mécanismes de régulation a été entreprise par le biais de deux approches stratégiques différentes mais complémentaires. Dans un premier temps, compte tenu des fonctionnalités originales du récepteur nucléaire SmFtz-F1 préalablement mises en évidence au laboratoire, nous avons entrepris l'étude des mécanismes de régulation de son activité transcriptionnelle en développant la technique de criblage de banque d'ADNc de S. Mansoni en levures en utilisant comme construction «appât» les domaines D, E et F de SmFtz-F1 fusionné au domaine de liaison à l'ADN hétérologue Gal4. Cette approche a permis de mettre en évidence un corépresseur de SmFtzF1 spécifique du genre Schistosoma nommé SmFIP-1 (SmFtz-F1 Interacting Protein-1). L'interaction entre les deux partenaires a été mise en évidence par la technique de double hybride en levures et en cellules mammifères et confirmée par GST-pull down. D'un point de vue fonctionnel, les expériences de cotransfection transitoire en système hétérologue (cellules mammifères) ont permis de montrer que SmFIP-1 réprime l'activité transcriptionnelle de SmFtz-F1 de manière dose-dépendante. Enfin, chez le parasite, l'ARNm de SmFIP-1 est fortement exprimé suggérant un rôle prépondérant de ce cofacteur dans les mécanismes de régulation transcriptionnelle. La seconde approche s'est basée sur le criblage in silico des banques EST et génomiques de S. Mansoni récemment rendues disponibles. Cette stratégie a permis de mettre en évidence l'existence de cofacteurs davantage conservés au cours de l'évolution. En effet, nous avons identifié la présence d'enzymes à activité HAT (histone acetyl transferase) et HDAC (histone deacetylase) chez le parasite. Ces deux familles d'enzymes participent activement aux mécanismes de régulation épigénétiques par le biais des modifications post-traductionnelles (acétylation/deacétylation) des histones qu'elles catalysent. Nous avons isolé puis montré une conservation de structure mais également de fonction pour SmCBP1. En effet, le domaine catalytique, exprimé sous forme de protéine recombinante, catalyse l'acétylation des histones in vitro. Par ailleurs, la mise en oeuvre de la technique de GST-pull down a permis de montrer une interaction entre SmCBP1 et SmFtz-F1. De plus, les expériences de cotransfection transitoire en système hétérologue indiquent que SmCBP1 active la transcription médiée par SmFtz-F1 de manière dose-dépendante. Enfin, de manière originale, nous avons prouvé l'existence d'un second représentant de cette famille chez le parasite (SmCBP2). De façon similaire, après avoir mesuré l'activité enzymatique HDAC globale chez le parasite, nous avons isolé les enzymes HDAC de classe 1 chez S. Mansoni (SmHDAC1, 3 et 8) et montré une conservation importante de leur structure. Plus généralement, l'utilisation d'inhibiteurs des enzymes HDACs (HDACi) sur le parasite en culture in vitro suggère un rôle capital de ces enzymes dans la survie parasitaire. Dans ce contexte, celle-ci semble être associée au profil d'acétylation des histones que le HDACi TSA (trichostatine A) est en mesure d'accroître, contrairement au HDACi VPA (acide valproïque). Ces résultats indiquent que certains gènes régulés par les enzymes HDAC, et probablement surexprimés en réponse au traitement par les HDACi, sont essentiels dans le maintien de l'homéostasie parasitaire. Ces deux approches complémentaires ont permis de mettre en évidence et de caractériser des protéines impliquées dans les mécanismes de régulation transcriptionnelle, à la fois spécifiques (SmFIP-1) et conservées (SmCBP1/2/SmHDAC de classe 1). Cette dualité suggère l'existence de réseaux de régulation originaux chez le parasite associant des protéines spécifiques à des protéines aux fonctions conservées. A cet effet, la caractérisation de ces nouveaux réseaux constitue un préalable nécessaire à la détermination des mécanismes d'adaptation, d'évolution et de développement parasitaires susceptibles de faire émerger de nouvelles stratégies chimiothérapeutiques.

L’épigénétique représente les modifications de l’expression génique, sans altérer la séquence nucléique de l'ADN. L'un des mécanismes de régulation est le remodelage de la chromatine qui s’effectue via les histones acétyltransférases et les histones désacétylases (HDAC) permettant ou non la transcription de gènes. Une expression anormale des HDAC est corrélée à de nombreuses maladies (dépendance à l'alcool, inflammation ainsi que les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, cancers…). Il est primordial de cibler la sélectivité d’une isoforme parmi les 11 connues des HDAC zinc dépendantes pour éviter les effets secondaires. Le but de la recherche était de concevoir et de synthétiser de nouveaux composés, de vérifier leur activité inhibitrice vis-à-vis des HDAC de classe I ou II et leur cytotoxicité sur quatre lignées cellulaires: HaCaT, V79-4, SH-SY5Y et PC12. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur les pharmacomodulations du ZBG, de l’espaceur et de la tête de molécules connues tels que le MS-275 (sélectif de la classe I des HDAC), les SAHA et TSA (espaceur en C5 ou C6) avec une forte activité inhibitrice vis-à-vis des HDAC, mais non sélectifs. Nous nous sommes concentrés sur les pharmacomodulations de l'HDACI connu modifiant le domaine de liaison au zinc ZBG (sulfonylhydrazide, catéchol), la nature de l’espaceur (alkyl, aryl) et le groupe de reconnaissance de surface (bis-aryl, adamantyl, indolopyridazinone). Une bibliothèque de 57 nouveaux composés a été créée en trois séries. Aucun d'entre eux n'a montré d'activité inhibitrice satisfaisante. Les composés sélectionnés n'ont pas montré d'activité cytotoxique sur les lignées de cellules neuronales. Sur la base de cette recherche, il est possible de créer de nouveaux composés dans la série indolopyridazinone afin de les tester
Epigenetics represents changes in gene expression without altering the nucleic sequence of DNA. One of the main mechanisms of regulation of gene expression is chromatin remodeling via histone acetyltransferases and histone deacetylases (HDAC), which may or may not allow gene transcription. An abnormal expression of HDACs is correlated with many diseases (alcohol dependence, inflammation as well as cardiovascular and neurodegenerative diseases, cancers...). It is essential to target the selectivity of one isoform among the 11 known zinc-dependent HDACs to avoid side effects. The aim of the research was to design and synthesize new compounds, verify their inhibitory activity against class I or II HDACs and their cytotoxicity on four cell lines: HaCaT, V79-4, SH-SY5Y and PC12. We focused on the pharmacomodulations of ZBG, the linker and the cap of known molecules such as MS-275 (selective for class I of HDACs), SAHA and TSA (spacer in C5 or C6) with a strong inhibitory activity towards HDACs, but not selective. We concentrated on the pharmacomodulations of known HDACI modifying the zinc binding domain (sulfonylhydrazide, catechol), the nature of the spacer (alkyl, aryl) and the surface recognition group (bis-aryl, adamantyl, indolopyridazinone). A library of 57 new compounds was designed in three series. None of them showed satisfactory inhibitory activity. The selected compounds did not show cytotoxic activity on neuronal cell lines. Based on this research, it is possible to create new compounds in the indolopyridazinone series in order to test them

Le gène suppresseur de tumeur LKB1 code une protéine sérine/thréonine kinase qui régule le métabolisme et la polarité cellulaires. LKB1 exerce une partie de ses fonctions biologiques en phosphorylant et en activant les 14 kinases appartenant à la famille des protéines kinases activées par l'AMP (AMPK). Le membre éponyme de cette famille, AMPK, agit comme un senseur nutritionnel essentiel dans la cellule. La recherche que j'ai conduite au cours de ma thèse a porté sur le mode de régulation de LKB1. L'holoenzyme LKB1, un hétérotrimère comprenant deux autres protéines appelées STRAD et MO25, est dotée d'une activité catalytique constitutive. Mon travail a permis de montrer que la lysine 48 de LKB1 est acétylée par l´acétyltransférase GCN5. Par des approches biochimiques et des techniques d'imagerie, j'ai montré que l'acétylation de LKB1 par GCN5 favorise sa localisation nucléaire, la fraction non-acétylée étant localisée à la fois dans le cytoplasme et le noyau. GCN5 promeut également l´export cytoplasmique de LKB1 de manière HAT-indépendente et régule son niveau d´expression. Afin de préciser la contribution de cette acétylation à la fonction in vivo de LKB1, j'ai utilisé le modèle expérimental de la crête neurale (CN) chez le poulet. En effet, j'ai été impliquée au cours de ma thèse dans une étude issue du laboratoire, qui a établi que l'activité de LKB1 est requise pour la délamination, la migration polarisée et la survie des cellules de la CN céphalique. Ces dernières contribuent à la formation de la majorité du squelette cranio-facial des vertébrés. Le signal LKB1 dans ces cellules est relayé par l'AMPK et la kinase ROCK et converge sur le moteur moléculaire dépendant de l'actine, la Myosine II. A l'aide du même modèle expérimental, j'ai montré que GCN5 est exprimé dans les cellules de la CN au cours de l'embryogenèse et que l'interaction fonctionnelle entre LKB1 et GCN5 est nécessaire à l'activité de LKB1 au cours de l'ontogénie des cellules de la CN céphalique et donc de la formation de la tête
The tumor suppressor gene LKB1 encodes a serine/threonine kinase which regulates the cellular metabolism and polarity. Its biological activity is partly exerted through the phosphorylation and activation of 14 kinases which belong to the AMP-activated protein kinases (AMPK). The eponym member of this family acts as an essential nutritional sensor in the cell. The research that I conducted during my PhD focused on the regulation of LKB1. The LKB1 holoenzyme is a constitutively active heterotrimer comprising two other proteins called STRAD and MO25. My PhD project shows that LKB1 is acetylated on the lysine 48 residue by the acetyltransferase GCN5. Using biochemical approaches and cell imaging, I have shown that the acetylation of LKB1 by GCN5 favors its nuclear localization, while the non-acetylated fraction is localized in both the nucleus and the cytoplasm. GCN5 also promotes the cytoplasmic export of LKB1 in an HAT-independent manner and regulates its expression levels. In order to investigate the contribution of this acetylation to the functions of LKB1 in vivo, I have used the experimental model of the neural crest (NC) in chick embryos. Indeed, during my PhD, I have contributed to a study, initiated by my host laboratory, in which we show that LKB1 is required for the delamination, polarized migration and survival of neural crest cells (NCCs) which contribute to the formation of most craniofacial structures in vertebrates. LKB1 signaling is mediated by AMPK and the ROCK kinase and converges towards the actin-dependent molecular motor, Myosin II. Using the same experimental model, I have shown that GCN5 is expressed in NCCs during embryogenesis and that the functional interaction between GCN5 and LKB1 is essential for the activity of LKB1 in the cephalic NCCs ontogenesis and head formation

Friedreich’s ataxia (FRDA) is an inherited recessive disorder characterized by progressive neurological disability and heart disease. It is caused by a pathological intronic hyperexpansion of a GAA repeat in the FXN gene, encoding the essential mitochondrial protein frataxin. At the homozygous state, the GAA expansion induces a heterochromatin state with decreased histone acetylation and increased methylation, resulting in a partial deficiency of frataxin expression. This was established in cells from FRDA patients. We showed that the same chromatin changes exist in a GAA based mouse model, KIKI, generated in our laboratory. Furthermore, treatment of KIKI mice with a novel Histone Deacetylase Inhibitor (HDACi), 106, a pimelic diphenylamide that increases frataxin levels in FRDA cell culture, restored frataxin levels in the nervous system and heart of KIKI mice and induced histone hyperacetylation near the GAA repeat. As shown by microarrays, most of the differentially expressed genes in KIKI were corrected towards wild type. In an effort to improve the pharmacological profile of compound 106, we synthesized more compounds based on its structure and specificity. We characterized two of these compounds in FRDA patients’ peripheral blood lymphocytes and in the KIKI mouse model. We observed a sustained frataxin upregulation in both systems, and, by following the time course of the events, we concluded that the effects of these compounds last longer than the time of direct exposure to HDACi. Our results support the pre-clinical development of a therapeutic approach based on pimelic diphenylamide HDACis for FRDA. Laboratory tools to follow disease progression and assess drug efficacy are needed in a slowly progressive neurodegenerative disease such as FRDA. We used microarrays to characterize the gene expression profile in peripheral lymphocytes from FRDA patients, carriers and controls. We identified gene expression changes in heterozygous, clinically unaffected GAA expansion carriers, suggesting that they present a biochemical phenotype, consistent with data from animal models of frataxin deficiency. We identified a subset of genes changing in patients as a result of pathological frataxin deficiency establishing robust gene expression changes in peripheral lymphocytes. These changes can be used as a biomarker to monitor disease progression and potentially assess drug efficacy. To this end, we used he same methodology to characterize the gene expression profiles in peripheral lymphocytes after treatment with pimelic diphenylamide HDACi. This treatment had relevant effects on gene expression on peripheral patients’ blood lymphocytes. It increased frataxin levels in a dose-dependent manner, and partially rescued the gene expression phenotype associated with frataxin deficiency in the tested cell model, thus providing the first application of a biomarker gene set in FRDA.
Doctorat en sciences biomédicales
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Les patients atteints de leucémie myéloïde chronique (LMC) breakpoint cluster region-Abelson (BCR-ABL)+ sont traités avec des inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK), comme l’imatinib, cependant certains développent des résistances et des effets secondaires sévères. Des traitements combinés à base d’inhibiteurs d’histone désacétylase (HDAC)6 (HDAC6i), pouvant potentiellement réduire l’expression de BCR-ABL, apparaît être une approche intéressante pour prévenir l’apparition de résistances aux ITK. De plus, l’implication d’HDAC6 dans les voies de dégradation des protéines rend son inhibition couplée à celle du protéasome susceptible de sensibiliser les cellules aux ITK. Notre hypothèse est que la combinaison ITK-HDAC6i pourrait être efficace pour le traitement de la LMC. Dans un premier temps, les effets anti-cancéreux d’un HDAC6i identifié dans notre laboratoire, le composé 7b, à celui de référence, la tubacine, en combinaison avec l’imatinib ont été comparés. La combinaison imatinib-7b a généré des effets anti- cancéreux plus importants que la combinaison imatinib-tubacine et a provoqué une mort synergique apoptotique dépendante des caspases dans les cellules K-562 et réduit la proportion de cellules souches leucémiques alors qu’elle n’a eu qu’un effet modéré sur des cellules saines. Enfin, la combinaison a diminué plus fortement la capacité de formation de colonies et la masse tumorale des cellules de LMC respectivement en milieu semi-solide et dans des poissons zèbres xénogreffés, par rapport aux composés seuls. D’un point de vue mécanistique, la combinaison induit l’ubiquitination et la dégradation de BCR-ABL, et la dérégulation de protéines de ses voies de signalisation impliquées dans la prolifération et la survie cellulaire. La protéine HDAC6 possédant deux sites catalytiques, nos résultats tendent à montrer que le composé 7b cible le deuxième. Dans un second temps, une étude a été initiée sur un nouvel HDAC6i de type hydroxamate, le MAKV-15, qui diminue l’expression de BCR-ABL, et qui en pré-traitement avec le bortezomib, sensibilise les cellules à l’imatinib, entrainant une augmentation de la mort apoptotique dépendante des caspases dans les cellules sensibles et résistantes à l’imatinib. Enfin, nos résultats suggèrent que l’inhibition d’HDAC6 potentialise l’effet de l’imatinib, pourrait prévenir l’apparition de résistances et que de telles combinaisons pourraient représenter une approche thérapeutique prometteuse pour les patients atteints de LMC
Breakpoint cluster region-Abelson (BCR-ABL)+ chronic myeloid leukemia (CML) patients receive tyrosine kinase inhibitors (TKIs) such as imatinib as the first-line treatment; however, some patients develop resistances and severe adverse effects. Combination treatments, especially with histone deacetylase (HDAC)6 inhibitors (HDAC6i), appear as an attractive option to prevent TKI resistances considering the capacity of HDAC6i to downregulate BCR-ABL. Moreover, HDAC6 is implicated in protein degradation pathways, so that its inhibition combined with that of the proteasome could sensitize cells to TKIs. Thus, we hypothesized that HDAC6i combined to TKIs could be effective for CML treatment. In the first part, we compared the anti-CML effects of a HDAC6i identified in our laboratory, compound 7b, to the reference HDAC6i tubacin, in combination with imatinib. Results showed that the imatinib-7b combination generated stronger anti- CML effects than imatinib-tubacin. Especially, the imatinib-7b combination elicited a potent synergistic caspase- dependent apoptotic cell death and drastically reduced the proportion of cancer stem cells in K562 CML cells, whereas it only moderately impacted various healthy cell models. Ultimately, the imatinib-7b combination decreased more potently the colony forming capacities and tumor mass formation of CML cells in a semisolid methylcellulose medium and in xenografted zebrafishes, respectively, compared to each compound alone. Mechanistically, the combination induced BCR-ABL ubiquitination and downregulation leading to a dysregulation of multiple key proteins of its downstream pathways involved in CML proliferation and survival. Results tend to demonstrate that 7b could target the second site. In the second part, we initiated a study of a novel hydroxamate-based HDAC6i, MAKV-15, and preliminary results demonstrated it triggered BCR-ABL downregulation. Accordingly, in pre-treatment with bortezomib it sensitizes CML cells to imatinib leading to enhanced caspase-dependent apoptotic death in imatinib-sensitive and imatinib-resistant CML cells. Considering that HDAC6 is reported to possess two functional catalytic sites, we finally attempted to determine which catalytic site is targeted by these HDAC6i. Taken together, our results suggest that HDAC6i potentiate the effect of imatinib and could overcome TKI resistance in CML cells and therefore such combination may represent a promising therapeutic approach for CML patients

La production des métabolites secondaires par les cultures de cellules indifférenciées est souvent limitée par la méconnaissance des voies métaboliques et de leur régulation. Dans le but d'étudier la relation entre l'accumulation de la S-adénosylméthionine (unique agent de méthylation dans les cellules) et la production des alcaloïdes nicotiniques du tabac, des protoplastes de tabac ont été transformés avec le gène sam-1 d'Arabidopsis thaliana. Des lignées transgéniques ont été obtenues et des plantes ont été régénérées à partir de certaines de ces lignées. L'analyse de l'activité SAM-s de ces lignées a permis de mettre en évidence qu'un certain nombre de transformant présente le phénomène de silence des gènes. L'analyse du contenu alcaloïdique dans ces cals de tabac a permis de mettre en évidence d'importants changements en fonction de la quantité de SAM présente dans les cellules. Les plantes transgéniques de tabac présentent jusqu'à deux fois plus de nicotine et de nornicotine que les témoins. Ces résultats confirment la notion de plasticité du métabolisme des plantes décrite par plusieurs auteurs. Le clonage d'ADNc correspondant à la S-adénosylhomocystéine hydrolase et à des homologues d'histones déacétylases d'Arabidopsis thaliana est aussi présenté.