Dissertationen zum Thema „Hépatocytes – Métabolisme – Aspect moléculaire“

Cette étude s'inscrit dans une thématique de phénotypage métabolique de souris génétiquement modifiées. A l'aide d'hépatocytes isolés, nous avons étudié les effets de l'hormone thyroi͏̈dienne T3, et le rôle de chacun de ses récepteurs,[alpha] et [beta], sur le métabolisme de la glutamine, principal précurseur hépatique de glucose et d'urée. L'effet de l'état nutritionnel, nourri ou à jeun, a d'abord été étudié chez des souris Swiss et 129SV normales. La RMN du carbone 13, couplée à des dosages enzymatiques et un modèle mathématique, montre que le jeûne ne modifie pas l'utilisation de glutamine. Mais il augmente la néoglucogenèse relative ou absolue et diminue l'oxydation de la glutamine (inhibition des flux citrate synthase, pyruvate et [alpha]-cétoglutarate déshydrogénases). Nous avons ensuite utilisé les souris [alpha]0/0 et [beta]-/- respectivement déficientes en récepteur [alpha) et [beta]. Quel que soit le génotype des souris (sauvages, [alpha] 0/0 et [beta]-/-), la T3 stimule les activités hépatiques de la citrate synthase, l'enzyme malique et la phosphoénolpyruvate carboxykinase. Par contre, les ARNm correspondants ne sont augmentés que chez les souris sauvages et [alpha]0/0. Ainsi, l'action transcriptionnelle établie ou supposée de la T3 sur ces gènes serait véhiculée par le récepteur [beta]. Chez les [beta]-/-, il existerait également une régulation de ces enzymes par la T3 à un niveau encore indéterminé. Les flux enzymatiques suggèrent que la suppression de la T3 chez la souris [beta]-/- s'accompagne d'une diminution de la consommation de glutamine, de la néoglucogenèse et de l'oxydation. La supplémentation en T3 ne restaure que le métabolisme oxydatif chez les [beta]-/-, donc via le récepteur [alpha]. En conclusion, la confrontation de trois niveaux différents de fonctionnement cellulaire (ARNm, protéine, flux enzymatique) apporte des éléments nouveaux sur le rôle respectif des récepteurs [alpha] et [beta] dans l'action métabolique hépatique de la T3.

Ma thèse de doctorat s’intitule « Une étude complète des effets antiplasmodiaux d’infusions d'Artemisia spp contre plusieurs stades de développement du parasite, y compris l'hypnozoïte». Le parasite dormant résidant dans le foie, appelé hypnozoïte, peut persister pendant des semaines, voire des mois, puis « s’éveiller » pour provoquer une infection récurrente au stade sanguin. Ce réservoir d'hypnozoïtes est l'un des obstacles critiques à l'éradication du paludisme, principalement en raison du manque de médicaments capables de l'éliminer. Le développement de nouveaux médicaments contre ces hypnozoïtes, est limité car les criblages phénotypiques sont entravés par le manque de plates-formes de culture in vitro. Dans des conditions de culture conventionnelles, les cultures d'hypnozoïtes sont souvent contaminées par des microbes qui affectent négativement la culture des hépatocytes. Ces contaminants sont introduits lors de l’inoculation des cultures par les sporozoïtes, récupérés par dissection manuelle et broyage des glandes salivaires de moustiques infectés. En abordant cette question, dans mon introduction générale (chapitre 1), je me suis d'abord concentré sur le développement d'un protocole facile à mettre en place à base d’un cocktail antimicrobien composé de méthylparaben, de pénicilline et de streptomycine. Ce cocktail, ajouté à la solution nutritive des moustiques à base de saccharose, permet de récupérer des sporozoïtes exempts de contaminants fongiques dans les glandes salivaires des moustiques infectés et est décrit en détails dans le chapitre 2. Après avoir développé une solide stratégie de culture, je suis passé au criblage de composés contre le stade hypnozoïte. Nous avons sélectionné deux Artemisiasp. La raison du choix de ces plantes a été décrite en détail dans ce manuscrit. J’ai testé l’effet d’infusions d'A. annuaet d'A. afra sur les stades pré-érythrocytaires de différentes espèces de Plasmodium. J'ai trouvé une forte activité antipaludique des infusions d'Artemisia, en particulier sur l’infectivité des sporozoïtes, le blocage de la formation d'hypnozoïtes, et une clairance des parasites hépatiques in vitro. De toute évidence, cet effet n’est pas dû à l’Artémisinine. Ces effets sont décrits en détail dans le chapitre 3. Nous pensons que cette profonde activité inhibitrice de l'infusion d'Artemisiasp est partiellement médiée par la perturbation de la biogenèse des apicoplastes et des mitochondries du parasite. Dans le chapitre 4, j'ai montré diverses images prises au confocal, montrant différents types d’altération observées sur ces organelles. Les données de PCR quantitatives de l'ADN des apicoplastes confirment ces observations. La résistance aux médicaments de P. falciparum est un problème croissant en Asie du Sud-Est et il est urgent de trouver de nouveaux médicaments pour faire face à ce problème. Dans le chapitre 5, j'ai décrit l'activité des infusions d'Artemisia contre des isolats de P. falciparum résistants aux dérivés d’artemisinine. Ma thèse a été effectuée en temps partagé entre l'Institut Pasteur du Cambodge, à Phnom Penh, où j'ai effectué des expériences sur les stades érythrocytaires de P. falciparum, et le stade hépatique de P. vivax, et le CIMI à Paris où j’ai travaillé sur les stades hépatiques des modèles rongeur et simiens, et du parasite humain P. falciparum
My PhD thesis entitled ‘A comprehensive study of the antiplasmodial effects of Artemisia spp. infusions against multiple parasite developmental stages including hypnozoite’. The dormant liver resident parasite is called hypnozoite which can linger for weeks to months, and then relapse to cause recurrent blood stage infection. This hypnozoite reservoir is one of the critical barriers towards malaria eradication, mainly due to the lack of mass medication with a drug that can clear the hypnozoites in the liver. There is a dire need for the development of new hypnozoite-killing drugs but phenotypic screens are hindered by a lack of in vitroculture platforms. Under conventional culture conditions, hypnozoite cultures are often contaminated. This effect partially arises from infection with unpurified sporozoites that adversely affect the hepatocytes culture. Addressing this issue, in chapter 1, firstly I focused on the development of a short protocol with an antimicrobial cocktail, methyl paraben and penicillin streptomycin in a supplementation with sucrose solution that ensure yeast free sporozoite production in the salivary glands. In chapter 2, I tried to describe the research objectives, methodology and findings of the experiments. After developing a robust culture strategy, I moved on drug screening against the hypnozoite stage. We selected two Artemisia sp. A. annuaandA. afra. Aqueousinfusions prepared from them and were tested against the hepatic stage of all Plasmodiumsp. The reasoning behind these plant selections have been described in detail in this manuscript. I found a strong antimalarial activity of Artemisia infusions that blocked the relpase causing hypnozoite formation and cleared the liver parasites. In chapter 3, I described the effect in more detail. We believe that this profound inhibitory activity of Artemisia infusion is partially mediated by the disruption of the biogenesis of apicoplast and mitochondria. In chapter 4, I showed various confocal images of apicoplast disruption and quantitative PCR data of apicoplast DNA confirm our observation. Drug resistance to P. falciparum is a growing problem in Southeast Asia. New drugs are required to solve the problem. In chapter 5, I described in vitro activity of Artemisia infusions against the drug resistant P. falciparum isolates. It can be noted that the in vitroantimalarial effect that I observed in the liver and blood stage of Plasmodium was not artemisinin dependent asA. afracontains negligible amount of artemisinin but showed potent inhibitory activity.This is the first indication that compounds other than 8 aminoquinolines and artemisinin could be effective against the relapsing malaria and overcome the antimlarail drug resistance

La toxicité hépatique des xénobiotiques constitue un sujet extrêmement riche, au vu des multiples mécanismes et acteurs impliqués. Ce travail de toxicologie translationnelle a pour but d’améliorer la compréhension des mécanismes hépatotoxiques de l’éthanol et des amanitines, puissantes toxines de champignons, afin d’apporter de nouveaux éléments permettant d’optimiser les prises en charge thérapeutiques des patients intoxiqués. Dans un premier temps, nous apportons des éléments supplémentaires de compréhension sur les mécanismes de réponse des macrophages à l’éthanol. Ces interactions xénobiotiques – cellules, montrées à travers l’exemple de l’induction des récepteurs P2X7, semblent participer à la sévérité des atteintes hépatiques alcooliques, et témoignent de la plasticité des macrophages en situation pathologique. Ces résultats suggèrent notamment l’intérêt du développement des antagonistes des récepteurs P2X7 dans le traitement des alcoolopathies. Dans un deuxième temps, nous appliquons l’outil de réseau moléculaire, permettant la visualisation de données complexes acquises par LC-MS/MS, à l’étude du métabolisme de xénobiotiques. L’exemple du métabolisme de l’acébutolol dans le cadre d’une intoxication médicamenteuse volontaire d’une part, et l’étude du métabolisme de la quétiapine de manière in vitro d’autre part, ont apporté des preuves consistantes sur l’intérêt du réseau moléculaire dans ce contexte. Dans un troisième et dernier temps, l’application du réseau moléculaire nous a permis d’écarter l’hypothèse d’un métabolisme des amanitines in vivo et in vitro. Par ailleurs, nos résultats montrent que le modèle cellulaire de cellules hépatiques HepaRG différenciés constitue un modèle pertinent dans l’étude des amanitines, et objectivent l’implication de la production des ROS mitochondriaux dans la toxicité de ces substances
Xenobiotic-induced hepatotoxicity is an extremely rich subject, given the multiple mechanisms and actors involved. This translational work aims to improve ethanol and amanitins (powerful fungal toxins) hepatotoxic mechanisms understanding, in order to provide new elements to optimize the therapeutic management of intoxicated patients. In a first step, we provide additional elements of understanding on macrophages response mechanisms to ethanol. These xenobiotic-cell interactions, shown through the P2X7 receptor induction example, seem to contribute in alcoholic liver damage severity, and testify to the macrophages plasticity in pathological situations. These results suggest in particular the interest of P2X7 receptor antagonist’s development in the treatment of alcoholism. In a second step, we are applied molecular networking, which allows the visualization of complex data acquired by LC-MS/MS, to xenobiotic metabolism study. The acebutolol metabolism example, in the context of voluntary drug intoxication on the one hand, and the in vitro quetiapine metabolism study on the other hand, have provided consistent evidence concerning molecular network interest in this context. In a third and final step, the molecular network application allowed us to rule out the hypothesis of an in vivo and in vitro amanitins metabolism. Moreover, our results show that the hepatocyte-like cellular model of differentiated HepaRG is a relevant model in amanitins study, and show the mitochondrial ROS production implication in these substances toxicity

Le transporteur sodium-dependant du d-glucose est responsable de la premiere etape de la reabsorption tubulaire de ce solute au niveau renal. De nombreuses etudes ont mis en evidence une heterogeneite concernant les proprietes cinetiques de ce transporteur tout le long du tubule proximal. Les differences existant entre le poids moleculaire estime par des methodes biophysiques comme l'inactivation par irradiation (230-345 kda) et les techniques biochimiques ou de biologie moleculaire (70-75 kda) indiquent que le transporteur a une structure oligomerique. La premiere partie de notre travail a consiste a preparer des anticorps polyclonaux chez le lapin, diriges contre une proteine de 70 kda prealablement identifiee comme une entite du transporteur responsable de la fixation de la phlorizine. Ces anticorps ont servi d'outils pour rechercher la (ou les) proteine(s) membranaire(s) impliquee(s) dans ce mecanisme de transport. La mise en evidence de plusieurs entites immunodetectables a permis de montrer l'existence de structures oligomeriques du transporteur, notamment d'un dimere particulierement resistant aux traitements classiques de dissociation par des agents reducteurs. Cette proteine d'un poids moleculaire apparent de 120 kda est presente egalement dans les membranes renales de rat, d'homme et des cellules llc-pk1. Nous avons pu montrer qu'il s'agissait d'un heterodimere constitue de la sous-unite 70 kda et d'une sous-unite 60 kda egalement reconnue par les anticorps. La dissociation de cet heterodimere semble en relation avec la perte de sites de fixation de haute affinite pour la phlorizine et la disparition du transport de basse affinite pour le d-glucose. Nous avons etudie les chaines sucrees portees par la proteine 70 kda par deglycosylation enzymatique et western blot avec des lectines. La proteine 70 kda est une n-glycoproteine apparemment depourvue de chaines sucrees o-liees. La n-glycosylation intervient pour 15 kda dans le poids moleculaire apparent de la proteine. Il s'agit de chaines complexes tri ou tetraantennaires contenant des residus d'acide sialique et de n-acetylglucosamine

Dans le cadre du développement de molécules ciblant le métabolisme phospholipidique de Plasmodium, nous présentons dans cette thèse la validation de méthodes analytiques ainsi que les études réalisés in vivo et in vitro sur quatre composés de cette nouvelle série chimique. Dans la première partie de notre thèse, les mécanismes physiopathologiques du neuropaludisme ainsi que les différentes axes de recherche sont développés. Dans une seconde partie, nous présenterons la série chimique sur laquelle nous avons travaillé. La troisième partie expose les résultats des méthodes analytiques validées selon les citères recommandés par la FDA pour la quantification des composés étudiés dans différentes matrices de différentes espèces animales. Le problème de l'effet matrice en spectrométrie de masse est également développé. Les résultats des études de distribution erythrocytes/plasma et de bioconversion prodrogue/drogue dans des matrices d'éspèces différentes sont présentés dans la quatrième partie. Enfin, dans une dernière partie nous rapporterons les études pharmacocinétiques et pharmacocinétiques / pharmacodynamiques réalisés chez le rat, la souris et le porc.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013.
L’obésité et le diabète de type 2 (T2D) sont étroitement associés à la résistance à l’insuline, une maladie métabolique qui se développe suite à un défaut causé par une réduction de la signalisation de l’insuline et de sa clairance. Afin de comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline plusieurs molécules qui régulent les voies de signalisation ainsi que la clairance sous contrôle du récepteur à l’insuline ont été étudiées, incluant la protéine tyrosine phosphatase (PTP) SHP1 et la molécule carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1 or CC1) qui est régulée en aval sous le contrôle de SHP1. Les nombreuses isoformes de CC1 contribuent à différentes fonctions cellulaires. Dans le foie, l’isoforme CC1-L, qui est phosphorylée sur tyrosine (Tyr), joue un rôle métabolique essentiel dans la régulation de la clairance de l’insuline et dans la suppression de l’activité de la synthase des acides gras (FAS). Nous avons démontré que des souris invalidées pour CC1 (Cc1-/-) sous un régime standard faible en gras (SD) développent néanmoins une importante stéatose hépatique qui est démontré par une augmentation de triglycérides, de cholestérol total ainsi que de cholestérol estérifié dans le foie. Sous un régime contenant 55% de gras (HFD) ces mêmes souris démontrent une prédisposition au développement de la stéatose et dysfonction hépatique induite par le régime, indiqués par une accumulation de lipides hépatiques et une augmentation d’enzymes marqueurs de dommage hépatique dans la circulation. La stéatose hépatique dans la souris Cc1-/- est liée à une augmentation significative d’importantes enzymes lipogéniques et de la synthèse du cholestérol qui sont régulés suite à une augmentation de l’activité nucléaire des facteurs de transcription Srebp1c et Srebp2. Comparées aux souris contrôle sauvages (WT) les souris CC1-/- ont démontré une réduction de la clairance de l’insuline, une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline hépatique et une augmentation d’expression des activateurs transcriptionels hépatiques PGC-1 et FoxO1. L’absence de CC1 a aussi exacerbé l’intolérance au glucose et la résistance à l’insuline hépatique induite par le régime à haute teneur de gras mais la clairance de l’insuline n’était pas diminuée dans les souris Cc1 -/-. Nos donnés indiquent que CC1 est un important régulateur de la lipogénèse hépatique et que les souris CC1-/- sont prédisposées à développer une stéatose hépatique qui mène à une résistance à l’insuline hépatique et des dommages dans le foie qui sont surtout évidentes sous un régime riche en lipides. Une importante Tyr phosphatase de CC1 est SHP1. Précédemment nous avons démontré que SHP1 est un important régulateur de l’homéostasie du glucose et de la clairance de l’insuline par le foie, cependant son rôle dans l’obésité liée au diabète reste méconnu. Nous rapportons ici que l’expression de SHP1 est significativement augmentée dans les tissus métaboliques de souris obèses sous régime HFD. Nous avons généré des souris invalidées pour SHP1 spécifiquement dans les hépatocytes (Ptpn6H-KO) pour investiguer le rôle de SHP1 dans le développement de la résistance à l’insuline et de la stéatose hépatique. Sous régime HFD les souris Ptpn6H-KO deviennent aussi obèses que les souris non invalidées pour SHP1 (Ptpn6f/f). Malgré ceci les souris Ptpn6H-KO démontrent une amélioration de la glycémie à jeun et une protection contre la résistance à l’insuline induite par l’obésité qui est confirmée par la suppression de la synthèse de glucose hépatique ainsi qu’une amélioration de l’activation du récepteur pour l’insuline avec une augmentation concomitante des voies de signalisation Akt. Il est aussi possible que la clairance de l’insuline accrue qu’on observe dans les souris Ptpn6H-KO soit due à une augmentation de la phosphorylation sur tyrosine de CC1. Les souris obèses Ptpn6H-KO montrent une augmentation de stéatose hépatique qui est le résultat de 1) une augmentation de lipogénèse hépatique associée à une augmentation importante de l’activité et de l’expression de SREBP-1 et des enzymes lipogéniques en aval FAS et ACC, 2) une augmentation de la captation postprandiale des acides gras qui est possiblement liée à une augmentation de l’expression du gène et de l’activité nucléaire de PPARγ, 3) une diminution de la sécrétion des triglycérides et de l’apolipoprotéine B sous le forme de lipoprotéines de très basse densité (VLDL). Étonnamment, malgré le niveau élevé de stéatose hépatique, le profil inflammatoire dans le foie des souris Ptpn6H-KO était similaire ou même amélioré comparé aux souris contrôles Ptpn6f/f et ceci était accompagné d’une diminution de dommage hépatocellulaire. Ces résultats démontrent que SHP1 est un nouveau médiateur de la résistance à l’insuline dans les hépatocytes et contribue à la détérioration du métabolisme du glucose induite par l’obésité. Chez la souris Ptpn6H-KO la stéatose hépatique induite par le régime suggère par ailleurs un autre rôle de SHP1 dans la régulation du métabolisme hépatique des lipides. Malgré le fait que CC1 et SHP1 se retrouvent dans le même complexe que Cdk2 et le récepteur de l’insuline, ils jouent des rôles opposés, CC1 étant un régulateur positif et SHP1 un régulateur négatif de la clairance de l’insuline. Ceci est en accord avec la régulation hépatique par le glucose des voies de signalisation de l’insuline pour ces deux molécules car les souris Cc1-/- démontrent une détérioration du métabolisme du glucose et de la signalisation de l’insuline alors que les souris Ptpn6H-KO démontrent une amélioration. Notre observation de stéatose hépatique chez ces deux modèles animaux suggère que CC1 et SHP1 limitent la synthèse et l’entreposage des lipides hépatiques de façon dépendante ou indépendante de la signalisation de l’insuline. Les résultats de ces études utilisant des modèles invalidés pour CC1 ou SHP1 révèlent des mécanismes du contrôle de la synthèse de glucose hépatique et du métabolisme des lipides qui sont très complexes et distincts. En plus ces résultats nous apportent une compréhension importante de la régulation hépatique de l’action et de la clairance de l’insuline.
Obesity and type 2 diabetes mellitus (T2D) are tightly associated with a common link, insulin resistance, a metabolic disorder developed from defective insulin action involving impaired insulin signaling and clearance. To investigate the pathogenesis of insulin resistance, many molecules modulating its signaling pathways as well as insulin receptor-mediated insulin clearance have been studied, including the protein tyrosine phosphatase (PTP) SHP1 and its regulated downstream molecule carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1 or CC1). CC1 in multiple isoforms contributes differentially to various cellular functions, the tyrosine (Tyr)-phosphorylated isoform of CC1 (CC1-L) is known to play an essential metabolic role in the hepatic regulation of insulin clearance and insulin-mediated acute inhibition of fatty acid synthase (FAS) activity. We have found that CC1-deficient (Cc1-/-) mice on standard diet (SD) already develop spontaneous hepatic steatosis with significantly elevated accretion of triglyceride (TG), total and esterified cholesterol. When challenged with a 55% kcal high-fat diet (HFD), these mice show greater susceptibility to the development of diet-induced hepatic steatosis and dysfunction, indicated by higher hepatic lipid content and serum levels of hepatic enzymes as markers of liver damage. Hepatic steatosis in the Cc1-/- mice is linked to a significant increase of key lipogenic (FAS, ACC) and cholesterol synthetic (HMGCR) enzymes, which is a result of increased nuclear activity of their positive gene transcription factors Srebp1c and Srebp2. Compared to their wild-type (WT) littermate controls, Cc1-/- mice exhibited impaired insulin clearance, glucose intolerance, liver insulin resistance, and elevated hepatic key gluconeogenic transcriptional activators Pgc1 and FoxO1. Lack of CC1 also exacerbated the HFD-induced glucose intolerance and hepatic insulin resistance, while insulin clearance was not further deteriorated. These data demonstrate that CC1 is a key regulator of hepatic lipogenesis and that Cc1-/- mice are predisposed to liver steatosis, leading to hepatic insulin resistance and liver damage, particularly when chronically exposed to dietary fat. An important Tyr phosphatase of CC1, SHP1, has been found previously by our lab to regulate glucose homeostasis and liver insulin clearance, but its potential implication in obesity-linked insulin resistance and hepatic steatosis has not yet been examined. We hereby report that SHP1 expression is significantly upregulated in metabolic tissues of HFD-fed obese mice. We have also further investigated the role of hepatocyte SHP1 in promoting insulin resistance and hepatic steatosis by generating hepatocyte-specific SHP1 knockout mice (Ptpn6H-KO). Upon HFD feeding, Ptpn6H-KO mice develop obesity as their Ptpn6f/f littermates. With consistently improved fasting glycemia, these mice are protected from obesity-induced liver insulin resistance as revealed by normalized insulin suppression of hepatic glucose production and hepatic insulin signaling with improved activation of insulin receptor and downstream signaling through Akt. More rapid insulin clearance in Ptpn6H-KO mice due to heightened CC1 tyrosine phosphorylation is also a possible contribution to the improved insulin action. Unexpectedly, obese Ptpn6H-KO mice exhibit enhanced hepatic steatosis. In detailed mechanisms, this is a result of 1) augmented hepatic lipogenesis, marked by upregulated activity and expression of SREBP-1 as well as the downstream regulated lipogenic enzymes such as FAS and ACC, 2) increased postprandial fatty acid uptake, possibly linked to the upregulation of PPAR gene expression and nuclear activity, and 3) decreased postprandial TG output in apolipoprotein B (ApoB)-associated lipoprotein particles, i.e. very low density lipoprotein (VLDL). More interestingly, the steatotic livers of these Ptpn6H-KO mice display comparable or even reduced level of inflammation accompanied by significantly less hepatocellular damage than that in their Ptpn6f/f counterparts. These results present hepatocyte SHP1 as a novel mediator of insulin resistance compromising hepatic glucose metabolism in diet-induced obesity. The enhanced diet-induced hepatic steatosis in Ptpn6H-KO mice provides a new role for SHP1 in liver lipid metabolism and further supports the bifurcation of insulin signaling in the regulation of hepatic glucose and lipid homeostasis or also confirms a possible disconnection between hepatic regulation of glucose and lipid metabolism. Although both CC1 and SHP1 are found in the same complex with Cdk2 and insulin receptor to regulate insulin clearance, they play opposing roles as CC1 is the positive regulator and SHP1 being the negative one. This is in accordance with the hepatic glucoregulation of insulin signaling for both molecules, since Cc1-/- mice show impaired glucose metabolism and insulin signaling whereas Ptpn6H-KO mice exhibit improvement. Interestingly, our observation of hepatic steatosis in both animal models, though with different characteristics, suggests that both CC1 and SHP1 limit hepatic lipid synthesis and storage, dependent or independent of insulin signaling. Findings from these studies using animal models lacking CC1 and SHP1 reveal complex and differential regulatory mechanisms of hepatic glucose and lipid metabolism, and they also provide important understanding of the hepatic regulation of insulin action and clearance.

La cellule a élaboré des mécanismes de surveillance afin d’assurer la fidélité de l’expression génique. Le nonsense-mediated mRNA decay (NMD) reconnaît et en général, dégrade rapidement les ARNm nonsens, qui contiennent des codons stop prématurés. Le NMD a longtemps été considéré comme un mécanisme de protection, permettant d’éviter la synthèse de protéines tronquées, potentiellement néfastes pour la cellule. Plus récemment, un nouveau rôle du NMD a émergé : il semble réguler l’expression génique, notamment lorsqu’il est couplé à l’épissage alternatif. D’autre part, bien que les mécanismes de reconnaissance et de dégradation des ARNm nonsens soient de mieux en mieux compris, une controverse subsiste quand à la localisation subcellulaire du NMD chez les mammifères. Ces deux aspects du NMD ont été abordés au cours de ma thèse dans le cas de l’étude du métabolisme des ARNm aberrants du gène de la fah, responsable de la tyrosinémie héréditaire de type I. Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de la maladie, j’ai caractérisé les ARNm de la FAH contenant des mutations d’épissage (Q279R et V259L) ou nonsens (W262X) dans l’exon 9. Deux transcrits alternatifs du gène de la fah ont ainsi été mis en évidence pour ces trois mutations : del100 a éliminé l’exon 8 et del231 les exons 8 et 9. Del231 est fortement produit lorsque les mutations d’épissage Q279R et V259L sont présentes. L’étude des transcrits chez les patients avec ces deux mutations a permis de proposer un modèle d’épissage pour les exons 8 et 9. Une analyse plus poussée sur del100 et del231 a révélé que ceux-ci étaient en fait produits de façon minoritaire dans des cellules avec un gène normal de la fah, par épissage alternatif des exons 8 et 9. Del100, qui contient de nombreux PTCs suite à l’élimination de l’exon 8, est dégradé par NMD. Cependant, la quantité de transcrit restante semble suffisante pour la synthèse d’une protéine de 31-kDa, détectable dans plusieurs tissus humains. Ce premier transcrit alternatif de la fah est important à deux points de vue : premièrement, il semble illustrer le rôle possible du NMD couplé à l’épissage alternatif dans la régulation génique et deuxièmement, la protéine synthétisée pourrait être importante pour la tyrosinémie héréditaire de type I.

Ce travail avait pour objectif i) d'analyser les caractéristiques physiologiques et musculaires(déterminées d'après des biopsies) de rameurs poids légers entraînés, ii) de proposer une méthode de153calcul pour estimer de façon non-invasive la quantité de lactate accumulé dans l'organisme (QTLS) au cours d'un exercice épuisant sur ergomètre aviron d'après la modélisation de la cinétique lactique pendant la récupération et iii) d'explorer l'influence des caractéristiques musculaires, et de l'aptitude à échanger et à éliminer le lactate sur la capacité anaérobie des rameurs appréciée par la mesure du déficit maximal d'O2 cumulé (DMOC).Premièrement, les rameurs étudiés possédaient un rapport masse musculaire - masse corporelle élevé et leurs paramètres physiologiques et musculaires étaient caractéristiques des athlètes spécialisées en endurance.Dans un deuxième temps, nous avons démontré que QTLS était corrélé positivement à DMOC.Cette relation supporte notre hypothèse et confirme la cohérence de la méthode proposée pour calculer QTLS.Dans une dernière étude, les résultats ont démontré que DMOC était corrélée positivement à l'aptitude à éliminer le lactate. Cette dernière était également significativement corrélée à la densité capillaire et au contenu musculaire en MCT4, une protéine impliquée dans le cotransport lactate-proton à travers le sarcolemme.

La toxicité des substances chimiques est difficile à appréhender chez l'homme, en raison de l'absence de modèle in vitro pertinent, notamment pour l'étude des effets induits par des expositions chroniques à de faibles doses et à des mélanges. Le but de ce travail a été de déterminer si les cellules HepaRG, capables de métaboliser des composés chimiques à des niveaux proches de ceux observés dans des hépatocytes humains en culture primaire, pouvaient répondre à un tel besoin. Nous avons tout d'abord montré que ces cellules restent fonctionnellement stables pendant un mois après l'acquisition de leur état de différenciation et qu'elles permettent la détection de dommages à l'ADN induits par des composés promutagènes, grâce aux tests des comètes et du micronoyau. Nous avons étudié les mécanismes impliqués dans la toxicité de l'aflatoxine B1 et d'amines aromatiques hétérocycliques en mélange; et identifié un gène marqueur d'exposition aux génotoxiques, FHIT
The lack of relevant in vitro models makes it challenging prediction of toxicity of chemicals in humans, particularly effects induced by reiterated exposure to low concentrations and mixtures. The present work aimed at determining whether human hepatoma HepaRG cells, which are able to metabolize chemicals to levels close to those found in primary human hepatocytes, could bring answers to these challenges. We first showed that these cells maintained their functional capacity for at least one month after differentiation and were suitable for the detection of DNA damage induced by promutagens using the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays. Then, we have studied mechanisms involved in AFB1 toxicity and identified FHIT tumor suppressor gene as a potent early biomarker for discriminating between genotoxic and nongenotoxic compounds

Ce travail explore pour la première fois la possibilité d'exploiter les propriétés anti-radicalaires de l'hydrogène gazeux, dans les domaines de la radioprotection et de la lutte contre le cancer. L'hydrogène réagit avec le radical hydroxyle, lequel est responsable d'une grande partie des dommages dues aux radiations ionisantes ; il participe également à l'initiation tumorale par différents mécanismes, dont l'altération de l'ADN. Nous avons montré que, à la concentration de 0. 7 MPa, l'hydrogène réduit d'environ 40% l'altération des bases d'une solution d'ADN soumise à une irradiation gamma. La proportion de dérivés oxydés/réduits n'est pas modifiée, ce qui montre que l'hydrogène agit bien sur le radical hydroxyle lui-même. Dans les mêmes conditions, un gaz inerte comme l'hélium est sans effet. Par ailleurs, l'hydrogène induit l'apoptose de lignées cancéreuses qui sont en multiplication active. Ces observations sont à rapprocher d'expériences montrant un effet protecteur de l'hydrogène vis à vis d'une inflammation hépatique chronique. Comparé à toutes les drogues connues, l'hydrogène présente l'avantage d'être totalement inerte et de "neutraliser " le radical hydroxyle sans effets secondaires. Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons examiné l'implication du monoxyde d'azote (NO) dans l'atteinte hépatique due au parasite Schistosoma mansoni, chez la souris. Nous avons constaté une altération de l'activité de la NO synthase endothéliale (eNOS), qui pourrait s'expliquer par la nitrosylation/nitration de l'enzyme du fait de la formation de peroxynitrite. De plus, nous avons mis en évidence une modification de l'expression et de l'activité du facteur « iron regulatory protein-1 » (IRP-1), ce qui devrait se traduire par une altération de l'homéostase du fer. De fait, la maladie s'accompagne d'une forte augmentation de la concentration du fer libre dans le foie. Ces observations pourraient éclairer certains aspects de la pathologie humaine
Our work is the first attempt to examine the opportunity to use the radical scavenging properties of gaseous hydrogen for protection against ionizing radiations and in a new anticancerous strategy. Hydrogen reacts with the hydroxyl radical, which is responsible for most of the radiation's damages ; the radical also initiates tumoral proliferation through several mechanisms, especially DNA alteration. We showed that 0. 7 MPa hydrogen reduces by 40 % base alteration in a gamma-irradiated DNA solution. The proportion of oxidized/reduced byproducts is unchanged, showing that hydrogen acts on the hydroxyl radical itself and not on down-stream reactions. Moreover, hydrogen triggers the apoptosis of cancer cell lines which are in active mitosis. Together with previous experiments showing a protective effect of hydrogen towards chronic hepatic inflammation, our findings illustrate the potential therapeutic properties of molecular hydrogen. Compared with all known drugs, hydrogen has the advantage to scavenge the hydroxyl radical without side effects. Ln the second part of our work, we examined the implication of nitric oxide (NO) in the hepatic injury due to the parasite Schistosoma mansoni, in the mouse. We showed that the activity of endothelial NO synthase (eNOS) is dramatically decreased. This is probably due to the nitrosylation/nitration of the enzyme by peroxynitrite, because of the simultaneous production of i) reactive oxygen species and ii) NO by the inducible NO synthase isoform (iNOS). We showed also that the expression and activity of iron regulatory protein-1 (IRP-1) is altered. This is likely to result in a change of the hepatic iron homeostasis. Actually, the disease induces a marked increase of free iron concentration in the liver. These observations should be taken into consideration for the human pathology

L’obésité est une maladie multifactorielle. La prise alimentaire, le mode de vie et la génétique sont les trois facteurs principaux contribuant à son développement. Tff2 est un petit peptide intestinal ayant pour fonction principale, la protection et la maintenance de la muqueuse. Les souris transgéniques déficientes (KO) du gène Trefoil Factor 2 (Tff2) sont viables, fertiles et protégées contre l’obésité induite par l’alimentation riche en gras (HIO) ; leurs comportements alimentaires diffèrent de ceux des souris du type sauvage (WT). Le but de cette étude est d’élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le gène Tff2 contribue au développement de l’obésité. Pour ce faire, on a identifié les principaux régulateurs de transcription des gènes sensibles à l’alimentation riche en gras (HF) et de ceux sensibles à l’alimentation faible en gras (LF) dans l’intestin grêle. Ensuite, les souries Tff2 KO et les souries WT ont été nourries avec HF et LF à volonté, leur développement a été suivi. Les organes qui participent dans le métabolisme énergétique tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique ont été prélevés pour y mesurer l’expression des gènes et des protéines impliqués dans ce processus. Les protéines et les gènes tels que CD36/Cd36, NUR77/Nur77 et GLUT4/Glut4 ont été plus fortement exprimés dans les souris Tff2KO que dans les souris WT, tandis qu’aucune différence significative n’a été observée dans les protéines mitochondriales. Nos résultats ont révélé en partie, les voies moléculaires et métaboliques qui mettent en évidence le lien de Tff2 avec les protéines impliquées dans le métabolisme énergétique. Il serait recommandable de mener la même étude sur les tissus humains afin de souligner le rôle de Tff2 dans le développement de l’obésité et le prendre pour la nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l’obésité.
Obesity is a multifactorial disease. Food intake, lifestyle and genetics are the three factors that contribute to its development. Tff2 is a small gut peptide playing protective and maintenance functions. Trefoil factor 2 knockout mice (Tff2KO) are viable, fertile and protected from high fat induced obesity (HIO) and their feeding behaviors are different from those of wild type (WT) ones. The purpose of this study is to elucidate the molecular mechanisms by which Tff2 contributes to the development of obesity. To do this, the principal transcriptional regulators for high fat and low fat responsive genes were identified in the small intestine; then Tff2 KO and WT mice were fed ad libitum with high-fat diet (HF) and low-fat diet (LF), their development has been supervised. Thereafter, energy metabolizing organs such as liver, adipose tissue and skeletal muscle have been harvested in order to measure the expression of genes and proteins involved in energy metabolism. Proteins and genes such as CD36/Cd36, NUR77/Nur77, and GLUT4/Glut4 were more expressed in Tff2KO mice than in WT mice, whereas no significant differences were observed in mitochondrial proteins. Our results showed a part of molecular and metabolic pathways that connect Tff2 and energy metabolizing proteins, we hope that Tff2 will be studied in human tissues to emphasize its role in the development of obesity and use it as a new therapeutic target for the treatment of obesity.

Nous avons recherché la présence de l'efflux actif, mécanisme de résistance possible aux fluoroquinolones chez les mycoplasmes. Dans cet objectif, nous avons caractérisé l'accumulation des fluoroquinolones et du bromure d'éthidium, substrat des pompes d'efflux, par des méthodes fluorimétriques chez la souche de référence M. Hominis PG21. Chez PG21, l'addition d'arginine, agent énergisant, réduit de façon significative le niveau d'accumulation de la ciprofloxacine (CIP) et de la péfloxacine (PEF) suggérant la présence d'un processus d'efflux actif. La réserpine, un inhibiteur de pompes de type MDR et l'orthovanadate, inhibant les transporteurs à "ATP-Binding Cassette" (ABC), augmentent uniquement le niveau d'accumulation de CIP, mais non celui de PEF. Les souches résistantes sélectionnées en présence de bromure d'éthidium (EtBr) présentent un profil compatible avec un phénotype MDR, avec augmentation des CMI des fluoroquinolones hydrophiles comme CIP, et d'autres composés de structure diverse tels que EtBr. En présence de réserpine, les CMI de ces deux types de substrats sont diminuées significativement. La souche RB1La a été choisie comme modèle d'étude. Chez cette souche le niveau d'accumulation de CIP et EtBr est diminué de façon significative par rapport à la souche de référence, alors que celui de PEF, molécule hydrophobe, ne l'est pas. En présence de réserpine et d'orthovanadate, le niveau d'accumulation de CIP est significativement augmenté, rejoignant celui de la souche parentale PG21. Des résultats similaires ont été obtenus pour les expériences d'accumulation et d'efflux du bromure d'éthidium. Après avoir mis en évidence et caractérisé physiologiquement une résistance de type MDR chez M. Hominis, le support génétique de cet efflux a été recherché. Deux gènes, présentant de fortes homologies avec des gènes MDR codant pour des protéines homologues aux transporteurs de type ABC, "MDR-like" putatifs identifiés par analyses de séquence chez M. Genitalium et M. Pneumoniae, ont été caractérisés. L'analyse de l'expression de ces gènes, par northern blot et RT-PCR quantitative compétitive, indiquent qu'ils sont surexprimés par rapport à la souche de référence PG21. Nos résultats montrent pour la première fois chez un mycoplasme humain, laa présence d'un système d'efflux actif de type transporteur ABC, impliqué dans une résistance de type MDR.

La dysfonction musculaire est une des manifestations importantes de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Cette dysfonction musculaire amène plusieurs anomalies musculaires tant au niveau clinique, structural, métabolique que biochimique. Ces anomalies contribuent à l’intolérance à l’effort, la perte de masse maigre et de force musculaire, ainsi qu’à la diminution de la qualité de vie des patients atteints de la MPOC. Cette thèse a pour objectif général l’étude de la dysfonction musculaire périphérique dans la MPOC, plus précisément 1) l’étude des mécanismes cellulaires impliqués dans l’atrophie musculaire 2) l’étude du métabolisme musculaire à la suite d’un exercice en endurance et 3) l’étude de la réponse cellulaire suite à un exercice en résistance. Tout d’abord, nous avons démontré que la voie de signalisation des MAPK, plus précisément les protéines p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK, pourrait jouer un rôle important dans le développement de l’atrophie musculaire chez les patients atteints de la MPOC. Par la suite, nous avons démontré que le SAA1 pourrait être impliqué dans la dysfonction des muscles périphériques chez les patients atteints de la MPOC. Le SAA1 est augmenté de façon significative tant au niveau de l’expression du gène que le niveau d’ARNm chez les patients présentant une MPOC. En second lieu, nous avons démontré une plus grande dépendance du système énergétique à la glycolyse a été observée lors d’un exercice en endurance chez les patients MPOC, ce qui pourrait contribuer à l’intolérance à l’exercice chez la MPOC. Finalement, nous avons déterminé qu’il existe une réponse cellulaire différente pour les protéines associées au maintien de la masse maigre suite à une session d’exercice en résistance chez les patients MPOC en comparaison à des sujets sains appariés pour l’âge. Cette thèse jette donc la lumière sur la contribution des voies de signalisation et des facteurs inflammatoires impliqués dans la dysfonction musculaire chez les patients présentant une MPOC et de la réponse à l’exercice tant en endurance qu’en résistance dans la MPOC. Ces résultats ajouteront aux connaissances moléculaires et cellulaires qui contribuent à la dysfonction musculaire périphérique et à l’intolérance à l’effort chez les patients atteints de la MPOC.
Peripheral muscle dysfunction is one of the most important systemic manifestations of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). This dysfunction brings many muscle abnormalities at the clinical, structural, metabolic and biochemical levels. These abnormalities contribute to the exercise intolerance, loss of muscle mass and force as well as diminishing quality of life of patients with COPD. This thesis as for general objective the investigation of peripheral muscle dysfunction in COPD, more precisely 1) the study of signalling pathways involved in muscle atrophy 2) the study of muscle metabolism in response to endurance exercise involved in exercise intolerance and 3) the study of muscle cellular adaptations to resistance exercise involved in the less than optimal response following resistance training in patients with COPD. First, we showed the possible contribution of the MAPKs, more precisely p38 MAPK, ERK1/2 and JNK, to the peripheral muscle dysfunction in COPD. The phosphorylation levels as well as the mRNA expression of these key proteins are elevated in patients with COPD compared to age-matched healthy controls. We also demonstrated that SAA1 could have a possible role in the peripheral muscle dysfunction in COPD. Secondly, we observed that patients with COPD have a greater reliance on the muscle glycolytic metabolism during an endurance exercise done until exhaustion, therefore possibly contributing to the exercise intolerance seen in patients with COPD. Lastly, we demonstrated that the cellular adaptation in response to resistance exercise training is different for proteins involved in muscle mass regulation in patients with COPD compared to age-matched healthy controls, thus possibly contributing to the less-than-optimal response to resistance exercise training in patients with COPD. This thesis puts at the forefront the signalling pathways and inflammatory markers contributing to the inherent peripheral muscle dysfunction in patients with COPD, as well as the investigation of exercise response in patients with COPD. These results will add to the scientific knowledge of the metabolic and cellular aspects of peripheral muscle dysfunction in COPD.

L’hormone peptidique Insulin-like 3 (INSL3) est produite par les cellules de Leydig du testicule. Elle est essentielle à la première phase de la descente testiculaire lors du développement fœtal. Les divers modèles animaux invalidés en Insl3 présentent une descente testiculaire incomplète chez les mâles, la cryptorchidie. Il s’agit du trouble développemental le plus courant chez les garçons nouveau nés des pays industrialisés et son incidence s’est accrue au cours des dernières décennies. Plusieurs études animales indiquent que les estrogènes répriment l’expression d’Insl3. La répression de l’expression d’Insl3 implique probablement le récepteur alpha des estrogènes (ERα) et/ou le récepteur nucléaire Nr0b2, tous deux présents dans les cellules de Leydig. En vue de vérifier la répression d’Insl3 par les estrogènes et d’impliquer ERα et/ou Nr0b2, j’ai analysé l’activité promotrice d’Insl3 murin par transfection et j’ai étudié les variations d’expression de son ARNm en PCR quantitatif. J’ai pu vérifier la répression d’Insl3 par l’estradiol et Nr0b2 ne parait pas être impliqué. L’implication d’ERα semble probable, mais les résultats de techniques différentes sont contradictoires.

La protéine Vif du VIH-1 est une petite protéine auxiliaire de 23 kDa, hautement basique et essentielle à la pathogénie dans les cellules non-permissives (cellules naturelles de l’infection par le VIH-1). Très récemment, il a été montré que ces cellules expriment spécifiquement un facteur de restriction, APOBEC3G (A3G) qui, en absence de Vif, induit une baisse de l’infectivité virale. Cependant, le virus a développé une stratégie qui lui permet de contourner cette défense immunitaire. Ce mécanisme d’évasion est contrôlé par la protéine Vif qui agit de multiples façons pour contrecarrer A3G : au niveau de l’encapsidation en inhibant son incorporation dans les virions, au niveau post-traductionnel en induisant sa dégradation par la voie de l’ubiquitine/protéasome et enfin au niveau traductionnel par un mécanisme encore inconnu. Mon travail de thèse a consisté en l’étude de ce dernier volet. Tout d’abord, nous avons montré que Vif se fixe à l’ARNm d’A3G et présente une meilleure affinité pour la région 3’UTR que pour la 5’UTR. Ces résultats sont confirmés par des analyses de cartographie en solution et d’empreinte qui indiquent que Vif se fixe majoritairement sur la région 3’UTR. L’analyse d’un mutant du domaine de multimérisation (PPLP) de Vif (Vif AALA) suggère que ce motif est impliqué dans la spécificité d’interaction avec l’ARNm d’A3G, Vif AALA ne présentant plus aucune préférence de liaison pour les ARN testés. Ensuite, des études biochimiques et biophysiques nous ont permis de caractériser les protéines Vif sauvage (Vif WT) et Vif AALA. Nos résultats indiquent que la protéine Vif WT s’assemble en complexes de 6 à 10 protéines alors que la protéine Vif AALA semble s’associer en dimères ou en trimères. La mutation du domaine PPLP réduit donc fortement la capacité de Vif à multimériser. L’analyse de la structure secondaire indique que les deux protéines s’organisent de façon similaire et que la région C-terminale est principalement déstructurée. Ce manque d’organisation expliquerait en partie la plasticité de cette région, autorisant ainsi une plus grande diversité d’interaction de la protéine Vif avec ses nombreux partenaires. Dans le but d’étudier les éventuelles conséquences de la fixation de Vif à l’ARNm d’A3G, nous avons analysé la traduction d’A3G ex vivo en présence de Vif. Nous avons montré que la région 5’UTR est nécessaire à l’inhibition traductionnelle par Vif mais que le domaine de multimérisation n’intervient pas dans ce mécanisme. Ainsi, compte tenu des propriétés de fixation de Vif à l’ARNm d’A3G, ces résultats suggèrent que l’affinité de Vif pour un ARN ne reflète pas obligatoirement son importance dans l’inhibition traductionnelle. L’étude du mécanisme d’inhibition lui-même suggère que Vif stimule l’assemblage de l’ARNm en complexes de haute densité. Des expériences complémentaires seront nécessaires afin d’identifier les composants de ces complexes et de localiser cet assemblage dans la cellule
HIV-1 Vif protein is a little auxiliary protein of 23kDa, highly basic and essential to pathogenicity in non-permissive cells. Recently, it has been shown that these cells express specifically a restriction factor, APOBEC3G (A3G) which, in absence of Vif, induced a decreased in viral infectivity. However, the virus has developed a strategy which allows to by-pass this immunitary defense. This evasion mechanism is controlled by Vif protein which acts by various ways to counteract A3G: at the packaging level by inhibiting its incorporation in the viral particles, at post-translational level by inducing its degradation and finally at translational level by understood mechanism. My PhD work focused in this last aspect. First of all, we have shown that Vif binds to A3G mRNA and presents a better affinity for 3’UTR than for 5’UTR. These results are confirmed by in solution probing and footprinting experiments which suggest that Vif binds preferentially the 3’UTR. Analyses of a Vif mutant in the multimerization domain (AALA Vif) show that this motif is implicated in binding specificity to A3G mRNA because this protein didn’t show anymore any binding preference for all tested RNA. Then, biophysical and biochemical studies allow us to characterize the wild-type Vif (WT Vif) and AALA Vif. Our results show that WT Vif is organized in complexes of 6-10 proteins whereas AALA Vif seems to form only dimers or trimers. Consequently, mutation in the multimerization domain decreased the Vif capacity to multimerize. Analyses of secondary structure indicate that the two proteins are organized in a similar way and that the C-terminal region is as a majority unstructured. This lack of organization would explain the plasticity of this region, providing a greater diversity of interactions between Vif and its numerous partners. In order to study the potential consequences of Vif binding to A3G mRNA, we analyzed the A3G translation in vitro and ex vivo in presence of Vif. We showed that the 5’UTR of A3G mRNA is necessary to translational inhibition by Vif but that the multimerization domain is not implicated in this mechanism. So, considering the Vif binding proprieties to A3G mRNA, these results suggest that Vif affinity for RNA doesn’t necessarily correlate with its importance in translational inhibition. The study of the inhibition mechanism itself suggests that Vif stimulates the assembly of A3G mRNA in complexes of high molecular weight. Complementary experiments will be necessary to identify the components of these complexes and to localized these assemblies in the cell

L’obésité représente l’un des problèmes majeurs de santé publique. De nombreux pays sont très bien documentés en littérature scientifique concernant la forte prévalence et la constante progression de l’obésité. Quoiqu’il existe certains médicaments contre l’obésité, ils sont de plus en plus retirés du marché à cause de leurs effets secondaires graves et parfois mortels. Afin de permettre de meilleures stratégies préventives et thérapeutiques de ce phénomène, il est important de connaître d’autres mécanismes moléculaires qui pourraient offrir de nouvelles cibles dans la prévention et la thérapie de l’obésité. L’objectif général de ce mémoire de fin d’études était d’identifier et caractériser de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant la prise lipidique afin de développer des stratégies préventives et thérapeutiques contre l’obésité et les maladies qui y sont associées. Nous avons d’abord voulu identifier le gène spécifique pour une diète riche en gras chez des souris. Nous avons donc choisi le facteur trefoil 2 (Tff2) puisqu’il est modulé par la nourriture riche en gras et que son expression est corrélée à celle de l’apolipoprotéine A4 (ApoA4), qui est un facteur de satiété induit par l’apport lipidique. Par la suite, nous avons déterminé les effets associés à la déficience du facteur trefoil 2 (Tff2KO) dans la protection contre l’obésité induite par une diète riche en gras. En somme, l’ensemble des résultats suggère l’implication de la Tff2KO dans le contrôle du bilan énergétique. En effet, Tff2KO augmente la prise alimentaire tout en diminuant le niveau de leptine. De plus, il augmente de façon substantielle l’excrétion d’énergie fécale. En conclusion, ces résultats suggèrent que Tff2 pourrait être une cible préventive et thérapeutique majeure dans le contrôle de l’obésité. Enfin, nous avons tenté de localiser l’expression du Tff2 dans le cerveau. Les résultats obtenus nous ont permis de voir que le Tff2 serait faiblement détecté dans le cerveau.
Obesity is a major public health problem. Many countries are well documented in scientific literature for their high prevalence of obesity. Although there are some drugs against obesity, they are increasingly removed from the market because of their serious and sometimes fatal side effects. To allow better preventive and therapeutic strategies, it is important to know other molecular mechanisms which could provide new targets for the prevention and therapy of obesity. The overall objective of this thesis was to identify new molecular mechanisms controlling food intake in order to develop prevention and treatment against obesity and the associated diseases. We first wanted to identify specific gene for a high-fat diet in mice. We therefore chose Tff2 since it is modulated by the high-fat food (high fat) and its expression is correlated to that of apolipoprotein A4 (ApoA4), which is a satiety factor induced by fat intake. Subsequently, we determined the effects associated with the impairment of trefoil factor 2 (Tff2KO) in protecting against obesity induced by high-fat diet. In sum, the overall results suggest the involvement of Tff2 deficiency in the control of energy balance. Indeed, Tff2KO increases food intake while decreasing leptin levels. In addition, Tff2KO substantially increases the excretion of fecal energy. In conclusion, these results suggest that Tff2 could be a major preventive and therapeutic target in controlling obesity. Finally, we attempted to localize the expression of Tff2 in the brain. The results have allowed us to see that Tff2 is weakly detected in the brain.

Il est bien accepté dans des modèles en culture que les dynamiques mitochondriales et le remodelage des crêtes régulent le fonctionnement mitochondrial sous diverses conditions de stress, particulièrement l’apoptose et la famine. Malgré la quantité impressionnante de recherche effectuée dans ce domaine, on en connait encore très peu au sujet de l’importance des dynamiques mitochondriales et du remodelage de la structure mitochondriale sous des conditions physiologiques. Dans les années 1960, Hackenbrock a démontré que des mitochondries isolées adoptent des conformations internes distinctes selon l’état métabolique. D’après ses observations, il a prédit que les changements ultrastructurels de la mitochondrie régulent la production fonctionnelle de l’organite. Cependant, il n’est pas évident que ces changements ultrastructuraux suivent bien les changements métaboliques in vivo dans des conditions physiologiques. De plus, le métabolisme hépatique nécessite une adaptation constante de la production bioénergétique et biosynthétique de la mitochondrie suite aux changements de l’état anabolique/catabolique de la cellule hépatique. Toutefois, le fonctionnement de ce processus est encore largement inconnu. Dans cette étude, nous apportons les premières descriptions quantitatives in vivo de la réponse adaptative du réticulum mitochondrial aux transitions métaboliques du foie. Grâce à un modèle hépatique de souris postprandiale et une analyse cryo- microscopie électronique (cryo-EM) quantitative, nous montrons que, 5 heures après un repas, la voie mTORC1 est bloquée, le réseau mitochondrial se fragmente, la densité des crêtes diminue et la capacité respiratoire des mitochondries chute. Ces changements sont accompagnés d’une augmentation parallèle de la longueur des contacts mitochondrie-réticulum endoplasmique (MERCs), qui contrôle les échanges de calcium et de phospholipides entre les deux organites. De plus, ces évènements sont associés à l’expression transitoire de deux fragments C-terminaux (CTFs) inconnus jusqu’à présent provenant de la protéine Optic atrophy-1 (OPA1), une GTPase qui régule les dynamiques des crêtes mitochondriales et des mitochondries. Grâce à un protocole in vitro, nous montrons que ces CTFs proviennent d’un nouveau clivage d’OPA1, appellé clivage-C, qui élimine l’activité d’OPA1 en la coupant. Plus important encore, nous montrons que le clivage-C nécessite la présence de Mitofusin-2 (MFN2), une protéine clé dans la régulation de la fusion mitochondriale et dans la génèse des MERCs, mais pas la présence de l’homologue Mitofusin-1 (MFN1), ce qui confirme le lien entre le remodelage des crêtes et l’assemblage des MERCs.
It is well established in cultured models that mitochondrial dynamics and cristae remodeling regulate mitochondrial function under different stress conditions, such as starvation and apoptosis. Despite the tremendous amount of research in this field, relatively little is known about the significance of mitochondrial dynamics and ultrastructure remodeling under normal physiological conditions in vivo. In the 1960’s, Hackenbrock demonstrated that isolated mitochondria adopt distinct internal conformations under different metabolic states. Based on these observations, he predicted that mitochondrial ultrastructural changes regulate the organelles functional output. However, whether these ultrastructural changes also accompany metabolic transitions in vivo, under physiological conditions, is not known. Further, hepatic metabolism requires mitochondria to adapt their bioenergetic and biosynthetic output to the ever-changing anabolic/catabolic state of the liver cell, but the wiring of this process is still largely elusive. In this study, we provide the first in vivo quantitative description of the adaptive response of the mitochondrial reticulum to hepatic metabolic transitions. Using a postprandial mouse liver model and quantitative cryo-EM analysis we show that at 5 hours after feeding the mTORC1 signaling is blocked, the mitochondria network fragments, the cristae density decreases and the mitochondrial respiratory capacity drops. These changes are accompanied with a parallel increase in the mitochondria-ER contact (MERCs) lengths, which control calcium and phospholipids fluxes between the two organelles. Further, these events are associated with the transient expression of two previously unidentified C-terminal fragments (CTFs) of Optic atrophy-1 (OPA1), a mitochondrial GTPase that regulates cristae and mitochondrial dynamics. Using an in vitro assay, we show that these CTFs originate from a novel OPA1 processing, termed C-cleavage that eliminates OPA1 activity by breaking off the GTPase. Importantly, we show that C-cleavage requires the presence of Mitofusin-2 (MFN2), a key regulator of mitochondria fusion and MERCs biogenesis, but not that of its homolog Mitofusin-1 (MFN1), thereby linking cristae remodeling to MERCs assembly.

L'habénula (Hb) est une petite structure cérébrale impliquée dans le contrôle des monoamines dont l’horloge circadienne est peu caractérisée. Ces travaux ont permis de prouver que l’Hb exprimait des gènes horloges en condition constante et qu’une déficience dans ces gènes altérait son horloge. De plus, l’Hb possède une horloge robuste qui oscille ex vivo sans l’entraînement du noyau suprachiasmatique (SCN) et même en présence de lumière constante qui affecte l’activité locomotrice et diminue l’amplitude des oscillations du SCN. Cependant, les oscillateurs de l’Hb se retrouvent désynchronisés en obscurité constante. Enfin, nous avons mis en évidence de potentiels synchronisateurs : quatre molécules affectent l’horloge dans l’Hb (dopamine, noradrénaline, vasopressine et orexine). Cette caractérisation de l’Hb pourra amener dans le futur à mieux comprendre son implication dans des maladies psychiatriques mêlant rythmes et monoamines comme la dépression ou l’addiction
The habenula (Hb) is a key nucleus for monoamine control with circadian properties. However, its clockwork is not fully characterized. In this thesis, we confirm that the Hb harbors a molecular circadian clock which can be disrupted by mutations of clock genes. Furthermore, we showed that the Hb clock was still rhythmic even without the suprachiasmatic nucleus (SCN) or in constant light condition which disrupts locomotor activity rhythms and SCN oscillations. However, Hb oscillators (in the caudal and rostral part) are uncoupled in constant darkness condition. In the last part of the study, we determined the potential internal synchronizators. The results indicated that at least four molecules (dopamine, noradrenaline, vasopressin and orexin) affect the Hb circadian properties (period, amplitude). The characterization of the Hb clock will give us a better understanding of its involvement in psychiatric diseases combining rhythms and monoamine alteration like depression or addiction

Ces 20 dernières années ont été consacrées à la dissection du réseau enzymatique complexe aboutissant à l’édification de l’amidon alors que bien moins de données ont été obtenues en ce qui concerne la dégradation ou les phénomènes de régulation de cette voie métabolique. Le métabolisme de ce polysaccharide nécessite plus de 40 gènes aussi bien chez la microalgue la plus primitive que chez les plantes les plus évoluées. Ce résultat est surprenant si on considère que l’amidon n’est composé que d’un seul sucre, le glucose, et contient uniquement que deux types de liaisons chimiques. En sus de son intérêt pour les industries alimentaire et des matériaux, un intérêt grandissant pour la compréhension des phénomènes de mobilisation de l’amidon chez les microalgues est apparu du fait de l’importance de ces organismes pour la production de bioénergies. Tandis que la majorité des données disponibles à ce jour proviennent d’approches de génétique inverse chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, nous proposons d’étudier le catabolisme de l’amidon via une stratégie de génétique formelle dans un système plus convenu pour une telle approche que les plantes modèles : l'algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. La construction et le crible d’une banque de mutants d’insertion nous ont permis d’isoler plus de 40 souches déficientes pour la mobilisation et représente une ressource essentielle pour une compréhension complète des mécanismes de dégradation de l’amidon. Nos caractérisations biochimiques, enzymologiques et moléculaires sur ces mutants nous ont permis d’identifier un nombre appréciable de fonctions impliquées plus ou moins directement dans le processus
During the last two decades of research, efforts have been focused on the understanding of the complex pathway of starch biosynthesis with comparatively less emphasis on the genes and regulatory networks responsible for mobilization in planta of this important source of storage polysaccharide. However the starch metabolism network includes over 40 genes highly conserved from green algae to land plants. This comes as a surprise when one considers that this storage polysaccharide is made solely of glucose residues with only two types of chemical linkages. In addition to its central importance in food and material science, a particular interest in the understanding of starch mobilization in green algae rather than crops has been generated from recent developments in the production of bioenergies. While successful reverse genetic approaches have been mostly applied to Arabidopsis, we propose to complete and reassess our vision of starch catabolism by applying a high throughput forward genetic strategy in the system which among all model plants is most suited for such an approach: the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. We thus constructed and screened an insertional mutant bank and identified more than 40 mutant strains altered in their ability or in the kinetics of starch mobilization. The combination of biochemical, enzymological and molecular approaches allowed us to identify several of the mutations responsive of the catabolic phenotype

La dégradation des ARNm participe à la régulation de l’expression des gènes, régulation essentielle au développement et à la survie des organismes. L’uridylation des ARNm favorise leur dégradation et est un processus conservé chez la plupart des eucaryotes. Mes travaux de thèse ont porté sur la caractérisation de URT1, une TUTase responsable de l’uridylation des ARNm chez Arabidopsis. J’ai notamment établi une chaine d’interactions entre URT1 et des facteurs impliqués dans l’inhibition de la traduction. Ces interactions sont probablement conservées dans l’ensemble des plantes terrestres. De plus, je montre grâce à une méthode d’analyse par séquençage à haut-débit des extrémités 3’ d’ARNm candidats que le niveau d’expression de URT1 ou de différentes versions mutées ou tronquées peut contrôler les profils de distributions de taille des queues poly(A) uridylées et non-uridylées. De manière très intéressante, la modification de ces profils de distributions est associée à la répression de l’expression d’un gène rapporteur, sans modification de l’accumulation des ARNm correspondants. Mes résultats contribuent à une meilleure compréhension des rôles moléculaires de l’uridylation des ARNm chez Arabidopsis et ouvrent des perspectives nouvelles quant à la diversité des rôles de l’uridylation dans le métabolisme des ARNm
RNA degradation is an essential step of gene regulation and is critical for development and survival of organisms. Uridylation of mRNAs triggers their degradation and is conserved in most eukaryotes. My PhD thesis is focused on the characterization of URT1, a TUTase responsible for the uridylation of mRNAs in Arabidopsis. I have identified a chain of interactions linking URT1 to factors involved in translation inhibition. Those interactions are likely conserved in all land plants. In addition, I show by 3’ RACE-seq, a method using high throughput sequencing to characterize the 3’ extremities of candidate mRNAs, that URT1 expression levels can control the distribution profiles of uridylated and non-uridylated poly(A) tails. Interestingly, the modification of these distribution profiles is associated to the repression of the expression of a reporter gene, without affecting mRNA steady-state levels. My results contribute to a better understanding of the molecular roles of mRNA uridylation in Arabidopsis and open new perspectives related to the diversity of the roles of uridylation in the metabolism of mRNAs

La protéine de liaison à l’ARN, Fragile Mental Retardation Protein (FMRP) est une protéine conservée dans l'évolution et particulièrement abondante dans le cerveau en raison de sa forte expression dans les neurones. L'absence de FMRP est responsable du syndrome du X Fragile, première cause du retard mental héréditaire. Cette protéine semble jouer un rôle important dans la régulation de la traduction des ARNm, puisqu’elle se retrouve sur les polyribosomes en traduction active. Elle se retrouve également dans des structures contenant des ARNm sous forme réprimée ce qui suggère qu’elle se comporte plutôt comme une protéine ayant un rôle de répresseur traductionnel. Il a déjà été montré que la surexpression de la protéine FMRP chez les mammifères peut induire la formation de granules cytoplasmiques d'ARN qui ressemblent aux granules neuronaux et aux granules de stress. Les mécanismes de formation de ces granules FMRP et leur dynamisme sont cependant totalement inconnus. Contrairement à FMRP chez les mammifères qui a deux homologues (FXR1 et FXR2), la drosophile possède un seul gène codant pour dFMRP. L'utilisation de ce modèle simple nous a permis d’étudier la formation des granules dFMRP et le rôle de dFMRP dans la formation des granules de stress. Nous avons pu montrer que l'expression de dFMRP dans les cellules de la drosophile induit la formation de granules dynamiques. La formation de ces granules dFMRP se fait sans activation d’une réponse générale au stress et leur mécanisme de formation ne ressemble pas à celui des granules de stress. La formation de ces granules implique le domaine de dimérisation de dFMRP. Ce domaine ne semble cependant pas important pour le recrutement de la protéine dans les granules de stress. Nos expériences de FRAP montrent que le domaine de dimérisation de dFMRP est plutôt nécessaire à la mobilité de la protéine entre les granules de stress et le cytoplasme. Dans l'ensemble, nos études suggèrent que la dimérisation de dFMRP est un événement important pour l’induction des granules-dFMRP et permet le trafic de dFMRP entre les granules à ARN et le cytoplasme.

Bactérie opportuniste bien connue, Pseudomonas aeruginosa est responsable d'infection bronchopulmonaire chronique chez les patients atteints de mucoviscidose. Afin de mieux appréhender les mécanismes mis en jeu par la bactérie pour résister aux nombreuses cures d'antibiothérapie par les aminosides (AGs), nous avons construit une banque d'insertion chez la souche sauvage de référence PAO1. Différents mécanismes de résistance ont ainsi été caractérisés, correspondant à : (I) l'augmentation de l'efflux actif des AGs; (II) la diminution de la perméabilité de la membrane externe aux AGs ; (III) la baisse du transport actif des AGs à travers la membrane cytoplasmique et (IV) l'altération de protéines ribosomales. Chacun des mécanismes identifiés confère à la bactérie une résistance de bas niveau aux AGs. Les hauts niveaux de résistance observés chez certaines souches cliniques pourraient résulter de l'addition de plusieurs mécanismes, ce qui a été démontré chez des doubles, triples et quadruples mutants construits in vitro
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible for chronic lung infection in patients with cystic fibrosis. Ln order to identify aminoglycoside resistance mechanisms, an insertional library was built in reference strain PAO 1 of P. Aeruginosa with a transposon. Screening of 12,000 clones on agar medium containing gentamicin led to the isolation of four groups of aminoglycoside resistant mutants showing either an alteration of the LPS, a defective electron transport chain, a lack in ribosomal protein L25, or overproduction of the efflux system MexXY. Each of these mechanisms promoted a 2-fold increase in the MICs of various aminoglycosides compared to PAO1. When combined, these alterations had addictive or multiplicative effects on resistance to aminoglycosides, resulting in MICs up to 16 fold higher than in PAO1 for clinical relevant drugs such as tobramycin. Altogether, these results show that high level resistance to aminoglycosides in P. Aeruginosa may result from the interplays of several low-level resistance mechanisms

L’athérosclérose débute par l’accumulation de cholestérol dans les cellules des parois artérielles, formant des plaques d’athéromes. LRP1 protège contre la maladie en inhibant l’accumulation intracellulaire de cholestérol et nous avions montré qu’une signalisation Wnt5a était impliquée dans cette inhibition. Le projet de thèse consistait à caractériser les mécanismes moléculaires de cette inhibition et à vérifier l’effet athéroprotecteur de Wnt5a. Nous avons montré in vitro et in vivo que Wnt5a inhibe l’accumulation de cholestérol via la stimulation de son export et l’inhibition de sa synthèse endogène. Nous avons ensuite observé que l’invalidation de Wnt5a spécifiquement dans les CMLv de souris LDLR-/- conduit à une augmentation des lésions athéromateuses après un régime riche en cholestérol, confirmant alors son rôle athéroprotecteur. Nos travaux ont ainsi permis de révéler le potentiel de Wnt5a en tant que cible thérapeutique dans le traitement contre l’athérosclérose
Protects against intracellular cholesterol accumulation and we identified the secreted protein Wnt5a as a partner of this inhibitory effect of LRP1. The aim of this thesis is to determine the molecular mechanisms by which the LRP1/Wnt5a signaling pathway prevents cholesterol accumulation in cells and to study the antiatherogenic potential of Wnt5a. We first showed in vitro and in vivo that Wnt5a decreases cellular cholesterol content by stimulating its efflux through the induction of cholesterol transporters expression and by down-regulating the expression of HMGCoA-reductase. Then we used mice deleted for Wnt5a specifically in smooth muscle cells, which present more atherosclerotic lesions than control mice after a high cholesterol diet. This confirms that Wnt5a protects against atherosclerosis and could be an interesting therapeutic target in the treatment of the disease

Ce travail de these s'est interesse a l'etude de l'expression de hsp72 au cours du vieillissement et aux effets de l'activite physique sur la capacite d'induction de cette proteine chez les personnes agees. Les personnes agees sont caracterisees par une baisse de la capacite de l'organisme a repondre de maniere adaptee a des conditions agressives et ce phenomene pourrait etre lie, au niveau cellulaire, a une alteration de la capacite d'induction de hsp72. Chez les sujets jeunes, il a ete observe qu'une aptitude physique aerobie elevee etait associee a une capacite d'induction de cette proteine en reponse a un stress plus importante. La pratique d'une activite physique reguliere est le moyen le plus performant pour induire une augmentation de l'aptitude physique aerobie, mais certains doutes persistent sur l'aptitude des personnes agees a produire les memes adaptations que celles observees chez des personnes plus jeunes. C'est pourquoi l'objectif de la premiere etude a ete de verifier que des octogenaires pouvaient beneficier de la pratique d'une activite physique reguliere et nous avons pu constater que ces personnes etaient en effet caracterisees par une aptitude physique aerobie largement superieure aux valeurs rapportees dans la litterature. La deuxieme etude a permis de verifier que la pratique reguliere d'une activite physique au cours du vieillissement permettait non seulement de maintenir un niveau eleve d'aptitude physique aerobie, comme il l'a ete demontre dans la premiere etude, mais permettait egalement de preserver la capacite d'induction de hsp72. Enfin, la troisieme etude a permis de mettre en evidence que l'implication de personnes agees sedentaires dans un programme d'activite physique permettait d'ameliorer leur capacite aerobie et de restaurer la capacite d'induction de hsp72.

Nous étudions les interactions hôte/pathogène entre la drosophile et un parasite intracellulaire, la microsporidie Tubulinosema ratisbonensis.Les microsporidies dérivent du groupe des champignons possédant un génome réduit et pas de mitochondrie. Ces parasites dépendent fortement du métabolisme de leur hôte pour proliférer. Les interactions entre les microsporidies et leurs hôtes reste peu étudiées au niveau métabolique.In vivo, les spores ciblent beaucoup de tissues, en particulier le corps gras qui perd ces gouttelettes lipidiques. Les réserves métaboliques sont épuisées au cours de l’infection et les mouches présentent les caractéristiques de famine. La supplémentation en acide gras dans la nourriture des mouches infectées augmente la prolifération du parasite. Cet effet est bloqué lorsque l’on perturbe l’assimilation ainsi que le transport des lipides provenant de l’intestin. En conséquence, les mouches résistent mieux à l’infection lorsque la synthèse des lipides est bloquée
We study the host/pathogen interactions between Drosophila and a natural intracellular parasite : the microsporidium Tubulinosema ratisbonensis. Microsporidia are highly derived group of fungi with a compact genome and no mitochondria. These obligate parasites thus rely intensively on host metabolism for growth and proliferation. The interactions between microsporidia and their hosts remain poorly understood at the metabolic level.In vivo, spores target many tissues especially the fat body that loses its lipid droplets. Metabolic reserves become depleted during the course of the infection and flies display the hallmarks of severe starvation. Fatty acids supplementation of the infected flies diet increases parasite proliferation and host susceptibility to the parasite. This effect is blocked when perturbing lipid assimilation and transport originating from the gut. Accordingly, flies resist better infection when lipid synthesis is blocked, as the parasite proliferation is hampered

MUCDHL est une cadhérine atypique encore peu étudiée. Les données obtenues à ce jour suggèrent que ce gène joue un rôle suppresseur de tumeurs dans l’intestin, notamment par son interaction et son effet inhibiteur sur la β-caténine, et que son expression est fréquemment diminuée dans les cancers colorectaux (CCR). Parallèlement à cette fonction anti-oncogénique, d’autres travaux ont suggéré que MUCDHL est impliquée dans la structuration de la bordure en brosse (BB) intestinale, en contribuant à la formation d’un complexe d’interaction inter-microvillositaire. Notre objectif était de déterminer la fonction et le mode d’action de MUCDHL dans le système digestif. Par la caractérisation détaillée de l’interaction avec la β-caténine, nous avons montré que le mode d’action anti-oncogénique de MUCDHL est plus complexe qu’une simple séquestration membranaire de la β-caténine. De plus, nous avons confirmé le rôle suppresseur de tumeurs de MUCDHL sur une cohorte importante de CCR humains et montré pour la première fois que sa perte amplifie la tumorigenèse intestinale dans un model murin. Par ailleurs, l’étude phénotypique des souris Mucdhl-/- a démontré son importance dans l’homéostasie du système digestif. En effet, l’absence de MUCDHL cause des altérations morphologiques de la BB intestinale, mais également de nombreuses perturbations métaboliques. Ces travaux apportent donc des informations inédites sur la fonction et le mode d’action de MUCDHL dans le système digestif
MUCDHL is an atypical cadherin that has been poorly studied. The data obtained so far suggest that this gene has tumor suppressive activity in the intestine, namely by its interaction and inhibitory effect on β-catenin, and that its expression is frequently decreased in colorectal cancers (CCR). In parallel to this anti-oncogenic function, other studies have suggested that MUCDHL is involved in the assembly of the intestinal brush border (BB), by contributing to the formation of an inter-microvilli interaction complex. Our objective was to determine the function and mode of action of MUCDHL in the digestive system, Through a detailed characterization of the interaction with β-catenin, we showed that the anti-oncogenic mode of action of MUCDHL is more complex than a simple membrane sequestration of β-catenin. In addition, we confirmed the tumor suppressive function of MUCDHL on a very large cohort of human CCR and showed for the first time that its loss amplifies intestinal tumorigenesis in a murine model. Moreover, the study of the phenotype of Mucdhl-/- mice allowed us to demonstrate the importance of MUCDHL in the homeostasis of the digestive system. Indeed, the absence of MUCDHL causes morphological alterations of the intestinal BB, but also numerous metabolic disturbances. Thus, this work provides new information on the function and mode of action of MUCDHL in the digestive system

Au cours des dernières décennies, les modifications comportementales ont conduit à une forte augmentation de la prévalence des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type 2. L’hyperglycémie chronique associée à ces maladies a des effets délétères sur de nombreux tissus, entraînant de graves complications (glucotoxicité). Parmi les différents mécanismes impliqués dans les effets toxiques du glucose, la O-N-acétylglucosaminylation (O-GlcNAc) des protéines joue un rôle très important. La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle réversible qui régule l'activité des protéines cytosoliques et nucléaires en fonction de la disponibilité en glucose. Deux enzymes seulement, l’O-GlcNAc transférase (OGT) et l’O-GlcNAcase (OGA), ajoutent ou retirent le groupement GlcNAc sur les protéines, respectivement. Cette modification dépend étroitement de la disponibilité en glucose et de son flux à travers la voie de biosynthèse des hexosamines (HBP). Les maladies métaboliques comme le diabète et l'obésité se caractérisent par ailleurs par une inflammation chronique à bas bruit, qui participe également aux complications observées dans ces pathologies. Les perturbations métaboliques associées à ces maladies (augmentation des acides gras libres et du glucose) favorisent les processus pro-inflammatoires dans le macrophage. Cependant, les relations entre processus inflammatoires et O-GlcNAcylation des protéines restent peu explorées. Le but de ce travail était d’évaluer l’implication de la voie de O-GlcNAcylation dans le macrophage. Les études ont été réalisées en utilisant la lignée de macrophages murins RAW264.7 ou des macrophages, différenciés à partir de moelle osseuse de souris, des macrophages péritonéaux de souris ou des macrophages différenciés à partir à de monocytes humains. La O-GlcNAcylation des protéines a été mesurée dans les macrophages RAW264.7 à l’aide d’un biosenseur BRET adressé dans différents compartiments cellulaires. Nous avons observé que l'activation du Toll-like receptor (TLR) 4 par le LPS (lipopolysaccharide) augmente le signal de BRET à la membrane plasmique, dans le cytosol et le noyau des cellules RAW264.7. Une augmentation de la O-GlcNAcylation induite par le LPS était également observée par western blotting dans les cellules RAW264.7 et dans les macrophages primaires de souris et humains. Cette augmentation de O-GlcNAcylation était en particulier détectée sur la sous-unité p65 du facteur de transcription NFκB, suggérant un rôle de cette modification dans les effets pro-inflammatoires du LPS. En accord avec cette notion, l’inhibition de l’OGA, (responsable de la dé-GlcNAcylation des protéines) à l’aide d’un inhibiteur spécifique (Thiamet G), potentialise les effets du LPS sur l’expression des ARNm de la cytokine pro-inflammatoire IL1β. Nous avons en outre généré un modèle de souris OGT-KO inductible au tamoxifène. L’invalidation de l’OGT dans les macrophages primaires de ces souris réduit l’effet du LPS sur l’expression des ARNm de l’IL1β d’un facteur 2, suggérant que l’induction de la O-GlcNAcylation est au moins en partie impliquée dans la transmission des effets pro-inflammatoires du LPS. Afin d’élucider les mécanismes responsables de l’augmentation de O-GlcNAcylation induite par le LPS, nous avons étudié, dans les cellules RAW264.7, l’effet du LPS sur les enzymes impliquées dans la voie O-GlcNAc. Nous avons observé que le traitement au LPS n’a pas d’effet sur l’expression (ARNm et protéine) et sur les activités enzymatiques de l’OGT et de l’OGA. En revanche, le LPS induit une forte augmentation de l’expression (ARNm et protéine) de la glutamine : fructose-6-phosphate amidotransférase (GFAT), enzyme limitante de la voie HBP. (...)
In the last decades, changes in lifestyle have led to a dramatic increased prevalence of pathologies such as obesity and type 2 diabetes. Chronic hyperglycaemia associated with these diseases has deleterious effects on many tissues, resulting in serious complications (glucotoxicity). Among the different mechanisms involved in the toxic effects of glucose, O-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAc) of proteins plays an important role. O-GlcNAcylation is a reversible post-translational modification that regulates the activities of cytosolic and nuclear proteins. Only two enzymes, O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA), control the level of O-linked N-acetyl glucosamine (O- GlcNAc) on proteins. OGT is the enzyme that O-GlcNAcylates proteins, whereas OGA removes O-GlcNAc from proteins. This post-translational modification tightly depends on glucose availability and its flux through the hexosamines biosynthesis pathway (HBP). Metabolic diseases such as diabetes and obesity are also characterized by chronic low level inflammation, which contributes to the complications observed in these pathologies. The metabolic disturbances associated with these diseases (increased free fatty acids and glucose) promote pro-inflammatory processes in the macrophage. However, the relationships between inflammatory processes and O-GlcNAcylation of proteins remain poorly explored. The aim of this work was to evaluate the involvement of the O-GlcNAcylation pathway in the macrophage. The studies were carried out using the RAW264.7 mouse macrophage cell line or primary macrophages differentiated from mouse bone marrow (BMDM), peritoneal mouse macrophages, or human monocytes derived macrophages (hMDM). O-GlcNAcylation of proteins was measured in RAW264.7 macrophages using a BRET biosensor targeted to different cell compartments. We have observed that activation of Toll-like receptor (TLR) 4 by LPS (lipopolysaccharide) increases the BRET signal at the plasma membrane, in the cytosol, and nucleus of RAW264.7 cells. An increase in LPS-induced O-GlcNAcylation was also observed by western blotting in RAW264.7 cells and primary mouse and human macrophages. This increase in O-GlcNAcylation was in particular detected on the p65 subunit of the NFκB transcription factor, suggesting a role for this modification in the pro-inflammatory effects of LPS. In agreement with this notion, inhibition of OGA, (responsible for de-GlcNAcylation of proteins) using a specific inhibitor (Thiamet G) potentiates the effects of LPS on mRNA expression of the pro-inflammatory cytokine IL1β. In addition, we generated a tamoxifen-inducible OTG-KO mouse model. Invalidation of OGT in primary macrophages of these mice reduces the effect of LPS on the expression of IL1β mRNAs by a factor of 2, suggesting that the induction of O-GlcNAcylation is at least in part involved in the transmission of the pro-inflammatory effects of LPS. In order to elucidate the mechanisms responsible for LPS-induced increase in O-GlcNAcylation, we studied the effect of LPS on the enzymes involved in the O-GlcNAc pathway in RAW264.7 cells. We observed that LPS treatment had no effect on the expression (mRNA and protein) and on the enzymatic activities of OGT and OGA. On the other hand, LPS induced a strong increase in the expression (mRNA and protein) of glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT), the rate limiting enzyme of the HBP pathway. Inhibition of GFAT with 6-Diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) inhibited LPS-induced increase in O-GlcNAcylation and LPS effect on the expression of IL1β mRNA, but not NOS2 expression, confirming a partial dependence of the pro-inflammatory effects of LPS on the O-GlcNAc pathway. In conclusion, our results indicate that activation of the O-GlcNAcylation pathway could be considered as an integral part of the signal induced by TLR4, and suggest that this pathway is involved in some of the pro-inflammatory effects of LPS in the macrophage

La chicorée industrielle, Cichorium intybus L. var. sativum, accumule une grandediversité de métabolites spécialisés. Ces métabolites montrent une grande variété destructures, activités et fonctions qui sont considérables d’un point de vue physiologique, mais aussi pour des applications humaines telle qu’en santé humaine et animale, en agronomie et autres diverses industries.Ce travail se concentre sur deux métabolites spécialisés de C. intybus : une phénolamide inhabituelle, la tétracoumaroyl-spermine (TetraSpm), et l’acide isochlorogénique (3,5-diCQA). Il constitue une contribution aux caractérisations biochimique, physiologique ainsi qu’à l’étude de l’histoire évolutive d’enzymes impliquées dans la biosynthèse de ces deux acides hydroxycinnamiques conjugués. Nous avons utilisé à ces fins des approches bioinformatiques et d’ingénierie moléculaires.Concernant la TetraSpm, nous avons démontré l’action successive des deux CiSHTs(Spermine Hydroxycinnamoyl Transférases) in vivo dans sa voie de biosynthèse. Nousavons exploré l’influence du ratio de polyamines libres disponibles et des caractéristiques structurelles des protéines SHT sur leurs activités catalytiques. En outre, nous avons produit une protéine chimérique capable de catalyser la production de TetraSpm en une seule étape. L’étude du métabolisme du diCQA chez C. intybus a impliqué l‘identification et la caractérisation préliminaire de gènes cibles appartenant à la famille enzymatique des GDSL-lipases like. De plus, cela a mis en évidence la diversité des acyltranférases impliquées dans le métabolisme spécialisé des plantes. Les rôles physiologiques et fonctions de la TetraSpm et du diCQA restent à déterminer. Cependant, la conservation de la TetraSpm au sein de la famille des Astéracées suggère son importance dans leur histoire évolutive, et les propriétés thérapeutiques du diCQA sont d’un grand intérêt en santé humaine. Ainsi, la compréhension de leurs voies de production permettra de leurs reconstitutions dans des systèmes hétérologues plus efficaces grâce à l’ingénierie moléculaire et par conséquent à la valorisation de ces composés
Industrial chicory, Cichorium intybus L. var. sativum, accumulates a wide array ofpotent specialized metabolites. These metabolites exhibit very diverse structures, activities and functions that are remarkable from a physiological standpoint, but also for their applications such as in human and animal health, agronomy and other diverse industries.This work focused on two specialized metabolites of C. intybus: an unusual phenolamide tetracoumaroyl-spermine (TetraSpm) and 3,5-isochlorogenic acid (diCQA). This research contributes to the biochemical and physiological characterization as well as the investigation of the evolutive history of the enzymes involved in the biosynthesis of these two hydroxycinnamic acid conjugates. We used computational analysis and molecular engineering approaches.We demonstrated the sequential action of the two CiSHTs (Spermine Hydroxycinnamoyl Transferases) in vivo in the biosynthetic pathway of TetraSpm. We investigated the influence of free polyamine availability and structural features on the catalytic activities of SHT proteins. Furthermore, we engineered a chimeric protein able to catalyze the production of TetraSpm in a single step.The study of diCQA metabolism in C. intybus involved the identification and preliminary characterization of target genes belonging to the GDSL-lipase like enzymatic family. Moreover, it emphasized the diversity of plant acyltransferases involved in specialized metabolism. The physiological roles and functions of TetraSpm and diCQA are still to be determined. However, the conservation of TetraSpm among the Asteraceae family suggests that it plays a significant role in their evolution, and the therapeutic properties of diCQA are of great interest in human health. Thus, deciphering these biosynthetic pathways is crucial for their reconstitution in more efficient systems via molecular engineering and consequently the valorization of these compounds

Chez les vertébrés, le foie est un des organes majeurs du métabolisme en étant le siège de la régulation de différentes voies du métabolisme qui contrôlent l’homéostasie du glucose et des lipides. En se basant sur des travaux de recherche récents suggérant que le système de conjugaison de l'ubiquitine est engagé en réponse à différents signaux métaboliques, nous avons réalisé une analyse protéomique globale dans le but d’identifier des protéines ubiquitylées dans le foie de souris soumises á un protocole de jeûne – re-nourrissage. Parmi les 117 protéines différemment ubiquitylé sur le jeûne ou le re-nourrissage, nous avons identifié complément 3 (C3) dans le foie de souris réalimentées. Nous avons observé qu'un produit d'activation de C3, C3a, est ubiquitylé dans les hépatocytes primaires traités avec les médias riches en nutriments. Ainsi, nous proposons que l'ubiquitination de C3 joue un rôle dans la régulation des fonctions inflammatoires ou métaboliques de C3 dans le foie
In vertebrates, the liver has developed to be a major metabolic organ able to control glucose and lipid homeostasis. It activates or inhibits specific pathways in a regulated manner, depending on the metabolic state of our organism. Based on the emerging experimental evidence suggesting that the ubiquitin conjugation system is engaged in response to different metabolic cues, we conducted a global proteomic analysis to identify metabolic pathways modified by ubiquitylation. To this end, we used livers of mice subjected to a fasting – refeeding protocol. Amongst the 117 proteins differentially ubiquitylated upon fasting or refeeding conditions, we identified complement 3 (C3) to be ubiquitinated in livers of refed mice. We observed that an activation product of C3, C3a, is ubiquitylated in primary hepatocytes treated with nutrient-rich media. Thus, we suggest that the ubiquitylation of C3 plays a role in the regulation of inflammatory or metabolic functions of C3 in the liver

Le virus respiratoire syncytial humain (VRS) est responsable de bronchiolites tant chez les nourrisson que chez les personnes âgées. La majorité des nourrissons ont été infectés par le VRS avant l’âge de 2 ans et peut dans certains cas avoir des conséquences fatales. Ce type d’infection respiratoire ne dispose d’aucun traitement efficace à ce jour. Lors de mon arrivée dans l’unité de virologie structurale de l’Institut Pasteur, la structure de la nucléoprotéine N du VRS venait d’être résolue. Disposant de la structure de cette protéine, le premier objectif de cette thèse était de caractériser au niveau structural l’interaction entre cette nucléoprotéine et son principal partenaire viral, la phosphoprotéine P, complexe essentielle au processus de réplication/transcription. A partir de ces données structurales, un second objectif a consisté en la recherche rationnelle d’inhibiteurs ciblant cette interaction en vue du développement de nouvelles molécules thérapeutiques. La première partie de ce manuscrit présente les résultats de la publication de 2015 (Ouizougun-Oubari et al., 2015) présentant un modèle d’étude valide, le N-NTD, permettant d’étudier l’interaction N-P. La structure du complexe NNTD/P2 a permis de caractériser une liste de 100 molécules où une famille moléculaire, les BPdC, sont capables d’inhiber la formation du complexe N-P. La seconde partie du manuscrit décrit les complexes obtenus avec d’autres molécules de la liste de 100 (non-BPdC), ainsi quelques caractérisations biochimiques du caractère inhibiteurs des certains composés. Ensemble, cette étude permet de mettre en lumière une démarche rationnelle en vue d’un développement d’un nouveau type d’inhibiteurs, non seulement chez le VRS, mais à d’autre Mononegavirales, ordre viral incluant de nombreuses maladies émergentes
Human respiratory syncytial virus (RSV) is responsible for bronchiolitis in both infants and the elderly. The majority of infants become infected with RSV before the age of 2 and in some cases can have fatal consequences. To date, this type of respiratory infection has no effective treatment.When I arrived in the structural virology unit of the Pasteur Institute, the structure of RSV nucleoprotein N had just been solved. Having the structure of this protein, the first objective of this thesis was to characterize at the structural level the interaction between this nucleoprotein and its main viral partner, phosphoprotein P, a complex essential to the replication / transcription process. From these structural data, a second objective consisted of the rational search for inhibitors targeting this interaction with a view to the development of new therapeutic molecules. The first part of this manuscript presents the results of the 2015 publication (Ouizougun-Oubari et al., 2015) presenting a valid study model, the N-NTD, for studying the N-P interaction. The structure of the N-NTD / P2 complex led to a list of 100 molecules where a molecular family, BPdCs, were able to inhibit the formation of the N-P complex. The second part of the manuscript describes complexes obtained with other compounds (non BPdC) and some biochemical characterization of their inhibitory feature. Together, this study sheds light on a rational approach to the development of a new type of inhibitor, not only in RSV, but also in other viral Mononegavirales including many emerging diseases

This thesis is dedicated to developments and applications of metabolomics, exploiting high field NMR spectroscopy. The first part is dedicated to a general presentation of metabolomics. We also report results about the introduction of reduced dimensionality techniques for the characterization of complex mixtures, coined targeted projection NMR spectroscopy. The second part of this manuscript reports results about three different metabolomic studies carried out in human populations. The first analysis demonstrates the suitability for metabolomics of serum samples collected in the framework of the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) study. The second study investigates a serum metabolic signature of metastatic breast cancer. The last analysis establishes potential plasma metabolic signatures for different liver pathologies, like hepatocellular carcinoma. The third part of this thesis is dedicated to the characterization of various model organisms. The first study presents a characterization of plasma and urine metabolic differences between four rat strains commonly used as controls in genetic studies. In the second study, we investigate the effects of physiological aging in Caenorhabditis elegans (C. elegans) and observe that dietary restriction buffers metabolic changes associated with aging. We further identify that perturbations in phosphocholine metabolism correlate with life expectancy. The third analysis of this part characterizes the ahr-1 C. elegans mutant, showing strong metabolic changes in ahr-1 mutants, which suggest an involvement in development and aging processes. We finally investigate in the last study the effects at the metabolic level of the interaction between an endogenous protein E4F1 and a viral protein HBx in liver cells infected by hepatitis B virus.

Depuis les révolutions industrielles des années 1700 et 1800, et pendant l'industrialisation des siècles les suivant, une accumulation de composés polluants a eu lieu dans l'atmosphère, principalement due à la combustion de matières fossiles comme le charbon et le pétrole. Outre les polluants directement émis comme les oxydes de souffre et d'azote, des polluants secondaires comme l'ozone se sont accumulés. Aujourd'hui, l'ozone est le troisième gaz responsable du réchauffement climatique, mais est également dangereux pour la santé humaine et responsable de dommages sur la végétation. Depuis les années cinquante, les effets de l'ozone sur les plantes et les réponses de ces dernières ont été étudiés de façon ciblée. Aujourd'hui, avec l'apparition de techniques permettant l'étude globale du transcriptome ou du protéome, il est possible d'aborder le problème d'une façon non biaisée, permettant des études plus complètes du stress. Dans le cadre de ce travail, une étude protéomique des effets de l'ozone sur les processus foliaires du peuplier a été proposée. Cette technique, complétée par des approches biochimiques, physiologiques, et des observations morphologiques, a permis de confirmer certains résultats d'études ciblées, mais également d'émettre des nouvelles hypothèses sur les mécanismes d'action de l'ozone sur le métabolisme du peuplier. En parallèle, l'étude du stress a aussi permis d'éclaircir les changements du métabolisme lors de la croissance de feuilles en conditions de stress et en conditions normales. Dans les pages de ce document, les procédures, résultats et conclusions de ce travail seront présentés en détail
After the industrial revolution of the 1700s and 1800s, and the subsequent industrialization, many pollutants have accumulated in the atmosphere, mainly due to the use of coal and fossil fuels. Besides the primary pollutants such as nitrogen oxides and sulfur oxides, secondary oxides such as ozone started to accumulate. Nowadays, ozone is the third gas involved in global climate change, but is also a major health risk for humans, and induces considerable damage to vegetation. Starting in the 50s, ozone research was based on targeted studies. Nowadays, with the advent of global techniques such as transcriptomics and proteomics, new results can be produced in an unbiased way. In the thesis presented here, a proteomic study of the effects of ozone on poplar leaf processes was carried out. With the help of this technique, complemented with biochemical and physiological approaches and with morphological observations, it was possible to confirm previous results, but also to elaborate new hypotheses concerning the effects of ozone on poplar leaf metabolism. In parallel, studying the stress also allowed to clarify some of the changes that occur in metabolism during leaf development, under stress conditions and under control conditions. In this document, the procedures, results and conclusions obtained during this study are presented in detail

Par sa fréquence et sa gravité, le cancer colorectal (CCR) demeure un problème de santé publique. Notre objectif global est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'homéostasie intestinale au travers de Mucdhl, une cadhérine atypique méconnue mais qui semble jouer un rôle très particulier dans l'épithélium intestinal et être impliquée dans les CCR. De manière intéressante, son expression semble fréquemment perdue dans les CCR, tandis que son maintien dans les cellules cancéreuses coliques diminue leur potentiel tumoral.Pour mieux appréhender le mode d'action de Mucdhl, une caractérisation fonctionnelle de son interaction avec β-caténine oncogénique a été réalisée et de nouveaux partenaires ont été identifiés dans les cellules intestinales. Afin de comprendre le rôle de Mucdhl dans la physiologie intestinale, encore inconnu à ce jour, un modèle murin déficient pour Mucdhl a été étudié. L'analyse des conséquences de la perte d'expression de Mucdhl indique qu'il est impliqué dans la structure et le fonctionnement de l'intestin chez la souris, mais également au niveau de processus métaboliques. De plus, cette perte d'expression de Mucdhl augmente la sensibilité des souris au développement de certaines tumeurs intestinales. Ces travaux ont donc permis de générer des informations inédites sur les fonctions physiopathologiques de Mucdhl, une cadhérine atypique encore mal connue, mais potentiellement impliquée dans les CCR
Because of its frequency and severity, Colorectal Cancer (CRC) remains an important public health issue. Our objective is to understand mechanisms contributing to intestinal homeostasis through Mucdhl, a poorly characterized atypical cadherin that may play a unusual role in the intestinal , epithelium and be implicated in CRC. lnterestingly, its expression seems to be frequently reduced in CRC, while its retention in colon cancer cells decreases their tumorigenic potential.To better apprehend the mode of action of Mucdhl, a functional characterization of its interaction with oncogen,iç β-catenin was performed and new partners have been identified in intestinal cells.To understand the role of Mucdhl in intestinal physiology, mice genetically-invalidated at the Mucdhl locus were studied. Analysis of the consequences of Mucdhl loss of expression indicates that it is involved in the morphology and function of the mouse intestine, but also in metabolic processes. Moreover, Mucdhl loss of expression increases the sensibility of mice to the development of certain intestinal tumors. Thus, we generated new information on the physiopathological functions of Mucdhl, an intriguing atypical cadherin potentially involved in CRC

Le foie est un organe clef dans la régulation du métabolisme énergétique de l’organisme. La superfamille des récepteurs nucléaires y joue un rôle primordial de senseur de l’environnement métabolique. Parmi ces récepteurs nucléaires, le récepteur des acides biliaires FXR participe aux mécanismes de régulation de l’activité du foie à travers son action sur les métabolismes des acides biliaires, des glucides et des lipides. FXR est devenu ainsi une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de nombreuses maladies impliquant un désordre métabolique comme les cholestases, le diabète de type 2 ou la stéatohépatite non-alcoolique. Malgré des résultats prometteurs dans le traitement de la stéatohépatite non-alcoolique, le traitement de patients avec un agoniste de FXR, le INT747, semble augmenter la concentration plasmatique du LDL-Cholestérol et diminue la concentration du HDL-Cholestérol suggérant un risque accru de développement d’athérosclérose. Ces effets sur le profil lipidique sont le frein majeur du développement clinique de ses agonistes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation par FXR de nombreuses voies comme le métabolisme des lipides et du cholestérol sont peu explorés et peu compris. Compte-tenu de ces informations, il est d’autant plus intéressant d’approfondir les connaissances de ces mécanismes et d’identifier des facteurs ou de nouveaux partenaires capables de moduler l’activité transcriptionnelle de FXR plus spécifiquement dans le cadre du contrôle du métabolisme des lipides et du cholestérol. L’un des facteurs de transcription connu comme régulateur majeur de ces voies métaboliques dans le foie est le facteur de transcription de la famille forkhead FOXA2. Ce facteur de transcription, dont l’activité est dépendante des conditions physiologiques, est activé par le glucagon et inhibé par l’insuline. De plus, c’est également un régulateur du métabolisme des acides biliaires, du cholestérol et des lipides.L’objectif de cette thèse a été d’étudier l’interaction entre les voies de signalisation de FXR et de FOXA2 dans différentes lignées cellulaires d’hépatocytes humains ou murins et dans le foie. Nous avons établi que FOXA2 et FXR sont colocalisés sur la chromatine des cellules HepG2 et dans le foie de souris à proximité de gènes impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et du cholestérol. Ces zones de cofixation de FXR et de FOXA2 présentent très peu de motifs de fixation de FOXA2 suggérant l’implication d’autres motifs de fixation non connus ou un mécanisme de type « tethering ». Nous avons montré que la fixation de FOXA2 à ces zones de cofixation avec FXR est augmentée par l’activation de FXR par son agoniste, le GW4064, évoquant une potentielle interaction entre ces deux facteurs. Nous avons démontré que ces deux facteurs interagissaient physiquement et que FOXA2 est un répresseur de l’activité transcriptionnelle de FXR à travers l’utilisation de différentes approches et modèles cellulaires. Finalement, dans les hépatocytes primaires de souris, FOXA2 est impliqué dans la répression de l’activité transcriptionnelle de FXR par le glucagon sur le gène Shp.L’ensemble de ce travail met en évidence pour la première fois la répression de l’activité de FXR par le facteur de transcription caractéristique du jeûne FOXA2 à travers un mécanisme moléculaire suggérant une transrépression de type «tethering». Ces résultats présentent un mécanisme inédit par lequel l’activité de FXR peut être modulée par le statut nutritionnel de façon gène-spécifique
The liver is a key regulator of whole-body energy metabolism. The nuclear receptor super-family plays a leading role in the metabolic sensing of the liver. Among the nuclear receptors, the bile acid nuclear receptor FXR contribute to the modulation of liver activity in particular through the regulation of bile acid, lipids and glucose homeostasis. Consequently, FXR became a potential therapeutic target for many diseases implicated metabolic disorder such as cholestasis, type 2 diabete or Non-Alcoholic Steatohepatitis (NASH). Despite promising results especially on NASH, patient treatment with FXR agonist the INT747 seems to increase LDL-Cholesterol plasma concentrations together with a decreased concentration of HDL-Cholesterol suggesting a higher risk to develop atherosclerosis. These effects on plasma lipid profile are the major break against the development of agonists in clinics. Giving the poor understanding and knowledge of the molecular mechanisms which govern FXR regulation of activity on various signaling pathways, it is of major interest to find new partners and regulators of FXR and especially on lipid and cholesterol homeostasis. One of the transcription factor known to be active in the control of these signaling pathways in the liver is the forkhead box transcription factor FOXA2. This transcription factor whose activity is dependent of physiological conditions is activated by glucagon and inhibited by insulin. In addition, this factor is known to regulate bile acid, cholesterol and lipid metabolism, functions very close from FXR activities in the liver.The objective of this PhD was to study the interaction between FXR and FOXA2 signaling pathways in different hepatic cells lines from human or mouse origin and in the liver. We established that FOXA2 and FXR are colocalised in HepG2 cells and liver chromatin near genes implicated in the lipid and cholesterol metabolism. These FXR/FOXA2 cobinding zones present few consensus FOXA2 response elements suggesting the implication of non consensus binding motifs or a “tethering” mechanism. We show that FOXA2 binding to FXR/FOXA2 cobinding zones is increased when FXR is activated and/or more present in the chromatin evoking a potential interaction between these two factors. We demonstrate that FXR and FOXA2 interact physically and that FOXA2 is a repressor of FXR transcriptional activity using different approaches and cellular models. Finally, we show that FOXA2 is implicated in glucagon-induced repression of FXR transcriptional activity on Shp gene.To conclude, our results show for the first time that the fasting key regulator of lipid and cholesterol homeostasis FOXA2 is a repressor of FXR transcriptional activity through a plausible mechanism involving “tethering” process. This work gives a novel mechanism by which FXR activity can be modified by nutritional status in a gene-specific manner

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative récessive due à un déficit en frataxine, une protéine mitochondriale très conservée. Elle est souvent associée à une atteinte cardiaque. Le déficit en frataxine est responsable d’une diminution de l’activité des enzymes Fe-Set d’une accumulation mitochondriale de fer. Les cellules pluripotentes induites (iPS) générées par reprogrammation de cellules somatiques constituent un outil puissant pour le développement de modèles de maladies monogéniques. Les cardiomyocytes obtenus par différenciation des iPS de patients AF développent une atteinte mitochondriale après 1 mois en culture. Celle-ci se complète par l’apparition secondaire de dépôts de fer, visibles après 4 mois en culture, indiquant une progression dans la physiopathologie de la maladie. Notre étude montre la capacité de ces cardiomyocytes à modéliser le phénotype cardiaque de l’AF, offrant ainsi l’opportunité d’approfondir leur caractérisation physiopathologique
Friedreich’s ataxia (FA) is a recessive neurodegenerative disorder due to a deficit of frataxin, a highly conserved mitochondrial protein. It is commonly associated with a hypertrophic cardiomyopathy. The main pathophysiological consequences are a decrease of Fe-S enzyme activities and mitochondrial iron accumulation. The recent technical advances in the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from somatic cells provide a powerful tool to create disease specific cellular models. Cardiomyocytes derived from FA-iPS present altered mitochondria after 1 month in culture. After four months in culture, iron deposits can be found in degenerating mitochondria, indicating a progression in the pathophysiology of the disease. Our study illustrates the ability of iPS-derived cardiomyocytes to model the cardiac phenotype associated with FA, and offers new opportunities to further investigate pathological mechanisms linked to frataxin deficiency

L’anophèle est le moustique vecteur du parasite Plasmodium, responsable du paludisme. Chez ce moustique, des protéines de type LRR (à motifs riches en leucine) ont été décrites comme antagonistes cruciaux du développement de Plasmodium. L’une d’entre elles, APL1C (Anopheles Plasmodium-responsive factor) protège spécifiquement le moustique contre les parasites Plasmodium de rongeurs en collaboration avec la protéine TEP1 du complément. En combinant des approches de biologie cellulaire et de génomique fonctionnelle, mon travail de thèse montre que le repas sanguin des moustiques induit le recrutement d’APL1C au niveau du pôle basal de l’épithélium digestif. Ce positionnement d’APL1C lui permet de se lier aux stades ookinètes du parasite émergeant du côté basal de l’épithélium, et ce, indépendamment de la fonction de TEP1. Néanmoins, cette action d’APL1C requiert la contribution des phagocytes et de la Nitration. Par ailleurs, mon travail montre que l’action d’APL1C ne se restreint pas à l'ookinète car elle agit aussi contre le dernier stade de développement de Plasmodium, les sporozoïtes. Avec la capacité de se lier aux sporozoites, APL1C contrôle la prévalence d’infection des glandes salivaires du moustique, mais avec des partenaires différents de ceux agissant sur les ookinètes. Finalement, une étude transcriptomique m’a permis d’identifier des facteurs agissant en aval d’APL1C. L’ensemble de ces résultats génère de nouvelles connaissances relatives à la fonction de cette famille de protéines LRR en tant que récepteurs de reconnaissance d'agents pathogènes capable de déclencher une réponse immunitaire dans différents compartiments tissulaires du moustique
Anopheles mosquito is a vector of Plasmodium parasite, the causative agent of malaria. The Anopheles leucine-rich repeat (LRR) proteins were described as key antagonists of Plasmodium parasites in Anopheles mosquito midgut. APL1C (Anopheles Plasmodium-responsive factor) is a representative of LRR members which specifically protects against rodent malaria parasites by stabilizing the complement-like protein TEP1. By combining cell biology with functional genomic approaches, this study shows that mosquito bloodmeal induce the presence of an extracellular layer of APL1C protein surrounding the midgut beneath of the basal lamina. Consistently with the formation of this layer, APL1C binds to the ookinetes that emerged on the basal side of the midgut. This presence occurs independently from TEP1 function, requires the contribution of the phagocytic cells and nitration pathway. In addition, APL1C defence function is not restricted to the ookinete in the midgut but it also acts against the latest Plasmodium stage, the sporozoites. APL1C inhibits salivary glands infection prevalence, and consistently, it also binds to the surface of the sporozoites in the hemocoel. However, unlike to the midgut stages, anti-sporozoites APL1C-dependent mechanism involves different partners. Moreover, RNAseq study revealed APL1C gene targets, including genes with immune-like function. These results generate novel biological insight for the function of APL1C, and probably other LRR family members, as a pathogen recognition receptor inducing immune response against pathogens that come in contact with mosquito hemolymph compartment

Les isoprénoïdes constituent une vaste famille de constituants cellulaires synthétisés chez la plupart des organismes vivants. Chez les plantes, la biosynthèse des isoprénoïdes est réalisée dans trois compartiments : le plaste, le cytoplasme-réticulum endoplasmique et la mitochondrie. Nous avons orienté nos travaux vers l'étude moléculaire et fonctionnelle du rôle de 2 types d'isoprénoïdes cytosoliques (dolichols et stérols) au cours du développement chez les plantes. Pour mener à bien notre étude, nous avons créé des lignées mutantes « knockdown » via la technique de !'ARN interférence (RNAi) et caractérisé des mutant~d'insertion T-DNAs « knockout » pour les gènes d'intérêt chez Arabidopsis.Dans le premier chapitre, nous montrons que les isoprénoïdes sont impliqués de façon indirecte dans la Nglycosylation de protéines via le Dolichol-P-Mannose (Dol-P-Man) dont la synthèse est catalysée par la dolichol phosphate mannose synthase (DPMS). Nous démontrons que chez les plantes, la DPMS est organisée en un complexe hétéromérique localisé dans le réticulum endoplasmique (RE) qui comprend 3 sous unités DPMS1, DPMS2 et DPMS3 codées par 3 gènes. Seule DPMS1 possède une activité catalytique. Les lignées DPMS 1-RNAi et dpms 1 présentent une hypo N-glycosylation des protéines, une forte chlorose et une inhibition de la croissance racinaire. Ces traits sont associés à une hypersensibilité à l'ammonium et à une induction de la« unfolded protein response »au niveau du RE. L'ensemble de ces données montrent que les gènes DPMS jouent un rôle important dans la N-glycosylation des protéines et le développement des plantes.Dans le deuxième chapitre, nous avons porté notre attention sur le rôle des intermédiaires de biosynthèse des stérols («SBls») dans la régulation du développement des plantes en choisissant comme cible ERG28,une protéine impliquée dans le complexe enzymatique de déméthylation en C-4 des stérols « SC4DM ». Nous montrons que ERG28 est localisée dans le RE et assemble 3 enzymes du complexe« SC4DM », la«sterol 4a-methyl oxidase ». la « 4a-carboxysterol-C3-dehydrogenase/C4-decarboxylase » et la « sterone ketoreductase ». Nous démontrons que la perte de fonction de ERG28 dans les lignées ERG28-RNAi eterg28 se traduit par des phénotypes caractéristiques d'une inhibition du transport polaire de l'auxine« PAT»(différenciation d'inflorescence de type «PIN», perte de dominance apicale, fusion des feuilles et inhibition du développement racinaire ... ). Ces phénotypes sont corrélés à l'accumulation de méthylène-cycloartanol-4-carboxy-4-méthyl (MCCM), un« SBI »qui inhibe de façon spécifique le« PAT». Ces données mettent en évidence un nouveau type d'interaction entre l'auxine et les stérols
Isoprenoids represent important cell constituents synthesized in many living organisms. ln plants, isoprenoid biogenesis occurs in three compartments : plastids, the endoplasmic reticulum-cytosol and mitochondrie.We focused on the molecular and functional studies of the role of Iwo cytosolic isoprenoids ( dolichol andsterol) in the development of plants. The key Io our strategy is the targeted silencing of specific Arabidopsis genes using the RNAi technology (knockdown) and the identification of T-DNA insertion mutants (knockout). ln the first chapter, we show that isoprenoids are involved indirectly in protein N-glycosylation via Dolichol P-Mannose derived from dolichol phosphate mannose synthase (DPMS). We demonstrate that plant DPMSis organized as a heteromeric enzyme complex localized in the endoplasmic reticulum (ER) and consists of DPMS1 acting as the catalytic core and two interacting subunits DPMS2 and DPMS3. The DPMS1-RNAiand dpms1 lines display an altered N-glycosylation pattern and exhibit extensive chlorosis, strong inhibition of root growth and hypersensitivity to ammonium. These phenotypic defects are associated with an «unfolded protein response» in the ER. These data demonstrate that the DPMS genes are essential for the protein N-glycome and plant development. ln the second chapter, we focused on the potentiel roles of sterol biosynthetic intermediates (SBls) in plant development using ERG28 protein, a component of the sterol C-4 demethylation (SC4DM) complex, as a target. We demonstrate that ERG28 is localized in ER and tethers 3 enzymes, sterol 4alpha-methyl oxidase, 4alpha carboxysterol-C3-dehydrogenase/C4- decarboxylase and sterone ketoreductase. We show that the Arabidopsis ERG28-RNAi and erg28 lines develop the hallmarks of altered polar auxin transport (PAT) including the differentiation of pin-like inflorescences, the loss of apical dominance, leaf fusion and inhibition root growth. The observed phenotypes correlate with the accumulation of methylene-cycloartanol-4-carboxy-4-methyl, a cryptic SBI. Our data provide a new level of interaction between sterols and auxin

Les troubles d’humeur sont fréquemment associées à une douleur chronique et le cortex cingulaire antérieur (CCA) est une région importante dans cette relation. Notre objectif est d'étudier les bases moléculaires de cette comorbidité, tant au niveau de la globalité du CCA (tissus entier) que dans les différents types cellulaires. Dans un modèle murin de douleur chronique présentant des conséquences anxiodépressives et dans plusieurs modèles de dépression, nous avons mis en évidence une surexpression du régulateur négatif de la voie de la protéine kinase activée par des agents mitogènes (MAPK), la MAPK Phosphatase-1 (MKP-1). La diminution de son expression dans le CCA atténue les comportements de type dépressif, ce qui montre que MKP-1 est un facteur clé de la physiopathologie de la dépression. Nous avons également démontré que l'administration aiguë du kétamine normalise la voie MAPK perturbée, tout en produisant un effet analgésique transitoire et un effet antidépresseur prolongé. Enfin, pour étudier la contribution individuelle de différentes populations de cellules dans le développement de la dépression, nous avons isolé les neurones GABAergiques du CCA pour étudier leur expression génomique afin d’établir une liste de gènes candidats plus spécifiques
Mood disorders are frequently comorbid with chronic pain and the anterior cingulate cortex (ACC) appears to be an important region in this relationship. We aimed to investigate the molecular basis of this comorbidity, at both the whole structure and the cell type specific level. A genomic analysis of the ACC in a mouse model displaying chronic pain-induced anxiodepressive consequences evidenced an overexpression of the Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) Phosphatase 1 (MKP-1). An upregulated ACC MKP-1 was also observed in other models of depression, while decreasing its expression attenuates depressive-like behaviors, showing that MKP-1 is a key factor in the pathophysiology of depression. This was further validated by showing that acute ketamine administration normalizes the disrupted MAPK pathway, alongside producing a transient analgesic and a prolonged antidepressant effect. Finally, to address the role of different cell populations in this comorbidity, we have isolated GABAergic neurons from animals showing depressive- like behaviors, which will be used for genomic analysis in order to reveal important cell-type specific candidate genes

ARCA2 est une ataxie autosomique récessive rare, caractérisée par une atrophie du cervelet et un léger déficit en Coenzyme Q10 (CoQ). La majorité des patients présentent des signes neurologiques supplémentaires comme l’épilepsie ou l’intolérance à l’exercice. La maladie est due à des mutations dans le gène COQ8A qui semble encoder une protéine kinase-like atypique, impliquée dans la biosynthèse du CoQ. Pour comprendre les mécanismes physiopathologiques, une souris Coq8a knock-out (KO) constitutif a été générée et récapitule les symptômes observés chez les patients. Le but de ce travail de thèse était de mieux comprendre certains aspects, notamment l’intolérance à l’exercice et l’ataxie. Malgré un déficit en CoQ dans les muscles, aucun défaut de respiration mitochondriale n’a été détecté dans un modèle cellulaire de muscle. Néanmoins, dans le cervelet, les niveaux de transcrits de 27 gènes sont dérégulés, précocement dans l’apparition de la pathologie chez les souris KO. Les voies métaboliques vont être explorées, ce qui devrait permettre de relier la fonction de COQ8A au taux de CoQ et aux symptômes observés chez les patients
ARCA2, a rare form of recessive ataxia, is characterized by early onset progressive ataxia, cerebellar atrophy and a mild Coenzyme Q10 deficiency. Most of the patients show additional neurological signs such as epilepsy and exercise intolerance. Mutations in the COQ8A gene lead to ARCA2. COQ8A is suggested as being an unorthodox protein kinase like, with a regulatory role in CoQ biosynthesis, in mammals. To better understand ARCA2, a constitutive Coq8a knock-out (KO) mouse model was generated, which recapitulates most of the patient’s symptoms. Here we report the use of cellular models and the affected tissues to uncover the molecular signature of COQ8A loss and CoQ deficit. Despite CoQ deficit in the muscle, no mitochondrial bioenergetics defect was uncovered. In parallel, we have identified, by RT-qPCR, a key set of genes that are dysregulated in cerebellum, very early on in the pathology. We are currently investigating these pathways to uncover the link with COQ8A function. Altogether, our experiments will shed light on the early molecular events that lead to ARCA2 and may help draw a link between COQ8A function, CoQ pools and the symptoms observed in patients

Une analyse du transcriptome d’Arabidopsis thaliana soumis à différents stress biotiques a révélé l’activation de certains membres de la famille CYP76, particulièrement celle de CYP76C2 (≈ 50 fois). La caractérisation fonctionnelle de la famille CYP76, et plus particulièrement celle de CYP76C2 a donc fait l’objet de cette thèse. Après confirmation de l’activation sélective de CYP76C2 en réponse aux pathogènes par qRT-PCR, le phénotype de ses mutants d’insertion et de surexpression a été caractérisé sous différentes conditions d’infection par: Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, P. syringae pv. tomato DC3000 avrRpm1 et par Botrytis cinerea. Afin d’identifier la voie métabolique faisant intervenir CYP76C2, un profilage métabolique ciblé et non ciblé a été entrepris, centré sur le(s) métabolite(s) différentiellement accumulés dans les différents mutants en condition d’infection. Alors que des différences subtiles de sensibilité des mutants de CYP76C2 aux pathogènes semblent confirmer son rôle dans la réponse aux pathogènes, les lignées affectées dans son expression ne présentent pas de phénotypes clairement différents de ceux des plantes sauvages. Une analyse non–ciblée en UPLC-MS (Orbitrap) a permis d’identifier un composé absent dans le mutant cyp76c2 qui pourrait correspondre à un dérivé conjugué en C11, sans que sa structure ne puisse pour l’instant être identifiée (formule brute C17H28O9). CYP76C2 ne semble pas impliqué directement dans la synthèse d’une molécule cruciale pour la mise en place du processus de défense, mais exerce plus probablement une fonction spécialisée ou partiellement redondante de défense ou de détoxication
A transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana subjected to biotic stresses has revealed the activation of members of the CYP76 family, especially of CYP76C2 (≈ 50 times). The functional characterization of CYP76C2, has been the objective of this thesis. After confirmation of the selective activation of CYP76C2 by pathogens, the phenotype of its insertion and overexpressor mutants was characterized under infection by Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, P. syringae pv. tomato DC3000 avrRpm1 and Botrytis cinerea. In order to identify the metabolic pathway involving CYP76C2, targeted and non-targeted metabolic profiling was focused on differentially accumulated compounds in the different mutants after infection. Whereas subtle differences of response of the CYP76C2 mutant lines in response to pathogens seemed to confirm its involvement in response to biotic stress, phenotypes strikingly different from those of wild-type plants were not observed. A non-targeted analysis by UPLC-MS (Orbitrap) identified a compound absent in the cyp76c2 line that may correspond to an oxygenated C11 conjugate (raw formula C17H28O9), but its structure was not identified. CYP76C2 thus does not seem directly involved in the synthesis of a molecule crucial for defense responses, but more likely has a role in the synthesis of a potentially redundant specialized defense compound or in a detoxification process

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative génétique, caractérisée par des symptômes moteurs, cognitifs et psychiatriques, qui s’accompagnent de dérégulations transcriptionnelles et épigénétiques touchant préférentiellement les triatum. La relation de cause à effet qui lie ces dysfonctionnements aux déficits comportementaux est encore mal comprise et sa caractérisation constitue l’objectif de ma thèse. Nous avons observé que la mémoire procédurale dépendante du striatum est progressivement altérée chez les souris R6/1 modèles de la MH. Ce déficit est partiellement compensé par l’utilisation d’une mémoire spatiale hippocampo-dépendante. Par ailleurs, nos données transcriptomiques montrent que le déficit cognitif des souris R6/1 est corrélé à une altération des régulations transcriptionnelles induites par l’apprentissage procédural et particulièrement de l’activation de gènes précoces immédiats essentiels à la plasticité neuronale. Pour tenter de corriger ces altérations, les souris R6/1 ont été traitées pharmacologiquement avec un activateur d’histone acétyltransférase. Le traitement a eu un effet bénéfique partiel sur la mémoire procédurale des souris R6/1, associé à des changements transcriptomiques et épigénétiques inattendus affectant plus particulièrement les cellules gliales, et favorisant le métabolisme du cholestérol. Ainsi, nos analyses permettent pour la première fois de définir avec précision la relation qui lie les altérations épigénétiques, transcriptionnelles et comportementales associées à la MH
Huntington's disease (HD) is a genetic neurodegenerative disease, characterized by motor, cognitive and psychiatric troubles, associated to transcriptional and epigenetic dysregulations, preferentially in the striatum. The causal relationship between these molecular dysfunctions and behavioral deficits is still poorly understood and its characterization is the objective of my thesis. We observed a progressive striatum-dependent procedural memory deficit in the R6/1 HD mouse, which is partially compensated by hippocampus-dependent spatial memory. Moreover, our transcriptomic data show that the cognitive deficit of R6/1 mice is correlated to altered striatal transcriptional regulations induced by procedural learning. Particularly, the expression of immediate early genes involved in neuronal plasticity is impaired. To improve these alterations, R6/1 mice were treated with a histone acetyltransferase activator. We observed a partial improvement of the procedural memory deficit of R6/1 mice. Surprisingly, this treatment induces transcriptomics and epigenetics changes, more particularly in the glial cells, and it improves cholesterol metabolism. Thus, our analyzes allows precisly, for the first time, to describe the relationship between the epigenetic, transcriptional and behavioral alterations in HD