Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Hépatocytes – Métabolisme – Aspect moléculaire“

Cette étude s'inscrit dans une thématique de phénotypage métabolique de souris génétiquement modifiées. A l'aide d'hépatocytes isolés, nous avons étudié les effets de l'hormone thyroi͏̈dienne T3, et le rôle de chacun de ses récepteurs,[alpha] et [beta], sur le métabolisme de la glutamine, principal précurseur hépatique de glucose et d'urée. L'effet de l'état nutritionnel, nourri ou à jeun, a d'abord été étudié chez des souris Swiss et 129SV normales. La RMN du carbone 13, couplée à des dosages enzymatiques et un modèle mathématique, montre que le jeûne ne modifie pas l'utilisation de glutamine. Mais il augmente la néoglucogenèse relative ou absolue et diminue l'oxydation de la glutamine (inhibition des flux citrate synthase, pyruvate et [alpha]-cétoglutarate déshydrogénases). Nous avons ensuite utilisé les souris [alpha]0/0 et [beta]-/- respectivement déficientes en récepteur [alpha) et [beta]. Quel que soit le génotype des souris (sauvages, [alpha] 0/0 et [beta]-/-), la T3 stimule les activités hépatiques de la citrate synthase, l'enzyme malique et la phosphoénolpyruvate carboxykinase. Par contre, les ARNm correspondants ne sont augmentés que chez les souris sauvages et [alpha]0/0. Ainsi, l'action transcriptionnelle établie ou supposée de la T3 sur ces gènes serait véhiculée par le récepteur [beta]. Chez les [beta]-/-, il existerait également une régulation de ces enzymes par la T3 à un niveau encore indéterminé. Les flux enzymatiques suggèrent que la suppression de la T3 chez la souris [beta]-/- s'accompagne d'une diminution de la consommation de glutamine, de la néoglucogenèse et de l'oxydation. La supplémentation en T3 ne restaure que le métabolisme oxydatif chez les [beta]-/-, donc via le récepteur [alpha]. En conclusion, la confrontation de trois niveaux différents de fonctionnement cellulaire (ARNm, protéine, flux enzymatique) apporte des éléments nouveaux sur le rôle respectif des récepteurs [alpha] et [beta] dans l'action métabolique hépatique de la T3.

Ma thèse de doctorat s’intitule « Une étude complète des effets antiplasmodiaux d’infusions d'Artemisia spp contre plusieurs stades de développement du parasite, y compris l'hypnozoïte». Le parasite dormant résidant dans le foie, appelé hypnozoïte, peut persister pendant des semaines, voire des mois, puis « s’éveiller » pour provoquer une infection récurrente au stade sanguin. Ce réservoir d'hypnozoïtes est l'un des obstacles critiques à l'éradication du paludisme, principalement en raison du manque de médicaments capables de l'éliminer. Le développement de nouveaux médicaments contre ces hypnozoïtes, est limité car les criblages phénotypiques sont entravés par le manque de plates-formes de culture in vitro. Dans des conditions de culture conventionnelles, les cultures d'hypnozoïtes sont souvent contaminées par des microbes qui affectent négativement la culture des hépatocytes. Ces contaminants sont introduits lors de l’inoculation des cultures par les sporozoïtes, récupérés par dissection manuelle et broyage des glandes salivaires de moustiques infectés. En abordant cette question, dans mon introduction générale (chapitre 1), je me suis d'abord concentré sur le développement d'un protocole facile à mettre en place à base d’un cocktail antimicrobien composé de méthylparaben, de pénicilline et de streptomycine. Ce cocktail, ajouté à la solution nutritive des moustiques à base de saccharose, permet de récupérer des sporozoïtes exempts de contaminants fongiques dans les glandes salivaires des moustiques infectés et est décrit en détails dans le chapitre 2. Après avoir développé une solide stratégie de culture, je suis passé au criblage de composés contre le stade hypnozoïte. Nous avons sélectionné deux Artemisiasp. La raison du choix de ces plantes a été décrite en détail dans ce manuscrit. J’ai testé l’effet d’infusions d'A. annuaet d'A. afra sur les stades pré-érythrocytaires de différentes espèces de Plasmodium. J'ai trouvé une forte activité antipaludique des infusions d'Artemisia, en particulier sur l’infectivité des sporozoïtes, le blocage de la formation d'hypnozoïtes, et une clairance des parasites hépatiques in vitro. De toute évidence, cet effet n’est pas dû à l’Artémisinine. Ces effets sont décrits en détail dans le chapitre 3. Nous pensons que cette profonde activité inhibitrice de l'infusion d'Artemisiasp est partiellement médiée par la perturbation de la biogenèse des apicoplastes et des mitochondries du parasite. Dans le chapitre 4, j'ai montré diverses images prises au confocal, montrant différents types d’altération observées sur ces organelles. Les données de PCR quantitatives de l'ADN des apicoplastes confirment ces observations. La résistance aux médicaments de P. falciparum est un problème croissant en Asie du Sud-Est et il est urgent de trouver de nouveaux médicaments pour faire face à ce problème. Dans le chapitre 5, j'ai décrit l'activité des infusions d'Artemisia contre des isolats de P. falciparum résistants aux dérivés d’artemisinine. Ma thèse a été effectuée en temps partagé entre l'Institut Pasteur du Cambodge, à Phnom Penh, où j'ai effectué des expériences sur les stades érythrocytaires de P. falciparum, et le stade hépatique de P. vivax, et le CIMI à Paris où j’ai travaillé sur les stades hépatiques des modèles rongeur et simiens, et du parasite humain P. falciparum
My PhD thesis entitled ‘A comprehensive study of the antiplasmodial effects of Artemisia spp. infusions against multiple parasite developmental stages including hypnozoite’. The dormant liver resident parasite is called hypnozoite which can linger for weeks to months, and then relapse to cause recurrent blood stage infection. This hypnozoite reservoir is one of the critical barriers towards malaria eradication, mainly due to the lack of mass medication with a drug that can clear the hypnozoites in the liver. There is a dire need for the development of new hypnozoite-killing drugs but phenotypic screens are hindered by a lack of in vitroculture platforms. Under conventional culture conditions, hypnozoite cultures are often contaminated. This effect partially arises from infection with unpurified sporozoites that adversely affect the hepatocytes culture. Addressing this issue, in chapter 1, firstly I focused on the development of a short protocol with an antimicrobial cocktail, methyl paraben and penicillin streptomycin in a supplementation with sucrose solution that ensure yeast free sporozoite production in the salivary glands. In chapter 2, I tried to describe the research objectives, methodology and findings of the experiments. After developing a robust culture strategy, I moved on drug screening against the hypnozoite stage. We selected two Artemisia sp. A. annuaandA. afra. Aqueousinfusions prepared from them and were tested against the hepatic stage of all Plasmodiumsp. The reasoning behind these plant selections have been described in detail in this manuscript. I found a strong antimalarial activity of Artemisia infusions that blocked the relpase causing hypnozoite formation and cleared the liver parasites. In chapter 3, I described the effect in more detail. We believe that this profound inhibitory activity of Artemisia infusion is partially mediated by the disruption of the biogenesis of apicoplast and mitochondria. In chapter 4, I showed various confocal images of apicoplast disruption and quantitative PCR data of apicoplast DNA confirm our observation. Drug resistance to P. falciparum is a growing problem in Southeast Asia. New drugs are required to solve the problem. In chapter 5, I described in vitro activity of Artemisia infusions against the drug resistant P. falciparum isolates. It can be noted that the in vitroantimalarial effect that I observed in the liver and blood stage of Plasmodium was not artemisinin dependent asA. afracontains negligible amount of artemisinin but showed potent inhibitory activity.This is the first indication that compounds other than 8 aminoquinolines and artemisinin could be effective against the relapsing malaria and overcome the antimlarail drug resistance

La toxicité hépatique des xénobiotiques constitue un sujet extrêmement riche, au vu des multiples mécanismes et acteurs impliqués. Ce travail de toxicologie translationnelle a pour but d’améliorer la compréhension des mécanismes hépatotoxiques de l’éthanol et des amanitines, puissantes toxines de champignons, afin d’apporter de nouveaux éléments permettant d’optimiser les prises en charge thérapeutiques des patients intoxiqués. Dans un premier temps, nous apportons des éléments supplémentaires de compréhension sur les mécanismes de réponse des macrophages à l’éthanol. Ces interactions xénobiotiques – cellules, montrées à travers l’exemple de l’induction des récepteurs P2X7, semblent participer à la sévérité des atteintes hépatiques alcooliques, et témoignent de la plasticité des macrophages en situation pathologique. Ces résultats suggèrent notamment l’intérêt du développement des antagonistes des récepteurs P2X7 dans le traitement des alcoolopathies. Dans un deuxième temps, nous appliquons l’outil de réseau moléculaire, permettant la visualisation de données complexes acquises par LC-MS/MS, à l’étude du métabolisme de xénobiotiques. L’exemple du métabolisme de l’acébutolol dans le cadre d’une intoxication médicamenteuse volontaire d’une part, et l’étude du métabolisme de la quétiapine de manière in vitro d’autre part, ont apporté des preuves consistantes sur l’intérêt du réseau moléculaire dans ce contexte. Dans un troisième et dernier temps, l’application du réseau moléculaire nous a permis d’écarter l’hypothèse d’un métabolisme des amanitines in vivo et in vitro. Par ailleurs, nos résultats montrent que le modèle cellulaire de cellules hépatiques HepaRG différenciés constitue un modèle pertinent dans l’étude des amanitines, et objectivent l’implication de la production des ROS mitochondriaux dans la toxicité de ces substances
Xenobiotic-induced hepatotoxicity is an extremely rich subject, given the multiple mechanisms and actors involved. This translational work aims to improve ethanol and amanitins (powerful fungal toxins) hepatotoxic mechanisms understanding, in order to provide new elements to optimize the therapeutic management of intoxicated patients. In a first step, we provide additional elements of understanding on macrophages response mechanisms to ethanol. These xenobiotic-cell interactions, shown through the P2X7 receptor induction example, seem to contribute in alcoholic liver damage severity, and testify to the macrophages plasticity in pathological situations. These results suggest in particular the interest of P2X7 receptor antagonist’s development in the treatment of alcoholism. In a second step, we are applied molecular networking, which allows the visualization of complex data acquired by LC-MS/MS, to xenobiotic metabolism study. The acebutolol metabolism example, in the context of voluntary drug intoxication on the one hand, and the in vitro quetiapine metabolism study on the other hand, have provided consistent evidence concerning molecular network interest in this context. In a third and final step, the molecular network application allowed us to rule out the hypothesis of an in vivo and in vitro amanitins metabolism. Moreover, our results show that the hepatocyte-like cellular model of differentiated HepaRG is a relevant model in amanitins study, and show the mitochondrial ROS production implication in these substances toxicity

Le transporteur sodium-dependant du d-glucose est responsable de la premiere etape de la reabsorption tubulaire de ce solute au niveau renal. De nombreuses etudes ont mis en evidence une heterogeneite concernant les proprietes cinetiques de ce transporteur tout le long du tubule proximal. Les differences existant entre le poids moleculaire estime par des methodes biophysiques comme l'inactivation par irradiation (230-345 kda) et les techniques biochimiques ou de biologie moleculaire (70-75 kda) indiquent que le transporteur a une structure oligomerique. La premiere partie de notre travail a consiste a preparer des anticorps polyclonaux chez le lapin, diriges contre une proteine de 70 kda prealablement identifiee comme une entite du transporteur responsable de la fixation de la phlorizine. Ces anticorps ont servi d'outils pour rechercher la (ou les) proteine(s) membranaire(s) impliquee(s) dans ce mecanisme de transport. La mise en evidence de plusieurs entites immunodetectables a permis de montrer l'existence de structures oligomeriques du transporteur, notamment d'un dimere particulierement resistant aux traitements classiques de dissociation par des agents reducteurs. Cette proteine d'un poids moleculaire apparent de 120 kda est presente egalement dans les membranes renales de rat, d'homme et des cellules llc-pk1. Nous avons pu montrer qu'il s'agissait d'un heterodimere constitue de la sous-unite 70 kda et d'une sous-unite 60 kda egalement reconnue par les anticorps. La dissociation de cet heterodimere semble en relation avec la perte de sites de fixation de haute affinite pour la phlorizine et la disparition du transport de basse affinite pour le d-glucose. Nous avons etudie les chaines sucrees portees par la proteine 70 kda par deglycosylation enzymatique et western blot avec des lectines. La proteine 70 kda est une n-glycoproteine apparemment depourvue de chaines sucrees o-liees. La n-glycosylation intervient pour 15 kda dans le poids moleculaire apparent de la proteine. Il s'agit de chaines complexes tri ou tetraantennaires contenant des residus d'acide sialique et de n-acetylglucosamine

Dans le cadre du développement de molécules ciblant le métabolisme phospholipidique de Plasmodium, nous présentons dans cette thèse la validation de méthodes analytiques ainsi que les études réalisés in vivo et in vitro sur quatre composés de cette nouvelle série chimique. Dans la première partie de notre thèse, les mécanismes physiopathologiques du neuropaludisme ainsi que les différentes axes de recherche sont développés. Dans une seconde partie, nous présenterons la série chimique sur laquelle nous avons travaillé. La troisième partie expose les résultats des méthodes analytiques validées selon les citères recommandés par la FDA pour la quantification des composés étudiés dans différentes matrices de différentes espèces animales. Le problème de l'effet matrice en spectrométrie de masse est également développé. Les résultats des études de distribution erythrocytes/plasma et de bioconversion prodrogue/drogue dans des matrices d'éspèces différentes sont présentés dans la quatrième partie. Enfin, dans une dernière partie nous rapporterons les études pharmacocinétiques et pharmacocinétiques / pharmacodynamiques réalisés chez le rat, la souris et le porc.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013.
L’obésité et le diabète de type 2 (T2D) sont étroitement associés à la résistance à l’insuline, une maladie métabolique qui se développe suite à un défaut causé par une réduction de la signalisation de l’insuline et de sa clairance. Afin de comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline plusieurs molécules qui régulent les voies de signalisation ainsi que la clairance sous contrôle du récepteur à l’insuline ont été étudiées, incluant la protéine tyrosine phosphatase (PTP) SHP1 et la molécule carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1 or CC1) qui est régulée en aval sous le contrôle de SHP1. Les nombreuses isoformes de CC1 contribuent à différentes fonctions cellulaires. Dans le foie, l’isoforme CC1-L, qui est phosphorylée sur tyrosine (Tyr), joue un rôle métabolique essentiel dans la régulation de la clairance de l’insuline et dans la suppression de l’activité de la synthase des acides gras (FAS). Nous avons démontré que des souris invalidées pour CC1 (Cc1-/-) sous un régime standard faible en gras (SD) développent néanmoins une importante stéatose hépatique qui est démontré par une augmentation de triglycérides, de cholestérol total ainsi que de cholestérol estérifié dans le foie. Sous un régime contenant 55% de gras (HFD) ces mêmes souris démontrent une prédisposition au développement de la stéatose et dysfonction hépatique induite par le régime, indiqués par une accumulation de lipides hépatiques et une augmentation d’enzymes marqueurs de dommage hépatique dans la circulation. La stéatose hépatique dans la souris Cc1-/- est liée à une augmentation significative d’importantes enzymes lipogéniques et de la synthèse du cholestérol qui sont régulés suite à une augmentation de l’activité nucléaire des facteurs de transcription Srebp1c et Srebp2. Comparées aux souris contrôle sauvages (WT) les souris CC1-/- ont démontré une réduction de la clairance de l’insuline, une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline hépatique et une augmentation d’expression des activateurs transcriptionels hépatiques PGC-1 et FoxO1. L’absence de CC1 a aussi exacerbé l’intolérance au glucose et la résistance à l’insuline hépatique induite par le régime à haute teneur de gras mais la clairance de l’insuline n’était pas diminuée dans les souris Cc1 -/-. Nos donnés indiquent que CC1 est un important régulateur de la lipogénèse hépatique et que les souris CC1-/- sont prédisposées à développer une stéatose hépatique qui mène à une résistance à l’insuline hépatique et des dommages dans le foie qui sont surtout évidentes sous un régime riche en lipides. Une importante Tyr phosphatase de CC1 est SHP1. Précédemment nous avons démontré que SHP1 est un important régulateur de l’homéostasie du glucose et de la clairance de l’insuline par le foie, cependant son rôle dans l’obésité liée au diabète reste méconnu. Nous rapportons ici que l’expression de SHP1 est significativement augmentée dans les tissus métaboliques de souris obèses sous régime HFD. Nous avons généré des souris invalidées pour SHP1 spécifiquement dans les hépatocytes (Ptpn6H-KO) pour investiguer le rôle de SHP1 dans le développement de la résistance à l’insuline et de la stéatose hépatique. Sous régime HFD les souris Ptpn6H-KO deviennent aussi obèses que les souris non invalidées pour SHP1 (Ptpn6f/f). Malgré ceci les souris Ptpn6H-KO démontrent une amélioration de la glycémie à jeun et une protection contre la résistance à l’insuline induite par l’obésité qui est confirmée par la suppression de la synthèse de glucose hépatique ainsi qu’une amélioration de l’activation du récepteur pour l’insuline avec une augmentation concomitante des voies de signalisation Akt. Il est aussi possible que la clairance de l’insuline accrue qu’on observe dans les souris Ptpn6H-KO soit due à une augmentation de la phosphorylation sur tyrosine de CC1. Les souris obèses Ptpn6H-KO montrent une augmentation de stéatose hépatique qui est le résultat de 1) une augmentation de lipogénèse hépatique associée à une augmentation importante de l’activité et de l’expression de SREBP-1 et des enzymes lipogéniques en aval FAS et ACC, 2) une augmentation de la captation postprandiale des acides gras qui est possiblement liée à une augmentation de l’expression du gène et de l’activité nucléaire de PPARγ, 3) une diminution de la sécrétion des triglycérides et de l’apolipoprotéine B sous le forme de lipoprotéines de très basse densité (VLDL). Étonnamment, malgré le niveau élevé de stéatose hépatique, le profil inflammatoire dans le foie des souris Ptpn6H-KO était similaire ou même amélioré comparé aux souris contrôles Ptpn6f/f et ceci était accompagné d’une diminution de dommage hépatocellulaire. Ces résultats démontrent que SHP1 est un nouveau médiateur de la résistance à l’insuline dans les hépatocytes et contribue à la détérioration du métabolisme du glucose induite par l’obésité. Chez la souris Ptpn6H-KO la stéatose hépatique induite par le régime suggère par ailleurs un autre rôle de SHP1 dans la régulation du métabolisme hépatique des lipides. Malgré le fait que CC1 et SHP1 se retrouvent dans le même complexe que Cdk2 et le récepteur de l’insuline, ils jouent des rôles opposés, CC1 étant un régulateur positif et SHP1 un régulateur négatif de la clairance de l’insuline. Ceci est en accord avec la régulation hépatique par le glucose des voies de signalisation de l’insuline pour ces deux molécules car les souris Cc1-/- démontrent une détérioration du métabolisme du glucose et de la signalisation de l’insuline alors que les souris Ptpn6H-KO démontrent une amélioration. Notre observation de stéatose hépatique chez ces deux modèles animaux suggère que CC1 et SHP1 limitent la synthèse et l’entreposage des lipides hépatiques de façon dépendante ou indépendante de la signalisation de l’insuline. Les résultats de ces études utilisant des modèles invalidés pour CC1 ou SHP1 révèlent des mécanismes du contrôle de la synthèse de glucose hépatique et du métabolisme des lipides qui sont très complexes et distincts. En plus ces résultats nous apportent une compréhension importante de la régulation hépatique de l’action et de la clairance de l’insuline.
Obesity and type 2 diabetes mellitus (T2D) are tightly associated with a common link, insulin resistance, a metabolic disorder developed from defective insulin action involving impaired insulin signaling and clearance. To investigate the pathogenesis of insulin resistance, many molecules modulating its signaling pathways as well as insulin receptor-mediated insulin clearance have been studied, including the protein tyrosine phosphatase (PTP) SHP1 and its regulated downstream molecule carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1 or CC1). CC1 in multiple isoforms contributes differentially to various cellular functions, the tyrosine (Tyr)-phosphorylated isoform of CC1 (CC1-L) is known to play an essential metabolic role in the hepatic regulation of insulin clearance and insulin-mediated acute inhibition of fatty acid synthase (FAS) activity. We have found that CC1-deficient (Cc1-/-) mice on standard diet (SD) already develop spontaneous hepatic steatosis with significantly elevated accretion of triglyceride (TG), total and esterified cholesterol. When challenged with a 55% kcal high-fat diet (HFD), these mice show greater susceptibility to the development of diet-induced hepatic steatosis and dysfunction, indicated by higher hepatic lipid content and serum levels of hepatic enzymes as markers of liver damage. Hepatic steatosis in the Cc1-/- mice is linked to a significant increase of key lipogenic (FAS, ACC) and cholesterol synthetic (HMGCR) enzymes, which is a result of increased nuclear activity of their positive gene transcription factors Srebp1c and Srebp2. Compared to their wild-type (WT) littermate controls, Cc1-/- mice exhibited impaired insulin clearance, glucose intolerance, liver insulin resistance, and elevated hepatic key gluconeogenic transcriptional activators Pgc1 and FoxO1. Lack of CC1 also exacerbated the HFD-induced glucose intolerance and hepatic insulin resistance, while insulin clearance was not further deteriorated. These data demonstrate that CC1 is a key regulator of hepatic lipogenesis and that Cc1-/- mice are predisposed to liver steatosis, leading to hepatic insulin resistance and liver damage, particularly when chronically exposed to dietary fat. An important Tyr phosphatase of CC1, SHP1, has been found previously by our lab to regulate glucose homeostasis and liver insulin clearance, but its potential implication in obesity-linked insulin resistance and hepatic steatosis has not yet been examined. We hereby report that SHP1 expression is significantly upregulated in metabolic tissues of HFD-fed obese mice. We have also further investigated the role of hepatocyte SHP1 in promoting insulin resistance and hepatic steatosis by generating hepatocyte-specific SHP1 knockout mice (Ptpn6H-KO). Upon HFD feeding, Ptpn6H-KO mice develop obesity as their Ptpn6f/f littermates. With consistently improved fasting glycemia, these mice are protected from obesity-induced liver insulin resistance as revealed by normalized insulin suppression of hepatic glucose production and hepatic insulin signaling with improved activation of insulin receptor and downstream signaling through Akt. More rapid insulin clearance in Ptpn6H-KO mice due to heightened CC1 tyrosine phosphorylation is also a possible contribution to the improved insulin action. Unexpectedly, obese Ptpn6H-KO mice exhibit enhanced hepatic steatosis. In detailed mechanisms, this is a result of 1) augmented hepatic lipogenesis, marked by upregulated activity and expression of SREBP-1 as well as the downstream regulated lipogenic enzymes such as FAS and ACC, 2) increased postprandial fatty acid uptake, possibly linked to the upregulation of PPAR gene expression and nuclear activity, and 3) decreased postprandial TG output in apolipoprotein B (ApoB)-associated lipoprotein particles, i.e. very low density lipoprotein (VLDL). More interestingly, the steatotic livers of these Ptpn6H-KO mice display comparable or even reduced level of inflammation accompanied by significantly less hepatocellular damage than that in their Ptpn6f/f counterparts. These results present hepatocyte SHP1 as a novel mediator of insulin resistance compromising hepatic glucose metabolism in diet-induced obesity. The enhanced diet-induced hepatic steatosis in Ptpn6H-KO mice provides a new role for SHP1 in liver lipid metabolism and further supports the bifurcation of insulin signaling in the regulation of hepatic glucose and lipid homeostasis or also confirms a possible disconnection between hepatic regulation of glucose and lipid metabolism. Although both CC1 and SHP1 are found in the same complex with Cdk2 and insulin receptor to regulate insulin clearance, they play opposing roles as CC1 is the positive regulator and SHP1 being the negative one. This is in accordance with the hepatic glucoregulation of insulin signaling for both molecules, since Cc1-/- mice show impaired glucose metabolism and insulin signaling whereas Ptpn6H-KO mice exhibit improvement. Interestingly, our observation of hepatic steatosis in both animal models, though with different characteristics, suggests that both CC1 and SHP1 limit hepatic lipid synthesis and storage, dependent or independent of insulin signaling. Findings from these studies using animal models lacking CC1 and SHP1 reveal complex and differential regulatory mechanisms of hepatic glucose and lipid metabolism, and they also provide important understanding of the hepatic regulation of insulin action and clearance.

La cellule a élaboré des mécanismes de surveillance afin d’assurer la fidélité de l’expression génique. Le nonsense-mediated mRNA decay (NMD) reconnaît et en général, dégrade rapidement les ARNm nonsens, qui contiennent des codons stop prématurés. Le NMD a longtemps été considéré comme un mécanisme de protection, permettant d’éviter la synthèse de protéines tronquées, potentiellement néfastes pour la cellule. Plus récemment, un nouveau rôle du NMD a émergé : il semble réguler l’expression génique, notamment lorsqu’il est couplé à l’épissage alternatif. D’autre part, bien que les mécanismes de reconnaissance et de dégradation des ARNm nonsens soient de mieux en mieux compris, une controverse subsiste quand à la localisation subcellulaire du NMD chez les mammifères. Ces deux aspects du NMD ont été abordés au cours de ma thèse dans le cas de l’étude du métabolisme des ARNm aberrants du gène de la fah, responsable de la tyrosinémie héréditaire de type I. Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de la maladie, j’ai caractérisé les ARNm de la FAH contenant des mutations d’épissage (Q279R et V259L) ou nonsens (W262X) dans l’exon 9. Deux transcrits alternatifs du gène de la fah ont ainsi été mis en évidence pour ces trois mutations : del100 a éliminé l’exon 8 et del231 les exons 8 et 9. Del231 est fortement produit lorsque les mutations d’épissage Q279R et V259L sont présentes. L’étude des transcrits chez les patients avec ces deux mutations a permis de proposer un modèle d’épissage pour les exons 8 et 9. Une analyse plus poussée sur del100 et del231 a révélé que ceux-ci étaient en fait produits de façon minoritaire dans des cellules avec un gène normal de la fah, par épissage alternatif des exons 8 et 9. Del100, qui contient de nombreux PTCs suite à l’élimination de l’exon 8, est dégradé par NMD. Cependant, la quantité de transcrit restante semble suffisante pour la synthèse d’une protéine de 31-kDa, détectable dans plusieurs tissus humains. Ce premier transcrit alternatif de la fah est important à deux points de vue : premièrement, il semble illustrer le rôle possible du NMD couplé à l’épissage alternatif dans la régulation génique et deuxièmement, la protéine synthétisée pourrait être importante pour la tyrosinémie héréditaire de type I.

Ce travail avait pour objectif i) d'analyser les caractéristiques physiologiques et musculaires(déterminées d'après des biopsies) de rameurs poids légers entraînés, ii) de proposer une méthode de153calcul pour estimer de façon non-invasive la quantité de lactate accumulé dans l'organisme (QTLS) au cours d'un exercice épuisant sur ergomètre aviron d'après la modélisation de la cinétique lactique pendant la récupération et iii) d'explorer l'influence des caractéristiques musculaires, et de l'aptitude à échanger et à éliminer le lactate sur la capacité anaérobie des rameurs appréciée par la mesure du déficit maximal d'O2 cumulé (DMOC).Premièrement, les rameurs étudiés possédaient un rapport masse musculaire - masse corporelle élevé et leurs paramètres physiologiques et musculaires étaient caractéristiques des athlètes spécialisées en endurance.Dans un deuxième temps, nous avons démontré que QTLS était corrélé positivement à DMOC.Cette relation supporte notre hypothèse et confirme la cohérence de la méthode proposée pour calculer QTLS.Dans une dernière étude, les résultats ont démontré que DMOC était corrélée positivement à l'aptitude à éliminer le lactate. Cette dernière était également significativement corrélée à la densité capillaire et au contenu musculaire en MCT4, une protéine impliquée dans le cotransport lactate-proton à travers le sarcolemme.

La toxicité des substances chimiques est difficile à appréhender chez l'homme, en raison de l'absence de modèle in vitro pertinent, notamment pour l'étude des effets induits par des expositions chroniques à de faibles doses et à des mélanges. Le but de ce travail a été de déterminer si les cellules HepaRG, capables de métaboliser des composés chimiques à des niveaux proches de ceux observés dans des hépatocytes humains en culture primaire, pouvaient répondre à un tel besoin. Nous avons tout d'abord montré que ces cellules restent fonctionnellement stables pendant un mois après l'acquisition de leur état de différenciation et qu'elles permettent la détection de dommages à l'ADN induits par des composés promutagènes, grâce aux tests des comètes et du micronoyau. Nous avons étudié les mécanismes impliqués dans la toxicité de l'aflatoxine B1 et d'amines aromatiques hétérocycliques en mélange; et identifié un gène marqueur d'exposition aux génotoxiques, FHIT
The lack of relevant in vitro models makes it challenging prediction of toxicity of chemicals in humans, particularly effects induced by reiterated exposure to low concentrations and mixtures. The present work aimed at determining whether human hepatoma HepaRG cells, which are able to metabolize chemicals to levels close to those found in primary human hepatocytes, could bring answers to these challenges. We first showed that these cells maintained their functional capacity for at least one month after differentiation and were suitable for the detection of DNA damage induced by promutagens using the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays. Then, we have studied mechanisms involved in AFB1 toxicity and identified FHIT tumor suppressor gene as a potent early biomarker for discriminating between genotoxic and nongenotoxic compounds