Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Génotoxines“

Depuis la mise en évidence de trihalométhanes dans les eaux potables en 1974, de multiples travaux ont démontré la présence de nombreux composés génotoxiques dans l'eau de boisson. L'eau potable obtenue à partir d'eau de surface subit un traitement incluant généralement une étape de chloration. Il est aujourd'hui largement admis que l'activité génotoxique des eaux de boisson provient principalement de la chloration des substances humiques, composés organiques naturels contenus dans l'eau brute et issus de la dégradation des déchets animaux et végétaux. Les très faibles concentrations en composés génotoxiques dans les eaux potables nécessitent la concentration des échantillons, procédé qui risque toutefois de modifier la génotoxicité. Plusieurs tests mettant en oeuvre des cellules procaryotes ou eucaryotes, des plantes ou des mammifères, ont permis de mettre en évidence les effets génotoxiques dans des eaux potables chlorées. L'identification des composés génotoxiques est réalisée au moyen des données de la spectrométrie de masse et de la spectroscopie UV ou RMN (proton ou carbone). Ces agents sont généralement non volatils, acides et polaires. Bien que certains composés inorganiques interviennent parfois, la majeure partie de la génotoxicité est attribuée aux agents organohalogénés (bromés ou/et chlorés), les principaux étant les trihalométhanes, acides acétiques, acétonitriles, cétones, et hydroxyfuranones. La fixation de normes contribue à limiter l'exposition des populations aux agents potentiellement dangereux. La qualité des eaux de boisson peut être accrue en utilisant une eau brute moins chargée en matière organique, et en améliorant le traitement chimique tout en veillant à conserver la qualité microbiologique de l'eau produite.

Il est admis aujourd'hui que la génotoxicité identifiée dans les extraits d'eau potable provient principalement de l'action du chlore sur la matière organique naturelle qui donne naissance à des dérivés organohalogénés. Dans le présent travail, nous avons comparé la sensibilité de trois essais de génotoxicité (SOS chromotest, test d'Ames-fluctuation et test micronoyau triton) lors de l'étude de composés organohalogénés, d'acides fulviques chlorés et d'échantillons d'eau (non concentrés) en cours de traitement de potabilisation. Les composés organohalogénés étudiés sont 4 trihalométhanes, 5 acétonitriles et 5 chloropropanones identifiés dans l'eau potable ou dans des solutions de substances humiques chlorées. Les résultats obtenus révèlent que le SOS chromotest est globalement le moins sensible des trois essais et que le test d'Ames-fluctuation et le test micronoyau triton permettent généralement de détecter les plus faibles concentrations de composés génotoxiques. Les essais ont également permis de démontrer que la nature des substituants halogénés (brome ou chlore), le nombre et la position des atomes de chlore influencent notablement la génotoxicité des composés organohalogénés. Toutefois, les résultats obtenus indiquent qu'aucun des trois tests réalisés n'est suffisant à lui seul pour détecter l'ensemble des produits génotoxiques. Ces observations confirment la nécessité de réaliser une batterie de tests qui mette en oeuvre divers types cellulaires et différents systèmes de métabolisation, et détecte divers évènements de génotoxicité. Les travaux portant sur les solutions concentrées d'acides fulviques chlorés montrent l'intérêt des essais sur bactéries (particulièrement le test d'Ames-fluctuation) pour la détection rapide de l'activité génotoxique de ces solutions. L'étude concemant les échantillons d'eau prélevés à différents niveaux d'une station de potabilisation, et analysés sans concentration préalable, indique que le test d'Ames- fluctuation est le seul capable de détecter une activité génotoxique dans les échantillons non concentrés étudiés. On montre, conformément à la littérature, que l'activité mutagène observée résulte de la chloration de l'eau.

Escherichia coli est une bactérie anaérobie facultative commune du microbiote intestinal de l'Homme. Certaines souches de E. coli peuvent être porteuses de l'ilot génomique pks codant pour une machinerie de biosynthèse produisant une génotoxine nommée la colibactine. L'ilot pks est régulé par différents facteurs environnementaux participant au métabolisme de la bactérie tels que le fer, les sources de carbone ou les polyamines. Dans l'intestin, la faible concentration en oxygène est un élément clé qui contribue à l'équilibre des populations microbiennes avec une majorité de bactéries anaérobies strictes. Les E. coli pks+ sont fréquemment associées aux tumeurs de cancer colorectal dans lesquelles la signature mutationnelle de la colibactine a été identifiée. La tumorogénèse est favorisée par les E. coli pks+ dans un contexte inflammatoire de l'intestin. Cet effet négatif pourrait être dû à une rupture de l'anaérobiose intestinale. L'objectif de ma thèse a donc été de déterminer si la production de colibactine pouvait être régulée par la concentration en oxygène. Cette hypothèse était appuyée par l'observation préalable de la sensibilité d'un mutant de la protéine de résistance à la colibactine ClbS lors d'une culture limitée en oxygène. Mes travaux de thèse ont confirmé le rôle de l'oxygène dans la production de colibactine par E. coli pks+ avec un maximum de production en anoxie, qui diminue avec l'augmentation de la concentration en oxygène entrainant une baisse de la génotoxicité sur les cellules eucaryotes. J'ai également établi que cette régulation dépendante de l'oxygène est effectuée par le régulateur transcriptionnel ArcA (Aerobic Respiration Control) qui induit directement le promoteur de clbB. En conclusion, la synthèse de la colibactine est régulée positivement par ArcA activée par de faibles concentrations en oxygène. Ces résultats montrent que la production de colibactine serait favorisée dans l'environnement hypoxique de la lumière intestinale, des tissus infectés et des tumeurs. Cette régulation de la production confèrerait un avantage adaptatif dans la compétition bactérienne mais causerait des dommages collatéraux sur les cellules eucaryotes
Escherichia coli is a common facultative anaerobic bacterium to the human intestinal microbiota. Some E. coli strains may carry the pks genomic island encoding a biosynthesis machinery producing a genotoxin called colibactin. The pks island is regulated by various environmental factors involved in the bacterium's metabolism, such as iron, carbon sources and polyamines. In the intestine, low oxygen concentration is a key factor contributing to the balance of microbial populations with a majority of strict anaerobic bacteria. E. coli pks are frequently associated with colorectal cancer tumours in which the colibactin mutational signature has been identified. Tumorigenesis is favoured by E. coli pks+ in an inflammatory context of the intestine. This negative effect could be due to a breakdown in intestinal anaerobiosis. The aim of my thesis was to determine whether colibactin production could be regulated by oxygen concentration. This hypothesis was supported by the previous observation of the sensitivity of a mutant of the colibactin resistance protein ClbS to oxygen-limited culture. My thesis work confirmed the role of oxygen in colibactin production by E. coli pks+, with production peaking in anoxia and decreasing with increasing oxygen concentration, resulting in reduced genotoxicity on eukaryotic cells. I also established that this oxygen-dependent regulation is carried out by the transcriptional regulator ArcA (Aerobic Respiration Control), which directly induces the clbB promoter. In conclusion, colibactin synthesis is positively regulated by ArcA activated by low oxygen concentrations. These results show that colibactin production is favoured in the hypoxic environment of the intestinal lumen, infected tissues and tumours. This regulation of production would confer an adaptive advantage in bacterial competition but would cause collateral damage to eukaryotic cells

Escherichia coli (E. Coli) est une bactérie commensale qui réside dans le tractus gastro-intestinal des mammifères, principalement au niveau du côlon. Certaines souches de E. Coli sont aussi des pathogènes intestinaux ou du système urinaire voire systémique (souches pathogènes extra-intestinales). Environ 34% des souches commensales de E. Coli du groupe phylogénétique B2 et 53% des souches isolées d'infections extra-intestinales possèdent dans leur génome un îlot génomique " pks " qui code pour la production d'un polyketide-peptide non-ribosomal, la Colibactine. Les souches de E. Coli pks+ provoquent des cassures double-brin de l'ADN (CDB) dans des cellules eucaryotes en culture. Dans mes travaux de thèse, j'ai examiné l'expression et l'activité de la Colibactine in vivo, et étudié les conséquences pour les cellules hôte des dommages à l'ADN infligés par la toxine. J'ai pu montrer dans un modèle murin d'anses ligaturées du côlon, avec un système rapporteur GFP, que les gènes de l'îlot pks étaient bien exprimés in vivo. En utilisant comme marqueur des CDB l'histone H2AX phosphorylée (gamma-H2AX), j'ai démontré la présence de ces lésions dans les cellules épithéliales du côlon après l'injection d'une E. Coli pks+ mais pas après l'injection d'un mutant isogénique déficient pour la production de Colibactine. Ces résultats ont été confirmés avec un autre modèle murin dans lequel les souris étaient traitées par des antibiotiques puis gavés avec les E. Coli pks+. Pour examiner les conséquences des dommages à l'ADN infligés par la Colibactine, j'ai utilisé un modèle de cellules en culture infectées avec les E. Coli pks+ à une dose infectieuse comparable à celle qui peut avoir lieu in vivo. Les cellules exposées aux faibles doses de bactéries (1 à 20 bactéries/cellule) produisant la Colibactine répondaient aux dommages à l'ADN de façon transitoire et réversible, puis ces cellules poursuivaient leurs divisions. Toutefois, une fraction de ces cellules en mitose montrait des signes de persistance des CDB, des ponts anaphasiques et des micronoyaux. Ceci entrainait des aberrations chromosomiques (translocations, anneaux, dicentriques), ainsi que de l'aneuploïdie / tétraploïdie. .
Escherichia coli (E. Coli) is a commensal bacterium that inhabits the mammalian gastrointestinal (GI) tract, especially the colon. Some E. Coli strains are pathogenic, infecting the GI tract, or extra-intestinal tissues. Up to 34% of commensal strains of phylogenetic group B2 and 53% of E. Coli strains isolated from extra-intestinal infections have in their genome the genomic island "pks", which codes for the production of a non-ribosomal polyketide-peptide hybrid compound, called Colibactin. E. Coli pks+ strains cause DNA double strand breaks (CDB) in cultured eukaryotic cells. During my thesis, I examined the in vivo expression and activity of Colibactine, and studied the consequences of Colibactin-inflicted CDB in infected cells. I showed in a colon loop mice model, using a GFP reporter system, that the pks genes were expressed in vivo. Using the phosphorylated histone H2AX (gamma-H2AX) as a marker of CDB, I showed that Colibactin inflicted CDBs in colonocytes following injection of a E. Coli pks+ strain, but not an isogenic mutant impaired for Colibactin production. These results were confirmed using an antibiotic-treated mice model in which animals were fed per os with the strains after five days of antibiotic treatment. In order to study the consequences of this genotoxic exposure, I used various cultured cell lines that were infected in vitro with infection doses relevant to what can occur in vivo. Cells exposed to low dose infections (1 - 20 bacteria/cell) showed a transient DNA damage response followed by cell division. .

En présence de lésions de l'ADN ou de perturbations dans la phase de réplication ou encore dans l'attachement des microtubules aux centromères pendant la mitose, les cellules de S. Pombe comme toutes les cellules eucaryotes, induisent l'activation du système de surveillance de la réparation, de la réplication et du fuseau mitotique. La fonction de ces systèmes de surveillance est d'inhiber ou de ralentir la progression du cycle cellulaire si une anomalie dans un de ces processus cellulaires est détectée. Ceci permettra à la cellule de résoudre le problème rencontré sans que la transmission de l'information génétique d'une cellule mère aux cellules filles soit mise en péril. . Au cours de mon travail de thèse, j'ai étudié, d'une part l'allèle Dset1 de S. Pombe, déficient dans la méthyltransferase spécifique de la lysine 4 de l'histone H3, en analysant l'effet de mutations des gènes checkpoint en réponse à différents traitements génotoxiques de la souche Dset1. D'autre part, je me suis intéressée à la caractérisation d'une nouvelle fonction de la protéine Crb2 de S. Pombe. La protéine Crb2 est la protéine nécessaire pour l'activation de la kinase Chk1 en réponse à l'activation du checkpoint de la réparation. Dans cette activation elle joue le rôle de protéine adaptatrice, permettant le recrutement de Chk1 à proximité de la kinase Rad3 afin que la phosphorylation de Chk1 par Rad3 soit efficace. Crb2 est aussi nécessaire pour la survie cellulaire en réponse à l'exposition chronique à l'hydroxyurée ou en cas d'inhibition des ADN polymérases
The appearance of DNA lesions or problems during the replicative phase or during microtubule attachment to centromeres during mitosis in Schizosacharomyces pombe, like in all other eucaryotes, all result in the activation of checkpoint systems responsible for DNA repair, and for correct DNA replication and mitotic spindle assembly. When anomalies in one of these cellular processes are detected, the different checkpoint systems can nhibit or retard cell cycle progression, thus allowing the cell machinery to repair the problem encountered without affecting the transmission of genetic information to the daughter cells. During my PhD, I have studied, on one hand, the Dset1 allele of S. Pombe, an allele which is deficient in methyltransferase activity towards lysine 4 of the histone H3. More specifically, I have studied the effect of mutations in checkpoint genes on the response of the Dset1 strain to different genotoxic treatments. I have also investigated a new function assigned to the Crb2 protein of S. Pombe. This protein is essential for the activation of the Chk1 kinase after induction of the DNA repair checkpoint. In this pathway Crb2 plays the role of an adapter, recruiting Chk1 to the vicinity of the Rad3 kinase, thus enhancing Chk1 phosphorylation by Rad3. The Crb2 protein is also necessary for cell survival in response to chronic exposure to hydroxyurea or to DNA polymerase inhibition

La peau étant le premier tissu exposé aux diverses agressions de l’environnement extérieur, les cellules qui la composent doivent disposer de mécanismes de protection vis-à-vis de ces agressions, afin d’assurer le maintien de l’homéostasie tissulaire. Les cellules souches de l’épiderme assurant le renouvellement du compartiment épithélial pendant toute la vie de l’individu, la préservation de l’intégrité de leur génome est essentielle à la fonctionnalité pérenne de la peau. Mon doctorat avait pour objectif d’explorer les mécanismes mis en œuvre par les cellules souches de l’épiderme interfolliculaire afin de se protéger de deux stress génotoxiques radiatifs, à savoir : les rayonnements gamma et les rayonnements ultraviolets B (UVB). Durant mon doctorat, j’ai tout d’abord participé à la démonstration des mécanismes de protection mis en œuvre par les cellules souches des kératinocytes après irradiation ionisante. En effet, il a été montré que ces cellules sont capables de réparer très rapidement l’ensemble des dommages de l’ADN radio-induits, et que cette réparation était activée par le facteur de croissance FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2). Afin de savoir si ce mécanisme de protection était aussi opérant dans les cellules souches de carcinome cutané, nous l’avons recherché dans la sous-population de cellules souches qui peut être isolée d’une lignée de carcinome cutané humain. Comme dans le cas des cellules souches normales, nous avons montré que les cellules souches de cancer présentent une réparation très rapide des dommages de l’ADN radio-induits. De plus, le facteur de croissance FGF2 participe à cette réparation, notamment par la présence d’isoformes de ce facteur dans le noyau cellulaire. Le second projet de mon doctorat avait pour objectif l’étude de la réponse des cellules souches et des progéniteurs de l’épiderme humain aux rayonnements UVB. Une fois mises en place les conditions de tri en cytométrie de flux et d’irradiation par les UVB, la toxicité de ces rayonnements a été évaluée dans un modèle cellulaire primaire. Nous avons caractérisé les effets des photons UVB sur la viabilité et la prolifération cellulaire et étudié la réparation des dommages de l’ADN. Cette étude nous a permis de mettre en évidence des réponses aux UVB différentes entre les cellules souches et leur descendance immédiate, les kératinocytes progéniteurs, notamment au niveau de l’activité de réparation des dommages de l’ADN. Par ailleurs, une étude du transcriptome des cellules irradiées a été réalisée, qui permet d’analyser les mécanismes globaux communs et spécifiques de réponse au stress dans les deux populations. L’ensemble des données obtenues nous permet de proposer plusieurs mécanismes de protection, communs et spécifiques, mis en œuvre par les cellules souches de l’épiderme en réponse aux stress radiatifs UVB et gamma
Human skin is the first organ exposed to various environmental stresses, which requires the development by skin stem cells of specific mechanisms to protect themselves and to ensure tissue homeostasis. As stem cells are responsible for the maintenance of epidermis during individual lifetime, the preservation of genomic integrity in these cells is essential. My PhD aimed at exploring the mechanisms set up by epidermal stem cells in order to protect themselves from two genotoxic stresses, ionizing radiation ( Gamma Rays) and ultraviolet radiation (UVB). To begin my PhD, I have taken part of the demonstration of protective mechanisms used by keratinocyte stem cells after ionizing radiation. It has been shown that these cells are able to rapidly repair most types of radiation-induced DNA damage. Furthermore, we demonstrated that this repair is activated by the fibroblast growth factor 2 (FGF2). In order to know if this protective mechanism is also operating in cutaneous carcinoma stem cells, we investigated the response to gamma Rays of carcinoma stem cells isolated from a human carcinoma cell line. As in normal keratinocyte stem cells, we demonstrated that cancer stem cells could rapidly repair radio-induced DNA damage. Furthermore, fibroblast growth factor 2 also mediates this repair, notably thanks to its nuclear isoforms. The second project of my PhD was to study human epidermal stem cells and progenitors responses to UVB radiation. Once cytometry and irradiation conditions were set up, the toxicity of UVB radiation has been evaluate in the primary cell model. We then characterized UVB photons effects on cell viability, proliferation and repair of DNA damage. This study allowed us to bring out that responses of stem cells and their progeny to UVB are different, notably at the level of part of their repair activity of DNA damage. Moreover, progenitors and stem cells transcriptomic responses after UVB irradiation have been study in order to analyze the global mechanisms of stress response in the two cell populations. Taken together, data obtained during my PhD allowed us to show that stem cells respond differently than keratinocyte progenitors to radiation stress, and that they developed both intrinsic and radiation-induced strategies allowing a better protection. When comparing gamma Rays and UVB, we found that, although their toxic effects on skin share many similarities, the mechanisms set up by human epidermal stem cells to protect themselves vary according to the type of radiation stress

Les amines hétérocycliques aromatiques (AHA), sont des contaminants environnementaux majoritairement présents dans la viande cuite et la fumée de cigarette. Ils sont classés cancérogènes possibles et probables pour l'homme et pourraient être impliqués dans l'augmentation de l'incidence de certains cancers. Aujourd'hui, il s'avère nécessaire de préciser le risque que ces contaminants représentent pour l'homme. Dans ce but, la caractérisation de leur potentiel génotoxique via la formation des adduits à l'ADN et l'étude de leurs voies de bioactivation ont été tout d'abord réalisées dans des hépatocytes humains en culture primaire, puis étendues à un modèle extra-hépatique, les lymphocytes humains. Notre étude montre que les AHA forment des niveaux d'adduits à l'ADN élevés et comparables à ceux formés par le cancérogène humain 4-ABP. Ces niveaux sont 10 à 100 fois plus élevés dans les hépatocytes humains que dans ceux de rat. Les lymphocytes peuvent aussi bioactiver les AHA en des composés capables de former des adduits à l'ADN. Cette étude confirme que les AHA sont activées chez l'homme de façon importante par l'intermédiaire de voies métaboliques spécifiques ce qui peut expliquer les différents niveaux de dommages observés chez l'homme. L'implication des tissus extra-hépatiques dans cette activation reste à poursuivre. Comme selon nos résultats, les adduits à l'ADN sont formés à des niveaux d'expositions faibles et sont persistants, ces contaminants représentent bien un danger pour l'homme qui serait sous-estimé par les études chez l'animal
Heterocyclic aromatic amines (HAA) are environmental contaminants most abundant in cooked meat and cigarette smoke. They are classified by the IARC as possible and probable human carcinogens and are likely to be involved in the increase in the incidence of several cancers. Today, it is essential to precise the human health risk associated with them. In this aim, the characterization of their genotoxic potential through DNA adducts formation and the study of their bioactivation pathways were first performed in human hepatocytes in primary culture, and extended to an extra-hepatic model: the human lymphocytes. Our study showed that HAA formed high levels of DNA adduct, comparable to those formed by the human carcinogen 4-aminobiphenyl. They were also 10 to 100 times higher in human hepatocytes than those formed in rat. Lymphocytes can also activate HAA into DNA reactive compounds to form adducts. This study confirmed that HAA are greatly bioactivated in humans through specific metabolic pathways which could explain the different levels of damage observed in humans. The involvement of extra-hepatic tissues in this activation requires further studies. As according to our results, the DNA adducts are formed at low levels of exposure and are persistent, these contaminants are potentially harmful in humans and the associated danger could be underestimated in animal studies

Les cellules sont en permanence soumises à des stress génotoxiques induisant des dommages de leur ADN. Elles ont mis en place des mécanismes spécifiques pour détecter ces dommages, signaler leur présence et les réparer. Ce travail a pour but de mieux comprendre les mécanismes de couplage entre la signalisation des dommages de l’ADN et l’assemblage de la chromatine (complexe protéique qui protège et régule l’accessibilité de l’ADN). Il s’intéresse plus particulièrement à deux protéines multifonctionnelles: la kinase Rad53, qui orchestre la réparation des dommages de l’ADN et la division cellulaire, et Asf1, un chaperon d’histones impliqué dans l’assemblage de la chromatine. Par une approche couplant biochimie et biologie structurale, nous avons caractérisé in vitro le mode d’interaction entre Asf1 et les histones et, entre Asf1 et Rad53. Cette étude est associée à l’analyse du rôle fonctionnel de ces interactions in vivo dans les cellules de levure.

Le développement et l'augmentation constante des systèmes de télécommunication s'accompagnent de nombreuses questions, en particulier sur le risque sanitaire et oncogène des radiofréquences. La cancérogenèse est un processus multi-étape lié à l'accumulation d'anomalies génétiques dans des régions critiques du génome. Ces lésions génomiques sont généralement détectées et réparées par les cellules. Des erreurs ou défauts de réparation peuvent conduire à des instabilités génomiques pouvant initier un processus cancérogène. Notre travail a porté sur l'étude des effets génotoxiques des radiofréquences utilisées par la téléphonie mobile (GSM-900) sur des amniocytes humains. Les cellules ont été exposées in vitro pendant 24 heures à des ondes GSM-900 dans une cellule fil-plaque. La génotoxicité a été évaluée selon différentes approches (1) étude des remaniements chromosomiques et des aneuploïdies à l'aide du caryotype en bandes R (DAS moyen de 0,25 W/kg) et de la FISH (DAS moyens de 0,25 ; 1 ; 2 et 4 W/kg), (2) étude de l'expression et de l'activation de protéines impliquées dans les voies de signalisation des lésions de l'ADN telles que l'activation de p53 et H2AX par western blot (DAS moyens de 0,25 ; 1 ; 2 et 4 W/kg) et (3) étude de certaines réponses cellulaires aux lésions de l'ADN comme l'apoptose par détection du clivage de la caspase 3 par western blot (DAS moyens de 0,25 ; 1 ; 2 et 4 W/kg). Les résultats obtenus ne montrent pas d'effet génotoxique significatif des radiofréquences de type GSM-900 sur des amniocytes humains exposés pendant 24 heures quels que soient la méthode utilisée et le niveau de puissance testé. Ces résultats semblent en adéquation avec la majorité des études publiées dans la littérature
With the ever-increasing growth of the telecommunication industry come the accompanying questions as to the health and oncogenic risk of radiofrequencies. Cancerogenesis is a multi-step process linked to the accumulation of genetic abnormalities in critical regions of the genome. This genomic damage is generally detected and repaired by the cells. Errors or faulty repairs can lead to genomic instability, which can initiate a cancerogenic process. Our study focused on the genotoxic effects of radiofrequencies used by cellular phones (GSM-900) on human amniocytes. Cells were exposed in vitro for 24 hours to GSM-900 waves in a wire-patch cell. The genotoxicity was evaluated using three different approaches. 1) The study of chromosomal aberrations and aneuploidies by using R-banded karyotype (average SAR value of 0. 25 W/kg) and FISH (average SAR values of 0. 25 ; 1 ; 2 ; and 4 W/kg). 2) The study of the expression and activation of proteins involved in the DNA damage signaling pathway, such as the activation of p53 and H2AX, using western blot (average SAR values of 0. 25 ; 1 ; 2 ; 4 W/kg). 3) The study of certain cellular responses to DNA damage, such as apoptosis, by detecting the cleaving of caspase 3 using western blot (average SAR values of 0. 25 ; 1 ; 2 ; 4 W/kg). The results showed that there was no significant genotoxic effect on the human amniocytes that were exposed for 24 hours to radiofrequencies of the GSM-900. These results seem to be in agreement with the majority of the previously studies published on this topic

Les recherches effectuées dans le cadre de cette thèse visent à évaluer l'impact biologique des flashs de contaminations d'origine agricole associés aux crues. Dans un premier temps, nous avons cherché à évaluer les effets génotoxiques de tels événements. Ces mesures renseignent sur des effets précoces et pertinents écologiquement. Après avoir optimisé et validé le test micronoyaux dans nos conditions expérimentales, nous l'avons utilisé conjointement avec l'essai comète pour tester le potentiel génotoxique de 3 conditions hydrologiques contrastées. Il a ainsi été mis en évidence une plus grande génotoxicité de l'eau de la Save prélevée lors d'une crue de printemps par rapport à une crue d'hiver ou un débit de base. Ces résultats ont ensuite été confrontés avec ceux observés lors d'expositions à des mélanges expérimentaux reconstituant les contaminations observées dans le milieu. Les effets génotoxiques des mélanges d'herbicides ont été confirmés, et la complexité des mécanismes induisant la toxicité lors des épisodes de crues a été mise en évidence. Dans un second temps, afin de caractériser la contamination des organismes lors des épisodes de crue, un protocole d'extraction et d'analyse des herbicides accumulés dans les tissus de poissons a été évalué
This study aims at evaluating the biological impact of transient agricultural contamination events associated with floods. First, we investigated the genotoxic impact of such contamination events. These measures provide early and ecologically relevant data. Then, after the optimization and validation of the micronucleus assay in our experimental conditions, this test has been used together with the comet assay in order to test the genotoxic potential of 3 contrasted hydrological conditions. Spring flood water has been found to be more genotoxic than winter flood water or water sampled during the basal flow. These results have been compared with those of exposure to experimental mixtures, mimicking field contamination. The genotoxic potential of herbicides mixture has been confirmed, and the complexity of the processes inducing the toxicity during flood events has been highlighted. Second, in order to investigate the contamination pattern during flood events, a protocol allowing the extraction and quantification of the herbicides accumulated in fish tissues has been evaluated

La plupart des gènes humains codants génèrent des transcrits alternatifs (isoformes) par épissage alternatif (alternative splicing, AS) et polyadénylation alternative (APA) en général dans la région codante et la région 3’ non traduite (3’UTR), respectivement. Le rôle de l’AS et la 3’UTR-APA est de plus en plus reconnu dans l’oncogenèse. En particulier, des réseaux d’AS connectant des facteurs d’épissage et des variants d’épissage ont récemment été identifiés. L’AS est aussi largement régulé par les agents anticancéreux génotoxiques, tel que la doxorubicine et le cisplatine (induisant des différents types de lésions sur l’ADN), qui sont régulièrementt utilisés dans les traitements du cancer du sein et du poumon non-à-petites-cellules (non-small-cell lung cancer, NSCLC), respectivement. Étant donné l’apparition fréquente de résistances aux chimiothérapies, comprendre les mécanismes sous-jacents est crucial pour surmonter ce problème clinique. Il existe des exemples d’évènements d’AS associés à la résistance aux agents anticancéreux, mais l’implication des facteurs d’épissage et des réseaux d’AS est très peu connue. De plus, une étude précédente a démontré que la doxorubicine réprime un grand groupe d’exon terminaux alternatifs (alternative last exons, ALE), qui correspondent à l’utilisation de sites de polyadénylation introniques (intronic polyadenylation, IPA). Les ALEs ont un rôle émergent dans le cancer, mais on ne sait encore que très peu sur leur régulation par d’autres agents anticancéreux, tel que le cisplatine. Afin de mieux comprendre le rôle des régulations d’AS et d’APA dans la réponse et la résistance cellulaire à la chimiothérapie, mon projet de thèse avait deux objectifs principaux : 1) déterminer l’étendue, les réseaux régulateurs, et les fonctions des régulations d’AS dans la résistance à la doxorubicine des cellules de cancer du sein, et 2) déterminer l’étendue, les mécanismes, et l’impact des régulations d’ALE en réponse au cisplatine dans des cellules de NSCLC. Dans la première partie, j’ai identifié par RNA-seq des milliers d’évènements d’AS et des dizaines de facteurs d’épissage régulés dans un modèle cellulaire de cancer du sein ER+ résistant à la doxorubicine. Par un miniscreen siARN, j’ai identifié deux facteurs, ZRANB2 et SYF2, impliqués dans la résistance à la doxorubicine. D’autres analyses RNA-seq ont révélé les évènements d’AS régulés par ces deux facteurs peu étudiés, ainsi que leur convergence vers l’exon 5 alternatif de l’oncogène ECT2. La déplétion de ZRANB2, SYF2, et du variant ECT2-ex5 réduit l’arrêt en phase S induit par la doxorubicine et la résistance des cellules. De plus, un niveau élevé d’inclusion de l’exon 5 d’ECT2 corrèle avec une mauvaise survie spécifiquement de patientes ER+ traitées par chimiothérapie. Dans la deuxième partie, j’ai identifié par 3’-seq que le traitement cisplatine (mais pas oxaliplatine) induit des ALEs/IPAs dans des milliers de gènes enrichis en gènes de cycle et de mort cellulaire. Cet effet est lié à une inhibition de la processivité de l’élongation dans les longs gènes. Une analyse 3’-seq sur polysomes m’a permis de montrer que ces régulations d’ALEs impactent le traductome, et a révélé un groupe d’isoformes particulièrement courtes peu efficacement traduites, dont un transcrit connu avec une fonction non-codante. En conclusion, j’ai pu identifier durant ma thèse un nouveau réseau d’AS impliqué dans la résistance à la doxorubicine des cancers du sein ER+, et une importante régulation d’ALEs impactant le traductome en réponse au cisplatine dans des cellules NSCLC. Ces travaux améliorent notre compréhension du rôle de l’AS et des ALE/IPA dans la réponse et la résistance cellulaire à la chimiothérapie anticancéreuse. Au plus long terme, les transcrits alternatifs et les régulateurs identifiés constituent des biomarqueurs candidats de chimiorésistance
Most human coding genes generate alternative transcripts (isoforms) through alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA), most often within the coding region and the 3’ untranslated region (3’UTR), respectively. Both AS and 3’UTR-APA regulations have been increasingly involved in oncogenesis. In particular, AS networks connecting oncogenic splicing factors and oncogenic splicing variants have been recently identified. AS is also widely regulated by genotoxic anticancer drugs, like doxorubicin and cisplatin that induce different types of DNA lesions and are widely used in breast cancer and non-small-cell lung cancer (NSCLC) therapy, respectively. Given the frequent occurrence of resistance to chemotherapy, understanding the underlying mechanisms is crucial to overcome this major issue. There are examples of AS events associated with anticancer drug resistance, but very little is known about the splicing factors and therefore the AS networks involved. In addition, a previous study showed that doxorubicin represses a large set of alternative last exons (ALE) corresponding to the use of intronic polyadenylation (IPA) sites. ALEs have an emerging role in cancer, but little is known about its regulation by other anticancer drugs, like cisplatin. In order to better understand the role of AS and APA regulation in cell response and resistance to chemotherapy, my PhD project had two main aims: 1) determine the extent, regulatory networks and function of AS regulation in breast cancer cell resistance to doxorubicin, and 2) determine the extent, mechanism and impact of ALE regulation in response to cisplatin in NSCLC cells. In the first part, I identified by RNA-seq thousands of AS events and dozens of splicing factors regulated in a cell model of acquired resistance to doxorubicin in ER+ breast cancer. Through an siRNA miniscreen, I found two splicing factors, ZRANB2 and SYF2, involved in doxorubicin resistance. Further RNA-seq analyses revealed the AS events regulated by depletion of these poorly characterized splicing factors, and their convergence on the alternative exon 5 of the oncogene ECT2. Depletion of ZRANB2, SYF2 and the ECT2-Ex5 variant reduces doxorubicin-induced S phase arrest and doxorubicin resistance. In addition, high inclusion levels of ECT2-Ex5 correlate with poor survival specifically in ER+ breast cancer treated with chemotherapy. In the second part, I found by 3’-seq that in NSCLC cell treatment with cisplatin (but not oxaliplatin) induces ALE/IPA in thousands of genes enriched in cell cycle and cell death. This effect is linked to an inhibition of transcription elongation processivity in long genes. 3’-seq analysis on polysomes showed that this ALE regulation impacts the translatome, and revealed a set of particularly short isoforms that were inefficiently translated, including a transcript with a non-coding function. In conclusion, during my thesis, I could identify a novel AS network involved in doxorubicin resistance in ER+ breast cancer, and widespread ALE regulation impacting the translatome in lung cancer cisplatin response. This work increases our understanding of AS and IPA role in cell response and resistance to anti-cancer chemotherapy. In the longer term, the identified alternative transcripts and regulators constitute candidate biomarkers of chemoresistance