Dissertationen zum Thema „Évolution bactérienne“

Les êtres vivants sont confrontés à des parasites qui diminuent leur fitness et se répandent dans la population. En réponse, les hôtes ont développé de nombreuses défenses immunitaires qui sont souvent mises en défaut par l'évolution des parasites. Ces défenses sont de plus souvent extrêmement diversifiées génétiquement. Quel est donc l'apport de la diversité génétique des défenses contre l'évolution des parasites ? Répondre à cette question expérimentalement nécessite un système biologique pour lequel on peut étudier la diversité génétique de l'hôte et l'évolution et la propagation du parasite. Les systèmes bactéries/phages sont de bons candidats pour une telle étude : leur manipulation au laboratoire est aisée, leurs cycles de vie sont rapides et ils ont de forts taux de mutation. La découverte récente de l'immunité CRISPR--Cas a ouvert de nombreuses possibilités : cette dernière a la propriété unique de générer dans le même fond génétique que l'hôte sensible de nombreux allèles de résistance. De plus, son mécanisme de fonctionnement reposant sur une interférence à ARN, la cible d'une résistance est très précisément connue ainsi que les possibilités de la contourner. Ce système permet donc l'étude expérimentale de l'impact de la diversité génétique sur la propagation et l'évolution des parasites, et sur la co-évolution antagoniste. Dans cette thèse, nous cherchons à 1) déterminer l'impact de la composition de la population d'hôtes sur la probabilité qu'une épidémie créée par un virus mutant ait lieu (émergence évolutive), 2) expliciter les causes de l'hétérogénéité de durabilité des résistances et 3) étudier la dynamique co-évolutive entre population génétiquement diversifiée d'hôtes et de parasites. Nous montrons que la composition de la population d'hôtes module fortement la probabilité d'émergence évolutive : une faible diversité génétique associé à un taux intermédiaire d'hôtes sensibles maximisant la probabilité d'émergence évolutive. Dans un second temps, nous montrons que l'immunité CRISPR génère des résistances dont la durabilité est hétérogène et cette hétérogénéité ne peut pas être expliquée par une hétérogénéité des fitness des mutants contournant CRISPR. Enfin, nous montrons que la diversité des résistances est maintenue à court terme par l'hétérogénéité des populations de parasites et que la dynamique co-évolutive est accélérée en présence d'une population génétiquement diverse. Enfin, nous proposons des pistes de recherche qu'il nous parait intéressant d'étudier dans le futur
Living organisms face parasites which decrease their fitness and spread into their population. In response, hosts have evolved countless immune defenses that are often circumvented by parasite evolution. These defenses are usually extremely diverse. What is the impact of such genetic diversity on the protection against the evolution of parasites? Answering this question experimentally requires an experimental system in which host genetic diversity and parasite evolution and spreading can be monitored. Phages and bacteria systems are ideal candidates for such studies as their handling is easy in the lab, their life cycle is short and their mutation rates is high. The recent discovery of CRISPR--Cas immunity has opened many possibilities. Indeed, this immunity has the unique property to generate in the same genetic background as the sensitive host, numerous resistant alleles. In addition, it relies on an interference--RNA-like pathway, which results in the precise understanding of phage bypassing and in the ability to predict the targeted sequence. This system hence allows the experimental study of the impact of host genetic diversity on the epidemiology and the evolution of parasites and on antagonist coevolution. In this PhD, we 1) study how the host population composition impacts the probability of an epidemic created by an escape mutant (evolutionary emergence), 2) try to understand the causes of the heterogeneity in durability of resistances and 3) monitor the coevolution dynamic between genetically diverse populations. We show that the composition of the host population impacts the probability of evolutionary emergence: a low resistances diversity with an intermediate proportion of sensitive hosts maximises the probability of evolutionary emergence. Second, we show that CRISPR--Cas resistances are heterogeneous in their durability and this is not explained by the heterogeneity of escape mutants fitness. Third, we show that resistances diversity is conserved in a short term by parasites genetic diversity and that the coevolutionary dynamic is fastened by parasite intra-specific genetic diversity. Finally, we discuss research questions that we find interesting to develop in the near future

Le genre Bordetella comporte à l’heure actuelle neuf espèces, majoritairement responsables d’infections respiratoires. B. pertussis, agent de la coqueluche, est le modèle de travail de cette thèse avec d’autres espèces telles que B. holmesii et B. avium. Les endotoxines bactériennes sont les composants essentiels de la membrane externe des bactéries à Gram-négatif. Du point de vue chimique, ce sont des lipopolysaccharides (LPS) qui provoquent un grand nombre de désordres physiopathologiques allant de la simple fièvre, à faible dose, jusqu’au choc endotoxinique mortel, à forte dose. L’analyse structurale des LPS de Bordetella est la spécialité majeure du laboratoire et la structure des endotoxines de la plupart des espèces de ce genre y a été décrite. Il est admis que le lipide A, qui constitue la région hydrophobe des LPS, est responsable de la majorité des activités biologiques de ces molécules. Ainsi, la moindre variation structurale de ces molécules a une répercussion importante sur la reconnaissance hôte-pathogène, les activités biologiques et la virulence bactérienne. A titre d’exemple, il a été mis en évidence que la modification spécifique, par substitution des groupes phosphate du lipide A, avec de la glucosamine, jouait un rôle majeur dans la modulation de la réponse immunitaire. Cette originalité structurale qui a été mise en évidence dans notre équipe chez B. avium, B. bronchiseptica puis chez B. pertussis; elle semble être un trait spécifique des Bordetelles. Il faut savoir que la coqueluche fait des ravages dans les pays sous-développés et touche les nouveau-nés dans de nombreux pays, comme la France, d’une maladie infectieuse mortelle dans les cas graves. Le vaccin qui ne peut être injecté qu’à l’âge de 2-3 mois et dont les rappels ne sont pas régulièrement suivis est imparfait. Les spécialistes du domaine ont reconnu qu’un complément antigénique serait nécessaire pour le rendre plus efficace. Au cours de cette thèse, nous avons analysé la structure des LPS d’isolats cliniques de B. pertussis afin d’étudier leur évolution et leur adaptation avec le temps ainsi que leur application vaccinale potentielle. De plus, concernant deux souches de B. pertussis, BP338 et BP18-323 nous avons contribué à la mise en évidence de nouveaux gènes impliqués dans la biosynthèse de la GlcN substituant les groupes phosphate de la région lipidique et à expliquer la différence de longueur du seul acide gras distinct entre les deux souches. L’étude de l’influence de ces éléments structuraux sur l’activation du complexe, TLR4/MD-2 apporte de nouveaux éclairages sur les interactions entre les lipides A et ce récepteur. Nos études sur les isolats cliniques de B. holmesii, pathogène opportuniste responsable d’affections de type coqueluche, montrent une grande hétérogénéité structurale du lipide A au sein d’un même isolat. Nous avons montré dans cette souche la présence d’un marqueur spécifique des souches de Bordetella, il s’agit d’un acide gras présent uniquement chez les lipides A des isolats humains. Nos travaux effectués sur des isolats cliniques de B. pertussis appartenant aux ères pré- et post-vaccinales et provenant de différents pays, montrent une perte du matériel génétique avec une déficience de certains antigènes majeurs. Nous avons démontré, via des méthodes physico-chimiques, que ces modifications ne concernaient pas les LPS de ces isolats. La stabilité de ces antigènes ainsi que nos méthodes de purification, nous permettent de proposer que ces LPS détoxifiés soient de bons candidats pour améliorer l’efficacité des vaccins coquelucheux acellulaires. Enfin, toutes les études structurales présentées dans cette thèse ont permis de mieux comprendre la régulation de certains gènes en réponse à un stress extérieur. Elles participent, sur l’exemple d’un pathogène majeur, au déchiffrage des mécanismes moléculaires qui mènent à la virulence et à l’adaptation bactérienne
The Bordetella genus is actually composed of nine species responsible for respiratory infections. B. pertussis, the agent of whooping cough, is the main model of this thesis along with other species such as B. holmesii and B. avium. Bacterial endotoxins are the major components of Gram-negative bacteria external membrane. From a chemical point of view, they are lipopolysaccharides (LPS) causing a high number of pathophysiological disorders ranging from low fever at weak doses, to lethal endotoxic choc at high ones. Structural analysis of the Bordetellae LPS is the major specialty of our group where the endotoxin structures of most species of the genus were described. It is well-known that lipid A, which constitutes the hydrophobic moiety of LPS, is responsible for the majority of biological activities of these molecules. Thus, any structural change of these molecules has an important impact on host-pathogen recognition, biological activities and bacterial virulence. For example, it has been demonstrated that the specific modification by grafting glucosamine on lipid A phosphate groups plays a major role in modulating the immune response. This structural peculiarity was highlighted by our team first in B. avium, B. bronchiseptica then in B. pertussis; it seems to be a unique trait of Bordetella. It should be noted that pertussis wreaks havoc in developing countries and affects newborns in several others, including France, where this infectious disease causes a significant death toll. The vaccine, which cannot be injected before the age of 2-3 months, could be improved and boosters are not regularly monitored. Experts in the domain have recognized the lack of an antigenic complement to make it more effective. In this thesis, we analyzed the structure of LPS from B. pertussis clinical isolates to study their evolution and adaptation over time along with their potential use in the design of new vaccines. In addition, regarding two strains of B. pertussis, BP338 and BP18-323, we have contributed to the identification of new genes involved in the biosynthesis of GlcN substituting the phosphate groups of the lipid moiety, which helped explaining the difference in the length of the single fatty acid differing between the two strains. The analysis of the influence of these structural elements on the activation of the receptor complex, TLR4/MD-2 sheds new light on the interactions between lipids A and this receptor. Our studies on clinical isolates of B. holmesii, an opportunistic pathogen responsible for pertussis-like illness, show great structural heterogeneity in the lipid A of these isolates. We showed the presence of a specific marker of Bordetella species, namely a fatty acid present only in the lipid A of human isolates. Our works on B. pertussis clinical isolates belonging to pre- and post-vaccine eras and coming from different countries show a loss of genetic material with a deficiency in certain major antigens. We have demonstrated, via physico-chemical methods, that these modifications did not affect the LPS of these isolates. The stability of these antigens and our ability to purify them, allow us to propose that detoxified LPS could be good candidates for improving the effectiveness of acellular pertussis vaccines. Finally, all structural studies presented in this thesis have provided insight into the regulation of certain genes in response to external stress. Our compiled work on a major pathogen is an important step in deciphering the molecular mechanisms leading to bacterial virulence and adaptation

Les processus d'innovation moléculaire nécessitent le bricolage moléculaire et la cooptation des gènes existants. Mais ce processus reste mal compris sur de longues échelles évolutives. J’ai analysé durant cette thèse l'histoire évolutive d'un vaste groupe de systèmes moléculaires membranaires associés aux bactéries et aux archées - la superfamille des filaments de type IV (TFF-SF) - qui se sont diversifiés dans les systèmes impliqués dans la motilité flagellaire ou par contraction, l'adhésion, la sécrétion de protéines, la transformation naturelle... J’ai développé des outils et méthodes qui m’ont permis d’identifier ces systèmes dans tous les phyla de deux des domaines du vivant, et leur phylogénie suggère qu'ils pourraient avoir été présents dans le dernier ancêtre commun universel. La TFF-SF c’est ensuite diversifiée par de multiples duplications de gènes, une fission du gène de la plateforme membranaire intégrale, et l'accrétion de nouveaux composants. La phylogénie et le contenu des systèmes ancestraux suggèrent que les pili bactériens initiaux étaient impliqués dans la motilité cellulaire et/ou la transformation de l'ADN. En revanche, les systèmes spécialisés de sécrétion de protéines sont apparus beaucoup plus tard. Tous ces processus de diversification fonctionnelle se sont accompagnés de réarrangements génétiques ayant des implications sur la régulation génétique et le transfert horizontal de gènes. Dans l'ensemble, l'histoire de l'évolution de la TFF-SF fournit à elle seule un catalogue impressionnant de la variété des mécanismes moléculaires impliqués dans l'origine des nouvelles fonctions par bricolage et cooptation des machines cellulaires
Process of molecular innovation require tinkering and the co-option of existing genes. But this process remains poorly understood on long evolutionary scales. During this thesis, I analyzed the evolutionary history of a large group of molecular membrane systems associated with bacteria and archaea - the superfamily of type IV filaments (TFF-SF) - that have diversified into systems involved in flagellar or contraction motility, adhesion, protein secretion, natural transformation.... I have developed tools and methods that have allowed me to identify these systems in all phyla of two of the kingdoms of life, and their phylogeny suggests that they may have been present in the last universal common ancestor. TFF-SF was then diversified by multiple gene duplications, fission of the gene from the integral membrane platform, and accretion of new components. Surprisingly, I found that Tad systems originated from the interkingdom transfer from Archaea to Bacteria of a system similar to the Epd pilus. The phylogeny and the content of ancestral systems suggest that the initial bacterial pili were involved in cellular motility and/or DNA transformation. On the other hand, specialized protein secretion systems appeared much later. All these processes of functional diversification have been accompanied by genetic rearrangements with implications for genetic regulation and horizontal gene transfer. Overall, the evolutionary history of TFF-SF reveals an impressive catalogue of the variety of molecular mechanisms involved in the origin of new functions through tinkering and co-optation of cellular machineries

L’huître creuse Crassostrea gigas est l’espèce de bivalve la plus cultivée dans le monde et est confrontée à des maladies infectieuses impliquant des bactéries du genre Vibrio. Parmi ces Vibrio, l’espèce V.aestuarianus, initialement décrite en 1983 comme bactérie des environnements estuariens, est associée à des mortalités d’huîtres creuses adultes en Europe depuis 2001. En 2012, des mortalités de coques adultes Cerastoderma edule associées à cette espèce ont également été rapportées. Cependant, les processus ayant mené à l’émergence des lignées pathogènes de bivalves sont restés inconnus. Au cours de cette thèse, nous avons cherché à préciser (1) la structure des populations de V. aestuarianus et leurs déterminants génomiques ; (2) les évènements évolutifs ayant participé à l’émergence et l’évolution dessous-espèces, et (3) les habitats, cycles et espèces sensibles à V. aestuarianus. Nous avons montré que les souches de V. aestuarianus pathogènes se répartissent dans deux sous-espèces aux histoires évolutives différentes. V. aestuarianus francensis, décrite en 2008, regroupe les souches pathogènes d’huîtres alors que V. aestuarianus cardii regroupe les souches pathogènes de coques. Les deux sous espèces provoquent des maladies dans leurs populations d’hôtes en été, et la température a été identifiée comme un facteur favorable au développement des maladies. V. aestuarianus francensis impacte l’ostréiculture et nous montrons que deux lignées distinctes se sont propagées à l’échelle de l’Europe depuis au moins 20 ans. Cette sous-espèce se caractérise par une faible diversité génétique et une évolution essentiellement clonale. Les souches de V. aestuarianus francensis ont un mode de vie de spécialiste, avec un habitat restreint aux huîtres. L’un des évènements ayant favorisé son émergence pourrait être l’acquisition et l’intégration génomique d’un élément génétique mobile contenant des gènes codant des protéines impliquées dans l’export du cuivre. Actuellement, la sous-espèce V. aestuarianuscardii impacte les coques uniquement en France. La diversité phénotypique et génétique dans cette sous espèce est plus importante que dans la sous-espèce V. aestuarianus francensis. Plusieurs groupes génétiques présentant des niveaux de virulence différents envers les coques ont pu être identifiées et la comparaison des génomes entre ces groupes a permis d’identifier des facteurs de virulence potentiels
The oyster Crassostrea gigas is the most cultured species of bivalve in the world and is confronted with infectious diseases involving bacteria of the genus Vibrio. Among these Vibrio, the species V. aestuarianus, initially described in 1983 as a bacterium of estuarine environments, has been associated with mortality of adult oysters in Europe since 2001. In 2012, mortality of adult cockles Cerastoderma edule associated with this species have also been reported. However, the processes leading to the emergence of pathogenic bivalve lineages have remained unknown. During this thesis, we sought to clarify (1) the population structure of V. aestuarianus and their genomic determinants, (2) the evolutionary events that participated in the emergence and evolution of the subspecies, and (3) the habitats, cycles and species sensitive toV. aestuarianus. We have shown that pathogenic V. aestuarianus strains fall into two subspecies withdifferent evolutionary histories. V. aestuarianus francensis, described in 2008, includes pathogenic oyster strains while V. aestuarianus cardii includes pathogenic cockle strains. Both subspecies cause disease in their host populations in summer, and temperature has been identified as a favorable factor for disease development. V. aestuarianus francensis impacts oyster farming and we show that two distinct lineages have spread across Europe for at least 20 years. This subspecies is characterized by low genetic diversity and essentially clonal evolution. Strains of V. aestuarianus francensis have a specialist lifestyle, with a habitat restricted to oysters. One of the events that favored its emergence could be the acquisition and genomic integration of a mobile genetic element containing genes coding for proteins involved in copper export. Currently, the subspecies V. aestuarianus cardii impacts cockles only in France. The phenotypic and genetic diversity in this subspecies is greater than in the subspecies V. aestuarianus francensis. Several genetic groups with different levels of virulence towards cockles could be identified and the comparison of genomes between these groups made it possible to identify potential virulence factors

Les changements des propriétés de texture du fruit au cours de la maturation et de la sénescence sont associés à la dégradation de la paroi. Toutefois, les évènements à l’origine de ces changements ne sont pas clairement identifiés et pourraient se réaliser dès le développement précoce du fruit. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux parois cellulaires du péricarpe externe depuis la mise en place des polysaccharides pariétaux lors du développement précoce jusqu’à leur dégradation au cours de la maturation du fruit. Une étude morphologique des cellules du péricarpe aux différents stades de développement du fruit a permis de préciser les différents phases de l’expansion cellulaire. L’analyse chimique des parois a montré un remaniement de leur composition tout au long du développement du fruit avec une synthèse importante de rhamnogalacturonanes de type I au début de la phase d’expansion cellulaire. L’analyse de la structure fine des xyloglucanes et des (galacto)glucomannanes a révélé un remodelage de ces polymères pendant la phase de maturation mais également durant la phase d’expansion cellulaire. L’immunocytochimie a apporté des éléments nouveaux sur la distribution des différents polysaccharides au sein de la paroi. Enfin, nous avons examiné l’influence des modalités de conservation sur la composition de la paroi de fruits issus de lignées présentant une texture contrastée au stade rouge. Nous avons montré que les conditions de conservation modulaient la dégradation des pectines et que les différences de composition des parois entre lignées s’atténuaient au cours de la période postrécolte
Fruit texture depends on histology and cell wall architecture, both under genetic and developmental controls. If ripening related cell wall modifications have been well documented with regard to softening, little is known about cell wall construction during early fruit development. Identification of key events and their kinetics with regard to tissue architecture and cell wall development can provide new insights on early phases of texture elaboration. Changes in the pericarp cellular structure during fruit development were first characterized. Cell expansion was shown to occur differently to the location within the pericarp. Analysis of cell wall composition and polysaccharide structure revealed that both are continuously modified during fruit development and not only during the ripening stage. During early stages, the relative high rhamnose content in cell walls indicates a high synthesis of rhamnogalacturonan I next to the one of homogalacturonans. Fine tuning of rhamnogalacturonan I side chains appears to occur from the cell expansion phase until prior the mature green stage. Cell wall polysaccharides remodelling also concerns xyloglucans and (galacto)glucomannans, the major hemicelluloses in tomato cell walls. In situ localization of cell wall polysaccharides in pericarp tissue brings new insights on cell wall construction and architecture. Then, the impact of post-harvest storage conditions on fruit texture from different genotypes was investigated in relation with cell wall changes. An effect of post-harvest conditions was found on pectins. Differences in cell wall composition between genotypes decreased on the course of storage

Au temps évolutif long, nous avons montré qu'à l'échelle de l'espèce la virulence extra intestinale est essentiellement expliquée par le nombre de gènes de virulence. A l'aide d'une nouvelle collection, collectée au cours de la thèse, nous avons montré que les mutations du gène rpoS sont essentiellement acquises au laboratoire et que l'histoire évolutive de rpoS est soumise à une pression de sélection purificatrice, qu'elle respecte la phylogénie de l'espèce et qu'elle suit un modèle « source and sink ». Par ailleurs, le mode d'acquisition est important. Les souches responsables d'infections communautaires pédiatriques présentaient des capacités de croissance supérieures aux souches responsables d'infection nosocomiales pédiatriques. Nous avons également montré que le clone ST131 possédait des capacités de croissance particulièrement élevées pouvant expliquer sa diffusion dans la communauté. Au temps évolutif court, nous avons étudié 9 isolats d'un patient au cours d'une péritonite présentant une microhétérogénéité génétique et phénotypique et des niveaux différents de RpoS. L'allèle rpoS n'influait pas sur la virulence. Il semble donc qu'à l'échelle du temps évolutif court les capacités de croissance sont prépondérantes dans les variations de virulence observées. L'inactivation de la virulence contrebalancée par l'augmentation des capacités de résistance aux stress doit conférer des avantages sélectifs dans l'environnement particulier qu'est la cavité péritonéale lors d'une péritonite à E. Coli. Enfin, les données du séquençage des génomes complets des isolats permettront de mieux comprendre les mécanismes de la microdiversité et de ses liens avec la virulence
Throughout long evolutionary time, we showed that at the species level the extra intestinal virulence is essentially explained by the number of virulence genes. Using a new collection, collected during the thesis, we have shown that mutations in the rpoS gene are essentially laboratory-acquired and the evolutionary history of rpoS is subjected to a pressure of purifying selection, that it respects the phylogeny of the species and that it follows a "source and sink" model. Moreover, the mode of acquisition is important. Strains responsible for pediatric community-acquired infections showed higher growth capacities officials pediatric nosocomial infection strains. We also showed that the ST131 clone had particularly high growth capacity may explain its spread in the community. In short evolutionary time, we studied vine isolates from a patient during a peritonitis with genetic and phenotypic microheterogeneity and different levels of RpoS. RpoS allele did not affect virulence. So it seems that across evolutionary time short growth capacities are predominant in the variations in virulence observed. Inactivation of virulence offset by increased resilience to stress must confer selective advantages in the unique : environment that is the peritoneal cavity during peritonitis E. Coli. Finally, data from the sequencing of complete genomes of isolates will better understand the mechanisms of microdiversité and its relationship with virulence

Les Streptomyces sont des bactéries de la rhizosphère qui contribuent à la fertilité des sols (recyclage de la matière organique), et à la croissance et la santé des plantes. Elles possèdent parmi les plus grands génomes bactériens (12 Mb) et présentent une variabilité génétique importante. Cette variabilité connue au niveau interspécifique n’a jamais été abordée à l’échelle de la population, c’est-à-dire entre individus sympatriques appartenant à la même espèce (souches sœurs) au sein de la même niche écologique. L’objectif de ce travail est de rechercher cette diversité dans les populations de l’écosystème sol forestier, d’approcher sa dynamique et son rôle fonctionnel. Après séquençage et comparaison des génomes complets, nous avons observé une grande diversité génomique en termes de taille, de présence/absence d’éléments extrachromosomiques, mais également en terme de présence/absence de gènes le long du chromosome. Un grand nombre d’événements d’insertions et délétions (indels) comprenant de 1 à 241 gènes différencient les individus de la population. Au vu des liens phylogénétiques étroits entre les individus, l’ancêtre commun de la population est récent, aussi la diversité génomique résulterait d’un flux massif et rapide de gènes. La forte prévalence d’éléments conjugatifs intégrés dans la population suggère que la conjugaison est le moteur prépondérant de cette diversité génomique. La production différentielle de métabolites spécialisés (antibiotiques) a également été utilisée pour estimer l’impact de la diversité génétique sur le fonctionnement de la population. Nous avons pu montrer que cette production était liée à des gènes spécifiques de souches et qu’elle pouvait constituer un bien commun pour la population. Nous proposons que l’évolution rapide du génome participe au maintien des mécanismes de cohésion sociale chez ces bactéries du sol
Streptomyces are rhizospheric bacteria that contribute to soil fertility (recycling of organic matter), plant growth and health. They have among the largest bacterial genomes (12 Mb) with a high genetic variability. The genome variability, observed at the interspecific level has never been addressed within a population, i.e. between sympatric individuals belonging to the same species (Conspecific strains) within the same ecological niche. The objective of this work was to investigate this diversity in the forest soil ecosystem, to estimate its dynamics and its potential functional roles. After sequencing and comparison of the complete genomes, we observed a wide genomic diversity in terms of size, presence/absence of extrachromosomal elements, but also in terms of presence/absence of genes along the chromosome. A large number of insertion and deletion events (indels) from 1 to 241 genes differentiate individuals in the population. Given the close phylogenetic relationship of these strains, the common ancestor of the population is recent, hence the genomic diversity would result from a massive and rapid gene flux. The high prevalence of integrative and conjugative elements in the population suggests that conjugation could act as a driving force of this diversity. Differential production of specialized metabolites (antibiotics) was also used to estimate the impact of genetic diversity on population’s ecology. We were able to show that this production was linked to strain specific genes and that it may constitute a « public good » for the population. We propose that the rapid evolution of the genome contributes to the maintenance of social cohesion mechanisms within these soil bacteria

L’enveloppe bactérienne est l’une des structures cellulaires les plus anciennes et les plus fondamentales. Toutefois, de nombreux aspects concernant sa diversité et son histoire évolutive sont encore inconnus. Dans cette thèse, j’ai profité du nombre croissant de génomes disponibles dans les bases de données publiques, afin de mener une analyse de phylogénomique et de génomique comparative à une large échelle évolutive. Les deux objectifs de ce travail doctoral étaient (i) d’identifier de nouvelles lignées didermes au sein des Firmicutes pour éclairer la transition monoderme/diderme, et (ii) d’élucider l’histoire évolutive de l’enveloppe cellulaire chez les bactéries et d’en déduire la nature chez le LBCA.En résumé, les résultats que j'ai obtenus au cours de cette thèse fournissent une avancée significative dans notre compréhension de la diversité et de l'évolution de l'enveloppe cellulaire, et sur l'une des transitions majeures de l'histoire des bactéries, celle entre les monodermes et les didermes
The bacterial envelope is one of the oldest and most fundamental cellular structures. Yet, many aspects of its diversity and evolutionary history are unknown. In this thesis I have taken advantage of the large available genomic data to investigate the issue through a large-scale phylogenomic and comparative genomic analyses at the level of Bacteria. The two goals of this doctoral work were (i) to identify putative new diderm lineages in the Firmicutes to illuminate the monoderm/diderm transition, and (ii) to elucidate the evolutionary history of the cell envelope in Bacteria and infer its nature in the LBCA. To sum up, the results I obtained during this thesis provide a timely and significant advancement to our understanding of the diversity and evolution of the cell envelope, and on one of the major transitions in the history of Bacteria, that between monoderms and diderms

Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus est une bacterie lactique largement utilisee dans l'industrie laitiere. Le bon deroulement des fermentations realisees par cette espece est souvent entrave par le developpement de bacteriophages. Nous avons choisi d'etudier le phage tempere mv4, representatif d'une grande famille de phages de lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus et lactis, pour ameliorer la resistance aux phages, mais egalement pour mieux comprendre la genetique de l'espece bacterienne sur laquelle il se propage. Une quinzaine de genes ont ete identifies grace au sequencage d'un tiers du genome phagique (12kb). Deux operons tardifs ont ete plus precisement etudies: le gene implique dans la lyse bacterienne et le gene codant la proteine majeure de la capside (34 kda). L'etude de l'expression des genes, abordee par cartographie des arn messagers, a permis de mettre en evidence une sequence consensus originale qui pourrait etre celle d'un promoteur de type tardif. De plus, un fragment d'adn phagique doue d'une activite promotrice dans un hote heterologue, lactobacillus casei, a ete caracterise. Dans une bacterie lysogene, l'adn genomique du phage mv4 est integre sous forme de prophage dans le chromosome, mais est egalement present sous forme lineaire extra-chromosomique. Pour apprehender cette forme de lysogenie originale, la region impliquee dans l'integration phagique a ete analysee: le phage mv4 integre son adn par un mecanisme de recombinaison site-specifique qui fait intervenir une enzyme codee par le phage, l'integrase, et un site d'attachement phagique attp. Cette integration a lieu dans l'extremite 3' du gene d'un arn de transfert present sur le chromosome de l'hote. La comparaison des sequences nucleotidiques du phage mv4 avec celle du phage virulent ll-h, apparente a mv4, a permis d'aborder l'evolution des genes au sein d'une meme famille de phages et de demontrer le role des phages temperes dans l'emergence de phages virulents

Les Streptomyces sont des bactéries du sol possédant un chromosome linéaire de grande taille (8-11 Mb), un fort taux en bases G-C (72,1% chez S. coelicolor) ainsi que l’apparition à haute fréquence de mutants, présentant de grands réarrangements touchant les régions terminales chromosomiques. L’analyse des séquences des régions terminales et des séquences partielles de la région centrale de la souche ATCC23877 de S. ambofaciens a permis de montrer que la taille de la région spécifique d’espèce augmente avec l’éloignement phylogénétique. Cette perte progressive de synténie est le résultat d’évènements d’insertions/délétions (indels) de petits fragments d’ADN. La comparaison des séquences des Répétitions Terminales Inversées de deux souches de S. ambofaciens a montré la présence de frontières ancestrales communes et les régions spécifiques situées aux extrémités. Cette variabilité serait la conséquence de remplacements d’extrémités de réplicons linéaires potentiellement d’origine plasmidique. L’intervention différentielle de mécanismes de réparation de cassures double brin ou une fréquence plus importante des cassures le long du chromosome pourraient être à la base de cette variabilité. Une conséquence de la formation de cassures double brin est l’entrée dans le cycle de cassure-fusion-pont (CFP) dont un intermédiaire est un chromosome dicentrique. L’entrée dans ce cycle serait la conséquence de la fusion de deux chromosomes délétés d’un bras chromosomique. L’analyse de souches de S. ambofaciens DSM40697 contenant un second centre de partition précisera l’implication des systèmes de partition dans l’instabilité et l’évolution du chromosome des Streptomyces
The Streptomyces are soil bacteria with a large linear chromosome, typically 8 to 10 Mb, high part of G-C bases (72.1% for S. coelicolor) and are subject to a high degree of genetic instability, correlated with the formation of large rearrangement occurring in the terminal chromosomal regions. The analysis of the terminal regions sequences and partial sequence central region of S. ambofaciens ATCC23877 shows that the size of the terminal species-specific regions increases as the phylogenetic distance between compared species increases. The synteny observed between central regions degenerates progressively over several hundreds of kilobases before reaching the terminal species-specific regions. This synteny appears as gradually parceled out by multiple insertions/deletions (indels) of genes. The comparison of the sequences of the Terminal Inverted Repeat (TIR) of two S. ambofaciens strains shows the two strains share the same ancestral boundaries of TIRs. On the other hand, the terminals regions are strain-specific suggesting that exchanges of replicon extremities, potentially plasmidic, have occurred, contributing to the terminal variability observed at the intraspecific level. The mechanisms of double breaks repair or the frequency of these double breaks could be the reasons of this variability. Sometimes, the chromosome becomes dicentric and enters in a break-fusion-bridge (BFB) cycle. This cycle is the consequence of a end-to-end fusion of two deleted chromosomes. The analysis of S. ambofaciens DSM40697 strains with a second locus involved in the partitioning narrows the implication of this one in the chromosomic instability and the Streptomyces’ evolution

Les systèmes de « Quorum Sensing » (QSSs) sont des systèmes génétiques permettant la communication entre cellules ou entre bactériophages. Cette communication est réalisée par l’émission et la détection d’une molécule signal dont la concentration extracellulaire reflète la densité de la population codant le QSS. Les QSSs ont une importance capitale dans la régulation densité-dépendante de processus biologiques clés tels que la virulence, la sporulation ou la formation de biofilms chez les bactéries, la conjugaison chez les plasmides, ou la lysogénie chez les bactériophages tempérés. Néanmoins, la diversité des QSSs demeure largement sous-explorée et il en va de même pour celle des organismes, plasmides et virus codant ces systèmes. Ainsi, beaucoup de comportements microbiens/viraux régulés de façon densité-dépendante restent probablement à découvrir, dont certains pourraient peut-être révolutionner notre vision de l’adaptation microbienne et de la coévolution entre bactéries et leurs éléments génétiques mobiles. Précisément, cette thèse de bioinformatique évolutive explore les diversités phylogénétique et fonctionnelle du processus de détection du quorum par des méthodes d’analyses de génomes et de réseaux appliquées à des éléments génétiques traditionnellement délaissés par ce champ de recherche : génomes de lignées méconnues comme les CPRs et les DPANNs, métagénomes environnementaux, génomes viraux ou encore plasmides. En particulier, cette thèse pose les bases théoriques de l’inférence de réseaux de communication au sein de communautés microbiennes environnementales et inclut le développement d’une nouvelle méthode permettant l’identification de QSSs de type RRNPP (Rap-Rgg-NprR-PlcR-PrgX) non homologues à des QSSs déjà connus. Ce travail révèle notamment les premiers bactériophages bilingues, c’est-à-dire codant deux QSSs appartenant à des familles génétiques différentes ainsi que les premiers bactériophages prédits pour manipuler de façon densité-dépendante la biologie de leur hôte bactérien
Quorum sensing systems (QSSs) are genetic systems supporting cell-cell or bacteriophage-bacteriophage communication via the production and the detection of a signal molecule, the extracellular concentration of which reflects the density of the QSS-encoding population. QSSs have a prime importance in the regulation of key biological processes such as virulence, sporulation or biofilm formation in bacteria, conjugation in plasmids or lysogeny in temperate bacteriophages. However, the genetic diversity of QSSs remains largely underexplored and the same holds for the diversity of organisms, plasmids and viruses encoding these systems. Hence, many bacterial and viral density-dependent behaviors likely await to be discovered, some of which could perhaps transform our views of microbial adaptation and of the co-evolution between bacteria and their mobile genetic elements. Specifically, this PhD in evolutionary bioinformatics explores the phylogenetic and functional diversity of quorum sensing using genome and network analysis methods applied to genetic elements traditionally neglected by this research field: genomes of poorly known lineages such as CPRs and DPANNs, environmental metagenomes, viral genomes or plasmids. In particular, this thesis lays the theoretical foundations for the inference of communication networks within environmental microbial communities and includes the development of a new method allowing the identification of QSSs of the RRNPP type (Rap-Rgg-NprR-PlcR-PrgX) that are non-homologous to already known QSSs. This work notably reveals the first bilingual bacteriophages, i.e. encoding two QSSs belonging to different genetic families, as well as the first bacteriophages predicted to manipulate in a density-dependent manner the biology of their bacterial host

La persistance bactérienne implique une adaptation aux conditions et aux contraintes environnementales, parfois associée à une diversification des génotypes et des phénotypes des populations bactériennes impliquées. Dans le cadre des infections chroniques, la mucoviscidose (CF) est une des pathologies humaines parmi les plus étudiées en termes de persistance et d’adaptation de pathogènes opportunistes. Certains pathogènes opportunistes d’origine environnementale, comme les bactéries des genres Achromobacter et Pandoraea, considérés comme émergents dans cette pathologie, sont capables de coloniser chroniquement les voies respiratoires des patients CF (VRCF). La colonisation et la persistance impliquent des mécanismes d’adaptations étudiés pour P. aeruginosa mais mal connus pour les bactéries émergentes.Nous avons étudié la persistance de bactéries du genre Achromobacter dans les VRCF de 13 patients, ainsi que dans de réseau d’eau d’un centre de soins dentaires, et la persistance de Pandoraea pulmonicola dans les VRCF d’un patient, durant des périodes de colonisation allant jusqu’à 7 ans. En parallèle, nous avons étudié la diversité génomique et phénotypique de populations d’Achromobacter dans les expectorations de 9 patients. Enfin, une investigation environnementale au domicile de 3 patients colonisés chroniquement par Achromobacter a été menée dans le but de connaître la diversité et l’écologie des bactéries de ce genre dans l’environnement proche des patients. Lors de ces différentes études, les espèces d’Achromobacter et Pandoraea ont été identifiées par méthodes moléculaires et la dynamique du génome ainsi que la diversité phénotypique ont été étudiées.Nous avons observé une diversité d’espèces de bactéries du genre Achromobacter colonisant les VRCF, incluant une espèce non décrite. Les patients colonisés chroniquement l’étaient par un clone unique d’Achromobacter ou de P. pulmonicola, appuyant l’idée de l’acquisition initiale d’un clone environnemental qui persiste dans le temps. Une importante diversité génomique et phénotypique a été observée au cours du temps mais aussi au sein de populations à un temps donné. Nous avons également mis en évidence une importante diversité de profils d’antibiorésistance au sein de chaque expectoration, dont l’impact clinique reste à évaluer. Enfin, une diversité d’espèces du genre Achromobacter a été observée au domicile des patients alors que le clone d’A. xylosoxidans adapté aux VRCF des patients n’a pas été isolé dans leurs environnements domestiques. Ces résultats suggèrent qu’après la colonisation initiale et la spécialisation des clones colonisant les VRCF, ceux-ci seraient secondairement incapables de survivre dans l’environnement.Un clone qui colonise les VRCF s’adapte rapidement aux conditions environnementales particulières de cet habitat et subit une diversification génomique et phénotypique intense par spécialisation de génotypes à différentes niches écologiques, aboutissant à une population clonale diversifiée. Cette diversité assure certainement la persistance de la population clonale par "l’hypothèse d’assurance" selon laquelle quelle que soit la pression environnementale exercée, une bactérie ou un sous-groupe de bactéries sera capable d’y résister.Mots clés : Achromobacter, adaptation, colonisation chronique, diversité, écologie, environnement, épidémiologie, évolution, génomique, mucoviscidose, Pandoraea, persistance, phénotype, réseau d’eau, résistance aux antibiotiques
Bacterial persistence involves adaptation to environmental conditions and constraints, sometimes associated with genotype and phenotype diversification of bacterial populations. In the context of chronic infections, Cystic Fibrosis (CF) is a human disease among the most studied in terms of persistence and adaptation of opportunistic pathogens. Some environmental opportunistic pathogens like Achromobacter and Pandoraea genera are considered as emerging in CF and are able to chronically colonize CF Respiratory Tract (CFRT). Adaptation mechanisms required for colonization and persistence were studied for P. aeruginosa but remain largely unknown for emerging bacteria. We studied Achromobacter spp. persistence in the CFRT of 13 patients and in a dental care unit water network, and Pandoraea pulmonicola persistence in the CFRT of one patient, during colonization periods up to 7 years. In parallel, we studied Achromobacter population genomic and phenotypic diversity in sputum samples from 9 patients. Finally, we made an environmental investigation to study the diversity and the ecology of Achromobacter spp. in household of 3 Achromobacter chronically colonized CF patients. During these studies, Achromobacter and Pandoraea species were identified by molecular methods and genome dynamic and phenotypic diversity were studied.Diversity of Achromobacter species colonizing the CFRT is described and included an undescribed species. Chronically colonized patients had a unique Achromobacter or Pandoraea clone in their CFRT, supporting the initial acquisition of one environmental clone which persists over time. A large genomic and phenotypic diversity has been observed over time and also at the intra-specimen level. A wide antibiotic susceptibility profile diversity was observed within samples and its clinical impact remains to be assessed. Finally, Achromobacter species diversity was observed in patient domestic environment but the Achromobacter clone adapted to the patient CFRT was not isolated. These results suggested that after initial colonization and specialisation the CFRT, colonizing clones might secondarily be unable to survive in the environment.A colonizing clone quickly adapts to the specific local conditions of the CFRT and undergoes intense genomic and phenotypic diversification with genotype specialization to the different ecological niches of the heterogeneous CFRT, resulting in a diversified clonal population. This diversity certainly insures the population persistence according to the “bet hedging” theory stating that regardless of the environmental pressures, a bacteria or a subgroup of bacteria will be able to persist.Key words : Achromobacter, adaptation, antibiotic susceptibility, chronic colonization, Cystic Fibrosis, diversity, ecology, environment, epidemiology, evolution, genomic, Pandoraea, persistence, phenotype, water network

P. aeruginosa est une bactérie pathogène de l'homme, responsable d'infections nosocomiales chez les patients immunodéprimés. Bien que son évolution au sein d'un patient soit bien décrite, son évolution génomique globale au cours de sa propagation dans un hôpital est très mal connue. Le clone à haut-risque ST395 multirésistant aux antibiotiques a diffusé dans le Centre Hospitalier Regional Universitaire de Besançon entre 1997 et 2008 en infectant ou colonisant plus de 300 patients. Une approche WGS a été utilisée afin d'identifier l'origine de l'épidémie, les caractéristiques ayant aidé à son installation à l'hôpital ainsi que celles à l'origine de sa disparition. Les génomes de 54 isolats représentatifs de l'épidémie ont été séquencés. L’arbre phylogénétique a mis en évidence deux clusters distincts indiquant la présence de deux épidémies parallèles. La datation d'un ancêtre commun en 1979, date de début de la construction de l'hôpital, indiquerait une contamination précoce du réseau d'eau de l'hôpital. Cette hypothèse est soutenue par la présence d'un îlot génomique spécifique de ST395 portant les gènes codant 6 transporteurs du cuivre et associée à une résistance phénotypique à ce métal constituant les tuyaux du réseaux de distribution d'eau potable. Les isolats tardifs présentaient des signatures génomiques d'adaptation à l’infection chronique (altération du lipopolysaccharide et de la porine OprD – objectivées phénotypiquement, et extinction de la surproduction de la pompe d’efflux MexAB-OprM – contrôlée par RT-qPCR) suite à des mutations indépendantes. Certaines de ces mutations ont été associées à une perte de fitness bactérien. Nous émettons l’hypothèse que l’émergence indépendante d’isolats adaptés à l’infection chronique, et ainsi l’accumulation de culs-de-sac épidémiologiques, a participé à l’épuisement de l’épidémie hospitalière de P. aeruginosa ST395
P. aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of hospital-acquired infections in immunocompromised patients. Although in-host evolution of P. aeruginosa is well documented, little is known about this pathogen evolution during its spread on a hospital scale. The high-risk multidrug resistant clone ST395 spread among more than 300 patients in the University Hospital of Besançon between 1997 and 2008. We used a WGS approach to identify the origin of the outbreak, the features that could have helped its implantation in our hospital and those associated with the end of the epidemics. The genomes of 54 representative isolates were fully sequenced. The phylogenetic tree indicated two distinct clusters corresponding to two parallel outbreaks. The ancestor of the ST395 clone possibly contaminated our hospital water network during its construction in 1979. This hypothesis is supported by the fact that the ST395 strain had a specific genomic island carrying 6 copper transporter genes implicated in copper resistance, correlated with the resistance to this metal which water supply network is made of. The late isolates displayed independent genomic signatures of chronic adaptation in patients (altered LPS and porin OprD, and extinction of MexAB-oprM efflux pump overproduction). Some of these mutations were associated with a decreased in vitro fitness. We hypothesize that the independent emergence of isolates adapted to chronic infection, and thus the accumulation of epidemiological dead-ends, participated to the end of the hospital outbreak of P. aeruginosa ST395

Depuis l'apparition de la vie sur terre, les pressions de sélection liées aux interactions biotiques et abiotiques ont généré une forte diversité des formes de vie. Ainsi, chaque espèce eucaryote coévolue avec sa communauté microbienne associée. Dans le cas des plantes, la diversité génétique se traduit au niveau de multiples traits phénotypiques (exsudation de substrats carbonés, architecture racinaire, densité et aération du sol, acidification, etc.) susceptibles d'influer sur les interactions avec les populations microbiennes du sol, et donc sur la composition et le fonctionnement de la communauté microbienne rhizosphérique. Notre hypothèse est que les différences entre communautés bactériennes rhizosphériques sont proportionnelles aux distances évolutives entre partenaires végétaux. L'objectif de cette thèse était donc de déterminer l'importance, dans le cas des Poacées et notamment du maïs, de l'histoire évolutive de la plante dans la capacité de sélection des communautés bactériennes de la rhizosphère. Les analyses faites à l'aide d'une puce à ADN taxonomique 16S indiquent que la composition de la communauté rhizobactérienne dépend du groupe génétique de maïs mais n'est pas liée aux marqueurs microsatellites de diversité du maïs. Par contre, à l'échelle des Poacées, une corrélation a été trouvée entre la phylogénie végétale et la composition de la communauté bactérienne (voire la prévalence de taxons bactériens particuliers). Cette corrélation n'était pas significative quand l'étude était limitée à l'effectif, le niveau de transcription de nifH ou la diversité du groupe fonctionnel des bactéries fixatrices d'azote. En conclusion, l'histoire évolutive du partenaire végétal à l'échelle des Poacées (mais pas à celle du maïs) est un facteur conditionnant les interactions avec les groupes bactériens taxonomiques (mais pas nécessairement fonctionnels) de la rhizosphère

Les systèmes toxine-antitoxine sont divisés en trois classes suivant la nature et le mode d’action de l’antitoxine. Ils sont fortement représentés au sein du règne bactérien et se trouvent sur des éléments génétiques mobiles qu’ils stabilisent dans la population bactérienne, mais aussi sur les chromosomes bactériens où leur fonction n’a pas encore été établie avec certitude. Au cours de ce travail, nous avons étudié les systèmes toxine-antitoxine bactériens de classe II, qui sont généralement composés de deux gènes organisés en opéron. Le premier gène code pour une antitoxine qui antagonise l’activité de la toxine, le produit du second gène. L’antitoxine, en complexe avec la toxine, est également capable de réguler l’expression de l’opéron en se fixant au promoteur de l’opéron. Lors du commencement de cette étude, les systèmes toxine-antitoxine étaient divisés en 10 familles sur base des similarités de séquences partagées par les toxines. A chaque famille de toxine était associée une famille d’antitoxine.

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Doctorat en Sciences
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Comprendre l’émergence des maladies dans les agroécosystèmes nécessite d’étudier l’histoire évolutive des populations bactériennes associées aux plantes. L’objectif de ce travail était de déterminer les évènements évolutifsconduisant à l’émergence des lignées pathogènes ou pathovars dans l’espèce Xanthomonas arboricola. Une analyse de génétique des populations a été menée sur un panel de souches phytopathogènes et commensales et complétée par l’inférence des gains et pertes de facteurs de virulence. Cette espèce possède une structure de population épidémique ; les clones épidémiques ont émergé suite à l’acquisition de facteurs de virulence à partir d’un fond recombinant de souches commensales. Une analyse de génomique des populations et la reconstruction de scénarios de divergence entre ces clones et le réseau de souches recombinantes, a montré la persistance d’un flux de gènes asymétrique entre ces deux groupes, dans le sens souches pathogènes vers souches commensales. Enfin, l’histoire évolutive du principal facteur de virulence des Xanthomonas, le système de sécrétion de type 3, a été retracée au sein du genre, et a montré que celui-ci avait été acquis ancestralement puis perdu dans certaines souches commensales. En conclusion, l’ancêtre commun de X. arboricola possédait des facteurs de virulence et au sein des souches commensales, certaines ont perdu ces facteurs, tandis que d’autres ont conservé le répertoire ancestral. Ces dernières diffèrent peu de certains agents pathogènes, et pourraient représenter un risque pour de nouvelles émergences. Des travaux de génomique fonctionnelle permettraient de valider ces hypothèses
Deciphering the evolutionary history of bacterial populations associated to plants is necessary to understand diseaseemergence in agroecosystems. The aim of this study is to unveil the evolutionary events responsible for pathogeniclineages or pathovar emergences in Xanthomonas arboricola. This species is composed of both plant pathogenic andcommensal strains Population genetics analyses and gain and loss inferences of virulence factors showed that X. arboricola exhibits an epidemic population structure, within which epidemic clones emerged from a recombinogenic background population following virulence factor acquisition. Population genomics and inference of divergence scenarii between epidemic clones and the network of recombinant strains showed persistence of homologous recombination along divergence of these two groups, with an asymmetric gene flux from pathogenic strains to commensal ones. Finally, evolutionary history of the type three secretion system (T3SS), the main virulence factor in Xanthomonas genus, was studied at genus scale and showed that T3SS was ancestrally acquired and lost in commensal strains. Altogether these analyses allowed us to show that the common ancestor of X.arboricola had virulence factors, and that within commensal strains, some lost these virulence factors whereas others kept the ancestral repertoire. These latter strains have a similar repertoire to that of some pathogenic strains, and could represent a risk for new disease emergence. Functional genomics could allow us to validate these hypotheses

L'atrazine, un des herbicides les plus utilisés pour contrôler le développement des plantes adventices dans les cultures, a conduit à la contamination de l'environnement. L'exposition chronique à cet herbicide a conduit à l'émergence de populations microbiennes du sol capables de dégrader l'atrazine et de l'utiliser comme une source d'azote pour leur croissance. Ces populations microbiennes sont responsables de la biodégradation accélérée (BDA) de l'atrazine, un service écosystémique contribuant à diminuer la persistance de cet herbicidedans l'environnement. L'objectif de ce travail était d'étudier les mécanismes génétiques et physiologiques responsables du fonctionnement et de l'amélioration de ce service écosystémique. Nous avons appliqué une démarche expérimentale allant des gènes codant la dégradation à des communautés microbiennes afin d'identifier les processus adaptatifs impliqués dans l'évolution de la fonction de BDA de l'atrazine.Le premier volet a consisté à évaluer l'importance de mutations accumulées dans le gène atzA dans la transformation de l'atrazine en hydroxyatrazine catalysée par AtzA. Le séquençage de gènes atzA de différents isolats bactériens dégradant l'atrazine (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps et différents Chelatobacter heintzii) a montré que la séquence du gène atzA était très conservée. Toutefois quatre mutations non silencieuses ont pu être identifiées (1 chez Pseudomonas sp. ADP MSE et 3 chez Chelatobacterheintzii). La modélisation de la structure de la protéine AtzA a permis de montrer que trois des mutations étaient situées dans des régions importantes (site actif, poche de liaison avec l'atrazine et liaison avec le métalFe2+. [...] Le second volet a consisté à étudier la plasticité de la voie de biodégradation de l'atrazine dans deux conditions opposées : (i) la première visait à évaluer la persistance de la capacité de dégradation en absence de pression de sélection et (ii) la seconde visait à évaluer l'évolution de la capacité de dégradation en présence d'une pression de sélection élevée. Pour conduire ces études, des manipulations d'évolution expérimentale sur Pseudomonas sp. ADP ont été menées. (i) L'exposition à l'acide cyanurique, intermédiaire métabolique de l'atrazine, a conduit à la sélection d'une population nouvellement évoluée capable de croître plus rapidement dans un milieu de culture ne contenant que l'acide cyanurique comme source d'azote. Cette population est caractérisée par une délétion d'une région de 47 kb du plasmide ADP1 contenant les gènes atzABC. Les analyses conduites ont permis de conclure que le gain de compétitivité de la population évoluée résidait dans la perte du fardeau génétique représenté par la région de 47 kb, la capacité de dégradation de l'acide cyanurique restant inchangée. (ii) L'exposition à l'atrazine a conduit à la sélection d'une populationnouvellement évoluée caractérisée par l'insertion du plasmide ADP1 en quasi-totalité sur le chromosome bactérien. [...] Le troisième volet a consisté à développer un outil permettant d'évaluer, à l'échelle d'une communauté microbienne synthétique, l'évolution du potentiel génétique dégradant. Pour ce faire quatre souches dégradantes dont une, Arthrobacter sp. TES6, isolée au cours de cette étude, ont été choisies. [...] Ces travaux montrent que la fonction de biodégradation accélérée de l'atrazine est très versatile et qu'elle est en constante évolution. Il met en évidence que le principal facteur pilotant cette évolution est le niveau d'exposition des populations dégradantes au pesticide.

Les systèmes CRISPR-Cas confèrent aux bactéries une immunité adaptative contre les éléments génétiques mobiles jouant ainsi un rôle important dans l’évolution bactérienne. Cependant, moins de la moitié des génomes bactériens encodent des systèmes CRISPR-Cas ; cela, malgré la protection qu’ils confèrent et leur haut taux de transfert horizontal. Des hypothèses telles que le coût des phénomènes d’auto-immunité ou de posséder des défenses adaptatives plutôt qu’innées ont été mises en avant pour expliquer ce paradoxe. Je propose une nouvelle hypothèse complémentaire : le contexte génétique jouerait un rôle important dans la fixation d’un système CRISPR-Cas après son transfert. Plus précisément, j’ai étudié comment les interactions entre les systèmes de réparation de l’ADN et les CRISPR-Cas influencent la distribution de ces derniers. Pour cela, j’ai d’abord examiné finement la distribution des systèmes CRISPR-Cas dans les génomes bactériens. J’ai ensuite analysé les co-occurences des systèmes de réparation de l’ADN et des CRISPR-Cas et démontré l’existence d’associations positives et négatives entre eux. Enfin, je me suis concentrée sur une des associations négatives découvertes pour valider mes prédictions expérimentalement et comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents. Mes travaux permettent de mieux comprendre les interactions complexes entre systèmes de réparation de l’ADN et CRISPR-Cas et démontrent la nécessite d’accommodation des CRISPR-Cas à un contexte génétique pour être sélectionnés et maintenus dans les génomes bactériens
CRISPR-Cas systems confer bacteria and archea an adaptative immunity against phages and other invading genetic elements playing an important role in bacterial evolution. Only 47% of bacterial genomes harbor a CRISPR-Cas system despite their high rate of horizontal transfer. Hypothesis such as the cost of autoimmu- nity or the trade off between a constitutive or an inducible defense system have been put forward to explain this paradox. I propose that the genetic background plays an important role in the process of maintaining a CRISPR-Cas system af- ter its transfer. More precisely I hypothesized that CRISPR-Cas systems interact with DNA repair pathways. To test this idea, we detected DNA repair pathways and CRISPR-Cas systems in bacterial genomes and studied their co-occurences. We report both positive and negative associations that we interpret as poten- tial antagonistic or synergistic interactions. We then focused on one interaction to validate our result experimentally and explored molecular mechanisms behind those interactions. My findings give insights on the complex interactions between CRISPR-Cas systems and DNA repair mechanisms in bacteria and provide a first example on the necessity of accommodation of CRISPR-Cas systems to a specific genetic context to be selected and maintained in bacterial genomes

Les ARN non-codants (ARNnc) forment une classe hétérogène d’éléments transcrits mais non traduits qui participent, par l’intermédiaire de leur structure et/ou leur séquence, à une grande diversité de processus cellulaire selon de multiple modalités. Ces dernières années, un grand nombre d’ARNnc ont été détectés expérimentalement dans les génomes et aujourd’hui les ARNnc sont considérés comme des acteurs majeurs de la biologie des cellules eucaryotes, bactériennes et archaeénnes. Malgré ces récentes avancées, l’étape de détection expérimentale des ARNnc dans les génomes nécessite toujours un investissement important en temps et reste encore rarement suivie d’une caractérisation fonctionnelle des éléments ainsi identifiés. Partant de ces constatations, nous avons développé une méthode de détection in-silico des ARNnc dans les génomes bactériens que nous avons appelée NAPP pour « Nucleic Acid Phylogenetic Profiling ». NAPP est une adaptation du profilage phylogénétique, une méthode utilisée pour prédire la fonction de protéine de fonction inconnue. NAPP analyse la co-occurrence d’éléments codants et non-codants d’un génome de référence dans toutes les espèces bactériennes disponibles. Il construit ainsi des groupes d’éléments d’histoire phylogénétique similaire et donc probablement dépendants les uns des autres, contraints par la nécessité de conserver l’intégrité d’un processus cellulaire. Parmi ces groupes, certains présentent un enrichissement en ARNnc connus, ce qui nous a permis logiquement de faire de NAPP un outil de détection des ARNnc dans les génomes bactériens. En comparaison à d’autres outils bioinformatiques, les performances de notre programme ont été quantifiées et se sont avérées très favorables dans plusieurs espèces modèles. Mais notre validation a été également expérimentale, permettant la découverte de 7 nouveaux ARNnc chez S. Aureus. L’un de ces ARNnc, RsaOG, a particulièrement retenu notre attention. En effet, fortement exprimé et conservé uniquement dans le genre Staphylococcus, RsaOG pourrait présenter une structure en pseudo-noeud encore jamais observée à notre connaissance dans un ARNnc agissant en trans. Après une étape de prédiction de ses cibles putatives, nous recherchons actuellement à les valider expérimentalement et à intégrer RsaOG dans la physiologie des Staphylocoques. Mais la caractéristique la plus intéressante de NAPP est probablement sa capacité intrinsèque à fournir une indication fonctionnelle sur les éléments qu’il classifie. En effet, l’analyse de l’enrichissement en certaines fonctions des groupes d’éléments codants et non-codants peut, dans le meilleur des cas, constituer un indice sur la fonction des éléments de fonction inconnue contenus dans ces groupes. Ce type d’analyse nous a permis, chez B. Subtilis, d’observer qu’un nouvel ARNnc, que nous avons appelé CsfG, se regroupait phylogénétiquement avec quasiment la moitié des gènes impliqués dans la sporulation. Nous avons donc inféré que CsfG était potentiellement lui-même impliqué dans la sporulation et des études expérimentales et in-silico nous ont permis de confirmer l’implication de CsfG dans la sporulation en validant sa régulation par les facteurs Sigma F et G spécifiques de la formation de la préspore
Non-coding RNAs (ncRNA) form a heterogeneous group of transcribed, non-translated elements that play, through their structure, sequence and mechanistic diversity, an important role in many cellular processes. In recent years, thousands of ncRNA have been experimentally detected in genomes and ncRNAs are now accepted as key components of the cellular biology of Eukaryota, Prokaryota and Archaea. Despite these recent advances, the experimental detection of ncRNAs remains a timeconsuming task and is rarely followed by a functional analysis of the identified transcripts. To address this issue, we developed an in-silico method for ncRNA detection in bacterial genomes, named NAPP - Nucleic Acid Phylogenetic Profiling. This method derives from phylogenetic profiling, a method used to predict the function of unknown proteins. Based on a reference genome sequence, NAPP computes the co-inheritance of coding and non-coding elements in all available bacterial genomes and clusters elements that share a similar phylogenetic history. Several of these clusters are enriched in known ncRNAs, which enables using NAPP as an ncrNA classifier. Performance benchmarks indicate that NAPP predictive accuracy is equivalent to that of methods designed specifically for ncRNA detection. We further validate our predictions by the description of seven new ncRNAs in S. Aureus. We further studied RsaOG, one of the new S. Aureus small RNAs identified by NAPP. RsaOG is highly expressed and specifically conserved in the Staphylococcus genus. This RNA may involve a pseudoknotted structure, a new observation for a trans-acting ncRNA. After a round of computational target predictions, we are now trying to validate RsaOG targets to integrate this small RNA in Staphylococcus physiology. The most attractive feature of NAPP, however, is its intrinsic capacity to provide functional information on the classified elements. Indeed, functional enrichment of coding and non-coding clusters can, in favorable cases, provide clues about the function of unannotated elements in these clusters. Using this type of functional analysis in B. Subtilis, we focused on CsfG, an ncRNA detected by NAPP. Half of the genes in the CsfG cluster are involved in sporulation and we inferred that CsfG could be a sporulation-related RNA. Experimental and in-silico studies confirmed this prediction, demonstrating that CsfG is directly regulated by two Sigma factors sigG and sigF, that are specific to the prespore formation

Variation et sélection sont au coeur de l'évolution Darwinienne. Cependant, ces deux mécanismes dépendent de processus eux-mêmes façonnés par l'évolution. Chez les micro-organismes, qui font face à des environnements souvent variables, ces propriétés adaptatives sont particulièrement bien exploitées, comme le démontrent de nombreuses expériences en laboratoire. Chez ses organismes, l'évolution semble donc avoir optimisé sa propre capacité à évoluer, un processus que nous nommons évolution de l'évolution (EvoEvo). La notion d'évolution de l'évolution englobe de nombreux concepts théoriques, tels que la variabilité, l'évolvabilité, la robustesse ou encore la capacité de l'évolution à innover (open-endedness). Ces propriétés évolutives des micro-organismes, et plus généralement de tous les organismes vivants, sont soupçonnées d'agir à tous les niveaux d'organisation biologique, en interaction ou en conflit, avec des conséquences souvent complexes et contre-intuitives. Ainsi, comprendre l'évolution de l'évolution implique l'étude de la trajectoire évolutive de micro-organismes — réels ou virtuels —, et ce à différents niveaux d'organisation (génome, interactome, population, …). L'objectif de ce travail de thèse a été de développer et d'étudier des modèles mathématiques et numériques afin de lever le voile sur certains aspects de l'évolution de l'évolution. Ce travail multidisciplinaire, car impliquant des collaborations avec des biologistes expérimentateur•rice•s, des bio-informaticien•ne•s et des mathématicien•ne•s, s'est divisé en deux parties distinctes, mais complémentaires par leurs approches : (i) l'extension d'un modèle historique en génétique des populations — le modèle géométrique de Fisher — afin d'étudier l'évolution du bruit phénotypique en sélection directionnelle, et (ii) le développement d'un modèle d'évolution in silico multi-échelles permettant une étude plus approfondie de l'évolution de l'évolution. Cette thèse a été financée par le projet européen EvoEvo (FP7-ICT-610427), grâce à la commission européenne
Variation and selection are the two core processes of Darwinian Evolution. Yet, both are directly regulated by many processes that are themselves products of evolution. Microorganisms efficiently exploit this ability to dynamically adapt to new conditions. Thus, evolution seems to have optimized its own ability to evolve, as a primary means to react to environmental changes. We call this process evolution of evolution (EvoEvo). EvoEvo covers several aspects of evolution, encompassing major concepts such variability, evolvability, robustness, and open-endedness. Those phenomena are known to affect all levels of organization in bacterial populations. Indeed, understanding EvoEvo requires to study organisms experiencing evolution, and to decipher the evolutive interactions between all the components of the biological system of interest (genomes, biochemical networks, populations, ...). The objective of this thesis was to develop and exploit mathematical and numerical models to tackle different aspects of EvoEvo, in order to produce new knowledge on this topic, in collaboration with partners from diverse fields, including experimental biology, bioinformatics, mathematics and also theoretical and applied informatics. To this aim, we followed two complementary approaches: (i) a population genetics approach to study the evolution of phenotypic noise in directional selection, by extending Fisher's geometric model of adaptation, and (ii) a digital genetics approach to study multi-level evolution. This work was funded by the EvoEvo project, under the European Commission (FP7-ICT-610427)

Bacteria are social organisms which participate in multiple cooperative and group behaviours. They moreover have peculiar genetic systems, as they often bear mobile genetic elements like plasmids, molecular symbionts that are the cause of widespread horizontal gene transfer and play a large role in bacterial evolution. Both cooperation and horizontal transfer have consequences for human health: cooperative behaviours are very often involved in the virulence of pathogens, and horizontal gene transfer leads to the spread of antibiotic resistance. The evolution of plasmid transfer has mainly been analyzed in terms of infectious benefits for selfish mobile elements. However, chromosomal genes can also modulate horizontal transfer. A huge diversity in transfer rates is observed among bacterial isolates, suggesting a complex co-evolution between plasmids and hosts. Moreover, plasmids are enriched in genes involved in social behaviours, and so could play a key role in bacterial cooperative behaviours. We study here the coevolution of gene mobility and sociality in bacteria. To investigate the selective pressures acting on plasmid transfer and public good production, we use both mathematical modelling and a synthetic system that we constructed where we can independently control public good cooperation and plasmid conjugation in Escherichia coli. We first show experimentally that horizontal transfer allows the specific maintenance of public good alleles in a structured population by increasing relatedness at the gene-level. We further demonstrate experimentally and theoretically that this in turn allows for second-order selection of transfer ability: when cooperation is needed, alleles promoting donor and recipient abilities for public good traits can be selected both on the plasmid and on the chromosome in structured populations. Moreover, donor ability for private good traits can also be selected on the chromosome, provided that transfer happens towards kin. The interactions between transfer and cooperation can finally lead to an association between transfer and public good production alleles, explaining the high frequency of genes related to cooperation that are located on plasmids. Globally, these results provide insight into the mechanisms maintaining cooperation in bacteria, and may suggest ways to target cooperative virulence.

La protéine H-NS est impliquée dans le contrôle de l'expression de nombreux gènes chez Escherichia coli. Pourtant, son rôle dans la physiologie bactérienne reste encore énigmatique. La sensibilité d'un mutant hns de E. Coli à l'acide aminé sérine nous a permis d'isoler plus d'une dizaine de protéines homologues chez d'autres bactéries comme Vibrio cholerae, l'agent du Choléra. La caractérisation d'une protéine H-NS chez la bactérie psychrophile Psychrobacter spp. A révélé par ailleurs le rôle essentiel du domaine N-terminal dans la stabilité à la température. A ce jour, plus de quarante protéines de type H-NS ont pu être identifiées, exclusivement chez les protéobactéries. Le rôle premier de la protéine H-NS dans la physiologie d'E. Coli semble se dessiner autour des ARNs et du métabolisme à un carbone
The H-NS protein of Escherichia coli controls the expression of various genes involved in adaptation to environmental challenges. But the function of H-NS in bacterial metabolism remains elusive. Taking advantage of serine susceptibility, we have characterized more than ten H-NS related proteins in other bacteria like Vibrio cholerae. Among them, the characterization of the Psychrobacter H-NS protein from a psychrophilic bacteria reveals the crucial role of the N-terminal domain for the thermal stability of H-NS protein. Currently, more than forty H-NS-like proteins have been identified exclusively from proteobacteria. The importance of RNAs and one carbon metabolism in H-NS functions have been suggested

La stabilité phénotypique est essentielle au succès d'organismes évoluant sous des conditions constantes. L'environnement est néanmoins soumis à de perpétuelles variations stochastiques, auxquelles les êtres vivants doivent sans cesse s'adapter. L'évolutivité caractérise la capacité d'une population à répondre à de telles pressions sélectives par la génération de modifications phénotypiques héritables. La majorité des mutations étant délétères, des processus permettant de limiter la production de telles variations aux seules périodes de stress, ou de la confiner à des loci et phénotypes bien définis, ont été sélectionnés au cours de l'évolution. Les intégrons en constituent une illustration particulièrement sophistiquée. Initialement identifiés comme vecteurs de résistance à de multiples antibiotiques, ces systèmes génétiques bactériens spécialisés dans l'échange, la collecte et l'expression de gènes accessoires constituent une importante source de diversité génétique. Ce travail montre que les intégrons sont directement couplés à une voie majeure de réponse au stress chez les bactéries, le système SOS. En permettant de générer de la variabilité phénotypique en période de stress sans affecter le reste du génome, les intégrons constituent ainsi un exemple paradigmatique d'évolutivité. Un autre aspect de ce travail démontre que des séquences codantes synonymes - bien que spécifiant des protéines identiques - peuvent accéder par mutations ponctuelles à des régions différentes de l'espace phénotypique. Utilisée de manière adéquate, cette propriété permet d'étendre l'évolutivité d'une protéine quelconque dans le cadre d'applications biotechnologiques
Phenotypic stability is essential to the success of organisms evolving under steady conditions. However, the environment is subjected to perpetual stochastic variations, to which living beings must constantly adapt. Evolvability characterizes the ability of a population to respond to such selective pressures through the generation of heritable phenotypic changes. Most mutations being deleterious, processes enabling the confinement of mutations to periods of stress, or to specific loci and well-defined phenotypes, have been selected over evolution. Integrons constitute a particularly sophisticated illustration of such processes. Initially identified through their involvement in multi-resistance to antibiotics, these bacterial genetic Systems are specialized in the exchange and stockpiling of accessory genes and therefore constitute an important source of genetic diversity. This work shows that integrons are directly coupled with the SOS System, a major bacterial stress response. By allowing the generation of significant phenotypic diversity during periods of stress without impacting the rest of the genome, integrons hence constitute a paradigmatic example of evolvability. Another aspect of this work demonstrates that synonymous coding sequences - although specifying identical proteins -can access different area of the phenotypic space through ponctual mutations. When properly exploited, this property can enhance the evolvability of any protein in the context of biotechnological applications

Ce travail a pour objectif (1) de decrire l'evolution et la dynamique spatio-temporelle des bacteries heterotrophes aero-anaerobies, des bacteries temoins de contamination fecale et de certaines bacteries pathogenes et pathogenes opportunistes a travers des bassins experimentaux de lagunage a haut rendement, (2) de quantifier et de qualifier les effets (positifs, negatifs, directs et/ou indirects) de certains facteurs environnementaux sur la dynamique de certaines populations et peuplement bacteriens: les coliformes thermotolerants, les aeromonas spp et les bacteries heterotrophes aero-anaerobies et (3) d'evaluer l'efficacite epuratrice sanitaire de ce procede d'epuration et de la comparer a celle d'un lagunage traditionnel. L'analyse des coefficients de direction (path analysis) appliquee aux donnees recueillies in situ a permis de mettre en evidence des modeles de comportement tres differents suivant la variable bacteriologique et l'echelle d'echantillonnage. Des resultats obtenus experimentalement (microcosmes) permettent d'evaluer le temps de survie (exprime par le t#9#0) d'e. Coli, de s. Typhumurium et d'a. Hydrophila dans les eaux des bassins de lagunage a haut rendement et du lagunage traditionnel. Ces resultats montrent notamment une meilleure faculte d'adaptation d'a. Hydrophila a l'ecosysteme qu'est un bassin de lagunage

La L-asparaginase est une enzyme d’intérêt thérapeutique pour le traitement des leucémies aigües lymphoblastiques participant à l’hydrolyse de son substrat naturel L-asparagine conduisant à l’apoptose des cellules cancéreuses. À ce jour, la L-asparaginase d’origine bactérienne fait partie intégrante des formulations car possédant des activités catalytiques élevées mais provoquant de nombreux effets secondaires liés à une immunogénicité. Trois enzymes avec une activité Lasparaginase produites chez l’homme ont été découvertes récemment mais possèdent des activités catalytiques qui sont 1000 à 2000 fois inférieures aux enzymes d’origine bactérienne. Augmenter l’activité catalytique de ces enzymes par évolution dirigée pourraient permettre leurs utilisations en thérapeutique en plus de potentiellement participer à la réduction de l’immunogénicité chez les patients. Ces travaux de doctorat décrivent le développement d’outils pour l’expression etla détection de l’activité L-asparaginase à l’échelle d’une cellule individuelle. La L-asparaginase d’E. coli, utilisée en thérapeutique, a servi de référence et a permis de démontrer que le test AUR est le plus adapté pour la mesure de l’activité en microfluidique. L’expression de l’enzyme à partir de différents vecteurs d’expression a montré que l’expression périplasmique semble la plus adaptée pour le ciblage permettant un bon rendement et une bonne accessibilité pour le substrat. La viabilité des cellules à l’issu des mesures a été aussi démontrée. Ces outils pourront être directement utilisés pour le criblage de banques de mutants de L-asparaginase d’origine humaine en microfluidique. Les propriétés de la L-asparaginase ont aussi été utilisées pour démontrer la potentielle utilisation de billes de silice en tant que biocatalyseurs où sont confinées des bactéries. Ces billes sont des excellents supports pour la croissance de microorganismes qui peuvent rester viables au-delà d’une semaine. L’expression d’enzymes peut être induite et l’activité catalytique être aisément contrôlée en faisant varier la concentration bactérienne au sein du matériau. La combinaison de différentes populations bactériennes offre la possibilité d’effectuer des réactions en cascade. Le recyclage de ces billes pour différents cycles de réactions a également été démontré. Ces matériaux bioactifs peuvent avoir de nombreuses applications dans le domaine des biotechnologies
L-asparaginase is an enzyme of therapeutic value for the treatment of acute lymphoblastic leukemia. Ths enzyme catalyzes the hydrolysis of L-asparagine conducting to apoptosis of cancer cells. To date, L-asparaginase of bacterial origine is used in the treatments due to high catalytic activities but causing a number of side effects linked with an immunogenicity. The human produces three enzymes with L-asparaginase activity but their catalytic activities are 1000 to 2000 times lower than the bacterial enzymes. Increase the catalytic activity of these enzymes by directed evolution could allow their uses in therapeutic in addition to potentially reduce immunogenicity in patients. This PhD work describes the development of tools for expression and detection of L-asparaginase at the single cell level for their applications in the screening of human L-asparaginase libraries in microfluidic. E. coli L-asparaginase, used in therapy, served as a reference and allowed to demonstrate that AUR assay is most suitable for measuring activity in microfluidic. Expression of the enzyme from different expression vectors showed that the periplasmic expression seems to be the most successful for screening enabling a good yield and good accessibility for the substrate. The viability of the cells following the measures has been shown. These tools might be used for the screening of mutants libraries of human L-asparaginases in microfluidic. The properties of L-asparaginase were also used to demonstrate the potential use of silica beads as biocatalysts in which bacteria are confined. These beads are excellent supports for the growth of microorganisms which may remain viable beyond one week. The expression of the enzymes may be induced and the catalytic activity can be reliably controlled by varying the concentration of bacteria within the material. The combination of various bacterial populations provides the possibility to carry out cascades reactions. The recycling of these beads for several cycles of reactions was also demonstrated. These bioactive materials have many potential applications in the field of biotechnologies

L'objectif de ce travail est de definir le comportement de deux types de peuplements bacteriens dans un ecosysteme lagunaire (etang de thau, france): le peuplement bacterien d'origine continentale (peuplement allochtone) et le peuplement bacterien lagunaire (peuplement autochtone). Une etude preliminaire a permis de definir dans quelle mesure l'utilisation de deux milieux de culture differents (gelose nutritive de salinite 8, biomerieux; milieu marine agar de salinite 34, difco) permettait de distinguer ces deux peuplements. Ensuite, l'echantillonnage a differentes echelles d'observation des abondances de ces deux variables bacteriologiques a permis de decrire leurs evolutions spatiales et temporelles. Les resultats obtenus nous permettent (i) de definir un plan d'echantillonnage optimise pour ces variables bacteriennes et (ii) de tester certaines hypotheses quant aux relations existant entre les bacteries autochtones et allochtones et certaines variables environnementales. Enfin, dans le but d'examiner la structure de ces deux peuplements, une methode de description morpho-macroscopique des colonies bacteriennes est proposee et comparee a la methode biochimique la plus couramment utilisee pour decrire les bacteries des milieux aquatiques: la methode api-20b (api-system). D'une part cette methode simple, rapide et peu couteuse permet d'estimer les indices de structure des peuplements meme si la concordance avec la methode biochimique n'est pas totale (coefficient de kappa). D'autre part cette methode est d'un interet particulier pour l'etude des evolutions de certaines populations bacteriennes "typiques

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle
The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration

L'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA) est cruciale pour l'homéostasie vasculaire des mammifères, chez qui trois ECA co-existent. L'ECAs et l'ECAt sont codées par le même gène qui subit un épissage alternatif. Ainsi, l'ECAs possède deux sites actifs (N-ter et C-ter) alors que l'ECAt n'en présente qu'un seul correspondant au site C-ter de l'ECAs. L'ECA2 est issue d'un autre gène, récemment cloné. Toutes ces enzymes sont ancrées à la membrane cellulaires mais peuvent être solubilisées. L'ECAs et l'ECA2 sont antagonistes, et participent à la régulation de la pression artérielle. L'ECAt permet la fertilité. Chez le rat, nous montrons que l'ECAs et l'ECA2 sont co-exprimées dans les tissus contrôlant la pression artérielle (PA) et participent à la programmation fœtale de l'hypertension. Néanmoins, leur vaste distribution et leur forte expression dans des tissus sans lien avec la PA, dont le tractus digestif, suggèrent d'autres fonctions de l'enzyme. Des ECA existent chez les Insectes, bien que dépourvus de système sanguin fermé. Elles sont solubles et ne présentent qu'un site actif. Plus loin dans l'évolution, C. Elegans ne possède pas d'ECA active. Chez un organisme encore plus distant, la sangsue, nous avons pourtant cloné une ECA soluble, à un seul site actif. Elle est fonctionnelle et son activité ressemble au domaine N-ter de l'ECAs mammalienne. Ces résultats soulèvent de nombreuses questions évolutives et physiologiques sur l'enzyme. De façon surprenante, nous avons également caractérisé une ECA fonctionnelle chez une bactérie, mais ses fonctions physiologiques restent énigmatiques. Ce travail suggère que l'ECA est une enzyme ancestrale, apparue très tôt dans la phylogenèse. Ses fonctions actuelles résulteraient d'une longue spécialisation évolutive.

Ralstonia solanacearum, une béta-proteobactérie d'origine tellurique, est l'une des phytobactérioses les plus nuisibles au niveau mondial. Cette bactérie est capable d'infecter plus de 250 espèces différentes dont certaines présentent un intérêt économique majeur (tomate, pomme de terre, tabac). R. solanacearum est divisée en 4 phylotypes distincts présentant des origines géographiques différentes : I (asiatique), IIA et IIB (américain), III (africain), IV (indonésien). Parmi ces phylotypes, le phylotype I est en expansion démographique, hautement recombinogène, réparti mondialement et possède une large gamme d'hôtes. Il possède donc un fort potentiel évolutif (sensu McDonald et Linde, 2002). Afin de contrôler cette bactérie, la lutte génétique reste la méthode la plus prometteuse : elle consiste à déployer des cultivars possédant différents sources de résistance (i.e., des gènes de résistance). La variété d'aubergine AG91-25 (E6) possède un gène majeur de résistance (ERs1) lui permettant de contrôler certaines souches de R. solanacearum de phylotype I. Cependant, la gestion de cette résistance requiert d'étudier au préalable sa durabilité afin d'en éviter le contournement. Cette durabilité peut être estimée en étudiant le potentiel évolutif d'un agent pathogène face à cette source de résistance, ainsi qu'en décryptant les mécanismes moléculaires de l'interaction entre l'hôte (gène R) et le pathogène (effecteur de types trois). Afin d'étudier la dynamique évolutive de R. solanacearum sous une pression de sélection exercée par la variété résistante E6, nous avons mis en place un essai d'évolution expérimentale au champ. Cet essai est composé de trois couples de microparcelles d'aubergines résistantes E6 et d'aubergines sensibles E8, implantées deux fois par an, pendant trois ans (soit 5 cycles). Un schéma MLVA (« Multi-Locus VNTR Analysis ») composé de 8 loci minisatellites a été développé afin de caractériser les souches extraites de ces cycles de cultures. Ces VNTR sont spécifiques aux souches de R. solanacearum de phylotype I, hautement polymorphes et discriminants à toutes les échelles : mondiale, régionale et locale. Nos résultats démontrent une absence de contournement de la résistance d'E6 par les populations parcellaires de R. solanacearum, confirmant le caractère durable de cette résistance. Cette variété aurait fortement réduit les populations bactériennes du sol, ne leur permettant plus d'infecter l'hôte résistant. Parallèlement, 100% des plants d'E8 sont morts à partir du cycle 2. La maladie au sein des microparcelles semble progresser selon une dynamique de « plante-à-plante ». Une baisse de la diversité génétique a aussi été observée au cours des cycles de culture répétés d'E8, associée à l'augmentation en fréquence de deux haplotypes. Cependant, aucune structuration génétique claire n'a été observée à l'échelle de la parcelle entière ou de la microparcelle. En revanche, les données d'isolement par la distance semblent indiquer qu'une structure spatiale semble être en cours d'établissement. L'ensemble de nos résultats suggère une structure épidémique clonale de nos populations parcellaires. Nous nous sommes aussi intéressés à l'implication de 10 ET3 dans l'interaction R. solanacearum vs aubergine résistante (E6). La distribution des 10 ET3 candidats est variable au sein d'une collection de souches phylogénétiquement diverses (91 souches) : ripAJ et ripE1 sont les ET3 les plus partagés alors que ripP1 et ripP2 sont les moins fréquemment. Certains ET3 présentent peu (ripAJ) voire pas (ripE1 et ripP2) de polymorphisme de taille, alors que d'autres (ripAU) sont extrêmement polymorphes. Cependant la composition en effecteurs d'une souche ne semble pas être corrélée à un phénotype sur aubergine E6. Nous avons identifié le gène d'effecteur ripAX2 comme ayant une fonction d'avirulence sur aubergine résistante E6. Sa reconnaissance par E6 semble s'opérer au niveau de la zone hypocotylaire
Ralstonia Solanacearum is a soilborn beta-proteobacterium responsible of bacterial wilt on Solanaceaous crops. This bacterium is considered as one of the most harmful plant disease worldwide. This bacterium possesses the ability to infect more than 250 different species, including crops with major economic importance (tomato, potato, tobacco, eucalyptus…). R. solanacearum is divided into four phylotypes originated from different areas: I (Asian), IIA and IIB (American), III (African), IV (Indonesian). Among these phylotype, phylotype I is currently in demographic expansion, is highly recombinogenic and has a wide hosts range. Thus, altogether, these characteristics demonstrated that this phylotype has a high evolutionary potential (sensu McDonald and Linde, 2002). In order to control this bacterium, genetic plant resistance seems to be the most promising method. This method consists in using cultivars with different source of resistance such as resistance genes and/or resistant QTLs. The AG91-25 (E6), an eggplant cultivar possessing a major resistance gene (ERs1), is capable to control some of phylotype I strains of R. solanacearum. However, in order to optimize the management of this resistance and to avoid its fast breakdown, we need to deeply investigate the durability of this resistant gene. Durability can be estimated by studying the evolutionary potential of our pathogen faced to E6 source of resistance and by understanding the molecular mechanisms underlying the interaction between the host (R gene) and its pathogene (Type III Effector – T3E). In order to study R. solanacearum evolutionary dynamics under selective pressure from E6 resistant cultivar, we set up an experimental evolution trial in the field. This trial consisted of three couples of resistant (E6) and susceptible eggplants (E8) microplots, implanted twice a year during three years, hence consisting of 5 cycles. A Multi-Locus VNTR Analysis (MLVA) scheme, consisting of 8 minisatellite loci, was developed in order to characterize the strains extracted from these crop cycles. These VNTRs were specific to R. solanacearum phylotype I strains, they were highly polymorphic and discriminatory at different scale: globally, regionally and locally.Our results showed no breakdown of E6 resistance by R. solanacearum populations, which confirms that this resistance is durable. It seemed that this cultivar reduced the soil bacterial population, preventing bacterial population to infest the resistant host. At the same time, 100% of the E8 plants have died, starting at cycle 2. Bacterial wilt seemed to spread with a “plant-to-plant” dynamics within each microplot. Genetic diversity reduction was also observed during the successive cycle of susceptible eggplant, associated with the increase of frequency of two main haplotypes. However, we failed to identify a clear genetic structuration, neither at the plot scale nor at the microplot scale. Nevertheless, isolation-by-distance data seemed to show that a spatial structure is currently establishing. Altogether, our results suggested that our plot populations appeared to have a clonal epidemic structure.We also looked into 10 T3Es' involvement in the interaction between R. solanacearum and the resistant eggplant (E6). Their distribution was completely different within a collection of phylogenetically diverse strains (91 strains): ripAJ and ripE1 are the most shared T3Es whereas ripP1 and ripP2 were the less common T3E whithin our collection of strains. Some T3Es showed few (ripAJ) or no length polymorphism at all (ripE1 and ripP2) whereas some other (ripAU) are extremely polymorphic. Nevertheless, the T3E effector repertoire did not seemed to be correlated to a specific phenotype on E6 eggplant. Its recognition by E6 seemed to occur in the hypocotyle region rather than in the mesophyll, highlighting a possible organ-specificity of the interaction between ERs1 and ripAX2

L’Identification rapide et la classification microbienne précise sont cruciales en microbiologie médicale pour la surveillance de la santé humaine et animale, établir un diagnostic clinique approprié et choisir des mesures thérapeutiques et de contrôle optimales. Cependant, les seuils universels utilisés pour la définition des espèces ne sont pas applicables à de nombreux genres bactériens. C'est notamment le cas des espèces du genre Rickettsia, qui expriment peu de caractéristiques phénotypiques distinctives. Compte tenu de la disponibilité des séquences de près de 100 génomes de Rickettsia, nous avons voulu évaluer une gamme de paramètres taxonomiques basés sur l’analyse des séquences génomiques afin de mettre au point des recommandations pour la classification des isolats au niveau de l’espèce et du genre. En comparant le degré de similarité des séquences de 78 génomes de Rickettsia et 61 génomes de 3 genres étroitement apparentés en utilisant 4 paramètres génomiques, nous avons montré que les outils taxonomiques basés sur les séquences génomiques sont simples à utiliser et rapides, et permettent une classification taxonomique fiable et reproductible des isolats de rickettsies avec des seuils spécifiques. Les résultats obtenus nous ont permis d'élaborer des recommandations pour la classification des isolats de rickettsies au niveau du genre et de l'espèce. À l'aide de la taxono-génomique, nous avons également pu décrire 17 nouvelles espèces bactériennes associées à l'homme. L'utilisation des outils génomiques est donc parfaitement adaptée à la classification taxonomique et peut changer radicalement notre vision de la taxonomie et de l'évolution bactérienne à l'avenir
Rapid identification and precise microbial classification are crucial in medical microbiology for human and animal health monitoring, appropriate clinical diagnosis and selection of optimal therapeutic and control measures. Indeed, the universal used for the definition of species are not applicable to many bacterial genera. This is particularly true of species of the genus Rickettsia which are strictly intracellular alpha-proteobacteria that express few phenotypic characteristics. Given the availability of genomic sequences of nearly 100 rickettsial genomes, we wanted to evaluate a range of taxonomic parameters based on genomic sequence analysis, to develop guidelines for the classification of Rickettsia isolates at the genus and species levels. By comparing the degree of similarity of the sequences of 78 genomes from Rickettsia species and 61 genomes from 3 closely related genera using several genomic parameters, we have shown that genome-based taxonomic tools are simple to use and fast, and allow for a reliable and reproducible taxonomic classification of isolates within species of the genus Rickettsia, with specific thresholds. The obtained results enabled us to develop guidelines for classifying rickettsial isolates at the genus and species levels. Using taxono-genomics, we have also been able to describe 17 new human-associated bacterial species on the basis of a combination of genomic analysis and phenotypic properties. The use of genomic tools is therefore perfectly adapted to taxonomic classification and can dramatically change our vision of taxonomy and bacterial evolution in the future

Les organophosphorés (OPs) sont des neurotoxiques. Leur décontamination est difficile et coûteuse. L’utilisation d’enzymes capables de les détoxifier est une solution élégante. Les enzymes bactériennes sont peu stables et chères à produire. Nous avons identifié des enzymes très résistantes, capable de biodégrader lentement ces composés. Nous avons alors développé une stratégie permettant d'améliorer l'activité de l'enzyme très stable en nous basant sur les enzymes les plus actives. Celle-ci fut améliorée de plus de 1000 fois envers ces insecticides. Enfin, nous avons analysé l'origine de ces améliorations et mis en évidence des concepts émergents dans l'évolution des enzymes
Organophosphorus compounds are neurotoxic. Their decontamination is difficult and cost prohibitive. An appealing solution resides in the use of enzymes capable of degrading such compounds. Bacterial enzymes are poorly stable and expensive. We identified highly resistant enzymes capable of slowly biodegrading these compounds. We have developped a strategy allowing to increase the activity of our enzyme by using the similarities with the highly active enzymes. The activity was increased by a factor of 1000 against OPs. We analyzed the origins of these ameliorations and showed emergent concepts in enzyme evolution

Selon une vision populaire, l’évolution serait un processus de « progrès » qui s’accompagnerait d’un accroissement de la complexité moléculaire des êtres vivants. Cependant, les programmes de séquençage des génomes ont révélé l’existence d’espèces dont les lignées ont, au contraire, subi une réduction massive de leur génome. Ainsi, chez les cyanobactéries Prochlorococcus et Pelagibacter ubique, certaines lignées ont subi une réduction de 30% de leur génome. Une telle évolution « à rebours », dite évolution réductive, avait déjà été observée pour des bactéries endosymbiotiques, pour lesquelles la sélection naturelle n’est pas assez efficace pour éliminer les mutations délétères comme les pertes de gènes. Cela vient notamment du fait que ces bactéries endosymbiotiques subissent, à chaque reproduction de leur hôte, une réduction drastique de leur taille de population. Cette explication semble peu plausible pour des cyanobactéries marines comme Prochlorococcus et Pelagibacter, qui ont un mode de vie libre et qui font partie des bactéries les plus abondantes des océans. D’autres hypothèses ont ainsi été proposées pour expliquer l’évolution réductive comme l’adaptation à un environnement stable et pauvre en nutriments, des forts taux de mutation, mais aucun de ces hypothèses ne semble capable d’expliquer toutes les caractéristiques génomiques observées. Dans cette thèse, nous nous intéressons au cas de l’évolution réductive chez Prochlorococcus, pour laquelle de nombreuses séquences et données sont disponibles. Deux approches sont utilisées pour cette étude : une analyse phylogénétique des génomes de Prochlorococcus, et une approche théorique de simulation où nous testons différents scénarios évolutifs pouvant conduire à une évolution réductive. La combinaison de ces deux approches permet finalement de proposer un scénario plausible pour expliquer l'évolution réductive chez Prochlorococcus
Given a popular view, evolution is an incremental process based on an increase of molecular complexity of organisms. However, some organisms have undergo massive genome reduction like the endosymbionts. In this case the reduction can be explained by the Muller’s ratchet due to the endosymbiont lifestyle with small population and lack of recombination. However, in some marine bacteria, like Prochlorococcus et Pelagibacter, lineage have undergo up to 30% of genome reduction. Their lifestyle is almost the opposite to the one of the endosymbionts and reductive genome evolution can not be easily explicable by the Muller’s ratchet. Some other hypothesis has been proposed but none can explain all the observed genomic characteristics. In the thesis, I am interested in the reductive evolution of Prochlorococcus. I used two approaches: a theoretical one using simulation where different scenarios are tested and an analysis of Prochlorococcus genomes in a phylogenetic framework to determine the causes and characteristics of genome reduction. The combination of these two approaches allows to propose an hypothetical evolutive history for the reductive genome evolution of Prochlorococcus

Le modèle étudié est l'agent phytopathogène vasculaire Ralstonia solanacearum, en portant une attention particulière aux souches de phylotype II. Cette bactérie d'origine tellurique est très diversifiée, tant au plan génétique que phénotypique. Sa classification en constante évolution témoigne d'une volonté de clarifier cette biodiversité inhabituellement forte, tout en cherchant à reconnaître les écotypes structurant ce complexe d'espèces, i.e., des groupes de souches partageant à la fois des traits génotypiques et biologiques spécifiques. Dans le cadre de ce pathosystème modèle, nous nous sommes attachés dans un premier temps à revisiter de façon précise les pathotypes au sein d'écotypes bien décrits dans la littérature, ou à en faire la description (phylotype III africain). Nous avons observé une forte convergence phénotypique entre les souches de phylotype III des hauts plateaux africains et les souches Brown rot de phylotype IIB-1, capables de flétrir la pomme de terre et d'autres Solanacées à température froide. L'adaptation de souches aussi diverses pour la tolérance au froid nous a conduits à dresser un bilan de la situation R. solanacearum en Europe et in extenso dans le bassin méditerranéen. Cette approche a permis d'apprécier les degrés de divergence significative dans le pouvoir pathogène (virulence et agressivité) sur Solanaceae au sein de souches quasi clonales unifiant l'écotype Brown rot, qui s'établissent aussi sous forme d'infections latentes dans les tissus vasculaires de bananiers (Musacées). Dans le même temps, le phénotype de souches pathogènes du bananier, unifiant l'écotype Moko, a aussi été revisité sur Solanaceae qu'elles parviennent à flétrir, y compris des ressources génétiques résistantes au flétrissement bactérien. L'ensemble de ces données expérimentales a permis de dégager les critères de sélection pour le choix de trois nouvelles souches du complexe d'espèces R. solanacearum, dont nous avons obtenu les séquences génomiques. Notre approche en génomique comparative a permis de décrire le premier pangénome chez cet agent pathogène : l'ensemble les gènes repérés de l'espèce. Ces données ont été exploitées par différentes approches bio-informatiques et permettent de concevoir une refonte pertinente du complexe d'espèces R. solanacearum en trois nouvelles espèces génomiques, regroupant les souches de phylotypes I (Asie) et III (Afrique) d'une part, puis les souches de phylotype II (Amérique), et enfin les souches de phylotype IV (Indonésie) d'autre part. Ce pangénome a ensuite été exploité en concevant et développant une puce à ADN, un outil permettant l'exploration à haut débit d'une grande quantité de souches. La densité des données expérimentales accumulées permet une démarche vers l'écologie moléculaire et de reconstituer certains pans du passé évolutif des souches de phylotype II chez R. solanacearum. Par ailleurs, l'analyse approfondie de ces données de génomique, associant phylogéographie et structuration des populations de l'écotype Brown rot, montre une double situation épidémiologique en Europe, recoupant des influences andines et africaines. De la même façon, l'écotype Moko présente trois structures génétiques distinctes. Ces données ont été analysées de manière à retracer les principaux flux de gènes dans les états ancestraux des phylotypes et de dégager la forte contribution de la partie mobile du génome, des gènes relatifs à l'adaptation environnementale et à la pathogénie, comme moteurs dans l'évolution de cet important organisme phytopathogène.

La compréhension de l'évolution des génomes est un des enjeux clé de la biologie actuelle. Nous avons rédigé une revue littéraire consacrée à la contribution de la génomique dans la compréhension de la diversité, de l'évolution et des phénotypes d'un super-phylum bactérien, le super-phylum PVC (Planctomycetes, Verrucomicrobiae et Chlamydiae). Ces bactéries proviennent d'environnements variés et présentent des caractéristiques phénotypiques intéressantes. Les analyses génomiques ont révélé la grande diversité de ces espèces, mais ont aussi permis de reconstruire l'évolution de leurs génomes et d'expliquer l'apparition de certains phénotypes particuliers. Une partie de notre travail était consacré à l'étude de l'évolution et de l'impact de la présence d'un plan cellulaire particulier chez les bactéries PVC. Ce plan cellulaire est sujet a différentes interprétations et induirait la compartimentation des cellules en deux régions distinctes. Les résultats obtenus semblent indiquer que cette caractéristique n'induit pas une protection des génomes bactériens vis à vis des transferts de gènes horizontaux, comme on pourrait le supposer. En revanche les observations microscopiques réalisées sur deux espèces ont permis de mieux appréhender l'évolution de ce plan cellulaire. Nous avons, de plus, détecté une contribution de l'environnement concernant la sélection des gènes transférés. Il semblerait que les gènes transférés soient en effet sélectionnés selon leurs fonctions par les différents environnements.Nos travaux ont donc permis d'améliorer la compréhension des relations entre l'évolution, les phénotypes et l'environnement, en particulier chez les bactéries du super-phylum PVC
The comprehension of genomes evolution is a key issue of modern biology.We wrote a review dedicated to the genomic contribution in comprehension of diversity, evolution and phenotypes, in a bacterial super-phylum named PVC (for Planctomycetes, Verrucomicrobiae and Chlamydiae). These bacteria are distributed in varied environments and present specific phenotypic characteristics. Genomic analyzes revealed the important diversity of these species and allow also to reconstruct the genomes evolution and, in some cases, to explain the presence of specific phenotypes. One part of our work was dedicated to the study of evolution and impact of one of this phenotype, the special cell plan detected in PVC bacteria. This original cell plan is subject to different interpretations and induces the compartmentalization of cells in two different regions, whom one containing the nucleoid. Our results indicate that this feature has probably no role in the protection of bacterial genomes against horizontal genes transfers, so, its function is still unknown. Microscopic observations of two species from PVC super-phylum permit to better understand the evolution of the special cell plan. The environment seems to contribute in the genomes evolution, by selection of genes transferred. Genes transferred are probably selected according to their functions by the different environments.Our works allowed to improve the knowledge about relations between evolution, genomes, phenotypes and environment, especially in bacteria from PVC super-phylum

Les éléments génétiques mobiles contribuent grandement à la diversité et à l’évolution des génomes bactériens par le biais du transfert horizontal. Parmi eux, les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) codent leur propre excision, leur transfert par conjugaison et leur intégration. En revanche, les éléments intégratifs et mobilisables (IME) ne sont autonomes que pour leur excision et intégration et ne codent seulement que certaines des protéines/fonctions (oriT) dont ils ont besoin pour leur transfert conjugatif. Par conséquent, les IME ont besoin d’un élément conjugatif « helper » pour se transférer. Malgré leur impact sur le flux des gènes et l’évolution des génomes, la prévalence des ICE reste peu étudiée et seulement très peu d’IME avaient été identifiés au début de cette étude. De plus, bien que plusieurs méthodes de détection des ilots génomiques existent, aucune d’elles n’est dédiée aux ICE ou aux IME. Ce qui ne facilite pas l’analyse exhaustive de ces éléments. Le genre Streptococcus appartient au phylum des firmicutes. La quasi-totalité des streptocoques sont des bactéries commensales ou pathogènes de l’homme et d’autres animaux. Aussi, 2 espèces de streptocoques sont utilisées en tant que ferments lactiques lors la production de laits fermentés et divers fromages. Globalement, le genre streptocoques représente un groupe d’intérêt pour l’homme, l’étude du flux de gènes au sein de ces organismes et l’impact qu’il peut avoir sur leur mode vie est primordiale. Au cours de cette thèse, nous avons recherché les ICE et les IME dans 124 souches de streptocoques appartenant à 27 espèces en utilisant une base de données de référence comportant des protéines dites « signatures » d’IME et d’ICE (de leurs modules de conjugaison/mobilisation et d’integration/excision). Cette analyse exhaustive a permis l’identification et la délimitation de 131 ICE ou ICE légèrement dégénérés et 144 IME. Tous ces éléments ont été délimités, ce qui nous a permis de déterminer leur spécificité d’intégration dans les génomes. Au total, 17 spécificités d’intégration ont été identifiées pour les ICE dont 8 encore jamais décrites (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC) et 18 spécificités pour les IME dont seulement 5 étaient connues chez les firmicutes. Les modules d’intégration des ICE codent soit une intégrase à tyrosine pouvant avoir une faible spécificité (1 famille d’intégrase) ou une forte spécificité (13 spécificités différentes), soit des intégrases à sérine seule ou en triplet (4 spécificités différentes), soit une transposase à DDE. Les IME codent soit des intégrases à tyrosine (10 spécificités différentes) soit des intégrases à serine seule (8 spécificités différentes). Les ICE ont été groupés en 7 familles distinctes selon les protéines codées par leur module de conjugaison. Les IME présentaient une très forte diversité au sein de leur module de mobilisation, empêchant ainsi leur regroupement en famille selon les gènes portés par ce module. Les analyses phylogénétiques des protéines signature codées par tous les ICE et les IME ont montré des échanges de modules d’intégration entre les ICE et les IME et de nombreux échanges entre les modules de mobilisation des IME. L’ensemble de ces résultats révèle la forte prévalence et l’extrême diversité des ICE et des IME au sein des génomes de streptocoques. Une meilleure connaissance et compréhension de ces éléments nous a incité à construire un outil informatique semi-automatisé de détection des ICE et des IME de Streptocoques ainsi que leurs sites d’insertion
Mobile genetic elements largely contribute to the evolution and diversity of bacterial genomes through horizontal gene transfer. Among them, the integrative and conjugative elements (ICEs) encode their own excision, conjugative transfer and integration. On the other hand, integrative mobilizable elements (IMEs) are autonomous for excision and integration but encode only some of the proteins needed for their conjugative transfer. IMEs therefore need a “helper” conjugative element to transfer. Despite their impact on gene flow and genome dynamics, the prevalence of ICEs remains largely underscored and very few IMEs were identified at the beginning of this study. Furthermore, although several in silico methods exist to detect genomic islands, none are dedicated to ICEs or IMEs, thus complicating exhaustive examination of these mobile elements. The Streptococcus genus belongs to the firmicutes’ phylum. Almost all streptococci are commensal bacteria or pathogenes to men and animals. Two species of Streptococcus are also used in the dairy industry as lactic ferments in order to produce fermented milk and different types of cheese. Studying the gene flux of the Steptococci genus and the impact it can have on the lifestyle of these organisms is essential, as it has a lot of interest for human health and activities. In this work, we searched for ICEs and IMEs in 124 strains of streptococci belonging to 27 species using a reference database of ICE and IME signature proteins (from their conjugation, mobilization and integration/excision modules). This exhaustive analysis led to the identification and delimitation of 131 ICEs or slightly decayed ICEs and 144 IMEs. All these elements were delimited, which allowed us to identify their integration specificities in the genomes. In total, 17 ICE integration specificities were identified. Among them, 8 had never been described before (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC). 18 specificities were also identified for IMEs, among which only 5 were known for the firmicutes. ICEs encode high or low-specificity tyrosine integrases (13 different specificities), single serine intégrases (1 specificity), triplet of serine integrases (3 different specificities), or DDE transposases while IMEs encode either tyrosine integrases (10 different specificities) or single serine integrases (8 different specificities). ICE were grouped in 7 distinct families according to the proteins encoded by their conjugation module whereas the mobilization modules of IMEs were highly diverse, preventing them from grouping into families according to their mobilization modules. The phylogenetic analysis of the signature proteins encoded by all ICEs and IMEs showed integration module exchanges between ICEs and IMEs and several mobilization module exchanges between IMEs. The overall results reveal a strong prevalence and extreme diversity of these elements among Streptococci genomes. Better understanding and knowledge of ICEs and IMEs prompted us to build a semi-automated command-line tool to identify streptococcal ICEs and IMEs as well as to determine their insertion site

Le virus du chikungunya (CHIKV) est un arbovirus émergeant qui, au cours des dernières décennies, s’est largement propagé à l’échelle mondiale. Le virus est transmis par les moustiques du genre Aedes, notamment Aedes albopictus qui est aujourd’hui présent dans une soixantaine de départements en France. Vecteurs de plusieurs agents pathogènes, Ae. albopictus représente une réelle menace de santé publique. L’émergence d’arboviroses est généralement liée à la convergence d’un ensemble de facteurs intrinsèques et extrinsèques affectant le vecteur, l’agent pathogène et l’hôte. Le moustique étant un organisme ectotherme, dont la température interne varie avec celle de l’environnement, il est très sensible aux variations de température du milieu ambiant. La relation entre la température et la transmission des arbovirus reste encore mal comprise, en particulier sur le plan moléculaire. L’objectif général de ce projet est de comprendre comment la température affecte les interactions virus-moustique et influence les cycles de transmission. Pour cela, nous étudions les aspects moléculaires du CHIKV, de son vecteur Ae. albopictus et de leurs interactions sous l’influence de la température. Nos résultats démontrent que la température affecte d’une part l’évolution du CHIKV et d’autre part, l’expression génétique et la composition microbienne du moustique, notamment en réponse à l’infection. Ces données apportent des informations importantes sur la manière dont les systèmes vectoriels peuvent être affectés par la température. La compréhension des mécanismes sous-jacents les interactions virus-moustique avec l’environnement sont essentielles afin de prévenir les épidémies
The chikungunya virus (CHIKV) is an emerging mosquito-borne Alphavirus which has widely spread around the world in the last two decades. The virus is transmitted to human hosts by Aedes mosquitoes, including the invasive species Aedes albopictus, which has today conquered more than half of the French territory. As a vector of several viral pathogens, Ae. albopictus poses a real threat to the health authorities. The emergence of arboviruses such as CHIKV, often results from a complex combination of both intrinsic and extrinsic factors. Since mosquitoes are poikilothermic ectotherms (i.e., internal body temperature is not constant and depends on environmental temperatures), they are acutely susceptible to temperature variations. The relation between temperature and arbovirus transmission is a complex phenomenon that remains poorly understood, especially at the molecular level. The aim of our project is to better understand how temperature affects mosquito-virus interactions and influences transmission cycles. We study the molecular aspects of CHIKV, its vector Ae. albopictus and their interactions under the influence of temperature. Our results show that temperature affects CHIKV evolution as well as mosquito genetic expression and microbial composition, especially in response to infection. These data provide important information on how vector systems can be affected by temperature. Understanding the mechanisms underlying virus-mosquito interactions with the environment is essential in order to prevent epidemics

Cette thèse concerne le développement d’outils microfluidique pour l’ingénierie d’enzymes d’intérêt thérapeutique. La microfluidique à base de gouttelettes présente un énorme potentiel dans le domaine de la biologie quantitative. Nous développons des outils microfluidiques pour l’évolution dirigée de l’enzyme L-asparaginase, enzyme utilisée comme traitement de laleucémie lymphoblastique aiguë. Ce traitement est basée sur une enzyme d’origine bactérienne,ce qui conduit à déclencher des réactions immunitaires qui se traduit par l’interruption du traitement, souvent fatale pour le patient. Cependant, une version humaine de l’enzyme L-asparaginase, qui est moins immunogénique, n’est à l’heure actuelle pas suffisamment active pour être utilisée. L’objectif principal de cette thèse est d’alors d’analyser et de cribler des banques de mutants d’enzymes en utilisant des méthodes classiques de mutagenèse et d’analyser chaque mutant individuellement par le biais de la microfluidique. Pour cela, plusieurs systèmes microfluidiques ont été développés et optimisés afin de répondre à différents critères de sélection pour l’analyse et la sélection de l’enzyme L-asparaginase. La version bactérienne a servi de contrôle positif pour l’optimisation des systèmes microfluidiques afin de pouvoir analyser et de cribler des banques de mutants de la version humaine de l’enzyme L-asparaginase
This thesis deals with the development of microfluidic tools for the engineering ofenzymes of therapeutic interest. Droplet microfluidics has enormous potential in the field ofquantitative biology. We are developing microfluidic tools based on the directed evolutionof the enzyme L-asparaginase, an enzyme used to treat acute lymphoblastic leukemia. Thistreatment is based on an enzyme of bacterial origin, which leads to immune reactions thatresult in the interruption of treatment, often fatal for the patient. However, a human version ofthe enzyme L-asparaginase, which is less immunogenic, is currently not sufficiently active to beused. The main objective of this thesis is to analyze and screen enzyme mutant libraries usingstandard mutagenesis methods and to analyze each mutant individually through microfluidics.For this, several microfluidic systems have been developed and optimized for different selectioncriteria for the analysis and selection of the enzyme L-asparaginase. The bacterial versionserving as a positive control for the optimization of microfluidic workflows to analyze andscreen mutant libraries of the human version of the enzyme L-asparaginase

La dysbiose est une cause importante dans la survenue de maladies, favorisant la prolifération de pathogènes ou induisant l’inflammation. L’étude de ce phénomène est devenue possible grâce aux approches d’analyse génomique (AG) associé avec d’autres techniques. L’entérocolite nécrosante (ECN) et l’infection du pied diabétique (IPD) demeurent deux maladies associées à la dysbiose dans lesquels différents bactéries ont été décrites, notamment C. butyricum dans l’ECN, E. coli et S. aureus dans l’IPD. Dans le cadre de l’ECN, C. butyricum demeure l’espèce la plus fréquente chez les ECN. L’identification clusters liés géographiquement et en fonction du temps. Le portage asymptomatique est suggéré par une similarité génomique des souches patients et contrôles. La prédiction d’un gène de β-hémolysine ainsi leur effet cytotoxique sur les cellules Jurkat avait été observé. De même, sur les cellules Caco-2 malgré le KO du gène de β-hémolysine. En se basant sur l’analyse physico-chimique du surnageant bactérien, nous avons suggéré que la fraction cytotoxique est protéique. La purification de la fraction cytotoxique a permis de trouver une protéine codant pour PspC family possédant un domain conservé commun avec celui de la toxine A/B. L’inactivation du gène codant pour cette protéine n’a pas supprimé l’effet cytotoxique, suggérant la présence d’une combinaison gènes. En parallèle, nous avons ciblé l’impact de C. neonatale par qRPC spécifique rpoB. Cette espèce était plus fréquente chez les patients, ainsi de clones géographiques ont été identifiées. Enfin, des SNPs ont été observés dans des gènes de virulence dans le cas des E. coli et S. aureus isolés de l’IPD
Dysbiosis remains a main cause during the establishment of several diseases, by promoting bacterial translocation, leading to inflammation process. Specific microorganisms were involved in the pathogenesis of dysbiosis-associated diseases, notably necrotizing enterocolitis (NEC) and diabetic foot (DF). This was possible by the implication of whole-genome analysis (WGA) in association with other techniques. In case of NEC, C. butyricum was significantly associated with in NEC; tested on a South-East French cohort. Geographical and/or temporal clusters were identified, thus genomic relationship between NEC-associated isolates and controls, suggesting the presence of asymptomatic carriage. Genes encoding for β-hemolysin was detected and C. butyricum supernatant exhibited cytotoxic effect on Jurkat cells. Cytotoxic effect was also presented on Caco-2 cells. Supernatant of β-hemolysin-mutant C. butyricum showed enterotoxic effect. Basing on physico-chemical data, we assumed that the evaluated fraction was a protein. Proteomics analysis revealed that PspC family was the cytotoxic protein. This protein owned a glucan-binding domain, shared by C. difficile toxin A/B. The KO of PspC gene was enterotoxic, suggesting by this the existence of a combination of genes. In parallel, a specific rpoB-based qPCR was developed to identify C. neonatale. We found that, C. neonatale was more prevalent in NEC than in controls. Although co-identified in association with C. butyricum. C. neonatale clones were distinguished especially in strains isolated from the same hospital. Regarding to DF infection, SNPs were identified within S. aureus and E. coli genomes, especially in virulent genes

Les molécules classiques du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII) sont des glycoprotéines de surface spécialisées dans la présentation de peptides, principalement dérivés de pathogènes extracellulaires, aux récepteurs des lymphocytes T CD4+ afin d’initier la réponse immunitaire adaptative. Elles sont encodées, avec celles du CMH de classe I, par les gènes les plus polymorphiques identifiés jusqu’à maintenant, avec plusieurs loci et une grande diversité allélique à chacun d’eux. De plus, le polymorphisme des gènes du CMHII n’est pas limité qu’aux séquences codantes. Il est également observé dans les promoteurs où on a démontré ses effets sur le niveau d’expression des gènes. La variation de la régulation d’un gène est considérée comme un facteur important et pour laquelle des modifications morphologiques, physiologiques et comportementales sont observées chez tous les organismes. Des séquences d’ADN répétées impliquées dans cette régulation ont été identifiées dans les régions non-codantes des génomes. D’un autre côté, la sélection par les pathogènes permettrait l’évolution et le maintien du polymorphisme des gènes du CMH chez les vertébrés. À ce sujet, plusieurs études ont montré l’implication de différents allèles du CMH dans la résistance ou la susceptibilité aux maladies. Cette étude avait pour objectifs de caractériser le polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis) et de documenter ses effets au niveau de la survie conférée par des allèles et/ou génotypes particuliers lors d’une infection, ainsi que sur la variation du niveau d’expression du gène dans différentes conditions. Dans une première partie, nous avons identifié un total de 6 allèles du gène MHIIb, désignés Safo-DAB*0101 à Safo-DAB*0601, qui montrent une grande similarité avec les séquences codantes provenant de poissons téléostéens et de l’humain. L’analyse des séquences du domaine b1 a permis de détecter l’effet d’une pression sélective positive pour maintenir le polymorphisme dans cette région de la molécule. Quatre de ces allèles ont été testés lors d’une expérience d’infection avec le pathogène Aeromonas salmonicida afin d’évaluer l’effet qu’ils pouvaient avoir sur la survie des poissons. Nous avons trouvé que l’allèle DAB*0101 était significativement associé à la résistance à la furonculose. En plus d’avoir été identifié chez les individus homozygotes pour cet allèle, l’effet a également été remarqué au niveau de la survie les poissons de génotype DAB*0101/*0201. À l’opposé, les facteurs de risque élevé obtenus pour les génotypes DAB*0201/*0301 et DAB*0301/*0401 suggèrent plutôt une association à la susceptibilité. Étant donné la faible fréquence à laquelle l’allèle DAB*0101 a été retrouvé dans la population, le modèle de la sélection dépendante de la fréquence pourrait expliquer l’avantage conféré par ce dernier et souligne l’importance de ce mécanisme pour le maintien du polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine. Dans une seconde partie, nous avons rapporté la présence d’un minisatellite polymorphique formé d’un motif de 32 nucléotides dans le second intron du gène MHIIb, et pour lequel un nombre exclusif de répétitions du motif a été associé à chaque allèle (69, 27, 20, 40, 19 et 25 répétitions pour les allèles DAB*0101 à DAB*0601 respectivement). L’expression relative de quatre allèles a été évaluée dans des poissons hétérozygotes aux températures de 6 ºC et 18 ºC. Les résultats indiquent que les allèles possédant un long minisatellite montrent une réduction de l’expression du gène d’un facteur 1,67 à 2,56 par rapport aux allèles qui en contiennent un court. De même, des allèles qui incluent des minisatellites de tailles similaires n’affichent pas de différence significative au niveau de l’abondance du transcrit aux deux températures. De plus, l’effet répressif associé aux longs minisatellites est amplifié à la température de 18 ºC dans des poissons de trois génotypes différents. Nous avons finalement observé une augmentation significative par un facteur 2,08 de l’expression totale du gène MHIIb à la température de 6 ºC. Ces résultats appuient l’implication des séquences d’ADN répétées dans la régulation de l’activité transcriptionnelle d’un gène et suggèrent qu’un minisatellite sensible aux différences de températures pourrait être soumis aux forces sélectives et jouer un rôle important dans l’expression de gènes et l’évolution des organismes poïkilothermes.
Classical major histocompatibility complex class II (MHCII) molecules are cell-surface glycoproteins specialized in the presentation of peptides, mainly derived from extracellular pathogens, to the antigen receptors of CD4+ T cells in the adaptive immune system. They are encoded, with those of the MHC class I, by the most polymorphic genes known to date, with multiple loci and high allelic diversity at each one. Moreover, the polymorphism within MHCII genes is not restricted to coding sequences. It has also been observed in promoters where it was shown to affect the expression level of the genes. Variation in gene regulation is believed to be an important factor from which modification in morphology, physiology or behaviour can be observed in all organisms. Repeated DNA sequences with functional roles in this regulation have been identified within the non-coding parts of the genomes. On the other hand, pathogen-driven selection is also believed to be important in the evolution and maintenance of the polymorphism of the MHC genes in vertebrates. Studies have shown the implication of different MHC alleles in disease resistance or susceptibility. In this study, our aims were to characterize the polymorphism of the MHIIb gene in brook charr (Salvelinus fontinalis), to document its effects on the survival conferred by specific alleles and/or genotypes following an infection and on the variation of the expression level of the gene in different environmental conditions. In a first part, we identified a total of 6 MHIIb alleles, designated Safo-DAB*0101 to Safo-DAB*0601, showing a high similarity to coding sequences from teleost fish and human. Analysis of the b1 domain sequences indicates the effect of a positive selection pressure to select polymorphic mutations in that region of the molecule. Four of these alleles were tested in a challenge experiment against the pathogen Aeromonas salmonicida to evaluate their effect on fish survival. We found that one allele, DAB*0101, was significantly associated with resistance to furonculosis. In addition to homozygotes for this allele, its resistance effect was also detected in the heterozygote individuals of the DAB*0101/*0201 genotype. In contrast, other allelic combinations, namely heterozygous genotypes DAB*0201/*0301 and DAB*0301/*0401 were significantly associated with increased susceptibility. Given that its frequency was relatively low in the population, the negative frequency dependant selection hypothesis could explain the advantage associated with the allele DAB*0101 over the other alleles and highlight the importance of this mechanism to sustain variation at the MHC in brook charr. In a second part, we reported the identification of a polymorphic minisatellite formed of a 32 nucleotides motif in the second intron of MHIIb gene, and for which distinctive repeat numbers of the motif were associated to each alleles (69, 27, 20, 40, 19 and 25 repeats for the DAB*0101 to DAB*0601 alleles respectively). Relative expression levels of four alleles were determined in heterozygous fish at temperature of 18 ºC and 6 ºC. Results indicate that alleles carrying the longest minisatellite showed a 1.67 to 2.56-fold reduction in the transcript expression relatively to the shortest one. In contrast, no significant differences were seen in the expression levels between alleles with comparable minisatellite length at both temperatures. Furthermore, the repressive activity associated to the longest minisatellite was more effective at temperature of 18 ºC in fish from three different genotypes. We finally observed a significant 2.08-fold up-regulation of the total MHII transcript amount at 6 ºC. The results support the implication of repeated DNA sequences in the regulation of the gene transcriptional activity and suggest that a temperature-sensitive minisatellite could potentially be submitted to selective forces and therefore play an important role in gene expression and evolution in ectothermic organisms.