Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Enzymes ligninolytiques“

Dans un premier temps, un protocole nouveau de production de lignine-peroxydases en culture submergee et agitee de p. Chrysosporium permet d'obtenir ces enzymes (100 a 150 unites par litre) a partir de pelotes du champignon en fermenteur. Cette technique est aisement extrapolable. Huit peroxydases dont six isoenzymes lignine-peroxydases sont isolees du milieu extracellulaire avec un rendement global de 0,68 et caracterisees. Les lignine-peroxydases oxydent totalement un compose modele de la lignine (structure diaryl propane ether). Le produit majoritaire, l'eldehyde veratrylique, provient du clivage de la liaison intercycle entre les carbones alpha et beta. Par contre, sur une lignocellulose (pate mecanique a haut rendement) le seul effet net observe est une perte importante de blancheur (10 points) sans amelioration des caracteristiques mecaniques de la pate. L'action delignifiante des lignine-peroxydases seules, est limitee. Dans un second temps, l'etude du milieu de culture de s. Viridosporus a permis de mettre en evidence, d'une part, la capacite ligninolytique du microorganisme, et d'autre part, l'existence d'un systeme enzymatique extracellulaire degradant la lignine. En effet, une solubilisation de lignine est obtenue, in vitro, a partir des enzymes extracellulaire de ce microorganisme sur une lignocellulose de peuplier. Pres d'un cinquieme de la lignine est ainsi eliminee. Cette activite est independante des activites cellulases, xylanases et peroxydases egalement isolees de ce milieu de culture et doit etre testee sur un substrat papetier

L'elimination de la lignine des composes lignocellulosiques reste le probleme majeur de l'industrie papetiere. Couteuse en energie et fortement polluante, elle genere des chlorolignines fortement toxiques pour l'homme. Ces considerations economiques et ecologiques ont incite la profession a rechercher des innovations technologiques. Dans ce contexte, les procedes biotechnologiques bases sur des enzymes fongiques ligninolytiques representent une alternative particulierement seduisante. Les travaux realises dans le cadre de cette these concernent la maitrise de la production et de la mise en uvre dans le domaine papetier de deux types d'enzymes ligninolytiques, la laccase et la manganese peroxydase (mnp). Dans un premier temps, nous avons selectionne par des methodes de la genetique formelle des souches monocaryotiques de pycnoporus cinnabarinus hyperproductrices de laccases. Deux souches ont ainsi ete selectionnees. Par la suite, deux isoformes de la laccase ont ete isolees et caracterisees chez la meilleure des souches selectionnee (p. Cinnabarinus ss3). Nos travaux se sont ensuite orientes vers la maitrise de la production a l'echelle pilote de mnp par une souche hyperproductrice (phanerochaete chrysosporium i-1512). L'extrapolation d'une technique de culture mise au point par notre unite, associant un systeme immobilise avec un reacteur de type air-lift a permis d'obtenir des taux de production de mnp sans precedents. Enfin, de nouveaux procedes mettant en uvre in vitro la laccase et la mnp sur deux types de pates industrielles (peuplier et paille de ble) ont ete developpes. Les potentialites de ces enzymes ont ete clairement demontrees permettant : - des gains d'energie lors de l'etape de raffinage, entrainant une reduction du cout de production ; - une delignification selective importante permettant une reduction significative du rejet de chlorolignines dans les effluents papetiers.

RésuméL'objectif de cette thèse était de rechercher de nouvelles enzymes de dégradation de la lignine à partir de souches de champignons issus de milieux naturels. Des prélèvements ont été effectués sur du bois dans trois écosystèmes différents : une forêt de feuillus (hêtre, bouleau) et résineux (cyprès Lambert), un cep de chardonnay attaqué par la maladie du bois de la vigne et enfin une souche en décomposition sur un parking d'une zone urbaine. 71 souches de champignons ont été isolées à partir de ces prélèvements. Pour connaître les souches produisant des enzymes d'intérêt, un criblage d'activité ligninolytique a été effectué. Afin de rendre ce criblage le plus exhaustif possible, différentes conditions de culture ont été mises en place. Trois milieux de cultures avec des éléments inducteurs spécifiques ont été testés afin de stimuler la production d'enzymes ligninolytiques par les champignons. Les trois milieux de culture utilisés pour le criblage furent donc un milieu riche sans induction, un milieu avec de la paille de blé et un autre avec du gaïacol. De même, pour prendre en compte l'aspect cinétique de production des enzymes par les champignons, deux temps de mesure à 7 et 14 jours ont été observés. Ce criblage a permis de sélectionner 15 champignons présentant au moins une activité enzymatique d'intérêt. Sur ces 15 champignons, deux souches ont produit leurs activités ligninolytiques seulement sur les milieux contenant un inducteur. Parmi ces 15 champignons, deux basidiomycètes ainsi que 13 ascomycètes appartenant à 6 genres différents ont été identifiés. 12 ascomycètes étaient déjà décrits dans la littérature pour produire des enzymes de type laccase, Lip et Mnp. Les deux basidiomycètes, Peniophora versicolor et Piptoporus betulinus n'étaient pas connus pour cette activité ligninolytique. En outre, l'ascomycète Scedosporium apiospermum a montré une activité de type laccase lors du criblage. Des expérimentations de dégradation de la lignine ont pu déterminer que les enzymes présentes dans le surnageant de culture de ce champignon, possèdent une activité de modification du polymère de lignine. S. apiospermum a donc été sélectionné afin de caractériser ses enzymes de type laccase, détectées lors du criblage. Grâce à un criblage in silico dans le génome de S. apiospermum, neuf gènes putatifs de laccase ont été détectés. Après avoir généré une librairie d'ADNc, cinq gènes putatifs de laccase ont été amplifiés puis clonés avec succès dans la levure Yarrowia lipolytica. Dans les conditions de l'étude, deux gènes Lac2 et ITMO2 permirent d'obtenir des enzymes recombinantes actives. Dans leur structure primaire, les enzymes Lac2 et ITMO2 présentent chacune les sites de coordination du cuivre, spécifiques des oxydases à cuivre. Lac2 et ITMO2 possèdent un pH optimum de 3 et 5 respectivement. Les deux enzymes ont démontré qu'elles possèdent une activité d'oxydation sur des substrats phénoliques comme le 2.6 dimétoxyphénol, le pyrogallol et la dopamine, mais aussi sur des substrats non phénoliques comme le 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) et l'o-Dianisidine
AbstractThe goal of this thesis was to search for new fungal ligninolytic enzymes from the environment. Samples of woody biomass were collected in three different ecosystems: a forest composed of deciduous trees (beech, birch) and gymnosperm (Cupressus macrocarpa), a cep of chardonnay infected with grapevine trunk disease and finally a decaying tree stump in a parking lot of an urban area. 71 strains were isolated from these environments. To select the fungal strain able to produce enzymes of interest a screening for laccase, Lip and Mnp was carried out. In order to maximize the completeness of this screening different culture conditions were used. To trigger the production of ligninolytic enzymes by the fungi Three culture media supplemented or not with inductors were used for the screening. The first medium tested was a rich medium without induction. The two other media contained respectively wheat straw and guaiacol as inductors. Besides, sampling was performed after 7 and 14 days as the kinetics of enzyme production could vary for a given fungal strain and culture conditions. 71 strains were tested for ligninolytic activities and 15 of them presented at least one enzymatic activity. Two of them showed their ligninolytique activities only on the media with inductors. Among the 15 fungi with enzymatic activities of interest, two basidiomycetes and 13 ascomycetes belonging to 6 different genera were identified. 12 ascomycetes were already described in the literature with laccase, Lip or Mnp activity. To our knowledge, the two basidiomycetes Peniophora versicolor and Piptoporus betulinus were not described for producing ligninolytic activities. Besides Scedosporium apiospermum showed laccase activity during the screening. Experiments of lignin degradation were carried out with the culture supernatant of this fungus. The results showed that the enzymes contained in S. apiospermum were able to modify the lignin polymer. This fungus was thus selected to further characterize its laccase like enzymes detected by the screening. Thanks to an in-silico screening in the genome of S. apiospermum 9 putative laccase genes were detected. Five putative laccase genes were then amplified with success from a cDNA library obtained from the mRNA of the fungus. Those five genes were cloned in the yeast Yarrowia lipolytica. In the conditions of the study, two genes called Lac2 and ITMO2 allowed the production of two active enzymes. In their primary structure, the two enzymes present the characteristic sites of copper coordination of multicopper oxidases. Lac2 and ITMO2 present an optimum pH of 3 and 5 respectively. Those two enzymes show an oxidative activity on various phenolic substrates such as 2.6 dimetoxyphenol, pyrogallol and dopamine but also on non-phenolic substrates including 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and o-Dianisidine

Phanerochaete chrysosporium, basidiomycete de la pourriture blanche du bois, secrete plusieurs enzymes ligninolytiques. Les faibles quantites de lignine et manganese peroxydases actuellement produites et l'inhibition partielle de l'excretion de ces enzymes par l'agitation limitent leur utilisation pour des procedes de delignification ou de depollution. Nos objectifs ont donc ete de definir de nouvelles conditions de culture permettant une synthese plus importante de la lignine peroxydase par p. Chrysosporium ina-12. Le changement de temperature 37#o/30#oc, realise apres 2 jours d'incubation, entraine une augmentation du reticulum endoplasmique du champignon et de la production d'enzyme. La synthese de lignine peroxydase est augmentee par l'addition d'une source phospholipidique pauvre en phosphatidylcholine et enrichie en phosphatidylinositol ou par la presence d'inositol. Grace a des marqueurs enzymatiques cellulaires, nous avons montre que le metabolisme energetique (mitochondries et enzyme de la glycolyse) du champignon est augmente par la fraction acide gras (acide linoleique) de la source phospholipidique, alors que la voie de secretion (reticulum endoplasmique) est principalement stimulee par le substituant (inositol). Un modele thermodynamique de prediction de l'adhesion nous a permis de selectionner le polyurethane comme support adapte a la croissance et a la production de lignine peroxydase par p. Chrysosporium ina-12. Nous avons mis au point un procede de production de la lignine peroxydase par le champignon immobilise sur des mousses de polyurethane (systeme de recolte-recharge du milieu de culture). Cette technique a ensuite ete transposee en bioreacteur de 2 litres

Les champignons basidiomycetes filamenteux sont parmi les plus performants pour la degradation de la lignine. Ils doivent leur activite a un complexe enzymatique au sein duquel trois enzymes jouent un role fondamental dans les mecanismes d'oxydation de la lignine. Il s'agit des lignines peroxydases (lip), des manganese peroxydases (mnp) et des laccases (lac). Trois souches fongiques, phlebia radiata (lip, mnp, lac), ceriporiopsis subvermispora (mnp, lac) et pleurotus eryngii (mnp, lac), ont ete selectionnees pour leur aptitude a degrader la paille de ble, dans le but d'utiliser les enzymes les plus efficaces pour la delignification de pates papetieres de paille. L'etude a ete realisee en microscopie electronique a transmission dans le but de montrer comment la nature du substrat et l'equipement enzymatique influencaient la degradation. L'organisation ultrastructurale des tissus lignifies constituant la paille de ble a tout d'abord ete etudiee. Pour cela nous avons mis en uvre de nouveaux marqueurs immunologiques des lignines. La caracterisation des differents types de lignine a mis en evidence des specificites liees a la nature des monolignols constitutifs et aussi a la nature des liaisons inter-unites de type condense et non-condense. L'application de ces marqueurs immunocytochimiques a revele l'heterogeneite de la distribution qualitative des lignines dans les differents tissus et au sein d'un meme type cellulaire. Dans une seconde partie du travail, l'aptitude des champignons a liberer leur enzymes lorsqu'ils se developpent dans la paille a ete etudiee. A l'aide d'anticorps diriges respectivement contre les mnp et les lac nous avons pu suivre la production, par les champignons, de leur enzymes extracellulaires. Ces enzymes sont excretees de facon concomitante au voisinage du site de degradation. Elles n'apparaissent pas dans les hyphes au contact des tissus sains. A des stades de degradation plus avances, l'excretion des mnp et lac a pu etre reliee a la nature de la lignine localement exposee a la degradation. Il a pu etre etabli que l'excretion etait plus forte au contact d'une lignine condensee. L'observation in situ a souligne le role du polysaccharide extracellulaire a l'interface entre paroi lignocellulosique et paroi de l'hyphe, dans le support de certaines enzymes excretees. Les marqueurs de lignines ont en outre revele la presence de fragments de degradation transitant a travers la paroi des hyphes. L'intensite des marquages avec les differents anticorps suggere que les fragments syringiques ont subi une demethylation avant d'etre metabolises dans la paroi de l'hyphe. La delignification des pates chimiomecaniques par des preparations de mnp et de lac purifiees ont montre que ces deux enzymes realisaient des defibrillations locales tres efficaces.