Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Édition de l'ADNmt“

Les cellules humaines contiennent multiples copies d'ADNmt, qui code 37 gènes. L'ADNmt est sujet à des mutations qui peuvent conduire à des maladies affectant gravement les tissus ayant des besoins énergétiques élevés. Nous nous sommes concentrés sur deux mutations pathogènes du gène MT-ND5, 13513G>A et 13514A>G, qui altèrent Asp393, un résidu essentiel à la translocation des protons lors de la synthèse de l'ATP. Notre objectif était d'évaluer si la technologie CRISPR/Cas12a peut être appliquée à l'ADNmt humain. Nous avons démontré que les crRNA chimiquement modifiés améliorent la spécificité de Cas12a à des concentrations physiologiques de Mg²⁺. L'activité spécifique des éditeurs de bases mitochondriales fusionnés à AsCas12a ciblant les gènes ND4 et ND5 de l'ADNmt a été démontrée à la fois in vitro et, pour la première fois, dans les mitochondries de cellules HEK293 en culture. Nous avons également démontré que Cas12a et crRNA fusionnés étaient importés dans des mitochondries isolées, montrant le potentiel de la technologie crosslink pour améliorer l'adressage mitochondriale de crRNA
Human cells contain multiple copies of mtDNA, which encodes 37 genes. mtDNA is prone to mutations that can lead to diseases severely affecting tissues with high energy demands. We focused on two pathogenic mutations in the MT-ND5 gene,13513G>A and 13514A>G, that alter Asp393, a residue critical for proton translocation during ATP synthesis. Our aim was to evaluate whether CRISPR/Cas12a technology can be applied to human mtDNA. We demonstrated that chemically modified crRNAs improve the specificity of the Cas12a system under physiological levels of Mg²⁺. The specific activity of AsCas12a-fused mitochondrial base editors targeting the ND4 and ND5 genes of mtDNA was shown both in vitro and, for the first time, in the mitochondria of cultured HEK293 cells. We also demonstrated that crosslinked Cas12a and crRNA were imported into isolated mitochondria, showing the potential of crosslink technology in enhancing crRNA mitochondrial delivery

L’édition du génome repose sur la création de cassures double brin à un endroit précis du génome à l’aide de nucléases artificielles (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) et sur les différents systèmes de réparation que la cellule va mettre en place pour réparer ces dommages. Les deux systèmes de réparation principaux sont le NHEJ (Non Homologous End Joining) et la RH (Recombinaison Homologue). Le NHEJ consiste en une ligation directe des extrémités de la coupure pouvant induire de petites insertions ou délétions avant la ligation. Ces mutations, si elles sont introduites dans un exon, vont modifier le cadre de lecture et pouvoir inactiver le gène cible (Knock Out). La RH permet la réparation de la cassure en recopiant les informations présentes sur la chromatide soeur. Si un ADN exogène comportant des homologies avec la séquence à réparer est inséré avec les nucléases artificielles, la cellule peut le prendre comme matrice de réparation, il est ainsi possible d’insérer n’importe quelle mutation ou transgène de manière précise (Knock In). Ici, différentes stratégies ont été développées pour optimiser ces approches d’édition du génome. Le couplage du domaine Nter de la protéine CtIP à la nucléase Cas9 permet d’augmenter le taux d’insertion par homologie d’un transgène au site de coupure. Le couplage de l’exonucléase Trex2 à la nucléase Cas9 nickase permet quant à lui d’augmenter le taux de mutation après coupure. Ces nouvelles approches peuvent être largement utilisées et permettent de faciliter l’édition du génome
Genome editing relies on the ability of artificial nucleases (TALEN or CRISPR/Cas9 system) to induce double strand break into a precise and unique sequence in a whole genome and on the different DNA repair system. The two major DNA repair systems are NHEJ (Non Homologous End Joining) and HR (Homologous Recombination). NHEJ consists on DNA end direct ligation. This system can lead to deletion or insertion at the cut site. These mutations, when induced in an exon, can induce reading frame change and gene inactivation (Knock out). HR consists on the use of sister chromatid to copy lost information in order to complete the double strand break. If an exogenous DNA with homologies with the targeted DNA is inserted with artificial nucleases, it can be used as a template and can permit to introduce any transgene at the cut site (Knock In). In this work, different strategies were used to optimize genome editing. By fusing Nter part of CtIP to Cas9, the KI rate of an exogenous DNA is increased and by fusing Trex2 exonuclease to Cas9, the mutation rate induced is also increased. These two approaches can be widely used to improve genome editing strategies

Les cytidine desaminases APOBEC1 (A1) ont une préférence claire pour le substrat pour l'ARN. De plus, il a été démontré que quelques enzymes A1 sont actives sur l'ADN simple brin, ce qui reflète les activités décrites pour les enzymes APOBEC3. Comme APOBEC3A (A3A) humain, APOBEC3B (A3B) humain et des enzymes apparentés appartenant au spectre des mammifères placentaires peuvent introduire des mutations dans l'ADN nucléaire conduisant à des génomes cancéreux, nous avons exploré la menace mutagène de la cytidine désaminase A1 sur l'ADN chromosomique.Utilisation de la 3D-PCR pour détecter des mutations spécifiques GC-AT d’APOBEC, nous avons démontré que les enzymes A1 de la vache, du porc, du chien, du lapin et de la souris avaient une spécificité de substrat intracellulaire d’ADN simple brin. Cependant, seule l'enzyme de souris était capable d'introduire des mutations dans l'ADN nucléaire. Fait intéressant, la souris A1 quitte le même contexte d’édition de dinucléotides (5’TpC) que les enzymes similaires à APOBEC3. Ces caractères ont été mis en parallèle par la désamination de l'ADN substitué de 5-méthylcytidine par A1 de souris, caractéristique des enzymes A3A et A3B de mammifères. L'enzyme A1 de la souris était beaucoup moins efficace que l'A3A humain et était plus proche de l'A3B humain.Au niveau expérimental, APOBEC1 chez la souris est remarquable parmi 12 enzymes de mammifères en ce sens qu’il représente une source de mutations somatiques dans le génome de la souris, alimentant potentiellement l’oncogenèse. Bien que l'ordre de Rodentia soit dépourvu d'un enzyme de type A3A, il semble qu'APOBEC1 pourrait bien le remplacer, tout en restant beaucoup moins actif. Cela modifie le paradigme selon lequel les enzymes APOBEC3 et AID sont les seules enzymes de mutation endogènes donnant lieu à une modification non ciblée des génomes de mammifères
APOBEC1 (A1) cytidine deaminases have a clear substrate preference for RNA. In addition, a few A1 enzymes have been shown to be active on single stranded DNA, mirroring the activities described for APOBEC3 enzymes. As human APOBEC3A (A3A), APOBEC3B (A3B) and related enzymes across the spectrum of placental mammals can introduce mutations in nuclear DNA leading to cancer genomes, we explored the mutagenic threat of A1 cytidine deaminases to chromosomal DNA.Using 3D-PCR to detect APOBEC specific GC to AT mutations, we demonstrated that A1 enzymes from the cow, pig, dog, rabbit and mouse have an intracellular ssDNA substrate specificity. However, only the mouse enzyme was able to introduce mutations into nuclear DNA. Interestingly, mouse A1 leaves the same dinucleotide editing context (5’TpC) as APOBEC3 like enzymes. These traits were paralleled by deamination of 5-methylcytidine substituted DNA by mouse A1 which is a feature of the mammalian A3A and A3B enzymes. Mouse A1 enzyme was far less efficient than human A3A and was closer to human A3B.At an experimental level mouse APOBEC1 is remarkable among 12 mammalian enzymes in that it represents a source of somatic mutations in mouse genome, potentially fueling oncogenesis. While the order of Rodentia is bereft of an A3A like enzyme it seems that APOBEC1 may well substitute for it, albeit remaining much less active. This modifies the paradigm that APOBEC3 and AID enzymes are the sole endogenous mutator enzymes giving rise to off-target editing of mammalian genomes

L’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9 est récemment apparue comme une stratégie thérapeutique potentielle des maladies génétiques. Pour les mutations dominantes de type gain de fonction, la correction allèle-spécifique pourrait être l'approche la plus appropriée. Ici, nous avons testé l'inactivation ou la correction d'une mutation hétérozygote du gène de la dynamine 2 (DNM2) causant la forme autosomique dominante de la myopathie centronucléaire (CNM). Des ARN-guides tronqués ciblant spécifiquement l'allèle muté ont été testés sur des cellules de patients et des myoblastes d'un modèle murin. L'allèle muté a été ciblé avec succès et des clones ont été obtenus avec inactivation ou correction précise du génome. Les myoblastes Dnm2R465W/+ ont montré une altération de l'endocytose et de l'autophagie. L'inactivation ou la correction allèle-spécifique a normalisé ces phénotypes. L'allèle muté a également été ciblé avec succès dans les muscles de la souris Dnm2R465W/+. Ces résultats illustrent le potentiel de CRISPR/Cas9 à cibler et corriger de manière allèle-spécifique les mutations ponctuelles hétérozygotes de type de gain de fonction
Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology has emerged recently as a potential strategy for therapy in genetic diseases. For dominant mutations linked to gain-of-function effects, allele-specific correction may be the most suitable approach. Here we tested allele-specific inactivation or correction of a heterozygous mutation in the Dynamin 2 (DNM2) gene causing the autosomal dominant form of centronuclear myopathies (CNM). Truncated single guide RNAs targeting specifically the mutated allele were tested on cells derived from a mouse model and patients. The mutated allele was successfully targeted in patient fibroblasts and Dnm2R465W/+ mouse myoblasts, and clones were obtained with both precise genome correction or inactivation. Dnm2R465W/+ myoblasts showed an alteration in transferrin uptake and autophagy. Specific inactivation or correction of the mutated allele rescued these phenotypes. The mutated allele was also successfully targeted in Dnm2R465W/+ mouse muscles. These findings illustrate the potential of CRISPR/Cas9 to target and correct heterozygous point mutations leading to a gain-of-function effect in an allele-specific manner

L’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9 est récemment apparue comme une stratégie thérapeutique potentielle des maladies génétiques. Pour les mutations dominantes de type gain de fonction, la correction allèle-spécifique pourrait être l'approche la plus appropriée. Ici, nous avons testé l'inactivation ou la correction d'une mutation hétérozygote du gène de la dynamine 2 (DNM2) causant la forme autosomique dominante de la myopathie centronucléaire (CNM). Des ARN-guides tronqués ciblant spécifiquement l'allèle muté ont été testés sur des cellules de patients et des myoblastes d'un modèle murin. L'allèle muté a été ciblé avec succès et des clones ont été obtenus avec inactivation ou correction précise du génome. Les myoblastes Dnm2R465W/+ ont montré une altération de l'endocytose et de l'autophagie. L'inactivation ou la correction allèle-spécifique a normalisé ces phénotypes. L'allèle muté a également été ciblé avec succès dans les muscles de la souris Dnm2R465W/+. Ces résultats illustrent le potentiel de CRISPR/Cas9 à cibler et corriger de manière allèle-spécifique les mutations ponctuelles hétérozygotes de type de gain de fonction
Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology has emerged recently as a potential strategy for therapy in genetic diseases. For dominant mutations linked to gain-of-function effects, allele-specific correction may be the most suitable approach. Here we tested allele-specific inactivation or correction of a heterozygous mutation in the Dynamin 2 (DNM2) gene causing the autosomal dominant form of centronuclear myopathies (CNM). Truncated single guide RNAs targeting specifically the mutated allele were tested on cells derived from a mouse model and patients. The mutated allele was successfully targeted in patient fibroblasts and Dnm2R465W/+ mouse myoblasts, and clones were obtained with both precise genome correction or inactivation. Dnm2R465W/+ myoblasts showed an alteration in transferrin uptake and autophagy. Specific inactivation or correction of the mutated allele rescued these phenotypes. The mutated allele was also successfully targeted in Dnm2R465W/+ mouse muscles. These findings illustrate the potential of CRISPR/Cas9 to target and correct heterozygous point mutations leading to a gain-of-function effect in an allele-specific manner

La transplantation de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSPH) corrigées autologues est une stratégie prometteuse pour traiter les troubles génétiques sanguins, immunitaires et métaboliques en raison de leur capacité d'autorenouvellement et de différenciation en cellules sanguines variées. Une des méthodes les plus utilisées pour modifier les CSPH repose sur les outils d'édition de gènes comme les nucléases CRISPR/Cas9. L'intégration ciblée via CRISPR-Cas9 permet l'insertion précise de séquences thérapeutiques, offrant une source durable de cellules corrigées La cassure double brin (CDB) induite par Cas9 peut être réparée par trois voies principales : La jonction d'extrémités non homologues (NHEJ), où les brins libres générés sont ré-ligaturés, ou la recombinaison homologue dirigée (HDR) et la jonction d'extrémités médiée par microhomologie (MMEJ), qui utilise un modèle d'ADN pour la réparation. En fournissant un modèle d'ADN externe, la HDR et la MMEJ peuvent être détournées pour insérer des séquences curatives. Une plateforme de thérapie génique a été développée, avec des locus de refuge comme AAVS1 et HBA. Le locus HBA, en raison de sa forte expression d'α-globine et de sa perte de gène asymptomatique, est particulièrement prometteur pour l'expression de protéines thérapeutiques dans les cellules érythroïdes. Cependant, cette approche prometteuse soulève d'importants défis quant à l'amélioration et à l'évaluation de son efficacité et de sa sécurité.Pour aborder ces défis, divers aspects de l'intégration ciblée basée sur CRISPR/Cas9 ont été étudiés, notamment l'optimisation des méthodes d'administration du modèle ADN, la réduction de la toxicité cellulaire et l'exploitation des voies de réparation pour maximiser l'efficacité de l'intégration.L'un des principaux domaines d'investigation a porté sur la sélection et l'optimisation des méthodes d'administration pour l'introduction de modèles donneurs dans les cellules cibles. Les méthodes d'administration non virales et virales ont été explorées, l'AAV6 et l'IDLV se révélant les plus prometteuses.La toxicité cellulaire, souvent déclenchée par les outils d'intégration ciblée comme l'AAV et CRISPR/Cas9, diminue la viabilité cellulaire en activant la réponse aux dommages de l'ADN, affectant ainsi la capacité de greffe des CSPH. Pour atténuer ces effets génotoxiques, des protocoles visant à réduire la toxicité tout en atteignant des taux suffisants d'intégration ciblée ont été explorés.Les voies de réparation basées sur l'homologie, nécessaires à l'intégration des cassettes, sont limitées à des phases spécifiques du cycle cellulaire. La MMEJ opère pendant les phases G1/S, tandis que la HDR se produit pendant les phases S/G2. La NHEJ, active tout au long du cycle cellulaire, est responsable de la plupart des inconvénients de CRISPR, notamment les aberrations chromosomiques post-CDB.Pour favoriser l'utilisation de la HDR et de la MMEJ, un inhibiteur de la NHEJ a été testé, entraînant une augmentation significative de l'efficacité de l'intégration ciblée avec l'AAV et l'IDLV. Avec l'AAV6 identifié comme méthode optimale d'administration et l'inhibition de la NHEJ comme moyen d'améliorer l'intégration ciblée, la sécurité de la stratégie au niveau du site ciblé a été évaluée. En utilisant le séquençage ciblé à lecture longue, la caractérisation et la quantification des altérations génomiques induites par CRISPR/Cas9 et des événements d'intégration ciblée ont été réalisées, démontrant ainsi l'amélioration de la sécurité de notre approche.Ces résultats mettent en évidence le potentiel de l'inhibition de la NHEJ comme stratégie prometteuse pour améliorer l'édition du génome et l'intégration ciblée de l'ADN
Transplantation of autologous corrected Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) emerges as an attractive strategy for treating blood, immune, and metabolic genetic disorders due to their self-renewal capacity and ability to differentiate into any blood cell type. One popular approach to edit HSPCs relies on gene-editing tools such as CRISPR/Cas9 nucleases. Targeted homology-directed integration using CRISPR-Cas9 in HSPCs enables precise insertion of therapeutic sequences, providing a long-term source of corrected cells. The Cas9 induced double-stranded break (DSB) can be repaired via three main pathways: Non-Homologous End Joining (NHEJ), where generated free strands are re-ligated, or Homology Directed Repair (HDR) and Microhomology-mediated End Joining (MMEJ), which uses a template DNA for repair. By providing an external template of interest, MMEJ and HDR can be hijacked to insert curative sequences at a chosen site. A universal gene therapy platform has been developed, with safe harbor loci like AAVS1 and HBA allowing integration of any therapeutic sequence. The HBA locus, with its high α-globin expression and asymptomatic gene loss, is particularly promising allowing the development of a universal platform for expression and secretion of therapeutic proteins into erythroid cells.However, this promising approach raises important challenges about enhancing and evaluating its efficacy and safety. To address these questions, various aspects of CRISPR/Cas9-based targeted integration were investigated, focusing on optimizing delivery methods, minimizing cell toxicity, and exploiting repair pathways to maximize integration efficiency.One of the key areas of investigation centered on the selection and optimization of delivery methods for introducing donor templates into target cells. We explored both non-viral and viral-based delivery approaches.The potential of AAV6 and IDLV delivery methods was found to be the most promising.Cellular toxicity is triggered by numerous tools utilized in targeted integration using CRISPR-Cas9. AAV and CRISPR/Cas9-induced DSBs decrease cell viability by activating the DNA Damage Response, further impacting HSPC engraftment capacity. Concerns about potential genotoxic effects have led us to explore protocols aimed at reducing toxicity while achieving sufficient rates of targeted integration.Homology-based repair pathways necessary for cassette integration are restricted to specific phases of the cell cycle, reducing the window of action for this strategy. MMEJ operates during G1/S phases, while HDR occurs during S/G2 phases. NHEJ, active throughout the cell cycle, is responsible for most CRISPR drawbacks, particularly chromosomal aberrations post-DSB. To promote HDR and MMEJ utilization, a chemical compound known to inhibit NHEJ has been tested. NHEJ inhibition resulted in a significant increase in targeted integration efficiency with both AAV and IDLV-mediated delivery.Having identified AAV6 as the optimal template delivery method and NHEJ inhibition as a means of enhancing targeted integration, the safety of the strategy at the targeted site was assessed. Using targeted long-read sequencing, characterization and quantification of CRISPR/Cas9-induced genomic alterations and targeted integration events were achieved, demonstrating the improved safety of our approach.Overall, these data highlight the potential of NHEJ inhibition as a promising strategy for tuning genome editing and enhancing DNA targeted integration

Cette thèse envisage la géographie des activités scientifiques à travers leur dimension productive (les publications des chercheurs). La méthode définie permet de localiser et d’analyser à plusieurs dates la production et les réseaux de collaboration entre chercheurs à l'échelle mondiale depuis le niveau de l’agglomération urbaine. Les résultats montrent un mouvement récent de diffusion de l’activité à un nombre croissant de lieux, atténuant le monopole d’espaces autrefois hégémoniques et sur-représentés dans le corpus de références étudié (le Science Citation Index Expanded). Une étude de cas est réalisée sur un domaine de recherche en biologie moléculaire : la réparation de l'ADN. Considérant le rôle des trajectoires individuelles, elle aborde les principes géographiques d'émergence de la spécialité et la diffusion spatiale d'une question de recherche associée au domaine de la transcription de l'ADN
This thesis considers the geography of scientific activities through its productive dimension (publications retrieved from bibliographic databases). An original method is designed which relies on two principles: taking the urban area as an elementary level of analysis to study the repartition and organization of research activity at the world scale, taking into account co-authorship data to deduce networks of scientific collaborations between places. The main results show a trend toward the spatial diffusion of production activity at several scales, mitigating the monopoly of hegemonic and over-represented areas in the whole corpus of scientific references considered (SCI Expanded). A case study is realized on a research field in molecular biology: DNA Repair. Considering the role of individual trajectories, it explains the geography of the emergence of the scientific specialty as well as the spatial diffusion of a problem area related to the field of DNA Transcription