Dissertationen zum Thema „Développement animal précoce“

Ce travail présente un modèle théorique de morphogenèse animale, sous la forme d'un système complexe émergeant de nombreux comportements cellulaires. Son implémentation repose sur un système multi-agents fondé sur le couplage mécano-génétique entre les dynamiques de la mécanique cellulaire et de la régulation génétique et moléculaire. Notre objectif est l'intégration des mouvements collectifs de myriades de cellules avec les dynamiques d'expression génétique sous-jacentes aux motifs des champs morphogénétiques. Nous examinons aussi les relations de causalité ascendante reliant les comportements cellulaires locaux aux déformations tissulaires globales. Le comportement mécanique de chaque cellule est associé à leur constitution moléculaire et génétique. Nous nous intéressons particulièrement au phénomène d'intercalation cellulaire induit par des comportements de protrusion active. Différents épisodes morphogénétiques se déroulant au cours des 10 premières heures de développement du poisson zébré sont explorés : la période de clivage, la formation de la couche épithéliale externe l'épibolie, l'internalisation du mésendoderme et la convergence-extension de l'axe antéro-postérieur. Pour chacun de ces phénomènes, une étude de cas examine le rôle respectif des différents tissus impliqués. Les hypothèses que nous proposons sont discutées au moyen de comparaisons automatisées entre les mesures reconstruites issues des données d'imagerie microscopique et des simulations computationnelles. Les reconstructions présentées incluent les champs de déplacements cellulaires in toto en 4 dimensions (3D + temps) de l'embryon de poisson zébré. Le modèle est paramétré à travers une interface inspirée du concept de paysage épigénétique de Waddington, permettant de spécifier les phénomènes d'induction et d'interaction mécanique à l'échelle des champs morphogénétiques
We present a theoretical model of animal morphogenesis construed as a self-organized phenomenon emerging from a complex system made of a myriad of individual cell behaviors. It is implemented in an agent-based simulation centered on the mechanic-chemical coupling between cellular and genetic dynamics. The goal is to integrate the collective motion of cells and the dynamics of their gene expression underlying the patterning of morphogenetic fields. We also investigate the causal bottom-up link from local cell behavior to global tissue deformation. Each cell's mechanical behavior is mapped from its molecular and genetic identity. Among these behaviors, we focus particularly on cell intercalation as an active process driving tissue deformation. We operate this model to explore the different morphogenetic episode occuring through the first 10 hours of the zebrafish development : cell segmentation, enveloping layer formation, epiboly, internalization and convergence-extension. For each specific episode, a case study is realized to decipher the respective role of the different tissue involved. Quantitative measures reconstructed from both the simulated and the experimental data are compared to automatically explore the multi-dimensional parameter spaces of our hypotheses and their interpretation. Various state of the art computational reconstruction will be presented, including global 4D (3D + time) displacement fields from in toto data of the developing zebrafish embryos. A waddingtonian interactive timeline tool to specifiy intra and inter tissue induction and mechanical behaviors is also proposed

Au cours du développement préimplantatoire, l'embryon de mammifère forme le blastocyste, qui est la structure fixant l'embryon dans l'utérus. La formation du blastocyste repose en grande partie sur les forces contractiles générées par le cortex d'actomyosine. Chez la souris, sur des échelles de temps de quelques secondes, nous observons des impulsions de contractions d'actomyosine voyageant périodiquement autour du périmètre cellulaire. Nous appelons ce phénomène vagues de contraction corticale périodique (PeCoWaCo), une manifestation fascinante et mal comprise de la contractilité. Dans cette étude, nous profitons du développement lent de l'embryon de souris pour étudier des milliers d'impulsions de contraction. Nous mettons également à profit la robustesse de ce développement pour explorer les propriétés biophysiques des PeCoWaCo pendant les étapes de clivage précédant la morphogenèse précoce des mammifères.Nous constatons que, lors des étapes de clivage, des mouvements périodiques apparaissent occasionnellement au stade zygote et 2-cellules puis deviennent systématiques après le 2ème cycle de divisions de clivage. Fait intéressant, la période des oscillations diminue progressivement de 200s au stade zygote à 80s au stade 8-cellules. Étant donné que les cellules deviennent de plus en plus petites avec des divisions de clivage successives, la taille des cellules pourrait être un déterminant important dans l'initiation et la régulation des PeCoWaCo. Nous manipulons la taille des cellules sur une large gamme de rayons cellulaires (10-40 µm) en utilisant la fragmentation et la fusion des cellules et constatons que l'initiation, la persistance ou les propriétés des PeCoWaCo ne dépendent pas de la taille des cellules. Après la période des PeCoWaCo, on découvre que les tensions de surface des blastomères diminuent progressivement jusqu'au stade de 8-cellules et que l’assouplissement artificiel des cellules augmente prématurément les PeCoWaCo. Par conséquent, lors des étapes de clivage, l’assouplissement cortical réveille la contractilité zygotique avant la morphogenèse préimplantatoire. En plus, en manipulant la contractilité de l'actomyosine à l'aide de mutants et des drogues, nous avons montré que la période des PeCoWaCo peut être contrôlée par la régulation du taux de polymérisation de l'actine filamenteuse et de l'activité motrice de la myosine.Dans l'ensemble, nos résultats sur les aspects biophysiques et moléculaires du PeCoWaCo nous aident à comprendre comment la contractilité de l'actomyosine s'éveille avant la morphogenèse préimplantatoire et comment elle est régulée au niveau mécanique et moléculaire
During pre-implantation development, the mammalian embryo forms the blastocyst, which is the structure embedding the embryo into the uterus. The shaping of the blastocyst relies in large part on contractile forces generated by the actomyosin cortex. In the mouse, on timescales of seconds, we observe pulses of actomyosin contractions traveling periodically around the cell perimeter. We call this phenomenon periodic cortical waves of contraction (PeCoWaCo), a fascinating and poorly understood manifestation of contractility. In this study, we take advantage of the slow development of the mouse embryo to study thousands of contraction pulses and of the robustness of the mouse embryo to size manipulation to explore the biophysical properties of PeCoWaCo during the cleavage stages preceding early mammalian morphogenesis. We find that, during cleavage stages, periodic movements appear occasionally at the zygote and the 2-cell stage and become systematic after the 2nd round of cleavage divisions. Interestingly, the period of oscillations progressively decreases from 200 s at the zygote stage to 80 s at the 8-cell stage. Since cells becomes successively smaller with successive cleavage divisions, cell size could be an important determinant in the initiation and regulation of PeCoWaCo. We manipulate cell size on a broad range of cell radii (10-40 µm) using fragmentation and fusion of cells and find that the initiation, persistence or properties of PeCoWaCo do not depend on cell size. Following the period of PeCoWaCo, we discover that blastomeres gradually decrease their surface tensions until the 8-cell stage and that artificially softening cells enhances PeCoWaCo prematurely. Therefore, during cleavage stages, cortical softening awakens zygotic contractility before preimplantation morphogenesis. In addition, by manipulating actomyosin contractility using mutants and drugs, we showed that the period of PeCoWaCo can be tuned by F-actin polymerization rate and myosin motor activity. Altogether our results on biophysical and molecular aspects of PeCoWaCo help us understand how actomyosin contractility awakens before preimplantation morphogenesis and how it is regulated both mechanically and molecularly
İmplantasyon öncesi gelişim sırasında, memeli embriyosu, embriyoyu rahim içineyerleştiren yapı olan blastosisti oluşturur. Blastosistin şekillendirilmesi büyük ölçüdeaktomiyozin korteks tarafından oluşturulan kasılma kuvvetlerine dayanır. Farede, saniyelikzaman ölçeklerinde, hücre çevresinde periyodik olarak dolaşan aktomiyozin kasılmalarınındarbeleri gözlemlenebilir. Bu fenomene, kasılmanın büyüleyici ve yeterince anlaşılmamış birtezahürü olan periyodik kortikal kasılma dalgaları (periodic cortical waves of contraction:PeCoWaCo) diyoruz. Bu çalışmada, erken memeli morfogenezinden önceki bölünmeaşamaları sırasında PeCoWaCo'nun biyofiziksel özelliklerini keşfetmek ve binlerce kasılmadarbesini inceleyebilmek için fare embriyosunun yavaş gelişiminden ve fare embriyosununboyut manipülasyonuna dayanıklılığından faydalandık.Bölünme aşamaları sırasında, zigotta ve 2 hücreli aşamada periyodik hareketlerinzaman zaman ortaya çıktığını ve ikinci tur bölünmeden sonra bu hareketlerin sistematik halegeldiğini bulduk. İlginç bir şekilde, salınım periyodunun zigot aşamasında 200 saniyeden, 8hücreli aşamada 80 saniyeye sistematik olarak azaldığını gözlemledik. Hücreler ardışıkbölünmeleriyle sürekli küçüldüğünden, hücre boyutu PeCoWaCo'nun başlatılmasında vedüzenlenmesinde önemli bir belirleyici olabilir. Hücreleri geniş bir hücre yarıçapı aralığında(10-40 μm) küçük parçalara bölerek veya birbirleriyle birleştirerek PeCoWaCo'nunbaşlatılmasının, kalıcılığının veya genel özelliklerinin hücre boyutuna bağlı olmadığını bulduk.PeCoWaCo periyodunu takiben, embriyo hücrelerinin zigottan 8 hücreli aşamaya kadar yüzeygerilimini kademeli olarak azalttığını ve yapay olarak korteksleri yumuşatılan hücrelerinPeCoWaCo'yu zamanından önce geliştirdiğini keşfettik. Bu sonuçlarla bölünme aşamalarısırasında, kortikal yumuşama, ilke implantasyon öncesi morfogenezinden önce zigotikkasılmaları uyandırdığını gösterdik. Ayrıca, genetik mutantlar ve kimyasallar kullanarakaktomiyozin kasılmasını manipüle ederek, PeCoWaCo periyodunun F-aktin polimerizasyonhızı ve miyozin motor aktivitesinin düzenlenmesi ile ayarlanabileceğini gösterdik.Sonuç olarak, PeCoWaCo'nun biyofiziksel ve moleküler yönleriyle ilgili bulgularımız,aktomiyosin kontraktilitesinin implantasyon öncesi morfogenezinden önce nasıl uyandığını,ayrıca hem mekanik hem de moleküler olarak nasıl düzenlendiğini anlamamıza yardımcı olur

La mammite chez le cheptel laitier engendre des pertes économiques considérables pour l'industrie laitière. Un test automatique de dépistage précoce de cette maladie, adapté au système de traite du cheptel, est un besoin urgent pour contrecarrer ces pertes. Nous avons mis au point une méthode immunologique de dosage des IgG totales dans le lait de vache ou de chèvre à l'aide du système Biacore®. Notre méthode permet des dosages rapides, sensibles, spécifiques, exacts et reproductibles. Elle est financièrement attractive et transposable pour la détection d'un marqueur précoce de la mammite au cours de la traite. Nos travaux, associés aux données de la littérature, présentent la protéine S3 du lait en tant que meilleur marqueur biologique actuel pour l'élaboration d'un test de dépistage précoce, sensible et spécifique de la mammite chez le cheptel laitier. Nous avons produit des anticorps monoclonaux anti-SAA3 à l'aide de protéine recombinante SAA3 bovine produite au cours de ce travail de thèse. A terme, ces réactifs biologiques seront utilisés pour permettre le dosage de la protéine SAA3, dans le but de surveiller en ligne l'état sanitaire des mamelles et la qualité du lait
Mastitis in dairy herd causes considerable economic losses for the dairy industry. Automatic test for early detection of this disease, adapted to the lng system, is an urgent need to counter these losses. We have developed an immunological assay method of IgG in cow's or goat's mille using the Biacore system. Our method allows rapid, sensitive, specific, accurate and reproducible assays. It is financially attractive and transposable to detect an early mastitis marker during milking. According to the literature and to our study, SÀA3 protein in milk is the best current biological marker for developing a test for early, sensitive and specific detection of mastitis in dairy herd. We produced monoclonal antibody anti-SAA3 with SAA3 bovine recombinant protein produced during this study. Ultimately, these biological reagents will be used to detect SAA3 protein in milk in order to monitor online health status of the udder and milk quality

Ce travail concerne le comportement de retrait relationnel du jeune enfant, sa mesure et sa validité prédictive sur la qualité du développement précoce dans ses différentes dimensions. Il représente la première synthèse de l'histoire du concept de retrait relationnel du jeune enfant, de ses liens avec les modèles animaux, avec le modèle paradigmatique du "Still Face" et de la réparation, de la dys-synchronie comme facteur majeur de la psychopathologie précoce. Le comportement de retrait relationnel prend ses racines dans la physiologie, comme mode privilégié de régulation par le bébé de l'interaction, dans une échelle micro interactive. D'une façon plus clinique et sur une échelle temporelle plus longue, il apparaît comme un mode de défense majeur face à la violation des attentes du bébé dans l'interaction. On l'observe donc de façon privilégiée dans la dépression maternelle post natale mais aussi dans toutes les circonstances psychopathologiques qui affectent les capacités parentales (par exemple et de façon très nette dans les situations de conflit et violences conjugales). Le retrait relationnel peut également être lié à des difficultés de traitement de l'information sensorielle par le bébé, à des difficultés de communication sociale, à une douleur intense prolongée, et dans la prématurité ou dans certains syndromes génétiques à une association de ces facteurs liés à l'enfant. Ce travail retrace les débuts de la construction d'un outil de mesure du retrait relationnel précoce, dans la mesure où cet outil n'existait pas en tant que tel, alors que le retrait relationnel apparaît comme un signal d'alarme important, témoignant de la difficulté du bébé de jouer le jeu relationnel à hauteur de ses capacités développementales, que ce soit pour des causes liées à lui-même, à la relation avec ses caregivers, ou aux deux. Ce travail s'ouvre par une histoire de la psychiatrie du bébé et de l'avènement de la psychopathologie développementale, car on note l'importance du symptôme retrait dans cette histoire, qu'il s'agisse de l'autisme (Kanner) ou de la dépression ou de la carence précoces (Spitz), puis un historique de concept de retrait relationnel précoce : contexte clinique modèles animaux, biologie, la Construction et validation de l'échelle Alarme Détresse bébé (ADBB à 8 items) puis celle de la m-ADBB à 5 items, puis par la Psychopathologie du retrait relationnel durable, et Les développements et les applications de l'échelle ADBB : m-ADBB, effets à terme du retrait, études longitudinales, la prématurité comme analyseur du développement, dépistage précoce de l'autisme et enfin les projets en cours et trois projets actuels, autour du dépistage de l'autisme, autour de l'étude des différentes analyses factorielles et de la validation de la m-ADBB, et autour des pistes génétiques et épigénétiques du comportement de retrait. Il présente les résultats des études contrôlées et publiées avec l'ADBB, en particulier celles liées à la cohorte française d'étude des facteurs de risque et de résilience du développement précoce (étude périnatale EDEN). Le comportement clinique de retrait relationnel apparaît comme le résultat d'une interaction gène environnement, basée sur la susceptibilité génétique au comportement de retrait. Celle-ci apparaît liée au système allélique 5-HTTPR. Sur le plan cognitif, la question se pose du retrait comme pari, comme choix dans une situation d'incertitude. Les études de suivi des enfants en retrait montrent l'impact sur diverses dimensions du développement, langage, intersubjectivité, régulation émotionnelle, avec la question d'une période sensible. Ceci souligne l'importance du dépistage de ce comportement en vue d'une intervention précoce adaptée à sa cause
This work deals with social withdrawal behavior in infants, its measure and its conceptual validity, its predictive value on early development within its several dimensions. This is the first synthesis on the history of the concept of withdrawal in infant, of its links with animal models, with the still face experimental paradigm, as well as with the repair process and with interactional dys- syssynchrony as a major process in early psychopathology. Social withdrawal behavior has its roots in physiology, as privileged way used by the infant to regulate the input within the parent infant interaction, within a micro temporal scale. On a longer temporal and more clinical scale, withdrawal behavior appears as a major defense maneuver when the baby is faced with major violations of his her expectations within the relationship. It is therefore observed in a privileged way in maternal post-natal depression, but also in all circumstances which hamper parental capacities, as conjugal violence and conflict may do for instance. Social withdrawal behavior may be as well linked with difficulties in processing sensorial input in the child, or difficulties in social communication and synchrony, or be due to an intense and sustained pain, or be linked with some genetic disorder or with some association of these factors. This work retraces the construction of a scale to asses social withdrawal behavior in infants, since no such tool existed at the time, although social withdrawal behavior appears to be an important alarm signal, showing the inability of the child to play the relational game as his her developmental level allow him or her to do, be it for causes related to himself or herself, for relational causes of because of both. This work opens on a history of the development of child psychiatry and of the coming of ages of infant development. Social withdrawal behavior took a large place at the onset of this history, with the description of autism by Kanner and anaclitic depression by Spitz. Then a history of the concept of social relational withdrawal, and of the construction of the alarm distress scale (8 item) the of the short version (5 item m-ADBB), then the studies on long term effects of social withdrawal on development. We then review the application of the scale on early diagnosis of autism, on the several factor analysis with several samples, and of the several epigenetic and genetic pathways of the social withdrawal behavior. This work reviews the results of several controlled studies with the ADBB, particularly those from the perinatal French EDEN cohort. Social withdrawal behavior appears as the result of a gene interaction, based on the genetic c susceptibility for social withdrawal behavior, possibly liked with the 5-HTPPR allele system. On a cognitive level, the issue is raised of social withdrawal behavior as a choice of a risk taking position in an uncertain situation. Follow up studies show the impact of the social withdrawal behavior on several dimensions of early development, i.e. language, early development of intersubjectivity or emotional regulation

L'utilisation du développement précoce de l'oursin nous a permis de mettre en évidence des dysfonctionnements spécifiques du cycle cellulaire et du développement précoce. Nous montrons que le roundup provoque un délai dans l'apparition du premier clivage mitotique ; il retarde l'activation du complexe régulateur de l'entrée en phase M, le complexe CDK/cycline B. La cible moléculaire initiale du roundup est l'activité de synthèse d'ADN. Le mécanisme de surveillance de la transition G2M détecte l'anomalie et provoque le retard du cycle cellulaire. Parallèlement, nous avons mis en évidence que le roundup provoque des dysfonctionnements du développement embryonnaire précoce en affectant le mécanisme de transcription. Les deux effets décrits en présence de roundup sont asociés à des pathologies et leur existence pose problème en terme de santé humaine

Les organismes sont soumis aux fluctuations de l'environnement et les stades précoces (vie embryonnaire) sont particulièrement sensibles aux perturbations qui peuvent modifier les trajectoires développementales. La sensibilité thermique des embryons est une caractéristique générale chez les vertébrés et aurait constitué une force sélective majeure dans l'évolution des soins parentaux (hypothèse de Farmer, 2000). Par ailleurs, le développement embryonnaire est un processus complexe et les influences environnementales peuvent avoir des effets très différents selon la période d'exposition. Pourtant cette variabilité est insuffisamment prise en compte en écologie évolutive et dans l'étude des soins parentaux. L'environnement maternel peut constituer une interface entre l'environnement extérieur et les embryons. La régulation des conditions thermique du développement est très répandue chez les vertébrés. Si les ectothermes produisent une chaleur métabolique négligeable, ils ont développé une diversité de stratégies comportementales et physiologiques pour protéger les embryons des variations thermiques. Les soins parentaux prénataux sont associés à un changement du comportement maternel avec une augmentation des activités de thermorégulation, ainsi qu'à de profondes modifications énergétiques et physiologiques. Nous avons examiné l'importance de la régulation maternelle des conditions prénatales chez deux espèces de serpents aux modes de reproduction contrastés, une ovipare (python de Children, A childreni) et une vivipare (la vipère aspic, V aspis). L'originalité de ce travail repose sur la prise en compte du caractère dynamique de la sensibilité embryonnaire et des contraintes maternelles. Nos résultats nous ont permis de démontrer l'existence d'une sensibilité thermique stade-dépendent, avec une plus forte sensibilité aux perturbations en début de de��veloppement, et l'importance de l'accès à la température préférée pendant cette étape. En parallèle, nous avons pu mettre en évidence un investissement maternel important (thermorégulation comportementale), et les contraintes associées (augmentation des prises de risque, pertes hydriques, coûts énergétiques). Ces données obtenues soutiennent la théorie de Farmer et l'importance de la prise en charge maternelle des stades précoces. Cette sensibilité thermique pourrait avoir constitué une force sélective majeure dans la complexification des soins parentaux (transition vers la viviparité, soins aux œufs)
Organisms undergo environmental fluctuations and early stages (embryonic life) are especially sensitive to perturbations that can modify developmental trajectories. Embryonic thermal sensitivity is a universal feature in vertebrates and may have been a major selective force in the evolution of parental care (Farmer’s hypothesis, 2000). Besides, embryonic development is a complex process and environmental influences can have contrasted effects depending on the timing of exposure. However this variability is insufficiently considered in evolutionary ecology and in studies on parental care. Maternal environment can constitute an interface between the external environment and embryos. Regulation of thermal developmental conditions is widespread in vertebrates. Since ectotherms produce negligible metabolic heat, they have developed a diversity of behavioral and physiological strategies to buffer the embryos from thermal variations. Prenatal parental care is associated with a shift in maternal behavior with an increase of thermoregulatory activities, as well as strong physiological and energy modifications. We examined the importance of maternal regulation of prenatal conditions in two snakes species with contrasted reproductive modes, one oviparous (Children’s python, A. Childreni) and the other viviparous (the aspic viper, V. Aspis). The originality of this work stems from the explicit consideration of the dynamic nature of embryonic sensitivity and maternal constraints. Our results demonstrated (1) the existence of a stage-dependent thermal sensitivity, with a higher sensitivity to perturbations early in development; and (2) the importance of accessing preferred temperature during that period. In parallel, we evidenced a strong maternal investment (behavioral thermoregulation), and associated constraints (risk taking increase, water loss, energetic costs). Our data supported Farmer’s theory and the importance of maternal regulation of early stages. This stage-dependent gradient in thermal sensitivity may have been a major selective force in the evolution of increased parental care (transition toward viviparity, eggs care)

L'oncoproteine mdm2 inhibe l'activite de p53, non seulement en masquant son domaine de transactivation, mais aussi en stimulant la degradation du suppresseur de tumeur grace a son activite e3-ubiquitine ligase. Mdm2 est egalement une des cibles transcriptionnelles de p53, ce qui cree l'opportunite d'un retro-controle negatif de l'activite de p53, essentiel durant le developpement precoce de la souris. Pourtant, le role physiologique precis de mdm2 au cours du developpement n'est pas clair, bien que des arguments existent en faveur de son implication dans le controle de processus essentiels tels que la differenciation et l'apoptose. Dans une premiere partie, nous avons donc etudie l'expression de mdm2 pendant l'embryogenese precoce par hybridation in situ whole mount et avons montre une expression preferentielle de mdm2 entre les jours 8 et 9 pc, notamment dans la crete neurale. Nous pouvons aussi montrer une correlation entre des regions riches en cellules pyknotiques, et des regions de plus faible expression de mdm2. En parallele, nous avons poursuivi notre etude par une approche originale in vivo en transgenese basee sur le systeme inductible cre/lox. Nos resultats suggerent que mdm2 pourraient jouer un role important au cours de la migration et la differenciation des cellules de la crete neurale. Dans une seconde partie, nous avons etudie les potentiels roles alternatifs de mdm2 et avons mis en evidence son implication dans la regulation de la transcription par sa capacite de liaison et de regulation du recepteur aux strogenes.

Les objectifs du travail présenté ont consisté à identifier et caractériser des antigènes très précoces de Trichinella afin de développer un test ELISA plus sensible et spécifique, permettant une détection de l’infection par rapport à l’ELISA E/S, seul test disponible sur le marché. La stratégie a consisté à établir des banques d’ADNc du parasite T. Spiralis recueilli 14h, 20h et 48h post-infestation (pi) et à sélectionner par immunocriblage les séquences potentiellement antigéniques. Les résultats obtenus ont permis de mettre en avant le rôle potentiel de protéines telles que les protéases à sérine ou bien les protéines de choc thermique durant les phases précoces de l’infection. De l’analyse des séquences identifiées, plusieurs cibles particulières ont été sélectionnées et testées vis-à-vis de leur antigénicité. Le clone L20h-Ts1. L’analyse ne révèle aucune identité avec une protéine connue. L’antigénicité de la protéine L20h-Ts1 a été démontrée par Western blot offrant une détection des porcs expérimentalement infestés par T. Spiralis dès 28 jours pi et cela jusqu’à 112 jours. Le clone L20h-Ts3. L’ELISA L20h-Ts3 développé reproduit la cinétique des réponses humorales détectées par l’ELISA E/S dans le cas de fortes infestations offrant un gain de précocité de 1 à 2 semaines ainsi qu’une persistance de la détection au-delà de 20 semaines. Par une approche originale, plusieurs gènes jouant probablement un rôle clef dans l’invasion de l’intestin et la survie du parasite ont été identifiés. De plus, deux antigènes sont des candidats envisageables pour le diagnostic par ELISA des trichinelloses chez le porc

La spermatogenèse peut être anormalement altérée à tous les stades, conduisant à l'azoospermie et à l'infertilité. La microinjection de spermatides (ROSI) peut pallier cette déficience en spermatozoïdes. Pour déterminer la faisabilité de la ROSI et ses conséquences sur le développement, nous avons mis au point une technique de séparation des spermatides chez la souris et l'homme : la cytométrie en flux couplée à un tri cellulaire. La population triée est homogène et exprime les marqueurs spécifiques de la spermatide. Cette technique ne permet pas d'isoler des spermatides dans les éjaculats d'hommes atteints d'azoospermie non obstructive. La PCR inverse a établi leur présence dans 22% des cas seulement, et leur déficience en protamine 2. Nous avons mis au point au laboratoire, la microinjection de spermatozoïdes et de spermatides dans l'ovocyte de souris. Les taux de fécondation et de développement jusqu'au stade 4-cellules sont similaires dans les deux cas. Dans les embryons conçus par microinjection de spermatides, la transcription de la protamine 2 est réprimée dès le stade pronoyau, alors que les ARNm d'Ubely et Ubelx sont présents jusqu'au stade 2- cellules. Les messagers de HSP70. 1 et Smcy sont détectés au stade 2-cellules, en phase avec l'activation du génome zygotique. Ces résultats suggèrent que des mécanismes régulateurs inhibent la transcription inapropriée de certains gènes dans les embryons de souris obtenus par microinjection de spermatides.

L'eczéma allergique de contact (EAC) est une pathologie inflammatoire cutanée de plus en plus fréquente. Il s'agit d'une sensibilisation vis-à-vis de substances chimiques, appelées haptènes, qui sont en contact répété avec la peau. A l'heure actuelle, le pouvoir sensibilisant d'une molécule est évalué principalement grâce à des modèles animaux. Cependant, dans un contexte européen exigeant le développement de méthodes alternatives, la compréhension et la reproduction in vitro des mécanismes de l'EAC permettent le développement de nouvelles stratégies. Le but de ce travail, réalisé sur des cellules dendritiques (DCs) et la lignée humaine U937, est de mettre en évidence les événements précoces de la signalisation intracellulaire à l'origine de l'activation des DCs induite par des allergènes, et notamment par le composé mercurique thimerosal. Les résultats obtenus démontrent que l'induction d'un stress oxydant par les allergènes est un mécanisme induit précocement. L'utilisation d'antioxydants montre que ce mécanisme participe de manière directe à l'initiation du processus d'activation des DCs (expression du CD86 et sécrétion d'IL-8) et de l'apoptose. Le stress oxydant, caractérisé par une production d'ERO associée à une chute du potentiel membranaire mitochondrial et une déplétion en glutathion intracellulaire, est un acteur majeur de la signalisation induite par les allergènes et notamment dans la réponse induite par le thimerosal et le DNCB. Plus particulièrement, ce travail démontre le rôle des groupements thiols dans l'initiation de la transduction du signal aboutissant à l'activation des DCs. Par ailleurs, une signalisation calcique, dépendante du stress oxydant, a également été mise en évidence en réponse aux allergènes. Ces résultats mettent en valeur l'importance de l'étude de la réactivité des allergènes vis-à-vis des groupements thiols et de la nécessité de tenir compte du potentiel oxydant (rédox) des haptènes ainsi que du métabolisme cellulaire dans la mise en place de modèles prédictifs in vitro.

L'eczéma allergique de contact (EAC) est une pathologie inflammatoire cutanée de plus en plus fréquente. Il s’agit d’une sensibilisation vis-à-vis de substances chimiques, appelées haptènes, qui sont en contact répété avec la peau. A l’heure actuelle, le pouvoir sensibilisant d’une molécule est évalué principalement grâce à des modèles animaux. Cependant, dans un contexte européen exigeant le développement de méthodes alternatives, la compréhension et la reproduction in vitro des mécanismes de l’EAC permettent le développement de nouvelles stratégies. Le but de ce travail, réalisé sur des cellules dendritiques (DCs) et la lignée humaine U937, est de mettre en évidence les événements précoces de la signalisation intracellulaire à l’origine de l’activation des DCs induite par des allergènes, et notamment par le composé mercurique thimerosal. Les résultats obtenus démontrent que l’induction d’un stress oxydant par les allergènes est un mécanisme induit précocement. L’utilisation d’antioxydants montre que ce mécanisme participe de manière directe à l’initiation du processus d’activation des DCs (expression du CD86 et sécrétion d’IL-8) et de l’apoptose. Le stress oxydant, caractérisé par une production d’ERO associée à une chute du potentiel membranaire mitochondrial et une déplétion en glutathion intracellulaire, est un acteur majeur de la signalisation induite par les allergènes et notamment dans la réponse induite par le thimerosal et le DNCB. Plus particulièrement, ce travail démontre le rôle des groupements thiols dans l’initiation de la transduction du signal aboutissant à l’activation des DCs. Par ailleurs, une signalisation calcique, dépendante du stress oxydant, a également été mise en évidence en réponse aux allergènes. Ces résultats mettent en valeur l’importance de l’étude de la réactivité des allergènes vis-à-vis des groupements thiols et de la nécessité de tenir compte du potentiel oxydant (rédox) des haptènes ainsi que du métabolisme cellulaire dans la mise en place de modèles prédictifs in vitro
Allergic Contact Dermatitis (ACD) resulting from skin sensitization is a frequent inflammatory skin disease linked to the use of chemicals, called haptens. At this time, the sensitizing potential of a new chemical is evaluated on animal models. However, new European legislation requires alternative methods for skin sensitization. In this context, a better knowledge of ACD and the capacity to reproduce in vitro its mechanisms lead to the development of new alternative methods. The aim of this study performed with human dendritic cells (DCs) and the human cell line U937 was to determine the early events involved in dendritic cell activation induced by contact sensitizers and especially by the mercury compound thimerosal. Data show that oxidative stress induced by sensitizers is an early signaling event leading to DC activation (expression of CD86 and IL-8 release) and to apoptosis. Using antioxidants, our data show that oxidative stress, characterized by ROS production in correlation with the depletion of the mitochondrial membrane potential and of intracellular glutathione, is a key player in signal transduction induced by sensitizers, especially in the response of DCs towards thimerosal and DNCB. More specifically, these studies demonstrate that thiol groups play a direct role in the initiating events leading to DC activation. In addition, calcium influx was detected in DCs exposed to sensitizers, in correlation with oxidative stress. These data highlight the great interest in the development of a hapten-protein binding assay based on thiol groups and the necessity to better understand the redox status of chemicals as well as cell metabolism for predicting skin sensitization

L'étude présentée dans la première partie de ce travail, porte sur la régulation post-transcriptionnelle d'une famille d'ARN (pIL) exprimés préférentiellement dans des fibroblastes de souris transformés ou en croissance active. Comme leurs homologues chez le rat, ces ARN contiennent une séquence répétée. Nous avons pu démontrer que le nombre des transcrits pIL est modulé par un élément de régulation composé d'une région non répétée contenant des motifs communs à tous ces ARNs et d'un élément répété. La fixation de protéines au niveau de cette séquence régulatrice a été mise en évidence par des expériences de retardement sur gel. Ces transcrits pIL sont, d'autre part, trouvés dans des ovocytes de souris fécondes ou non fécondes. Nous nous sommes intéressés aux régulations intervenant lors de ces premiers stades du développement. Un autre modèle original était disponible du fait de l'observation qu'un fragment de 343 pb d'ADN génomique lorsqu'il est injecté dans un oeuf de souris cause l'arrêt précoce des divisions embryonnaires. Nous avons mis en évidence, par les mêmes techniques que précédemment, plusieurs sites de fixation protéique sur ce fragment. Dans un premier temps, nous nous sommes concentrés sur l'un d'entre eux, le motif GTCACATG (identique au motif CDEI des centromères de la levure S. Cerevisiae). Lorsque des oligonucléotides contenant ce motif sont microinjectés dans un ovocyte de souris fécondé, on observe un effet toxique comparable à celui obtenu avec le fragment de 343 pb. Nous avons cloné et séquencé un ADN complémentaire, codant pour une protéine (CDEBP) se fixant de façon spécifique sur cet octamère. L'analyse de la séquence déduite en acides aminés a révélé des régions d'homologies inattendues avec la protéine précurseur de l'amyloïde impliquée dans la maladie d'Alzheimer. Nous avons perturbé l'expression de la protéine CDEBP dans l'oeuf, en utilisant des oligonucléotides complémentaires au messager codant pour elle. De nouveau, ces expériences ont abouti à l'arrêt très précoce du développement embryonnaire. Nous avons caractérisé un deuxième site de fixation sur le fragment de 343 pb, vraisemblablement reconnu par un complexe protéique. Grâce à des expériences de compétition, nous avons pu mettre en évidence l'existence d'interactions entre les protéines se liant spécifiquement aux deux sites de reconnaissance étudiés. Ces protéines cellulaires, ADN-affines, paraissent donc essentielles lors des premiers stades de la division de l'embryon de souris.

En France, le tritium est principalement rejeté sous forme d’eau tritiée (HTO) par les centres de production d’électricité et les centres de traitement des combustibles en fonctionnement normal. Les effets développementaux et reprotoxiques du tritium ont été étudiés. Cependant, peu d’études portent sur les effets moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse est d’évaluer les effets de l’HTO sur les stades embryo-larvaire du poisson zèbre (Danio rerio). Deux débits de dose, 0,4 et 4 mGy/h, ont été testés. Un protocole pour la mesure de l’activité dans les organismes a été mis au point. Il a permis (i) de confirmer que l’internalisation de l’HTO est rapide, (ii) la discrimination des formes de tritium libre dans les tissues et lié à la matière organique, et (iii) le calcul de la dose permettant de relier les effets observés à une dose reçue. Les effets de l’HTO ont été évalués à différents niveaux d’organisation biologique. A l’échelle moléculaire, une analyse transcriptomique (mRNAseq) a montré la modulation de gènes impliqués dans la contraction musculaire et le développement de l’œil à 24hpf ainsi que dans le cycle circadien et la réponse au stress oxydant à 96hpf. Une modulation de gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN a été montrée. A des niveaux d’organisation supérieurs, quelques altérations des fibres musculaires ont été observées pour les deux débits de dose. Une diminution de la vitesse de nage a été montrée à 96 hpf après exposition à 0,4 mGy/h. Ces travaux ont permis de mieux appréhender l’internalisation du tritium, de caractériser la dose absorbée dans les organismes et de mieux comprendre les effets du tritium
In France, tritium is mainly released as tritiated water (HTO) by nuclear power plants and nuclear reprocessing plants. The developmental and reprotoxic effects of tritium have already been studied. However, few studies focus on molecular effects. In this context, the aim of this thesis is to evaluate the effects of HTO on the embryo-larvae stages of the zebrafish (Danio rerio). Two dose rates, 0.4 and 4 mGy/h, were tested. A protocol for the measurement of activity in organisms was developed. It has (i) confirmed that the internalization of HTO is rapid, (ii) allowed the discrimination of the tissue-free-water-tritum and organically bound tritium forms, and (iii) allowed the calculation of the dose permitting to link the observed effects to a received dose. The effects of HTO were evaluated at different biological levels. At the molecular level, a transcriptomic analysis (mRNAseq) showed the modulation of genes involved in muscle contraction and eye development at 24hpf, as well as in the circadian rythm and the response to oxidative stress at 96hpf. Modulation of genes involved in the DNA damage repair was shown. At higher levels of organization, some alterations of muscle fibers were observed for both dose rates. A decrease in swimming velocity was shown at 96 hpf after exposure to 0.4 mGy/h. This work allowed a better understanding of the tritium internalization, to characterize the absorbed dose in organisms and to better understand the effects of tritium

Depuis quelques années, une biopsie testiculaire suivie d’une congélation du tissu testiculaire est proposée aux enfants atteints de cancer avant introduction d’un traitement gonadotoxique. Cette procédure de préservation de la fertilité est proposée avec l’espoir qu’une méthode de restauration de la fertilité soit développée. Le tissu testiculaire décongelé pourrait ainsi être utilisé afin d’effectuer une maturation in vitro, évitant la réintroduction de cellules tumorales, pour produire des spermatozoïdes. Ce travail de thèse a consisté, dans un premier temps, à évaluer la mise en place de la méthylation de l’ADN au sein du tissu testiculaire prépubère de souris au cours de la spermatogenèse in vitro. La culture de tissu testiculaire frais ou décongelé de souris prépubère permet le maintien des niveaux d’expression des ADN méthyltransférases 1 et 3a dans les spermatogonies et les spermatocytes. De plus, la méthylation de l’ADN est retrouvée jusque dans les spermatozoïdes produits in vitro. Par la suite, la qualité nucléaire des spermatozoïdes ainsi obtenus a été analysée. La culture de tissu testiculaire n’a pas d’impact sur le taux d’aneuploïdie, la condensation de la chromatine et la fragmentation de l’ADN spermatique. Cependant, la congélation suivie par la culture organotypique augmente la proportion de spermatozoïdes avec un ADN oxydé. Enfin, la fonctionnalité des spermatozoïdes produits in vitro a été analysée par micro-injection ovocytaire et la dynamique de différentes marques épigénétiques a été étudiée au cours du développement préimplantatoire. Les taux de développement embryonnaire sont diminués par l’utilisation de spermatozoïdes produits in vitro. Les niveaux des histones H3K4me3, H3K27me3 et H3K9ac sont peu modifiés dans les embryons issus de spermatozoïdes générés in vitro alors que la méthylation et déméthylation de l’ADN sont plus impactées. La production de spermatozoïdes après culture de tissu prépubère frais ou décongelé dans le modèle murin a permis de mettre en évidence que cette procédure n’est pas sans impact sur l’embryon précoce bien que la qualité des spermatozoïdes produits soit peu altérée
In recent years, testicular biopsy followed by the freezing of testicular tissue has been proposed to children with cancer before the introduction of a gonadotoxic treatment. This fertility preservation procedure is offered with the hope that a fertility restoration method will be developed. The thawed testicular tissue could thus be used to perform in vitro maturation, avoiding the reintroduction of tumor cells, to produce spermatozoa. This thesis work first consisted in assessing the establishment of DNA methylation in mouse prepubertal testicular tissue during in vitro spermatogenesis. The culture of fresh or thawed mouse testicular testicular tissue allows the expression levels of DNA methyltransferases 1 and 3a to be maintained in spermatogonia and spermatocytes. In addition, DNA methylation is found even in in vitro produced spermatozoa. The nuclear quality of these spermatozoa was then analyzed. The culture of testicular tissue has no impact on sperm aneuploidy rate, chromatin condensation and DNA fragmentation. However, freezing followed by organotypic culture increases the proportion of spermatozoa with oxidized DNA. Finally, the functionality of in vitro produced spermatozoa was analyzed by oocyte microinjection and the dynamics of different epigenetic marks was studied during preimplantation development. Embryo developmental rates are decreased when using in vitro produced spermatozoa. The levels of H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac are slightly modified in embryos derived from spermatozoa generated in vitro whereas DNA methylation and demethylation are more affected. The production of spermatozoa after culture of fresh or thawed prepubertal tissue in the mouse model has shown that this procedure is not without impact on the early embryo, although the quality of the spermatozoa produced is relatively unaltered

Le cerveau des mammifères continue de produire des nouveaux neurones tout au long de la vie adulte, notamment dans le gyrus denté de l'hippocampe, une structure impliquée dans l'apprentissage et la mémoire. Le rôle précis des néo-neurones n'est pas entièrement élucidé et reste au cœur des débats. Les recherches menées lors de cette thèse ont examiné l'implication fonctionnelle des néo-neurones hippocampiques dans les processus d'apprentissage et de mémoire chez la souris adulte. Afin d'identifier les nouveaux neurones hippocampiques et de suivre leur devenir, les souris ont été injectées avec du bromo-deoxyuridine, un marqueur des cellules en division. Ainsi, notre première étude a révélé que les néo-neurones peuvent être recrutés lors du rappel d'informations spatiales anciennes, et que leur activation est spécifique de la situation mnésique initialement apprise. Nos données suggèrent donc que les néo-neurones participent à la réactualisation et à la stabilisation d'une information préalablement apprise. Notre deuxième étude nous a permis de préciser le rôle des néo-neurones en démontrant que la force de l'apprentissage spatial initial influence leur contribution à l'activation du réseau neuronal lors du rappel à long terme. Enfin, par une approche pharmacologique de blocage de la neurogenèse, notre troisième étude a révélé qu'une diminution modérée de la population de jeunes neurones hippocampiques induit une altération des performances mnésiques lors du rappel de diverses tâches spatiales mettant en jeu l'hippocampe, confirmant ainsi leur implication dans le traitement des informations spatiales
New neurons are being produced continuously in the mammalian brain throughout adulthood, most particularly in the dentate gyrus of the hippocampus, a region critical for learning and memory processes. To date, the function of the new granular neurons remains to be elucidated. This doctoral work has focused on the functional role of the hippocampal new neurons in learning and memory processes in adult mice. In order to identify newborn hippocampal neurons and follow their fate, mice were injected with the cell division marker bromo-deoxyuridine. Our first study revealed that new neurons aged 9 days at the time of training are recruited during remote memory retrieval. Moreover, their activation appears to be specific of the initial training situation. Our data suggest that new neurons contribute to the updating and strengthening of a previously encoded memory. Our second study aimed at determining more precisely the role of new neurons by demonstrating whether initial training strength influences their contribution to the overall neuronal activation during remote memory retrieval. In our last study, we provided evidence that a moderate decrease of the number of new neurons was sufficient to induce spatial memory impairments in several learning tasks that are hippocampal dependent, thus pointing to their functional implication in spatial memory processing.

Le syndrome métabolique, défmi comme l'association de pathologies métaboliques et cardiovasculaires, telles que l'hypertension et le diabète de type II, représente actuellement une des premières causes de mortalité dans les pays riches, et constitue un défi majeur de santé mondiale. Cette recrudescence pourrait être liée à la fois à la détérioration des conditions de vie périnatales, mais également à la propagation du style de vie dit « occidental », comme le défend la théorie de la programmation précoce des maladies chroniques de l'adulte. En effet, il existe des périodes critiques de l'ontogenèse durant lesquelles un environnement défavorable, tel qu'une sous-nutrition, entraînerait des adaptations du développement et de la fonctionnalité de certains organes et axes neuroendocriniens, ce qui, une fois l'environnement redevenu plus favorable, conduirait à l'augmentation de la prévalence de pathologies apparentées au syndrome métabolique au cours du vieillissement. Le système sympathosurrénalien et les cellules chromaffmes de la glande médullosurrénale, intervenant dans la réponse au stress et la régulation du métabolisme via la libération des catécholamines, constituent vraisemblablement une cible potentielle de la programmation. Cependant, l'impact des conditions nutritionnelles précoces sur le développement du système sympathosurrénalien ainsi que les conséquences possibles sur son activité à l'âge adulte ne sont pas connus. Nous avons alors entrepris d'analyser les effets d'une dénutrition maternelle périnatale de 50 %, pratiquée de la dernière semaine de gestation au sevrage chez le rat, sur la structure et la fonction de sécrétion des cellules chromaffmes, l'activité de l'innervation sympathique de la médulla, et sur l'expression génique de la glande surrénale au cours de l'ontogenèse et à l'âge adulte. Nous avons ainsi pu démontrer l'existence de profondes altérations de la différenciation des cellules chromaffmes et de la mise en place des îlots chromaffmes et de leur innervation au cours de l'ontogenèse suite à la dénutrition. Nos résultats montrent également que ces modifications précoces entraînent des répercussions à long terme sur la physiologie et l'activité de la glande, notamment en réponse au stress. En considérant l'influence majeure des catécholamines sécrétées par la médullosurrénale dans le maintien de l'homéostasie, nos observations montrent que les adaptations du système sympathosurrénalien constituent un des mécanismes potentiellement impliqués dans la programmation nutritionnelle de pathologies apparentées au syndrome métabolique.

Les grands prématurés sont particulièrement vulnérables aux lésions inflammatoires de la substance blanche (WMI) qui augmentent le risque de troubles cognitifs et neurodéveloppementaux à long terme dans cette population. L’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) dans cette population a permis une évaluation non invasive de la progression des WMI et une meilleure compréhension de la pathologie. Les WMI sont associées une activation de la microglie et des astrocytes et la production de facteurs pro-inflammatoires, dont l’interleukine 1 (IL-1). En utilisant un modèle de WMI induite par injection intracérébrale de lipopolysaccharides (LPS), nous avons évalué dans un premier temps les changements de méthylation de l’ADN durant la phase aigüe (24 h) et la phase chronique (21 jours) de l’inflammation. Par la suite, nous avons déterminé la capacité de l’IRM multimodale de détecter la lésion et la réponse thérapeutique à un antagoniste du récepteur de l’IL-1. Finalement, par le biais d’un antagoniste et d’un modulateur allostérique du récepteur à l’IL-1, nous avons évalué in vitro le rôle de la signalisation IL-1 durant la phase aigüe de la modulation de l’activation de la microglie et des astrocytes par le LPS. Nous avons démontré la présence d’une altération du méthylome cérébral dans divers mécanismes liés au neurodéveloppement et à la réponse immunitaire. De plus, l’application de l’IRM multimodale dans notre modèle a permis d’évaluer in vivo la lésion et le début de la réponse thérapeutique durant la phase aigüe (24 h) de l’inflammation. L’évaluation à l’IRM corrèle aux changements observés par immunomarquage post mortem. In vitro, le LPS induit une réponse mixte de la microglie et des astrocytes qui évoluent dans le temps vers une réponse pro-inflammatoire et neurotoxique. Bien que l’IL-1 est hautement exprimée par la microglie et les astrocytes, son inhibition a un effet limité sur la modulation de l’activation gliale dû à la multitude de voies activées par le LPS durant la phase aigüe de l’inflammation.
Very premature infants are particularly vulnerable to inflammatory white matter injury (WMI) which increases the risk of long-term cognitive and neurodevelopmental disorders in this population. The use of magnetic resonance imaging (MRI) in this population has allowed non-invasive assessment of the progression of WMI and a better understanding of the pathology. WMI is associated with activation of microglia and astrocytes and the production of pro-inflammatory mediators, including interleukin 1 (IL-1). Using a model of inflammatory WMI induced by intracerebral injection of lipopolysaccharides (LPS), we first evaluated the changes in DNA methylation during the acute phase (24 h) and the chronic phase (21 days) of inflammation. We then determined the ability of multimodal MRI to detect the lesion and the therapeutic response to an IL-1 receptor antagonist. Finally, using an antagonist and an allosteric modulator of the IL-1 receptor, we evaluated in vitro the contribution of IL-1 signaling during the acute phase of the modulation of microglia and astrocytes activation by LPS. We have shown the presence of persistent alteration DNA methylation profile in the brain that was associated with pathways involved in neurodevelopment and immune response. In addition, the application of multimodal MRI in our model made it possible to evaluate in vivo the lesion and the therapeutic response during the acute phase (24 h) of the inflammation. The changes at the MRI correlated to post-mortem evaluation by immunostaining. In vitro, LPS induce a mixed response of microglia and astrocytes which evolved over time toward a pro-inflammatory and neurotoxic phenotype. Although IL-1 is highly expressed by microglia and astrocytes, its inhibition has a limited effect on the modulation of glial activation due to the multitude of pathways activated by LPS during the acute phase of inflammation.