Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Cytométrie par microscopie“

Background: The origin of wound-healing fibroblasts is still debated. Dermal papilla cells (DPCs), which are an important population of stem cells for the regeneration of hair follicles, play a considerable role in cutaneous wound healing. Based on the plasticity of DPCs in wound healing, we hypothesized that DPCs may contribute to the fibroblast population of wound repair. Objective: To explore the possibility of differentiation of DPCs into fibroblasts induced by transforming growth factor β1 (TGF-β1). Methods: The fourth passage DPCs were treated with TGF-β1 (10 ng/mL) for 4 days, and a series of methods was used to observe morphologic changes under an inverted phase contrast microscope, to validate the messenger ribonucleic acid expression change in α-smooth muscle actin (α-SMA) and vimentin by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (QRT-PCR), to analyze the expression of α-SMA and vimentin protein by flow cytometry, and to semiquantitatively measure the expression of fibroblast-specific protein 1 (FSP1) by Western blot. Results: DPCs treated with TGF-β1 presented fibroblast-like changes in morphology and immunocytochemistry. The effects of TGF-β1 on α-SMA and vimentin in DPCs were detected on both the transcriptional and the posttranscriptional levels. The results showed that TGF-β1 significantly downregulated α-SMA expression and enhanced the expression of vimentin at all times tested. Further study revealed that TGF-β1 could gradually promote the expression of FSP1 in a time-dependent manner. Conclusion: DPCs experienced the changes in molecular marker expression in response to TGF-β1, which may be a key source of fibroblasts in wound healing. Contexte: L'origine des fibroblastes dans la cicatrisation fait encore l'objet de débats. Les cellules des papilles dermiques (CPD), qui constituent une population importante de cellules souches pour la régénération des follicules pileux, jouent un rôle considérable dans la cicatrisation du tissu cutané. Compte tenu de la plasticité des CPD dans la cicatrisation, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle les CPD pourraient contribuer à l'accroissement de la population de fibroblastes dans la cicatrisation. Objectif: L'étude visait à examiner la possibilité de différenciation des CPD en fibroblastes, provoquée par le facteur de croissance transformant β1 (TGF-β1). Méthodes: Les CPD ont été traités, au quatrième passage, au TGF-β1 (10 ng/mL), pendant 4 jours, et nous avons eu recours à la microscopie à contraste de phase inversée pour observer les changements morphologiques; à la réaction en chaîne par polymérase quantitative, en temps réel, après transcription inverse (RCP-TI) pour valider le changement d'expression de l'acide ribonucléique messager de l'actine des muscles lisses alpha (AMC-α) et de la vimentine; à la cytométrie de flux pour analyser l'expression des protéines d'AMC-α et de vimentine; et au buvardage de Western pour obtenir une mesure semiquantitative de l'expression de la protéine 1 spécifique des fibroblastes (PSF1). Résultats: Les CPD traités au TGF-β1 ont subi des changements morphologiques et immunocytochimiques leur conférant un caractère fibroblastoïde. Les effets du TGF-β1 sur l'AMC-α et la vimentine dans les CPD ont été détectés aux phases transcriptionnelle et posttranscriptionnelle. D'après les résultats obtenus, le TGF-β1 a sensiblement régulé à la baisse l'expression de l'AMC-α et intensifié l'expression de la vimentine, et ce, à tous les points de vérification dans le temps. Enfin, une étude complémentaire a révélé que le TGF-β1 pouvait favoriser graduellement l'expression de la PSF1 en fonction du temps. Conclusion: Les CPD ont subi des changements tels d'expression de marqueurs moléculaires, en réaction au TGF-β1, qu'ils pourraient être une source importante de fibroblastes dans la cicatrisation.

Les zones côtières contribuent de manière importante à la production primaire des océans. Le compartiment phytoplanctonique y joue un rôle prépondérant de par sa position de producteur primaire à la base des réseaux trophiques, mais également en terme de diversité, étant capable d’intégrer et/ou de refléter les changements environnementaux qui s’opèrent à court, moyen et long terme. Le but de ce travail a été de caractériser la dynamique phytoplanctonique en eaux côtières, en utilisant une technique traditionnelle (la microscopie) et une technique d’analyse automatisée des propriétés optiques individuelles des cellules, la cytométrie en flux. L’écosystème de la Manche orientale a été choisi comme site atelier, se caractérisant par un important hydrodynamisme et des efflorescences massives de Phaeocystis globosa. Le principal objectif a consisté en l’étude de la variabilité temporelle des communautés phytoplanctoniques allant du long au court terme, à l’aide de résolutions temporelles différentes, dans le but d’appréhender leur relation avec les facteurs responsables de la variabilité observée. Une première échelle interannuelle sur le long-terme (1992-2007) a permis d’appréhender les principaux changements saisonniers ainsi que les tendances majeures de variabilité des espèces les plus représentées. Une seconde échelle saisonnière sur le moyen terme a permis d’étudier le compartiment phytoplanctonique au cours de la période productive printanière de trois années consécutives (2005-2007), afin de mieux comprendre certains mécanismes régissant les efflorescences micro-algales. Une troisième échelle réalisée au cours de quatre moments différents du bloom printanier en 2007 a permis de suivre la dynamique à plus court terme de groupes cellulaires. Au cours de ces différentes études, des assemblages d’espèces indicatrices ont été identifiés en fonction de leur occurrence et de leur diversité morphologique visant à définir des groupes fonctionnels. En particulier, les morphotypes de Phaeocystis globosa dont la diversité des formes de vie conditionne son succès dans le milieu, ont été analysés dans ce sens. Une fréquence d’échantillonnage appropriée à chaque échelle d’observation a été utilisée, allant de prélèvements mensuels à des prélèvements journaliers. L’abondance, la biomasse et la diversité phytoplanctoniques ont été dans un premier temps estimées par microscopie. Cependant, dans le cadre de l’étude à court terme, il s’est avéré utile d’appliquer une méthodologie alternative à la microscopie. La cytométrie en flux est une technique développée pour l’énumération des cellules individuelles, identifiées à partir de l’analyse de leurs propriétés optiques (diffusion et fluorescence). L’analyse des cellules phytoplanctoniques y est alors facilitée par l’autofluorescence des pigments photosynthétiques. L’appareil utilisé (CytoSense Benchtop CytoBuoy©) est spécialement adapté à la détection et l’énumération des cellules phytoplanctoniques entre 1 µm et 800µm. Cette méthode a nécessité une mise au point et a permis d’effectuer des mesures reproductibles de durée inférieure à 10 min. Des groupes d’espèces voire des espèces ou stades de vie ont été identifiés à la fois manuellement et en système semi-automatisé, sur la base de leurs propriétés optiques similaires
The coastal areas contribute in an important way to the primary production of the oceans. The compartment phytoplanctonic plays there a paramount role from its position of primary producer at the base of the trophic networks, but also in term of diversity. The goal of this work was to characterize phytoplanctonic coastal water dynamics, by using a technique of traditionel analysis (microscopy) and a technique of automated analysis (the cytometry in flow). The coastal area of the Eastern English Channel was selected like site workshop characterizing by the recurrence of massive blooms of Phaeocystis globosa. During the work of thesis, a sampling rate appropriate to the scale of observation was used, from monthly samples to daily. The primary goal consisted to the study of the temporal variability of the phytoplanctonic communities to long term (1992-2007) and medium term (2005-2007), with different temporal resolutions, with an aim of apprehending their relationship to the environmental factors. The second objective aimed at determining the structure of the communities during these various scales. Within a short term study, it proved to be useful to apply an alternative methodology to microscopy. The cytometry in flow is a technique developed for the enumeration of the individual cells, identified from the analysis of their optical properties (diffusion and fluorescence). A cytometer in flow of “scanning” (CytoSense Benshtop-CytoBuoy) was used, especially adapted to the detection and the enumeration of the phytoplanctonic cells between 1µm and 800µm

La protéine XIAP est capable d'inhiber l'apoptose mais les mécanismes moléculaires régissant cette activité sont encore mal définis. Afin d'identifier ces mécanismes, nous avons étudié l'impact de mutations affectant différentes fonctionnalités de la protéine sur la réponse apoptotique à divers inducteurs. L'apoptose a été mesurée grâce à la mise au point d'un test fonctionnel basé sur la mesure de l'activité protéolytique des caspases 3 et 7 dans des cellules surexprimant XIAP mutée ou non. Nous montrons que : (1) l'effet protecteur de XIAP varie selon l'inducteur utilisé ; (2) en condition de surexpression, les modifications post-traductionnelles de la protéine affectent peu son activité ; (3) l'activation de la voie NF-kB ne contribue pas à l'activité anti-apoptotique de XIAP tout comme l'activité E3 ubiquitine ligase du domaine RING qui n'est généralement pas nécessaire ; en revanche, (4) l'oligomérisation de la protéine via ses domaines BIR1 et RING contribue à son effet inhibiteur, et la perte simultanée d'interaction avec les caspases 3, 7 et 9 réduit significativement l'inhibition de l'activité des caspases 3 et 7. Par ailleurs, nous avons montré que les voies de signalisation intrinsèques peuvent être différenciées en fonction de l'existence d'une boucle d'amplification non canonique dépendante de Smac ou d'une branche d'activation directe de la caspase 7. En marge de ces travaux, sont également présentés dans ce manuscrit les premiers résultats obtenus dans le cadre du développement d'une nouvelle méthode fluorescente pour étudier les interactions protéine-protéine directement dans les cellules vivantes, et de son application aux protéines de la famille Bcl-2
The anti-apoptotic activity of XIAP protein is well-established but the underlying molecular mechanisms remain unclear. To identify these mechanisms we studied the effects of several mutations targeting specific features of the protein on its ability to inhibit apoptosis in response to various inducers. Apoptosis was quantified with a novel functional assay based on the measure of caspases 3 and 7 proteolytic activity in XIAP overexpressing cells. Our results show that : (1) the extend of XIAP-mediated inhibition of caspases varies depending on the inducer used to trigger apoptosis ; (2) when XIAP is overexpressed, post-translational modifications of the protein have a limited impact on its activity ; (3) NF-kB activation does not contribute to XIAP anti-apooptotic function and the E3 ubiquitin ligase activity of the RING domain is in most cases dispensable ; in contrast, (4) dimerization of the protein mediated by its BIR1 and RING domains contributes to its function, and the simultaneous loss of interaction with caspases 3, 7 and 9 diminishes but do not suppress the inhibition of caspases 3 and 7 activity. In addition we show that intrinsic apoptotic pathways can be differentiated depending on the existence of a non-canonical Smac amplification loop of a direct caspase 7 activation arm. Besides this work we also present the first results obtained in the course of the development of a new fluorescent method to study protein-protein interaction in living cells and its application to Bcl-2 family proteins

La biologie synthétique promet de révolutionner la façon dont les scientifiques manipulent et analysent les systèmes vivants. Dans ce projet, nous proposons de développer une nouvelle classe de réseaux de gènes synthétiques, basée sur la compétition entre la forme active et inactive d'un facteur de transcription synthétique. Afin de déterminer les paramètres moléculaires et les topologies requises pour une fonction voulue, nous utilisons une approche in silico évolutionnaire couplée à de la modélisation. Avec cette méthodologie, nous voulons construire des circuits à multiples entrées, ainsi que de nouveaux réseaux bistables et oscillatoires. Cette nouvelle classe de réseaux pourra par la suite être étendue à des réseaux multi-cellulaires montrant des motifs dissymétriques ou oscillatoires. Ce projet fondamental à l'interface entre la modélisation et la validation expérimentale permettra de promouvoir le développement de circuits avancés avec des applications prometteuses en diagnostique, en thérapie génique et en ingénierie tissulaire avancée
Synthetic biology, by its engineering approach, promise to revolutionize the way scientists manipulate and analyze living systems. In this project, we propose to develop a new class of synthetic gene circuits whose fine tuning rely on the affinity competition between active and inactive forms of a transcription factor. Modelling, together with an in silico evolutionary approach, will be used to determine molecular parameters and network topologies required for a given functionality. Circuits will be assembled accordingly and their expression in mammalian cells measured to confirm the expected response or correct our model. Using this methodology, we plan to build multi-inputs circuits with tunable response function, as well as new bistable and oscillatory circuits. The new investigated class of circuits will also be extended to multi-cellular networks exhibiting symmetry breaking or oscillating patterns. This fundamental project bridging modelling and experimental validation will promote the development of advanced targeting circuits with promising applications in diagnosis, gene therapy and complex tissue engineering

Trois inquiétudes, actuellement, dans le monde de la microbiologie médicale : la fréquence des infections nosocomiales, d'origine bactérienne dans plus de 60% des cas, la multiplication et la dissémination des résistances bactériennes, mais aussi la pénurie annoncée en molécules antibiotiques et antiseptiques. Il est indispensable de trouver de nouvelles molécules antibactériennes, avec un mécanisme d'action innovant. Nous présentons dans cette étude, l'évaluation d'une molécule innovante, calixarène purement synthétique, le para-guanidinoéthylcalix[4]arène (Cx1). Dans une 1ère partie de ce travail, nous avons montré que cette molécule se caractérise par : (i) une activité antibactérienne à large spectre, conservée sur des isolats cliniques tels que les SARM, les ERG ou les EBLSE ; (ii) une activité rapidement bactéricide, concentration-dépendante ; et (iii) une absence de cytotoxicité in vitro. Des interactions de type synergie sont obtenues avec de nombreux antibiotiques (ß-lactamines, fluoroquinolones, rifampicine, acide fusidique, tigécycline…) ; aucun antagonisme n'a été observé. Dans une 2ème partie, nous avons souligné l'absence de sélection de mutants résistants in vitro, après 30 passages, pour S. aureus et P. aeruginosa. Pour E. coli, des mutants résistants stables sont sélectionnés au delà de 15 ou 20 passages, avec un effet inoculum. Enfin, dans une 3ème partie, nous avons recherché la ou les cible(s) du Cx1 par diverses techniques, innovantes (microélectrophorèse, microscopie à force atomique) ou plus classiques (cytométrie en flux, liaison au LPS/LTA). L'ensemble des données recueillies converge vers l'existence d'une cible ou plusieurs cibles pariétales (liaison au LPS et au LTA, à d'autres structures ?). L'activité du Cx1 résulte en une modification des propriétés pariétales (densité de charge de surface, souplesse hydrodynamique, perméabilité membranaire) et en une augmentation de la rigidité bactérienne (pression osmotique). En conclusion, le Cx1 possède un potentiel intéressant en terme de nouvel antibactérien, mais de nombreuses inconnues demeurent encore concernant son mécanisme d'action. Cela laisse ouverte la porte à de nombreuses voies de recherche afin de mieux appréhender les cibles de cette molécule, et d'en optimiser les propriétés
The progressive reduction of the therapeutic effectiveness of the available antibiotics and antiseptics as a result of the spread of antimicrobial resistance underlines the urgency of the development of new classes of drugs for the treatment of infectious diseases. The major challenge is to find drugs that act against multiple multidrug-resistant strains, with a real new mechanism of action. The work presented here is an evaluation of the potential of the para-guanidinoethylcalix[4]arene (Cx1), as a new innovative antibacterial. In the first part of this work, we have demonstrated that Cx1 possess: (i) a broad-spectrum with an activity conserved against multidrug-resistant isolates such as MRSA, VRE or ESBL-producing Enterobacteriaceae; (ii) a rapid bactericidal and concentration-dependant activity; and (iii) an absence of cytotoxicity in vitro. Checkerboard studies have underlined a large number of synergies with numerous antibiotics (ß-lactamins, fluoroquinolones, rifampicin, fusidic acid, tigecycline…) ; no antagonism have been observed. In the second part, we have showed that Cx1 was not able to select resistant mutants with S. aureus and P. aeruginosa. For E. coli, we have observed resistant mutants beyond 15 or 20 passages, with inoculums effect. In the last part of this work, we have used various techniques in order to elucidate mechanism of action of Cx1: innovative techniques (microelectrophoresis, atomic force microscopy),and other more classical (flow cytometry, LPS/LTA sequestration). All data obtained conduct us to confirm our first hypothesis: Cx1 possess one or many targets on bacterial cell wall, and its activity was translated by wall changes (surface charge density, hydrodynamic properties, membrane permeability), and increase of bacterial rigidity (increase of turgor pressure). In conclusion, Cx1 appears as a good candidate as new antibacterial or adjuvant in anti-infectious therapy, but its real mechanism of action remains unknown. Numerous research ways remain to be investigated in order to better understand of targets of Cx1, and to optimize its antibacterial properties