Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Conflit entre la réplication et la transcription“

Ce papier sur les espaces naturels protégés, s’inscrit dans un contexte national et international où les thématiques environnementales occupent une place de plus en plus importante dans les débats sociaux et les préoccupations politiques. Élément incontournable de la gestion des ressources naturelles, de l’aménagement des territoires et du développement durable, les espaces protégés traduisent des représentations très variables du rapport des sociétés à leur espace de vie. Ils sont les révélateurs des différences entre des modes concurrents de gouvernance des territoires. La méthodologie repose sur une recherche bibliographique et sur des enquêtes administrées par guides d’entretiens et par questionnaires. Les résultats permettent de comprendre les jeux et les stratégies d’acteurs en cours pour le contrôle et l’exploitation des ressources de l’aire protégée, mais également leur déclinaison ou leur transcription en plusieurs conflits latents ou ouverts et non au seul conflit ouvert de la crise casamançaise. Ils montrent également que le parc n’est pas à l’origine des conflits sur la scène locale, mais qu’il constitue un cadre qui facilite leur éclosion et leur lecture. Des recommandations sont enfin proposées sur des formes alternatives de gouvernance susceptibles d’apaiser ou de réguler les conflits autour du Parc. This paper on protected natural areas falls within national and international context where environmental themes occupy an increasingly important place in social debates and political concerns. An essential element in the management of natural resources, regional planning and sustainable development, protected areas reflect very variable representations of the relationship of societies to their living space. They reveal the differences between competing modes of territorial governance. The methodology is based on bibliographic research and on surveys administered by interview guides and questionnaires. The results make it possible to understand the games and the strategies of actors in progress for the control and the exploitation of the resources of the protected area, but also their variation or their transcription in several latent or open conflicts and not only to the open conflict of the Casamance crisis. They also show that the park is not at the origin of conflicts on the local scene, but that it constitutes a framework which facilitates their hatching and their interpretation. Recommendations are finally proposed on alternative forms of governance likely to appease or regulate conflicts around the Park.

Ce papier sur les espaces naturels protégés, s’inscrit dans un contexte national et international où les thématiques environnementales occupent une place de plus en plus importante dans les débats sociaux et les préoccupations politiques. Élément incontournable de la gestion des ressources naturelles, de l’aménagement des territoires et du développement durable, les espaces protégés traduisent des représentations très variables du rapport des sociétés à leur espace de vie. Ils sont les révélateurs des différences entre des modes concurrents de gouvernance des territoires. La méthode de recherche repose sur des enquêtes adressées aux représentants de l’État, aux élus locaux et aux populations locales riveraines. Les résultats permettent de comprendre les jeux et les stratégies d’acteurs en cours pour le contrôle et l’exploitation des ressources de l’aire protégée, mais également leur déclinaison ou leur transcription en plusieurs conflits latents ou ouverts et non au seul conflit ouvert de la crise casamançaise. Ils montrent également que le parc n’est pas à l’origine des conflits sur la scène locale, mais qu’il constitue un cadre qui facilite leur éclosion et leur lecture. Des recommandations sont enfin proposées sur des formes alternatives de gouvernance susceptibles d’apaiser ou de réguler les conflits autour du Parc.

Les machineries de réplication et de transcription peuvent provoquer des conflits entre transcription et réplication (TRC), qui se produisent de manière frontale ou co-directionnelle. La collision frontale est considérée comme étant la plus délétère et peut conduire à de l’instabilité génomique au travers des R-loops qui se composent un hybride ADN-ARN et un brin d'ADN déplacé. En analysant les données multi-omiques, nous avons révélé avec succès que la pause transitoire de la fourche de réplication aux 3' des gènes enrichis en R-loops avec collision frontale affecte la stabilité génomique d'une manière dépendante de Topoisomérase1 (Nat.Communs. 2020) puis j'ai développé le premier outil bio-informatique pour analyser de données de réplication (OKseqHMM, disponible sur GitHub, Liu et al. BioRxiv. 2022). Finalement, il a été montré récemment que dans les cellules cancéreuses du sein, les R-loops colocalisent fortement avec une augmentation des cassures de l'ADN, de manière dépendante de la réplication. Nous visons à étudier le TRC dans des cellules cancéreuses et des échantillons de patients cancéreux pour déterminer comment le stress réplicatif induit de l'instabilité génomique dans le développent de cancer, ce qui pourront contribuer à l’établissement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer
Replication and transcription machinery can cause transcription-replication conflicts (TRCs), which occur either frontally or co-directionally. The head-on collision is considered to be the most deleterious and can lead to genomic instability through R-loops that consist of a DNA-RNA hybrid and a displaced DNA strand. By analyzing multi-omics data, we successfully revealed that transient replication forks pause at the 3' of genes enriched in R-loops with more head-on collisions affects genomic stability in a Topoisomerase1-dependent manner (Nat. Commons . 2020) then I developed the first bioinformatics tool to analyze replication data (OKseqHMM, available on GitHub, Liu et al. BioRxiv. 2022). Finally, it has recently been shown that in breast cancer cells, R-loops strongly colocalize with an increase in DNA breaks, in a replication-dependent manner. We aim to study TRC in cancer cells and samples from cancer patients to determine how replicative stress induces genomic instability in cancer development, which may contribute to the establishment of new therapeutic strategies against cancer

Les cellules sont constamment exposées à des agents endommageant de l'ADN d'origine exogène, notamment les rayons ultraviolets, les irradiations γ, et l'exposition aux agents chimiques génotoxiques, mais également d'origine endogène générés par le métabolisme cellulaire. De plus en plus d'évidences montrent que la transcription est un processus biologique qui peut mettre en péril l'intégrité du génome. Un mécanisme actuellement très étudié qui lie la transcription à l'instabilité génomique est la formation des boucles R (R-loops), des structures hybrides ARN:ADN qui exposent un ADN simple brin déplacé. Ces structures aberrantes se présentent en tant que sous-produits de la transcription et/ou lors de l'interférence entre la réplication et la transcription, et plus récemment ils ont été montrées s'accumuler lorsque la biogénèse de l'ARNm est perturbée. La persistance des boucles R est une source importante d'instabilité génomique car elle peut générer des cassures double brin de l'ADN et favoriser la recombinaison. Pour faire face aux conséquences néfastes des endommagements de l'ADN, les cellules activent une cascade élaborée de voies de signalisation qui permet de coordonner la prolifération cellulaire avec la réparation de l'ADN. L'ensemble de ces acteurs moléculaires constitue un réseau de réponse aux dommages de l'ADN qui est indispensable pour la stabilité génomique. Récemment chez la levure, l'activation transitoire de ce réseau a été également proposée être important dans la coordination de la transcription et de la réplication, afin d'éviter d'une part des contraintes topologiques et d'autre part la formation de structures aberrantes générées lors de conflits entre ces deux processus cellulaires essentiels. Dans la perspective d'identifier des nouveaux gènes impliqués dans ce réseau de signalisation, un crible fonctionnel in vitro précédemment établi au laboratoire a conduit à l'identification de Ddx19, une hélicase à motif DEAD-box, en tant que nouvel élément répondant à l'endommagement de l'ADN. Ddx19 interagit avec le pore nucléaire via CAN/Nup214, et il est impliqué dans l'export des ARNm grâce à son activité hélicase et ATPase, stimulé par les facteurs IP6 et Gle1. Le présent travail de thèse dévoile une nouvelle fonction de Ddx19 distincte de son rôle connu dans l'export de l'ARNm. Je pu montrer que, lors de l'induction des dommages à l'ADN par les rayons UV, Ddx19 se relocalise transitoirement de la face cytoplasmique du nucléopore vers le noyau de façon dépendant d'ATR. L'inactivation de Ddx19 entraîne des endommagements spontanées dépendant de la prolifération, démontré par l'activation de la voie de signalisation d'ATM-Chk2 et la formation de foyers nucléaires de γH2AX et 53BP1. Ces phénotypes sont concomitants avec le ralentissement des fourches de réplication qui ne peuvent plus redémarrer après leur blocage par la camptothécine. En outre, les cellules déplétées de Ddx19 présentent une forte accumulation des boucles R nucléaires, enrichi dans le compartiment nucléolaire, et aussi autour de la périphérie nucléaire. Par ailleurs, ces cellules présentent une viabilité réduite et une létalité synthétique lorsque la déplétion de Ddx19 est combinée avec l'inhibition de l'expression de la topoisomérase I. Je propose Ddx19 comme deuxième hélicase nécessaire pour la résolution des boucles R, et qui fonctionne à côté mais de façon indépendante de la Senataxin, l'hélicase précédemment connue pour résoudre ces structures in vivo chez les cellules de mammifères. Je démontre que cette nouvelle fonction de Ddx19 ne dépend pas de son interaction avec le pore nucléaire, mais plutôt de son activité hélicase et d'un résidu de sérine phosphorylée par Chk1 qui stimule sa relocalisation vers le noyau. Ces données proposent Ddx19 en tant que nouvelle ARN hélicase qui facilite la coordination de la réplication et la transcription, médiée par ATR à travers de la résolution des boucles R, préservant ainsi l'intégrité du génome
Cells are continuously challenged by DNA damage resulting from external cues as UV light, γ-irradiation and exposure to genotoxic chemicals, as well as from endogenous stress caused by cellular metabolism. Growing evidence points to transcription as a biological process that could adversely affect genome integrity. One currently highly investigated mechanism by which transcription can induce genome instability is through the formation of R-loops, RNA:DNA hybrid structures exposing a displaced single-stranded DNA tract. These aberrant structures occur as byproducts of transcription and/or upon interference between replication and transcription, and more recently were also shown to accumulate upon disruption of mRNA biogenesis and processing. Persistent unresolved R-loops are a potent source of genomic instability as they ultimately generate double strand breaks and promote recombination events. To deal with the deleterious consequences of DNA damage, cells activate elaborate DNA damage response (DDR) pathways to delay cell division and stimulate repair of lesions, thus preserving genome stability. Recently in yeast transient DDR activation has also been proposed to be important in the coordination of transcription and replication, in order to avoid topological constraints and the formation of aberrant structures generated upon collision of their machineries. By means of an in vitro screen aimed at identifying new DDR genes, we isolated Ddx19, a DEAD-Box helicase known to be involved in mRNA export, as a novel DNA damage responsive gene. Ddx19 interacts with the nucleopore complex via nucleoporin CAN/Nup214, and is involved in mRNA remodelling and export through its ATPase and helicase activities, stimulated by IP6 and the Gle1 factor. My present thesis work unravels a novel function of Ddx19 in preserving genome stability in mammalian cells, distinct from its known role in mRNA export. I show that upon UV-induced damage, Ddx19 transiently relocalizes from the cytoplasmic face of the nucleopore to the nucleus in an ATR-dependent manner. Downregulation of Ddx19 gives rise to spontaneous, proliferation-dependent DNA damage, as determined by the specific activation of the ATM-Chk2 pathway and formation of γH2AX and 53BP1 nuclear foci. This is concomitant with the slowing down of replication forks that are unable to restart after being stalled with camptothecin. In addition, cells depleted of Ddx19 display strong accumulation of nuclear R-loops, enriched in the nucleolar compartment, and around the nuclear periphery. Moreover, these cells show low viability and exhibited synthetic lethality when combined with inhibition of topoisomerase I expression. I propose Ddx19 as a second helicase required for R-loops resolution, functioning alongside but independently of Senataxin, the first known RNA helicase to resolve these structures in vivo in mammalian cells. I provide evidence that this new function of Ddx19 does not depend on its interaction with the nuclear pore, but rather on its helicase activity and on a serine residue phosphorylated by Chk1 which promotes its relocalization into the nucleus upon damage. These data put forward Ddx19 as a novel RNA helicase that facilitates ATR-dependent coordination of DNA replication and transcription through R-loops resolution, thus preserving genome integrity

L’instabilité génomique est une caractéristique majeure des cellules cancéreuses. Dans les premières étapes du développement du cancer, l’activation des oncogènes induit du stress réplicatif à l’origine de cette instabilité. Le mécanisme par lequel la dérégulation des oncogènes induit un blocage des fourches de réplication et du gammaH2AX sur la chromatine reste peu compris. Ainsi déterminer l'origine de ce stress réplicatif dans les cellules précancéreuses est donc essentiel afin de mieux comprendre les premières étapes de la tumorigenèse. Il a été montré dans notre laboratoire que la déplétion dans des cellules humaines de la topoisomérase 1 ou du facteur d’épissage ASF/SF2 perturbe la progression des fourches de réplication, active le checkpoint de phase S et induit des cassures chromosomiques (Tuduri et al., 2009). Puisque les dommages à l’ADN et les défauts de réplication sont corrigés par la RNase H1, il est possible que ce stress réplicatif soit dû à la formation de R-loops. Ces hybrides ADN/ARN se forment au cours de la transcription lorsque l’ARN naissant revient s’hybrider avec sa matrice d’ADN laissant le brin non-transcrit sous forme simple brin. Les R-loops se formant dans des sites spécifiques du génome, nous avons alors cartographié leurs distributions et l’avons comparé à celle de marqueurs de stress réplicatif et de cassure double brin (CDB) de l’ADN dans nos cellules shASF et shTop1. Nous avons donc combiné différentes approches génomiques comme le DRIP-seq (R-loops), le ChIP-seq (pRPA et gammaH2AX) et le BLESS (CDB ; Crosetto et al., Nature Methods, 2013). Nos données montrent une corrélation importante entre les régions formant du stress réplicatif et la formation de R-loops appuyant l’idée que l’interférence entre réplication et transcription augmente l’instabilité génomique dans les cellules humaines. Toutefois puisque les R-loops ont de multiples rôles physiologiques, toutes régions qui en forment ne corrèlent pas avec l’induction de stress réplicatif. Ce projet devrait nous aider à déterminer dans quelles conditions les R-loops représentent une menace pour l’intégrité du génome. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons confirmé que les R-loops s’accumulaient dans nos lignées HeLa déplétées pour ASF et Top1. A noter que les R-loops s’accumulent également dans des fibroblastes immortalisées exprimant la forme oncogénique de Ras et dans des préplasmablastes, une étape du développement plasmocytaire particulièrement à risque pour le développement de myélome multiple. Ensemble, ces données indiquent que les R-loops pourraient être une source du stress réplicatif induit par les oncogènes
Genome instability is a hallmark of cancer cells. It has been proposed that at early stages of the cancer process, genomic instability is caused by oncogene-induced replication stress, a poorly-understood process characterized with the accumulation of stalled replication forks and gammaH2AX on chromatin. Understanding the origin of chronic replication stress represents a major challenge in cancer biology. We have previously shown that depletion of DNA Topoisomerase 1 or the splicing factor ASF/SF2 in mammalian cells interferes with replication fork progression, activating the DNA damage response and inducing chromosome breaks (Tuduri et al., 2009). Since DNA damage and replication fork stalling are relieved by RNaseH1, an attractive hypothesis could be that replication stress is caused by R-loops. These RNA-DNA hybrid structures form when nascent RNA re-anneals to the template DNA strand, leaving the non-template strand unpaired. Using immunofluorescence confocal microscopy with the S9.6 antibody that recognizes RNA-DNA hybrids, we confirmed that R-loops accumulate in ASF/SF2 and Top1-depleted HeLa cells. Since R-loops are enriched at specific sites in the human genome, wecombined different genomic approaches, including DRIP-seq (R-loops), ChIP-seq (gammaH2AX, pRPA) and BLESS (DSBs; Crosetto et al., Nature Methods, 2013) to monitor their distribution relative to replication stress markers and DNA double-strand breaks (DSBs) in the absence of Top1 or ASF/SF2. . Our data reveal a significant correlation between replication stress and cotranscriptional R-loops, supporting the view that the interference between replication and transcription promotes genomic instability in human cells. However, not all R-loops forming regions colocalize with replication stress since these structures have multiple physiological roles. This approach allowed us to determine the conditions in which R-loops may represent a threat to genome integrity. Moreover, we also observed the accumulation of R-loops in immortalized fibroblasts expressing an oncogenic form of Ras and in preplasmablast during plasma cell differentiation, a crucial process during which multiple myeloma may evolve. In clonclusion, our data indicate that R-loops may represent an important source of oncogene-induced replication stress

L’activation d’oncogènes entraine une prolifération aberrante des cellules, un stress réplicatif et des cassures de l’ADN. Un lien a été établi entre l’instabilité génomique résultant des cassures et l’inhibition de checkpoints entrainant l’accumulation de mutations et finalement le cancer (Halazonetis et al. 2008). Cependant, les mécanismes liant ces différents évènements n’ont pas encore été caractérisés. Notre hypothèse est que la prolifération incontrôlée des cellules augmente les incidents dus aux conflits entre les polymérases responsables de la réplication et celles responsables de la transcription. Lors de la rencontre des deux polymérases, l’accumulation de surenroulements positifs de l’ADN induit un blocage des fourches de réplication. Ceci crée des zones de fragilité, notamment dues à l’exposition d’ADN simple brin, et pourrait être à l’origine des cassures observées chez les cellules tumorales. Pour valider cette hypothèse, les biologistes de l'équipe ont étudié plusieurs lignées de cellules HeLa dans lesquelles les conflits réplication-transcription sont augmentés et j'ai réalisé l'analyse bioinformatique des approches génomiques suivantes :-DRIP-seq pour la détection des R-loops, une structure double brin hybride ADN/ARN qui se forme lors de la transcription, exposant ainsi un brin d’ADN simple brin.- ChIP-seq de γ-H2AX, une marque d’histone indiquant les cassures de l’ADN.-ChIP-seq de phospho-RPA (S33), un substrat de la kinase ATR au niveau des fourches bloquées. Pour chaque expérience, nous avons utilisé une lignée contrôle et deux lignées dans lesquelles TOP1 et ASF/SF2 sont appauvries avec un shRNA inductible (shTOP1 et shASF). La Topoisomérase I (TOP1) est une enzyme qui relaxe les surenroulements de l’ADN. Le complexe ASF/SF2 est un facteur d’épissage responsable entre autres de l’assemblage des mRNP (ribonucleoprotein particles) au moment de la transcription, qui limitent la formation des R-loops. L’analyse bioinformatique de ces données, ainsi que d'autres données de la littérature, m'a permis d'identifier des régions à risque du génome, localisées en aval de gènes fortement transcrits et répliqués précocement en phase S par des fourches progressant en sens opposé à la transcription. J’ai également observé que les gènes impliqués dans le cancer sont surreprésentés dans ces régions à risque
Oncogenes activation promotes aberrant cell proliferation, increasing replication stress and DNA damage. It has been proposed that genomic instability leads to checkpoints inhibition and promotes cancer development (Halazonetis et al. 2008). However, the link between aberrant proliferation, replication stress and DNA breaks is still unclear. We hypothesized that aberrant proliferation leads to more incident due to DNA and RNA polymerases encounter and stalling. When the two polymerases encounter, the accumulation of positive-supercoiled DNA between two polymerases induces fork stalling, resulting in the formation of fragile structures such as single-stranded DNA (ssDNA). These ssDNAs formed at stalled forks could be a source for DNA breaks, promoting the development of cancer cells. To validate this hypothesis, biologists from our team have worked on HeLa cell lines with increased replication-transcription conflicts. I perform the bioinformatics analysis of the following genomic data:- DRIP-seq: R-Loops positioning on genome using immunoprecipitation on DNA/RNA hybrids.-γ-H2AX ChIP-Seq: Gamma-H2AX is an histone mark found at DNA breaks.-pRPA ChIP-Seq : Positioning of stalled forks using the substrate of ATR kinase, phospho-RPA (S33) as a marker.Each data was produced on control cells and two cell lines where TOP1 and ASF/SF2 were depleted by as inducible shRNA (shTOP1 and shASF). Topoisomerase 1 is a topological enzyme that unwinds DNA when supercoiling accumulates. ASF/SF2 is part of the splicing complexes that processes mRNP (messenger ribonucleoprotein particles) to prevent the accumulation of R-loops during transcription. Using these data and others from literature, I determined that regions having higher risk to induce replication stress are located downstream of highly transcribed and early replicated genes, and preferentially with head-on collision between DNA and RNA polymerases. I also revealed that cancer-related genes are enriched in these regions of the genome

Les protéines liées à l'ADN, comme les ARN polymérases peuvent arrêter la réplication. Chez E. Coli, le chromosome est simultanément transcrit et répliqué, et la réplication progresse 10 fois plus vite que la transcription. Les gènes essentiels et fortement transcrits sont co-orientés avec la réplication, comme les 7 opérons ribosomiques (rrn), transcrits mais pas traduits. L'inversion de grandes régions chromosomiques contenant plusieurs rrn n'affecte pas la viabilité des cellules, suggérant qu'il existe des protéines dont le rôle est de faciliter la progression des fourches de réplication à travers les rrn inversés. Nous avons montré que les hélicases DinG, Rep et UvrD sont essentielles pour le passage de la réplication à travers des rrn fortement transcrits en orientation opposée. Deux de ces trois hélicases sont nécessaires pour empêcher le blocage de la réplication et DinG est capable d'enlever les R-loop. Lorsque la fourches de réplication est bloquée, les brins néo-synthétisés peuvent s'apparier, formant une extrémité double-brin et une jonction de Holliday. Cette réaction est appelée réversion de la fourche de réplication (RFR). Les extrémités double-brin sont prises en charge par RecBCD et les jonctions de Holliday par RuvABC. Lorsqu'un rrn est inversé, la RFR et la re-réplication des fourches arrêtées créent des cassures du chromosome. Nos résultats montrent que les extrémités double-brin formées par ces cassures sont reconnues par des exonucléases telles que RecBCD et RecJ et que leur dégradation est ralentie au niveau des rrn. Nous proposons que le redémarrage des fourches après réversion soit couplé à l'action des hélicases qui délogent les ARN polymérases.