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Dissertationen zum Thema „Chromatius“
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Besnard, Emilie. „Modifications de l'organisation de la chromatine liées à l’entrée en sénescence et son impact sur la réplication du génome“. Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON1T008.
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L'entrée en sénescence, considérée comme un arrêt irréversible du cycle, se caractérise par une modification de l'organisation de la chromatine formant de véritables foyers d' hétérochromatine spécifiques (SAHF) coordonnée à une modification d'expression génique et à un déclin progressif de la compétence à répliquer le génome. Ainsi, au cours de ma thèse, j'ai voulu comprendre en quoi ces changements d'organisation du génome pouvaient influer sur la distribution et l'activation des origines d e réplication lors de l'entrée en sénescence réplicative ou déclenchée de façon prématurée par l'inhibition d'un modulateur de chromatine, la protéine à activité Histone AcétylTransférase p300. Pour étudier ces régulations, j'ai utilisé le peignage moléculaire d'ADN réplicatif qui permet de suivre les fourches de réplication et d'évaluer la distribution moyenne des origines. De plus, à l'aide de la purification de brins naissants aux origines de réplication couplée à un séquençage haut débit, nous avons cartographié la position de ces origines sur l'ensemble du génome humain et étudier un ensemble de facteurs pouvant intervenir dans ce déterminisme. Grâce à cette étude, nous avons pu suivre finement les modifications d'activité des origines associées à l'entrée en sénescence. De plus, afin de mieux comprendre les mécanismes d'activation des origines de réplication, nous avons étudié en collaboration avec l'équipe du Dr Fisher, le rôle de Cdk1 et de Cdk2 dans l'activation des origines dans le modèle XénopeSenescence entry, considered as an irreversible cell cycle arrest, is characterized by modifications of chromatin organization forming specific heterochromatin foci (SAHF) coordinated to modification of gene expression and the progressive loss of capacity to replicate the genome. During my PhD, we investigated whether these changes in genome organization might induce modifications in the distribution and the activity of replication origins during replicative senescence entry and in prematurely induced senescence by inhibition of a chromatin modulator, the Histone AcetylTransferase p300. To study these regulations, we used the replicating DNA combing allowing to follow the progression of replication forks and to evaluate the mean distribution of origins. By using the nascent strand purification assay coupled to deep sequencing, we mapped the position of replication origins in the whole human genome and studied some factors which could be involve d with this determinism. Thanks to this study, we followed finely the modifications of activity of replication origins associated to senescence entry. Moreover, in order to better understand the mechanisms of activation of origins, we studied in collaboration with Dr Fisher's team, the role of Cdk1 and Cdk2, in the activity of replication origins in the Xenopus model
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Beurton, Flore. „Étude de l’interaction physique et fonctionnelle entre le complexe histone méthyltransférase SET-2/SET1 et le complexe histone déacétylase SIN-3S dans l’embryon de C. elegans“. Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSEN017.
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Les complexes histones méthyltransférases SET1, hautement conservés de la levure aux mammifères, sont ciblés aux régions promotrices par la protéine CFP1/CXXC, résultant en l’implémentation de la méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me), modification post-traductionnelle influençant l’expression des gènes selon le contexte chromatinien. La présence de plusieurs complexes SET1 distincts dans différents systèmes modèles eucaryotes a compliqué l’étude de leurs fonctions dans un contexte développemental. Caenorhabditis elegans contient une seule protéine homologue de SET1, SET-2, et d’uniques homologues des autres sous-unités du complexe, RBBP5, ASH2, WDR5, DPY30 et CFP1. Cependant, la composition biochimique du complexe n’a pas été décrite. En couplant des expériences de co-immunoprécipitation avec des analyses de spectrométrie de masse, j’ai identifié le complexe SET-2/SET1 dans les embryons de C. elegans. D’autre part, j’ai montré que le complexe SET-2/SET1 co-immunoprécipite aussi un autre complexe conservé modifiant la chromatine et j’ai mis en évidence les interactions mises en jeu entre ces deux complexes. Mon analyse génétique a démontré que les mutants de perte de fonction des sous-unités des deux complexes partagent des phénotypes communs, en cohérence avec des fonctions développementales communes. Le laboratoire a également entrepris des expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine montrant un nouveau rôle de CFP-1 dans le recrutement de ce complexe au niveau de sites spécifiques de la chromatineThe highly conserved SET1 family complexes are targeted by CFP1/CXXC protein to promoter regions through multivalent interactions to implement methylation of histone H3 Ly4 (H3K4me), a modification that correlates with gene expression depending on the chromatin context. The presence of distinct SET1 complexes in multiple eukaryotic model systems has hampered studies aimed at identifying the complete array of functions of SET1/MLL regulatory networks in a developmental context. Caenorhabditis elegans contains one SET1 protein, SET-2, one MLL-like protein, SET-16, and single homologs of RBBP5, ASH2, WDR5, DPY30 and CFP1. The biochemical composition of the complex however, has not been described. Through the use of co-immunoprecipitation coupled to mass spectrometry-based proteomics, I identified the SET-2/SET1 complex in C. elegans embryos. Most importantly, I showed that the SET-2/SET1 complex also co-immunoprecipitates another conserved chromatin-modifying complex and I highlighted the interactions involved between these two complexes. My genetic analysis revealed that loss of function mutants of the two complex subunits share common phenotypes, consistent with common developmental functions. The laboratory has also undertaken transcriptomic and chromatin immunoprecipitation experiments showing that CFP-1 has a role in the binding of this complex at specific chromatin regions
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Jurisic, Anamarija. „Développement d'une approche méthodologique basée sur la biotinylation in vivo de protéines de la chromatine - Application à l’étude des interactions entre des domaines chromosomiques et une protéine de l'enveloppe nucléaire dans des cellules individuelles“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS349.
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Les arguments en faveur d’un rôle important de l'architecture des chromosomes en interphase pour la régulation des gènes et la maintenance du génome s’accumulent rapidement. Au cours de l'interphase, les chromosomes sont positionnés de façon non aléatoire l’un par rapport à l'autre et fournissent ainsi des points de repère nucléaires. Deux types d'interactions contribuent probablement à ce positionnement non aléatoire: (i) des domaines subchromosomiques interagissent avec des structures nucléaires telles l'enveloppe nucléaire (EN) et (ii) des interactions intrachromosomiques s’établissent entre des loci situés de façon linéairement distante en cis sur un même chromosome. Contribuant à l’expansion de ce domaine de recherche, nous avons poursuivi le développement d’une technique préalablement établie au laboratoire pour détecter des interactions protéine-protéine. Le développement de cette technique nouvelle a constitué une part de ce travail de thèse accompli sur des cellules humaines. Elle se base sur le marquage par la biotine de composants de la chromatine qui en interphase se trouvent à proximité immédiate de l’EN. Les cellules ont été traitées pour exprimer (i) la biotine ligase BirA fusionnée à l’émerine, une protéine de l’EN, conjointement avec (ii) une variante d’histone, l’histone macroH2A, en fusion avec un peptide accepteur de biotine. L'étiquette biotine déposée sur l’histone macroH2A pendant l'interphase est ensuite détectée par microscopie à fluorescence sur des cellules en mitose étalées sur lames. Les chromosomes mitotiques marqués peuvent en outre être caractérisés par des techniques plus classiques de caryotypage. Nous avons nommé cette technique «topokaryotypage» car elle peut fournir des informations d’ordre à la fois topologique et caryotypique. Son développement pas à pas a nécessité la production d'une lignée cellulaire ad hoc et une optimisation fine du protocole. Ce travail de thèse peut déboucher sur des questions biologiques explorées sur cellules uniques. A titre d’application, une analyse comparative a été réalisée par topokaryotypage sur des cellules cultivées in vitro dans diverses conditions de stress expérimentales. L’utilisation du topocaryotypage pourrait fournir des informations précieuses sur les mécanismes à la base de l’organisation et de la dynamtique des noyaux cellulairesEvidence is rapidly accumulating that the architecture of interphase chromosomes is important for both gene regulation and genome maintenance. During interphase, chromosomes are nonrandomly positioned with respect to each other and thus they provide nuclear landmarks. Two kinds of interactions are likely to contribute to this nonrandom positioning: (i) subchromosomal domains interact with nuclear structures such as the nuclear envelope (NE) and ii) intrachromosomal interactions take place between linearly distant loci positioned in cis on the same chromosome. As a contribution to this expanding research domain, we have built upon an existing approach previously established in the laboratory to detect protein-protein interactions. The new technique was developed in human cells as part of the present PhD research. It is based on biotin labelling of chromatin components which are in close proximity with the nuclear envelope (NE) in interphase cells. Cells were made to express (i) the biotin ligase BirA fused to the NE protein emerin together with (ii) a fusion between a biotin acceptor peptide and macroH2A, a variant core histone. The biotin label deposited on the macroH2A histone during interphase is then detected by fluorescence microscopy on mitotic cells spread on slides. The biotin-labelled mitotic chromosomes can be further characterized using more classical karyotyping techniques. We refer to this new technique as “Topokaryotyping” since it can provide both topological and karyotypic information. Its step-by-step development has required the establishment of an ad hoc cell line and a fine protocol optimization. This PhD work could pave the way for biological questions explored at a single cell level. As an illustration, a comparative topokaryotyping analysis was performed on cells cultivated in vitro in various experimental stress conditions. It is envisioned that using this technique can provide valuable mechanistic insights relevant to the organization and dynamics of cell nuclei
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Marie, Corentine. „The role of Chd7 & Chd8 chromatin remodelers in oligodendrogenesis and (re)myelination“. Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066365/document.
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Les oligodendrocytes (OLs) sont les cellules myélinisantes du système nerveux central, s’enroulant autour des axones et permettant la conduction saltatoire du potentiel d’action. Dans la Sclérose en Plaques, des gaines de myélines sont détruites et l’efficacité de la remyélinisation par les précurseurs d’oligodendrocytes (OPCs) diminue avec la progression de la maladie. Une meilleure compréhension du mécanisme qui contrôle la génération des OPCs et leur différentiation est donc essentielle pour développer des thérapies efficaces de remyélinisation. L’oligodendrogenèse, qui comprend les étapes de génération des OPCs, de différenciation et de maturation des OLs, est un processus contrôlé par des facteurs de transcription spécifiques incluant Ascl1, Olig2 and Sox10 mais le mécanisme impliqué est encore peu connu. Sachant que les facteurs du remodelage de la chromatine sont des régulateurs nécessaires à la formation de la boucle promoter-enhancer permettant l’initiation de la transcription, nous nous sommes focalisé sur Chd7 (Chromodomain-Helicase-DNA-Binding 7), un membre de la famille de protéine CHD. Dans une première étude, nous avons montré que Chd7 est hautement enrichi dans le lignage oligodendroglial avec un pic d’expression pendant la différenciation des OLs. Nous avons également montré que la délétion conditionnelle de Chd7 diminuait la différentiation des OLs pendant la (re)myélinisation. Dans un seconde étude, nous avons utilisé des techniques de génomique sur les OPCs purifiés pour étudier la régulation par Chd7 de gènes impliqués dans la différenciation, la survie et la prolifération des OPCs. Dans ce but, nous avons générer des délétions inductible de Chd7 spécifiquement dans les OPCs (Chd7iKO) et nous avons analysé le transcriptome (RNA-seq) d’OPCs purifiés à partir de cerveaux de souris P7 comparé à des contrôles. Nous avons trouvé que Chd7 activait l’expression des gènes impliqué dans la différenciation des OPCs et la myélinisation et inhibait l’apoptose, sans montré de défaut de prolifération. Pour aller plus loin, nous avons étudié Chd8, un paralogue de Chd7, et nous avons montré qu’il est exprimé dans le lignage oligodendrocytaire avec un pic d’expression dans les OL en différenciation, similairement à Chd7. Les données de fixation (ChIP-seq) de Chd7 et Chd8 indiquent que ces deux facteurs du remodelage de la chromatine se fixent sur des gènes communs reliés au processus de différenciation, de survie et de prolifération des OPCs. Intégrant ces données avec celles de facteurs transcriptionnels clés dans l’oligodendrogenèse (Olig2, Ascl1 et Sox10), nous avons construit un modèle de la régulation de l’expression de gènes contrôlés dans le temps et impliqué dans chacune des étapes de la différenciation des oligodendrocytesOligodendrocytes (OLs) are myelin-forming cells of the central nervous system wrapping axons and allowing the saltatory conduction of action potentials. In Multiple sclerosis (MS), myelin sheath is destroyed and effective remyelination by oligodendrocyte precursor cells (OPCs) diminishes with disease progression. Therefore, a better understanding of the mechanisms controlling OPC generation and differentiation is essential to develop efficient remyelinating therapies. Oligodendrogenesis, involving the steps of OPC generation, OPC differentiation and maturation of OLs, is a process controlled by specific transcription factors including Ascl1, Olig2 and Sox10 but the mechanisms involved are poorly understood. As it is known that chromatin remodelers are regulatory factors necessary in the formation of the promoter-enhancer loop prior to transcription, we focused our study on Chd7 (Chromodomain-Helicase-DNA-Binding 7), a member of the CHD protein family. In a first study, we showed that Chd7 is highly enriched in the oligodendroglial lineage cells with a peak of expression during OL differentiation and that Chd7 OPC-conditional deletion impairs OL differentiation during (re)myelination. In a second study, we used unbiased genome wide technics in purified OPCs to study Chd7 regulation of genes involved in OPC differentiation, proliferation and survival. To this aim, we have generated OPC-specific inducible Chd7 knock-out (Chd7-iKO) and analyse the transcriptome (RNA-seq) of purified OPCs from P7 mouse cortices compared to control littermates. We found that Chd7 promote the expression genes involved in OPC differentiation and myelination and inhibits apoptosis, without affecting OPC proliferation. Furthermore, we investigated Chd8, a paralog of Chd7, showing that it is expressed in the oligodendroglial lineage with a peak of expression in differentiating oligodendrocytes, similar to Chd7. Genome wide binding (ChIP-seq) profiling for Chd7 and Chd8 indicate that these two chromatin remodelers bind to common genes related to OPC differentiation, survival and proliferation. Integrating these datasets with other key transcriptional regulators of oligodendrogenesis (Olig2, Ascl1 & Sox10), we have built a model accounting for the time-controlled regulate expression of genes involved in each step of OL differentiation
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Germier, Thomas. „Dynamique de la chromatine et transcription“. Thesis, Toulouse 3, 2018. http://www.theses.fr/2018TOU30376.
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La dynamique de la chromatine est affectée par les processus biologiques. Pour comprendre comment la physique de la chromatine et la biologie se repondent, nous avons besoin d'outils pour analyser la dynamique de la chromatine in vivo. Plusieurs systèmes existent pour marquer les loci d'ADN et déterminer efficacement leur position dans le noyau, mais ils présentent des inconvénients dans les cellules de mammifères lorsqu'il s'agit d'étudier le mouvement de la chromatine dans le contexte de processus biologiques. Cela est particulièrement vrai lorsqu'il s'agit de mécanismes où l'ADN doit être lu à proximité du marquage. Pour étudier la dynamique de la chromatine in cellulo, l'équipe Bystricky a développé ANCHOR. ANCHOR repose sur l'insertion d'une séquence courte et non répétitive (ANCH) dans le génome de l'hôte. Cette séquence contient des sites de liaison pour une protéine (OR) qui, une fois liée, s'oligomérise et permet la visualisation du locus marqué. ANCHOR est dérivé des systèmes de partitionnement des chromosomes bactériens. L'outil a été implémenté avec succès dans la levure bourgeonnante (Saad et al. 2014) et plus récemment dans la drosophile (H. Chen, Fujioka, et Gregor 2017 ; Gomez-Lamarca et al. 2018). L'un de mes projets de thèse consistait à appliquer le système ANCHOR dans des cellules humaines. La séquence ANCH3 a été insérée de manière aléatoire et en une seule copie dans le génome de la lignée cellulaire de cancer du sein MCF7 par Hafida Sellou (étudiante en M2) et Fatima Moutahir (technicienne). Pour insérer la séquence ANCH3, les cellules MCF7 ont d'abord été modifiées pour insérer un site FRT dans le génome. Ensuite, un plasmide contenant l'ANCH3 couplé au transgène Cyclin D1 et un site FRT a été transfecté. La recombinaison entre les deux sites FRT a été favorisée par la Flipase. La protéine OR3 étiquetée par fluorescence a été exprimée de manière stable ou transitoire pour permettre l'imagerie du gène CCND1 (voir (Germier et al. 2017, 2018) pour plus de détails). Nous avons voulu établir une preuve de principe pour l'utilisation d'ANCHOR dans des cellules de mammifères. Des cellules MCF7 contenant un transgène CCND1, appelé G7-CCND1 (Germier et al. 2017) ont été transfectées de manière stable avec OR3-Santaka et le locus CCND1 a été suivi sur 24 heures à travers une division cellulaire. Nous avons pu suivre efficacement le locus du transgène sans photoblanchiment. La présence de la protéine OR3-Santaka sur le locus chromatinien n'a pas perturbé la réplication et deux loci ont été effectivement observés dans les deux cellules filles (Germier et al. 2018). En utilisant le système ANCHOR3, nous avons donc développé un outil puissant pour étudier à la fois des événements rapides et courts comme la transcription et des événements à long terme se déroulant sur plusieurs jours, comme la division ou la différenciation cellulaireChromatin dynamics are affected by biological processes. To understand how physical behaviour of chromatin and biology work together, we need tools to analyse chromatin motion in living cells. Several systems exist to fluorescently label DNA loci and to effectively determine their position within the nucleus, but they have drawbacks in mammalian cells when it comes to studying chromatin motion in the context of biological processes. This is especially true when it comes to mechanisms where DNA needs to be processed in the vicinity of the labeling. To study chromatin dynamics in cellulo, the Bystricky group developed the ANCHOR DNA labelling system. ANCHOR relies on the insertion of a short, non-repetitive sequence (ANCH) in the host genome. This sequence contains binding sites for a protein (OR) which once bound, oligomerize and allow visualization of the tagged locus. ANCHOR is derived from the bacterial chromosome partitioning systems. The tool was successfully implemented in budding yeast (Saad et al. 2014) and more recently in Drosophila (H. Chen, Fujioka, and Gregor 2017; Gomez-Lamarca et al. 2018). One of my thesis projects was to apply the ANCHOR system in human cells. The ANCH3 sequence was inserted randomly and in one copy in the genome of breast cancer cell line MCF7 by Hafida Sellou (M2 student) and Fatima Moutahir (technician). To insert the ANCH3 sequence, MCF7 cells were first modified to insert a FRT site in the genome. Then, a plasmid containing ANCH3 coupled to Cyclin D1 transgene and a FRT site was transfected. Recombination between the two FRT site was promoted by Flipase. The fluorescently-tagged OR3 protein was either stably or transiently expressed to allow imaging of the CCND1 gene (see (Germier et al. 2017, 2018) for details). We wanted to establish a proof of principle for the use of ANCHOR in mammalian cells. MCF7 cells containing a CCND1 transgene, called G7-CCND1 (Germier et al. 2017) were stably transfected with OR3-Santaka and the CCND1 locus was followed using fast- time lapse microscopy over 24 h through one cell division in a single cell. We could effectively follow the transgene locus without much photobleaching. The presence of OR3-Santaka protein on the chromatin locus did not disturb replication and two loci were effectively observed in the two daughter cells (Germier et al. 2018). Using the ANCHOR3 system, we hence developed a powerful tool to study both rapid, short events such as transcription and long-term events taking place over days, such as cell division or differentiation
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Galic, Hrvoje. „Heterochromatin dynamics upon release from stationary phase in budding yeast“. Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT006/document.
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La complexe protéique Sir (Silent Information Regulator) de la levure bourgeonnante est l’acteur principal dans la formation de l’hétérochromatine, qui provoque l’atténuation de l’expression génique par un mécanisme épigénétique. Le complexe Sir lié à la chromatine maternelle est démonté lors de la réplication génomique et puis réformé sur les deux brins nouvellement répliqué. La dynamique de maintien de Sir sur la chromatine pendant le cycle cellulaire et dans de variables conditions de croissance n’est pas bien comprise. Pour comprendre comment la structure chromatinienne telle que l’hétérochromatine peut être héritée et par conséquent comment les structures épigénétiques sont transmises d’une génération cellulaire à l’autre, nous avons besoin de mesurer la vitesse d’échange des sous-unités du complexe Sir au cours du cycle cellulaire dans différentes conditions de croissance. Nous avons donc utilisé le système RITE qui permet d’échanger deux épitopes attachés à Sir3 (une des sous-unités de Sir) et par la suite mesurer la cinétique de remplacement de Sir3. Nous avons constaté que la Sir3 maternelle est complètement remplacée par la Sir3 nouvellement synthétisées dans les régions télomériques durant le premier cycle cellulaire après la sortie de la phase stationnaire. Nous proposons que cette reprogrammation du complexe hétérochromatique est un mécanisme d’adaptation qui assure l’activation des gènes de réponse au stress par la déstabilisation transitoire de la structure hétérochromatinienneThe budding yeast SIR complex (Silent Information Regulator) is the principal actor in heterochromatin formation, which causes epigenetically regulated gene silencing phenotypes. The maternal chromatin bound SIR complex is disassembled during replication and then, if heterochromatin is to be restored on both daughter strands, the SIR complex has to be reformed on both strands to pre-replication levels. The dynamics of SIR complex maintenance and re-formation during the cell-cycle and in different growth conditions are however not clear. Understanding exchange rates of SIR subunits during the cell cycle and their distribution pattern to daughter chromatids after replication has important implications for how heterochromatic states may be inherited and therefore how epigenetic states are maintained from one cellular generation to the next. We therefore used the tag switch RITE system to measure genome wide turnover rates of the SIR subunit Sir3 before and after exit from stationary phase and show that maternal Sir3 subunits are completely replaced with newly synthesized Sir3 at subtelomeric regions during the first cell cycle after release from stationary phase. We propose that the observed “reset” of the heterochromatic complex is an adaptive mechanism that ensures the activation of subtelomeric stress response genes by transiently destabilizing heterochromatin structure
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Clement, Camille. „Rôle du chaperon d'histone ASF1 dans le recyclage des histones parentales pendant la réplication de l'ADN“. Electronic Thesis or Diss., Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. https://theses.hal.science/tel-02518693.
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Chez les eucaryotes, l’ADN s’enroule autour de protéines appelées histones pour former la chromatine. Cette structure permet, d’une part, de compacter le génome dans le noyau, mais également de réguler son expression. En effet, les histones sont porteuses d’information dite « épigénétique » : elles existent sous différentes formes, les variants d’histone, et peuvent porter des modifications post-traductionnelles. La présence de tels variants et modifications organise le génome en domaines au statut transcriptionnel différent.La réplication de l’ADN déstabilise la structure chromatinienne, et représente ainsi un défi pour la cellule qui doit à la fois dupliquer son matériel génétique et transmettre son paysage épigénétique pour garantir le maintien de son identité. Ceci passe par le recyclage des histones parentales, processus essentiel pour transmettre de manière fidèle les variants d’histone et leurs modifications.Au cours de ma thèse, j’ai tenté de répondre à la question : comment les variants d’histone H3.1 et H3.3 sont-ils recyclés au cours de la réplication de l’ADN ? En particulier, je me suis intéressée au rôle du chaperon d’histone Anti-Silencing Function 1 (ASF1) dans ce processus.Mon approche a été de développer une technique de microscopie de super-résolution (STORM) pour visualiser les variants d’histone parentaux précisément aux sites de réplication. Grâce à cette technologie, j’ai pu étudier l’impact de la déplétion d’ASF1 sur le recyclage des histones parentales, apportant ainsi des éléments de compréhension sur les mécanismes fondamentaux qui transmettent l’information épigénétiqueIn eukaryotes, DNA wraps around proteins called histones to form chromatin. This structure allows, first, the compaction of the genome in the nucleus, but also the regulation of its expression. Indeed, histones can be a source of information referred to as “epigenetic”: they exist under different forms, histone variants, and can have post-translational modifications. The presence of these variants and modifications organizes the genome into domains with different transcriptional status.DNA replication destabilizes chromatin structure and, therefore, represents a challenge for the cell, which must duplicate its genetic material while also transmitting its epigenetic landscape in order to maintain its identity. In this context, recycling parental histones is essential to faithfully transmit histone variants and their modifications.During my PhD, I tried to address the question: how are the histone variants H3.1 and H3.3 recycled during DNA replication? In particular, I investigated the role of the histone chaperone Anti-Silencing Function 1 (ASF1) in this process.My approach was to develop a super-resolution microscopy technique (STORM) to visualize parental histone variants precisely at replication sites. Using this technology, I could study the impact of ASF1 depletion on the recycling of parental histones, and further our understanding of fundamental mechanisms that transmit epigenetic information
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Szabo, Quentin. „Étude du repliement tridimensionnel de la chromatine en domaines topologiques“. Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT064.
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Mon projet de thèse a consisté à étudier les mécanismes du repliement tridimensionnel du génome dans les cellules eucaryotes. L’organisation des chromosomes est étroitement liée à la régulation de nombreuses fonctions biologiques, telles que le contrôle de l’expression génique, la réplication de l’ADN ou encore la stabilité génomique. La méthode de « chromosome conformation capture » Hi-C, qui permet la cartographie des interactions entre régions d’ADN, a révélé que chez de nombreuses espèces, le génome est organisé en domaines enrichis en interactions chromatiniennes, les « Topologically Associating Domains » (TADs). Les TADs sont apparus être des acteurs majeurs de la régulation du génome par leur capacité à définir spatialement des domaines fonctionnels. Cependant, les méthodes de chromosome conformation capture générèrent des profils d’interactions généralement moyennés à partir d’ensemble de cellules. Déterminer la nature du repliement des TADs en cellules individuelles est donc crucial pour comprendre la relation structure-fonction de ces domaines génomiques. Au cours de ma thèse, j’ai utilisé des techniques de marquage fluorescent d'ADN combinés à de la microscopie en super-résolution afin d’étudier l’organisation des chromosomes en cellules uniques. Chez la drosophile, les TADs coïncident avec le partitionnement de la chromatine en domaines épigénétiques distincts. Nous avons pu caractériser chez cette espèce que les chromosomes sont organisés en une série d’unités discrètes qui correspondent aux TADs, reflétant l’exclusion mutuelle de régions transcriptionnellement actives et inactives. Ces résultats indiquent que les TADs de drosophile forment des domaines physiques qui caractérisent un niveau d’organisation structurale des chromosomes en cellules uniques. Chez les mammifères, la majorité des TADs est formée grâce à l’action du complexe cohésine et à la présence de la protéine CCCTC-binding factor (CTCF) à leurs frontières. L'application de l'imagerie à super-résolution dans des cellules souches embryonnaires et des cellules progénitrices neuronales de souris nous a permis de caractériser l’hétérogénéité du repliement des TAD d’une cellule à l’autre. Nous avons notamment pu observer leur organisation en sous-domaines globulaires qui semblent représenter une propriété générale du repliement de la chromatine à l’échelle de la centaine de nanomètres. De plus, nos résultats indiquent que les interactions chromatiniennes sont fortement favorisées à l’intérieur des TADs dans la majorité des cellules. La déplétion de CTCF abolie l’organisation spatiale de la fibre de chromatine associée aux TAD, soulignant le rôle de cette protéine dans la génération de barrières physiques entre TAD adjacents. Ces données démontrent que le repliement dynamique des TAD est compatible avec l'établissement d'environnements chromosomiques dans lesquels les contacts sont privilégiés, et réconcilient ainsi la nature probabiliste du repliement de la chromatine avec le rôle proposé des TAD dans la définition spatiale d’unités génomiques fonctionnellesMy thesis project consisted in studying the mechanisms of the three-dimensional genome folding in eukaryotic cells. The organization of chromosomes is closely related to the regulation of many biological processes, such as gene expression control, DNA replication or genomic stability. The Hi-C "chromosome conformation capture" method, which allows the mapping of interactions between DNA regions, has revealed that the genome of many species is organized into domains enriched in chromatin interactions, the "Topologically Associating Domains" (TADs). TADs have emerged as major players of genome regulation by their ability to spatially define functional domains. However, chromosome conformation capture methods generate averaged interaction profiles that generally come from an ensemble of cells. Determining the nature and the folding of TADs in individual cells is therefore crucial to better understand the structure-function relationship of these domains. During my thesis, I used a combination of fluorescent DNA labeling and super-resolution microscopy to characterize the organization of chromosomes in single cells. In Drosophila, TADs coincide with the partitioning of the chromatin into distinct epigenetic domains. In this species, we could characterize the folding of the chromosomes into a series of discrete units that correspond to TADs, reflecting the mutual exclusion of transcriptionally active and inactive regions. These results indicate that Drosophila TADs form physical domains that characterize a higher-order layer of chromosome folding in individual cells. In mammals, the majority of TADs emerge through the action of the cohesin complex and the CCCTC-binding factor (CTCF) bound at their borders. The application of super-resolution imaging in mouse embryonic stem cells and neuronal progenitor cells revealed the high degree of cell-to-cell heterogeneity of TAD folding, ranging from condensed and globular objects to dispersed and stretched conformations. We were able to observe their organization into discrete subdomains which seem to represent a general property of the folding of the chromatin fiber at the nanoscale. Furthermore, our data indicate that the physical intermingling of the chromatin is highly favored within TADs in a large majority of cells. Depletion of CTCF abolishes the TAD-dependent spatial organization of the chromatin fiber, highlighting the role of this protein in generating physical barriers between adjacent TADs. Altogether, our results demonstrate that the dynamic folding of TAD is compatible with the establishment of chromosomal environments in which contacts are privileged, and thus reconcile the probabilistic nature of chromatin folding with the proposed role of TADs in the spatial definition of functional genomic units
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Bourbousse, Clara. „Dynamiques chromatiniennes au cours de la photomorphogenèse chez Arabidopsis thaliana“. Thesis, Paris 11, 2012. http://www.theses.fr/2012PA112097.
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Les états chromatiniens peuvent être étudiés à l’échelle des unités transcriptionnelles par des approches moléculaires ou à l'échelle plus globale de l'hétérochromatine structurée au sein de chromocentres par des approches cytogénétiques. Ces deux niveaux d’organisation de la chromatine sont dynamiques et influencent l'ensemble des processus nucléaires. L’objectif de cette thèse était d'avancer la compréhension des dynamiques chromatiniennes à ces deux échelles chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, en se focalisant sur une transition développementale majeure, la photomorphogenèse. Le processus de dé-étiolement implique la reprogrammation de l’expression de centaines de gènes en réponse à la lumière, constituant ainsi un excellent modèle d'étude. La première partie des travaux montre que la reprogrammation de l’expression du génome au cours de la photomorphogenèse est associée à des dynamiques de l’hétérochromatine qui sont régulés de façon différentielles dans les hypocotyles et les cotylédons. Ces dynamiques à grande échelle ont des conséquences localement, car les états décompactés sont associés à la réactivation d'éléments hétérochromatiniens répétés. Dans une deuxième partie, le répresseur transcriptionnel DE-ETIOLATED-1 (DET1) a été utilisé afin de rechercher l'implication de régulateurs de la photomorphogenèse dans les mécanismes chromatiniens. Ce répresseur majeur de la photomorphogenèse peut lier l'histone H2B et influence le niveau global de sa modification par mono-ubiquitination (H2Bub). Dans le cadre de ma thèse, j'ai révélé d'une part l’existence d’interactions génétiques entre DET1 et les gènes contrôlant l’homéostasie de H2Bub et d'autre part un défaut de la régulation chromatinienne des variants des gènes ribosomiques 5S et 45S dans le mutant det1-1. L’ensemble de ces données permet de proposer un modèle impliquant DET1 dans la régulation de H2Bub de façon différentielle dans l’euchromatine et l’hétérochromatine, constituant ainsi le premier lien entre régulateurs de la photomorphogenèse et modifications des histones. La marque H2Bub étant directement liée à l'activité transcriptionnelle chez divers eucaryotes, l'impact de H2Bub sur l'expression des gènes durant la photomorphogenèse a été analysé. La combinaison d’approches épigénomiques et transcriptomiques a permis de montrer que le gain de H2Bub est associé à l’induction des gènes. L’utilisation du mutant hub1 dans lequel le dépôt de H2Bub est aboli a également permis de révéler le rôle de cette marque pour une régulation rapide de l’induction et de la répression de nombreux gènes. De façon générale, ce travail a révélé des dynamiques chromatiniennes impliquant des réorganisations massives au niveau cytologique ainsi que des variations fines des modifications d'histones au niveau des gènes de l'euchromatine, ainsi que le rôle de DET1 dans la régulation de ces processus. Il ouvre donc la voie à l'étude des connections entre ces deux échelles de dynamiques pour la régulation de l'activité transcriptionnelle, liant compartimentation nucléaire et activité des gènes dans le contexte global de la réponse aux signaux lumineuxChromatin states can be studied both at the level of individual transcriptional units by molecular approaches or at the larger scale of heterochromatin by cytogenetic approaches. These two levels of chromatin organization are dynamic and influence all nuclear processes. The objective was to enhance the understanding of chromatin dynamics at these two scales in the model plant Arabidopsis thaliana, focusing on a major developmental transition, photomorphogenesis. The process of de-etiolation involves the reprogramming of the expression of hundreds of genes in response to the perception of light therefore constituting an excellent experimental system. The first part of the work shows that reprogramming of genome expression during photomorphogenesis is associated with heterochromatin dynamics that is differentially regulated in the hypocotyls and the cotyledons. These widespread dynamics have local consequences, as the decompacted states are associated with reactivation of heterochromatic repeat elements. In the second part, the transcriptional repressor DE-ETIOLATED-1 (DET1) was used to investigate the involvement of photomorphogenesis regulators in chromatin mechanisms. This major repressor of photomorphogenesis can bind histone H2B and influences the overall level of mono-ubiquitinated H2B (H2Bub). As part of my thesis, I uncovered the existence of genetic interactions between DET1 and the genes controlling H2Bub homeostasis and also a defect in the regulation of the chromatin around the 45S and 5S ribosomal genes in the mutant det1-1. These data have led me to propose a model involving DET1 in the differential regulation of H2Bub in heterochromatin and euchromatin, thus constituting for the first time a link between photomorphogenesis regulators and histone modifications. Because the H2Bub mark has been directly linked to transcriptional activity in a diverse range of eukaryotes, I analysed the impact of H2Bub on gene expression during photomorphogenesis in the third part of my thesis. The combination of transcriptomic and epigenomic approaches showed that the gain of H2Bub is associated with gene induction. The use of a hub1 mutant in which H2Bub deposition is abolished also revealed the role of this mark for the rapid control of many genes. In general terms, this work has revealed both dynamic chromatin changes that result in major genome reorganizations at the cytological scale and fine variations of histone modifications on euchromatic genes, as well as the role of DET1 in regulating these changes. My study paves the way for further studies on the connections between these two scales of dynamics and their function in the nuclear localization and changes in expression of genes in the overall context of light signaling
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Acquaviva, Laurent. „L' intéraction entre SPP1 et MER 2 : Le chaînon manquant entre la triméthylation de H3K4 et la recombinaison méiotique chez Saccharomyces cerevisiae?“ Thesis, Aix-Marseille, 2012. http://www.theses.fr/2012AIXM4013.
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Chez Saccharomyces cerevisiae, la methylation de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4) est catalysée par le complexe à activité methyltransférase Set1, conservé au cours de l'évolution. Durant la méiose, l'absence de Set1 conduit à un retard de démarrage de la phase S, et à un défaut dans la formation des coupures double-brin de l'ADN (CDBs). Nous avons cherché à mieux caractériser ces deux conséquences phénotypiques liées à l'absence de Set1. Nous montrons que le retard de réplication est lié à la perte de méthylation de H3K4 mais qu'il ne résulte pas d'un défaut d'activité des kinases responsables de l'activation des origines de réplication ou de l'activation des voies canoniques de surveillance moléculaire liées aux dommages de l'ADN. L'importante diminution de fréquence de CDB sur la majorité des points chauds chez le mutant set1∆ a été corrélée à l'absence de la marque de H3K4 triméthylée. Nous avons confirmé le role de la méthylation de H3K4 sur la base de la diminution générale de la fréquence des CDBs observée en absence des différentes sous-unités du complexe associé à Set1 (COMPASS) ou chez un mutant exprimant une histone H3 non-méthylable (H3K4R). Pour tester la relation de causalité entre méthylation et CDBs, différentes sous-unités du COMPASS, telles que Set1 et Spp1, ont été fusionnées avec le domaine de fixation à l'ADN de Gal4 pour les cibler vers des régions non méthylées et dépourvues de CDB. Gal4BD-Spp1 stimule fortement la fréquence des CDBs à certains loci, y compris en contexte mutant H3K4R. Ainsi, le ciblage de Spp1 peut etre suffisant pour recruter et/ou activer la machinerie de CDBIn Saccharomyces cerevisiae, the methylation of the lysine 4 of histone H3 (H3K4) is catalysed by the evolutionary conserved Set1 methyltransferase complex. During meiosis, the absence of Set1 leads to a delay of S-phase onset and to a defect in the formation of double-strand breaks (DSBs). Our work was intended to give some clues about these two phenotypic consequences of Set1 loss. We show that the replication delay is linked to the absence of H3K4 trimethylation but does not result from a defect of the kinases responsible for the activation of replication origins or the activation of the canonical DNA-damage checkpoints. The severe decrease of DSB levels at the majority of recombination hotspots in set1∆ has been correlated with the specific marking of DSB sites by H3K4 trimethylation at some loci. We have confirmed the role of H3K4 methylation by observing a general decrease in DSB frequency similar to that of set1∆ in mutants lacking various subunits of the Set1- associated complex (COMPASS) or expressing a nonmethylatable histone H3 (H3K4R). To test for a causal relationship between H3K4 methylation and DSB formation, we have fused different proteins of the COMPASS, such as Spp1 or Set1, with the DNA binding domain of Gal4, in order to target them to H3K4-unmethylated and DSB-cold regions. Remarkably, Gal4BD-Spp1 strongly stimulates DSB formation in naturally cold DSB regions, even in the H3K4R mutant context. Thus, the specific tethering of Spp1 to a chromosome site is sufficient to recruit and/or activate the DSB machinery
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Diagouraga, Boubou. „Rôle de l'activité méthyltransférase de la protéine PRDM9 dans la recombinaison méiotique chez la souris“. Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTS060.
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Chez les organismes à reproduction sexuée, les gamètes (cellules sexuelles) sont produits par un processus comprenant deux divisions successives appelé méiose. Durant la première division, la recombinaison méiotique permet un contact physique et un échange de matériel génétique entre les chromosomes homologues. Elle résulte de la réparation, par recombinaison homologue, de cassures double-brin de l’ADN générées par la protéine SPO11 au début de la prophase de la première division. Chez les mammifères, les évènements de recombinaison se situent dans des régions de 1-2 kb appelées points chauds de recombinaison. La protéine PRDM9, qui contient un domaine PR/SET et des doigts de zinc, détermine la position des points chauds en ciblant des séquences spécifiques d’ADN par ses doigts de zinc. Son domaine PR/SET porte une activité lysine méthyltransférase, corrélée avec un enrichissement de H3K4me3 au niveau des points chauds, dans les spermatocytes.Les objectifs de mon travail étaient de caractériser l’activité catalytique de PRDM9 et d’étudier son rôle dans l’initiation de la recombinaison chez la souris. La structure cristallisée du domaine PR/SET de PRDM9 en complexe avec un peptide de l’histone H3 nous a permis de montrer que ce domaine adopte une structure similaire aux domaines SET canoniques portés par d’autres méthyltransférases, et d’identifier des résidus clés pour son activité. Nous montrons que le domaine PR/SET de PRDM9 méthyle in vitro non seulement H3K4, mais aussi H3K9 et H3K36. Nous confirmons in vivo la triméthylation de H3K36 dépendante de PRDM9 dans les spermatocytes. Utilisant deux allèles différents de PRDM9, Prdm9b et Prdm9wm7, qui activent des points chauds différents grâce à leur spécificité de séquence, nous avons généré des lignées de souris exprimant des allèles mutés du domaine PR/SET dont l’activité catalytique est abolie, Prdm9wm7G278A ou Prdm9wm7Y357F. La protéine mutante PRDM9wm7Y357F se fixe à ses cibles, mais n’y permet in vivo ni la triméthylation de H3K4, ni celle de H3K36. Enfin, nous montrons que l’activité catalytique de PRDM9 est requise pour promouvoir la recombinaison aux points chauds. Chez les souris exprimant uniquement un allèle Prdm9 muté, les spermatocytes présentent des défauts d’appariement des chromosomes homologues et de réparation des cassures double-brin de l’ADN, ainsi qu’un arrêt de la progression en méiose en milieu de prophase I, phénotype similaire à celui de la souris KO pour Prdm9 (Prdm9-/-). L’ensemble de nos résultats met en évidence le rôle primordial de l’activité méthyltransférase de PRDM9 pour la détermination des sites de recombinaison méiotique et plus généralement pour la progression de la méiose et finalement la formation de gamètes chez la sourisIn sexually reproducing organisms, gametes are produced by a process comprising two successive division, called meiosis. During the first division, meiotic recombination enables a physical contact and an exchange of genetic material between homologous chromosomes. Meiotic recombination results from the repair, by homologous recombination, of programmed DNA double-strand breaks (DSBs) catalyzed by the SPO11 protein at the beginning of prophase I. In mammals, recombination events are localized in 1 to 2 kb-long regions called recombination hotspots. PRDM9, a PR/SET domain and zinc finger-containing protein, determines hotspot localization by targeting specific DNA sequences through its zinc finger array. Notably, PRDM9 PR/SET-domain possesses an H3K4 methyltransferase activity, while PRDM9-dependent H3K4me3 enrichment is found at hotspots in spermatocytes.We aimed at characterizing PRDM9 methyltransferase activity and studying its role in meiotic recombination initiation in mouse. The crystal structure of PRDM9 PR/SET domain, which we generated in complex with a histone H3 peptide, shows that this domain adopts a similar topology to that of classical SET domains and allowed us to identify key residues for its catalytic activity. PRDM9 PR/SET domain catalyzes not only mono-, di- and trimethylation of H3K4, but also of H3K9 and H3K36. We confirmed PRDM9 dependent H3K36 trimethylation in spermatocytes. Taking advantage of the distinct DNA binding specificity of two Prdm9 alleles, Prdm9b and Prdm9wm7, each activating its own set of hotspots, we generated transgenic mouse lines expressing either Prdm9wm7G278A or Prdm9wm7Y357F mutant allele together with the endogenous wild-type Prdm9b allele. Both G278A and Y357F mutations abolish PRDM9 catalytic activity. We show that PRDM9wm7Y357F binds normally to its genomic targets, but is not able to promote H3K4 nor H3K36 trimethylation at these sites. In addition, PRDM9wm7Y357F does not promote recombination at one Prdm9wm7-dependent hotspot, showing that PRDM9 catalytic activity is required for promoting recombination at hotspots. In mice expressing only the mutant allele (Prdm9wm7G278A or Prdm9wm7Y357F), spermatocytes display defects in homologous chromosome synapsis and DSBs repair, as well as an arrest of meiosis at the mid-prophase I. This phenotype is similar to that of Prdm9 KO mice. Overall, our results demonstrate the role of PRDM9 methyltransferase activity in determining recombination hotspots and more generally for meiotic progression and gametes formation
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Kahli, Malik. „Implication des protéines HMGA et HMGA2 dans les changements du programme de réplication au cours de la sénescence cellulaire“. Thesis, Montpellier 2, 2011. http://www.theses.fr/2011MON20059/document.
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La sénescence, considérée comme étant un arrêt irréversible du cycle cellulaire, se caractérise par des changements drastiques de l'expression génique et de l'organisation de la structure de la chromatine. En effet, il se forme des foyers denses d'hétérochromatine au sein du noyau (SAHF) et ces modifications s'accompagnent d'un déclin progressif de la capacité à dupliquer le génome. Au cours de ma thèse, j'ai voulu savoir si ces modifications de la chromatine induite par les SAHF pouvaient influer sur le programme de réplication et changer la distribution des origines de réplication sur le génome au cours du processus d'entrée en sénescence réplicative des cellules. Nous avons donc, dans un premier temps, comparé par peignage moléculaire de l'ADN réplicatif la distribution des origines de réplication de cellules primaires prolifératives et sénescentes. Nous avons également cartographié l'ensemble de leurs origines de réplication sur la totalité du génome en purifiant les brins naissants aux origines de réplication que nous avons couplé à une analyse de séquençage à haut débit.Les protéines HMGA1 et HMGA2 étant des éléments précurseurs essentiels à la mise en place des SAHF, nous avons créé des lignées cellulaires qui, en sur-exprimant de façon inductibles ces protéines, induit une sénescence prématurée. Nous avons réalisé le même type d'analyses sur ces cellules afin de mettre en évidence le rôle de ces protéines dans les modifications du programme de réplication que nous avons observé au cours de l'entrée en sénescence de ces différents types cellulairesSenescence, considered as an irreversible cell cycle arrest, is characterized by dramatic changes in genes expression and chromatin organisation forming dense heterochromatic foci (SAHF). These changes are concomitant to a progressive decline of the capactity to replicate the genome. My PhD topic was to investigate whether the chromatin changes induced by SAHF formation could influence the replication program and modify the origin distribution along the genome at replicative senescence. We first compared the origin distribution of proliferative and pre-senescent primary fibroblasts by DNA molecular combing. Then, we mapped the origins positions in whole human genome by using the nascent strand purification assay coupled to deep sequencing.As HMGA1 and HMGA2 proteins are essential to induce SAHF formation, we designed inducible cell lines wich overexpress these proteins, triggering premature senescence. We made the same type of experiments in these cell lines in order to investigate the implication of these proteins on the changes of the replication program we observed during senescence
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Hodimont, Elsie. „Etude des fonctions de Cdk8 dans la régulation de la chromatine, la réplication et la transcription“. Thesis, Montpellier 2, 2012. http://www.theses.fr/2012MON20166.
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La kinase Cdk8 est impliquée dans la régulation de la transcription. Pourtant, cette protéine est retrouvée sur la chromatine lors de la réplication dans le modèle d'extrait d'œufs de xénope, où la transcription n'est pas active. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les fonctions de Cdk8 sur la chromatine en cours de réplication.Les résultats de ma thèse montrent que Cdk8 est impliquée dans la réplication de l'ADN. Le recrutement de Cdk8 sur la chromatine est concomitant avec le recrutement de certaines protéines du complexe de pré-réplication, bien qu'elle ne soit pas accumulée au niveau des foyers de réplication.Cependant, la déplétion de Cdk8 induit des défauts de réplication de l'ADN.Ces défauts ne sont pas induits par une collision entre le réplisome et la machinerie transcriptionnelle. En effet, l'ARN polymérase II, engagée sur la chromatine mais inactive en condition normale, est moins abondante sur la chromatine en absence de Cdk8.La déplétion de Cdk8 conduit à la diminution du recrutement des complexes de pré-réplication et des complexes de pré-initiation de la réplication. Cette diminution conduit à une baisse du taux de réplication sans activation du checkpoint intra-S. L'ensemble de mes résultats montrent que Cdk8 est nécessaire à une réplication normale de l'ADN. Plusieurs mécanismes semblent être mis en jeu, à savoir, un défaut de recrutement de la machinerie de réplication, l'accumulation de la protéine Adenomatous polyposis coli (APC) sur l'ADN ainsi que des modifications post-traductionnelles des histonesThe Cdk8 kinase is involved intranscriptional regulation.This protein is found on chromatin during DNA replication in xenopus egg extract model when transcription is not active. My PhD project was to characterize Cdk8 functions on chromatin during replication.My results show that Cdk8 is involved in DNA replication.Cdk8 is not found at replication foci , but its recruitment on chromatin occurs at the same time as several components of the pre-replication complex.Moreover, Cdk8 depletion leads to DNA replication defects.These defects are not induced by collision between the replisome and transcriptional regulators (RNA polymerase II and transcription factors). Indeed, RNA polymerase II, which is on chromatin in an inactive form under normal conditions, is less abundant on chromatin in absence of Cdk8.Cdk8 depletion leads to a decrease in pre-replication complexes and pre-initiation complexes recruitment. This decrease induces a reduction in DNA replication rate without activating the intra-S checkpoint.My data show that Cdk8 is necessary for proper DNA replication. It seems that Cdk8 depletion involves several mechanisms : altered replication machinery recruitment, presence of Adenomatous Polyposis Coli (APC) protein on DNA, and post-traductional modifications of histones
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Benyelles, Maname. „Le rôle de l'oncoprotéine INT6 dans la maintenance des télomères“. Thesis, Lyon, École normale supérieure, 2015. http://www.theses.fr/2015ENSL0978/document.
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La protéine INT6/EIF3E codée par le gène mammalien correspondant au site d’intégration du rétrovirus Mouse Mammary tumor virus (MMTV) n°6 (int-6), a été impliquée dans le cancer du sein chez la souris et l’homme. Malgré qu’INT6 soit une sous-unité du facteur d’initiation de la traduction eIF3, elle n’est pas essentielle pour la traduction générale mais pour l’expression d’ARNm spécifiques tel qu’il a été montré pour la traduction d’ARNm histones. Elle a aussi été impliquée dans la réplication d’ADN en stabilisant le facteur de licence de la réplication MCM7, dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) et dans la voie du “nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD). Par rapport à cette dernière activité j’ai étudié si INT6 pouvait spécifiquement intervenir au niveau de l’homéostasie des télomères en agissant sur les transcrits TERRA. La délétion d’INT6 par une approche d’ARN interférence révèle une augmentation des niveaux des ARN télomériques TERRA qui est dépendante du chromosome et du type cellulaire. Malgré qu’INT6 soit un facteur du NMD, elle n’agit pas sur la demi-vie des TERRA. Les expériences de DNA-FISH ont montré une augmentation des dommages aux télomères (TIF) dans les cellules en absence d’INT6. Les aberrations observées correspondent à des pertes de télomères (TFE) et des signaux multi-télomériques (MTS). Par la technique de digestion de la chromatine à la nucléase micrococcale, nous avons retrouvé une plus rapide accumulation des mono-nucléosomes aux télomères en absence d’INT6, suggérant un rôle dans la conformation de la chromatine télomérique. Ces résultats mettent en évidence INT6 comme un nouveau facteur régulateur de la stabilité des télomèresThe INT6/EIF3E protein encoded by the mammalian integration site 6 (int-6) gene, has been implicated in mouse and human breast carcinogenesis. Although, INT6 is a subunit of the eIF3 translation initiation factor, it is not essential for bulk translation but for specific mRNAs expression as histone mRNA translation. It has also been implicated in DNA replication by stabilizing the DNA replication licensing factor MCM7, in DNA Damage Response (DDR) and in the Nonsense mRNA Decay (NMD) pathway. Relative to the latter activity, I investigated whether INT6 can specifically meddle in telomere homeostasis by acting on TERRA transcripts. Deletion of INT6 by RNA interference approach revealed an increase in the telomeric RNA TERRA levels which is depending on the chromosome and cellular type. Although INT6 is a NMD factor, it doesn’t change TERRA steady-state. DNA-FISH experiments showed an increase in Telomere Induced Foci (TIFs) in INT6 depleted cells. These aberrations correspond to Telomere Free Ends (TFE) and Multi-Telomeric signals (MTS) which implicate INT6 in DDR. By means of Microccocal Nuclease (MNase) mapping assay, we found a rapid accumulation of telomeric mono-nucleosomes in INT6-depleted cells, suggesting a role in telomeric chromatin structure. These findings evidenced that INT6 is a novel key player in telomere stability
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Chen, Zhenhui. „Régulation épigénétique de la production de mycotoxines chez Fusarium graminearum“. Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0600.
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La contamination des aliments par les mycotoxines représente un risque potentiel pour la santé humaine et animale. Des rapports de l'Autorité européenne de sécurité des aliments, l’EFSA, indiquent que près de la moitié des aliments dérivés des céréales et de céréales non transformées collectées entre 2007 et 2012 dans 21 pays européens étaient contaminées par des trichothécènes de type B, ou TCTB, et en particulier du déoxynivalénol, ou DON. Ces mycotoxines sont produites par des champignons phytopathogènes sur les grains en cours de remplissage, avant la récolte. Dans un contexte de changement climatique, cette situation pourrait s’aggraver. Ainsi, maitriser les contaminations en mycotoxines est une tâche urgente qui ne peut être repoussée. En Europe, le DON est principalement produit par Fusarium graminearum. Si les étapes de la voie de biosynthèse des TCTB sont assez bien décrites, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de cette voie restent, à ce jour, mal compris.Des études récentes ont mis en évidence que les modifications post-traductionnelles des histones canoniques ainsi que de leurs variantes joue un rôle critique dans les régulations des biosynthèses des mycotoxines et autres métabolites secondaires chez les champignons filamenteux, en modifiant la structure de la chromatine. Chez F. graminearum, il a été prouvé que l'histone désacétylase HDF1 est impliquée dans l'activation de la production de DON. Par contre, la marque histone H3K27me3 réprime 14 % de son génome, y compris des gènes impliqués dans les voies métaboliques secondaires. La variante d'histone H2A.Z, trouvée de façon ubiquitaire chez les eucaryotes, participe à de nombreux processus biologiques dont la stabilité génomique, la réparation de l’ADN, la régulation de transcription et la désactivation des télomères. Toutefois, les mécanismes sous-jacents de ces fonctions restent flous. Chez certaines espèces, la fonction de H2A.Z semble essentielle. À ce jour, la seule étude ciblant directement la fonction de H2A.Z chez les champignons filamenteux a été réalisée chez Neurospora crassa et a identifié son rôle dans la réponse au stress oxydatif.Nous avons ici fait l’hypothèse que H2A.Z est impliquée dans des processus biologiques importants chez F. graminearum, y compris ceux impliqués dans la production de métabolites secondaires dont les mycotoxines. Ce projet vise ainsi à caractériser les rôles joués par H2A.Z dans le contrôle du développement, du métabolisme et de la virulence chez F. graminearum.À l’aide d’une approche de génétique inverse, nous avons créé six mutants ne possédant plus le gène codant H2A.Z dans trois souches différentes de F. graminearum. Tous les mutants présentent un déficit en sporulation, germination, croissance radiale et production de DON. Cependant, l'intensité des effets observés dépend du fond génétique considéré. En outre, le rajout du gène sauvage codant H2A.Z ne restaure pas les phénotypes sauvages. Les séquençages des génomes complets des mutants ont montrés que, bien que H2A.Z ait été totalement éliminé du génome, des mutations compensatoires se produisent à d'autres loci, indépendamment du fond génétique, dans des gènes impliqués dans le remodelage de la chromatine. De manière frappante, une mutation supplémentaire a été détectée dans les mutants délétés pour H2AZ dans lesquels l’allèle sauvage a été réintroduit. Nous avons également construit les mutants surexprimés H2A.Z, mais aucune différence significative de phénotype entre les mutants et la souche sauvage n’a été observée. L’ensemble de ces résultats indique que H2A.Z est essentielle chez F. graminearum, l’occurrence de mutations compensatoires ayant compensé l’effet létal de la délétion infligée. Nous émettons l'hypothèse que les profondes réorganisations des réseaux génétique permettent cette plasticité, avec certaines conséquences en termes d'évolution et d'adaptationContamination of food with mycotoxins is a significant risk to human and animal health. Reports from the European Food Safety Authority indicate that nearly half of the food derived from cereals and unprocessed grains collected between 2007 and 2012 in 21 European countries were contaminated with Type B trichothecenes, or TCTB, and especially deoxynivalenol, or DON. These mycotoxins are produced by fungal phytopathogens on growing kernels, before harvest. On account of the global climate change, this situation may become increasingly serious. Therefore, preventing the production of mycotoxins is a task which brooks no delay. In Europe, DON is predominantly produced by Fusarium graminearum. Even though the sequential steps of the TCTB biosynthetic pathway are fairly well described, the molecular events involved in regulating this pathway are complex and remain, so far, widely misunderstood.Recent studies highlighted post-translational modifications of canonical histones as well as their variants as critical players in the regulation of mycotoxin and other secondary metabolite biosyntheses in filamentous fungi, by altering chromatin structure. In F. graminearum, it was shown that the histone deacetylase HDF1 could be involved in the activation of DON production. In contrast, H3K27me3 histone mark represses 14 % of its genome, including genes involved in secondary metabolic pathways. Histone variant H2A.Z is ubiquitous in eukaryotes and is involved in a diverse range of biological processes, including genome stability, DNA repair, transcriptional regulation and telomere silencing. However, the underlying mechanisms of these functions remain unclear. In some species, the function of H2A.Z appears to be essential. Up to now, the only one study targeted directly on the function of H2A.Z in filamentous fungi was carried out on Neurospora crassa, and identifying a role in oxidative stress response.Here, we hypothesized that H2A.Z may be involved in important biological processes of F. graminearum including those involved in the production of secondary metabolism. Therefore, this project aims to characterize the roles played by the histone variant H2A.Z in controlling development, metabolism and virulence in F. graminearum.Using a reverse genetics approach, we created six H2A.Z deleted mutants in three different F. graminearum strains. All mutants exhibit deficiency in sporulation, germination, radial growth and DON production; however, intensities in the observed effects depend on the considered genetic background. Additionally, adding back wild-type H2A.Z could not rescue mutant phenotypes. Whole-genome sequencing showed that, although H2A.Z has been totally removed from the genome, compensatory mutations occur at other sites in each mutant regardless of the genetic background, in genes involved in chromatin remodeling. Strikingly, one extra mutation was detected in the H2A.Z add-back mutants. H2A.Z overexpressed mutants have also been constructed, but no significant difference in phenotype can be observed with wild type. Considering our results as a whole, we draw the conclusion that H2A.Z is essential in F. graminearum. It is the occurrence of compensatory mutations that rescued part of the lethality caused by H2A.Z deletion. We hypothesize that profound reorganizations of gene networks allow such plasticity, with certain consequences in terms of evolution and adaptation
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Teano, Gianluca. „Functional interplays between linker histone H1 variants and chromatin landscape in Arabidopsis thaliana“. Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASB003.
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Les plantes sont caractérisées par une remarquable plasticité développementale. En vertu de leur mode de vie sessile, elles sont capables d'adaptations phénotypiques rapides en réponse à des signaux environnementaux. En particulier, les plantes ont la capacité de détecter les conditions de lumière par de multiples photorécepteurs et utilisent cette information pour adapter leur morphologie et leur physiologie à un environnement changeant. Par exemple, la première perception de la lumière par des jeunes plantules, émergeant du sol, induit des changements profonds dans l'expression des gènes qui lancent la croissance et l'activité photosynthétique. Au cours de cette transition, la reprogrammation de l'expression du génome s'accompagne de réorganisations massives de l'organisation de la chromatine dans la grande majorité des cellules des feuilles embryonnaires, les cotylédons. Ainsi, chez la plante Arabidopsis thaliana, le dé-étiolement des cotylédons est associé à une condensation rapide des principaux domaines hétérochromatiniens en 8 à 10 "chromocentres" qui se forment autour des centromères. L’étude des voies de signalisation contrôlant ce processus nous a conduit à l'identification d’un acteur moléculaire clé pour la dynamique d'organisation des chromocentres en réponse à la lumière, les histones H1. Ces histones de liaison inter-nucléosomiques sont des composants structurels conservés qui contribuent à réguler l'organisation et la condensation locale et a grande échelle de la chromatine en limitant l'accessibilité à l'ADN pour de nombreux facteurs telles que les ARN polymérases. Cette thèse porte sur la caractérisation des réarrangements chromatiniens médiés par des variants d'histone H1. Des approches cytologiques et génomiques ont permis d’appréhender l'influence des trois différents variants H1 d'Arabidopsis thaliana dans la définition des structures 3D du génome et de la chromatine des cellules de cotylédons. La combinaison de tests d’accessibilité à la transposase Tn5 (ATAC) et de capture de conformation chromosomique (Hi-C) permet également de disséquer comment les histone H1 impactent la topologie du génome et l'adaptation du paysage chromatinien pour un nouveau programme de transcription. L'analyse de l'abondance et le profilage par immuno-précipitation quantitative de marques d'histones (ChIP-Rx) a également permis d'identifier le rôle joué par les histones H1 sur le paysage chromatinien répressif ainsi que son impact fonctionnel sur de nombreux gènes et éléments répétés du génome, potentiellement en restreignant l'accès à des facteurs de transcription sur des motifs de séquence spécifiques. Collectivement, ce travail a permis de disséquer les spécificités et les redondances fonctionnelles des variants d'histones de liaison en tant que régulateurs moléculaires du paysage chromatinien chez les plantesBeing capable of rapid phenotypic adaptations in response to environmental cues, plants are characterized by a remarkable developmental plasticity. Specifically, plants have the ability to sense light conditions by multiple photosensory receptors and to use this crucial information to adapt their morphology and physiology to a changing environment. For example, the first perception of light by young plantlets emerging from the soil induces deep changes in gene expression that launch growth and photosynthetic activity. During this transition, genome expression reprogramming is accompanied by massive rearrangements of chromatin sub-nuclear organization. In the Arabidopsis thaliana plant species, a large part of heterochromatin containing silent and condensed repeated elements is scattered within multiple foci in the nucleoplasm of most cotyledon cells when grown in darkness. Upon exposure to light, cotyledon de-etiolation triggers the rapid condensation of heterochromatic domains into 8-to-10 large chromocenters that form around centromeres. This phenomenology has led us to the identification of histone H1 variants as key molecular players in triggering chromocenter dynamics. These inter-nucleosomal linker histones are conserved structural components of eukaryotic chromatin that contribute to both local and higher-order chromatin organization and condensation, notably restricting DNA accessibility to multiple factors such as RNA polymerases. In this thesis cytological and genomic approaches were used to investigate the influence of the three Arabidopsis thaliana H1 variants in the definition of the genome and the 3D chromatin structure in cotyledon cells. The combination of Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) and Chromosome Conformation Capture (Hi-C) allowed dissecting how H1 histones impact genome topology and the adaptation of the chromatin landscape for a new transcriptional program. The analysis of histone marks abundance and their genome-wide profiling using quantitative chromatin immunoprecipitation (ChIP-Rx) further enhances current knowledge. We uncovered the functional impact of histones H1 in defining chromatin repressive landscape on many genes and repeated elements, potentially by restricting access to transcription factors on specific sequence motifs. Collectively, this work has allowed deciphering the specific and redundant functional implications of histone H1 variants as key molecular regulators of the chromatin landscape in plants
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Boubacar, Ali Nabiya. „Etude des fonctions transcriptionnelles de la lysine methyltransférase PR-Set7 et de l’effet des enzymes de méthylation de la Lysine 20 de l’Histone H4 sur la radiosensibilité des cellules cancéreuses“. Thesis, Montpellier, 2018. http://www.theses.fr/2018MONTT032.
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La chromatine, dont l’unité de base est le nucléosome, est une structure nucléoprotéique dynamique qui nécessite un remodelage au cours des processus nucléaires utilisant l’ADN comme matrice tels que la réplication, la transcription ou la réparation des cassures et autres types de lésions à l’ADN. Plusieurs facteurs capables de moduler la structure de la chromatine ont été caractérisés. Ils regroupent les complexes de remodelage ATP-dépendants et les enzymes modifiant les histones de façon post-traductionnelle. Nous nous intéressons au laboratoire à la voie de méthylation de la lysine 20 située sur la queue aminoterminale de l’histone H4. Le premier niveau de méthylation est induit par la monométhyltransférase PR-Set7 tandis que la di et tri méthylation sont déposées par le couple d’enzymes SUV4-20H1/2. Pour mieux caractériser le rôle joué par PR-Set7 au cours du développement, j’ai étudié la fonction de l'orthologue de PR-Set7 chez la Drosophile (dPR-Set7). La première partie de ma thèse a consisté à caractériser le rôle de dPR-Set7 dans la transcription. De manière intéressante, nous avons montré que la régulation transcriptionnelle médiée par PR-Set7 nécessite son domaine SET enzymatique mais pas H4K20me, suggérant l'existence d’autres substrats non-histones. Nous avons mis en évidence une interaction fonctionnelle de PR-Set7 et ISWI qui est la sous unité catalytique des complexes de remodelage de la chromatine (CRC). Fait intéressant, ISWI contient un patch basique identique à la queue N-terminale de H4 suggérant qu’il pourrait être un substrat pour dPR-Set7. La deuxième partie de ma thèse a consisté à combiner l’effet des radiations à ceux induits par les inhibiteurs des méthyltransférases responsables de la méthylation H4K20 et les radiations dans les lignées de cellules cancéreuses du pancréas et de l’ovaire. Par l'utilisation de différents inhibiteurs ciblant soit PR-Set7 ou les enzymes SUV4-20H, j’ai voulu savoir si la baisse des niveaux de H4K20me pourrait contribuer à une meilleure efficacité des traitements aux rayons X. Nos résultats montrent que la diminution globale des marques H4K20me2/3 suite à l’inhibition des enzymes SUV4-20H n’impacte que faiblement sur la survie des cellules et la combinaison des deux traitements les rendraient plus radiosensiblesChromatin is a dynamic nucleoprotein structure that requires remodeling for all nuclear processes such as replication, transcription and DNA damage. Several factors have been characterized to modulate chromatin structure and include ATP-dependent remodeling complexes and histone-modifying enzymes. We are interested in the laboratory in the methylation pathway of lysine 20 on histone H4 tail. The first level of methylation is induced by the monomethyltransferase PR-Set7 and the di/tri methylation are deposited by the SUV4-20H enzymes. To better characterize the role of dPR-Set7 during development, I wanted to study the function of Drosophila PR-Set7 (dPR-Set7). The first part of my thesis aimed to unravel the role of dPR-Set7 in transcription. Interestingly, transcriptional regulation mediated by PR-Set7 requires its enzymatic SET domain but not H4K20me, suggesting the existence of other non-histone substrates. We demonstrated a functional interaction between PR-Set7 and ISWI, the catalytic subunit of chromatin remodeling complexes (CRC). Interestingly, ISWI contains a basic patch identical to the histone H4 tail suggesting that it could be a substrate for dPR-Set7. The second part of my thesis consisted in combining inhibitors of H4K20 methyltransferase and radiation in ovarian and pancreatic cancer cell lines. I wanted to know if the decrease of H4K20me levels by inhibiting either PR-Set7 or SUV4-20H enzymes, contribute to better X-ray treatments. Our results show that the overall decrease of H4K20me2/3 marks following the inhibition of SUV4-20H enzymes has a low impact on cell survival and the combining effects of both treatments sensitize cancer cells
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Boskovic, Ana. „Study of histone variants and chromatin dynamics in the preimplantation mouse embryo“. Thesis, Strasbourg, 2014. http://www.theses.fr/2014STRAJ034/document.
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Comment le zygote acquiert la totipotence à partir de deux cellules complètement différenciées, et comment les décisions du destin cellulaire sont faites plus tard dans le développement sont des questions biologiques essentielles. Les études menées au cours de la première partie de mon doctorat ont contribué à l'annotation de la composition de la chromatine embryonnaire en ce qui concerne les variantes des histones et des modifications post-traductionnelles. L'expression ectopique de H2A.Z après la fécondation réduit la progression du développement, ce qui suggère que l'absence de H2A.Z au début du développement pourrait être importante pour l'organisation de la chromatine embryonnaire nouvellement formée. Deuxièmement, j'ai étudié la dynamique des histones dans l'embryon de souris en développement. La reprogrammation épigénétique après la fécondation est accompagnée par une étonnante forte mobilité des histones dans le noyau. Ma thèse a contribué à la compréhension des événements dynamiques affectant la chromatine embryonnaire pendant le remodelage épigénétique après la fécondationHow the zygote acquires totipotency from two differentiated cells, and how cell fate decisions are made later in development is a pivotal biological question. The studies conducted during the first part of my doctorate contributed to the annotation of embryonic chromatin composition with regards to histone variants and PTMs, and more specifically those correlated with active chromatin regions. The histone variant H2A.Z was shown to be present on embryonic chromatin in a stage-specific manner. Ectopic expression of H2A.Z after fertilization reduced developmental progression, suggesting that absence of H2A.Z at the onset of development might be important for the organization of the newly formed embryonic chromatin. Secondly, I investigated histone dynamics in the developing mouse embryo. Our work represents the first report on histone mobility during early mouse embryogenesis. My thesis contributed to the understanding of the dynamic events affecting embryonic chromatin during epigenetic remodeling after fertilization
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Tissot, Louis-Jean. „L'Ouvrage incomplet sur Matthieu (Opus imperfectum in Matthaeum) et les commentaires en latin sur l'évangile de Matthieu de l'Antiquité. Comparaison exégétique et stylistique ciblée sur la partie A (Mt. 1-8)“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2024. http://www.theses.fr/2024SORUL158.
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S'inscrivant dans le projet d'édition critique de l'Ouvrage incomplet sur Matthieu (Opus imperfectum in Matthaeum, OIM), la présente thèse analyse les liens entre ce commentaire anonyme sur l'évangile de Matthieu, provenant d'un milieu subordinationiste riminien (i.e. « homéen »), et d'autres ouvrages exégétiques latins sur le même évangile. Après avoir rappelé, dans un état de la recherche, les principales caractéristiques du corpus pris en compte, nous avons procédé à une comparaison exégétique suivie portant sur la section Mt 1-8, correspondant à la première partie de l'OIM, avec les commentaires sur Matthieu de Fortunatien d'Aquilée et d'Hilaire de Poitiers (milieu IVe siècle), ceux de Jérôme et Chromace d'Aquilée (fin IVe siècle), et les textes d'un auteur latin anonyme de la fin de l'Antiquité surnommé le pseudo-Origène. Cette étude s'est doublée d'une comparaison stylistique sur quelques aspects (appellations du Christ, vocabulaire exégétique, marques de personne), faisant ressortir la profonde originalité de l'OIM à cet égard. Le bilan de cette double comparaison confirme l'influence profonde du Commentaire sur Matthieu d'Origène sur l'OIM, ce qui rapproche l'auteur anonyme de Jérôme. De plus, notre étude met en évidence pour la première fois son utilisation du Commentaire sur Matthieu de Chromace d'Aquilée. Enfin, les résultats de la comparaison stylistique, assortis d'une analyse théologique des positions du traducteur, tendent à confirmer que c'est bien à l'auteur de l'OIM que nous devons l'ancienne traduction latine du Commentaire sur Matthieu d'OrigèneAs part of the critical edition project of the Incomplete Work on Matthew (Opus imperfectum in Matthaeum, OIM), the present thesis analyzes the links between this anonymous commentary on the Gospel of Matthew, coming from a Riminian subordinationist environment (i.e. “Homean”), and other Latin exegetical works on the same gospel. After recalling, in a state of research, the main characteristics of the corpus taken into account, we carried out a continued exegetical comparison relating to the section Mt 1-8, corresponding to the first part of the OIM, with the fragments remains of the commentary on Matthew by Origen (3rd century), the commentaries on Matthew by Fortunatian of Aquileia and Hilary of Poitiers (mid-4th century), those of Jerome and Chromatius of Aquileia (late 4th century), and the texts by an anonymous Latin author from late Antiquity known as pseudo-Origen. This study was accompanied by a stylistic comparison on certain aspects (appellations of Christ, exegetical vocabulary, personal marks), highlighting the profound originality of the OIM in this regard. The results of this double comparison confirm the deep link of the OIM with Origen's Commentary on Matthew, an influence that the anonymous author shares with Jerome. Furthermore, our study shows for the first time the use in the OIM of the Commentary on Matthew by Chromatius of Aquileia. Finally, the results of the stylistic comparison, accompanied by a theological analysis of the translator's positions, tend to confirm that it is indeed to the author of the OIM that we owe the ancient Latin translation of the Commentary on Matthew of Origen
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Ignatyeva, Maria. „Identification et caractérisation de HIRIP3 comme nouveau chaperon d'histone H2A“. Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAJ028.
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Le génome des cellules eucaryotes est empaqueté dans la chromatine, dont l’établissement et la maintenance nécessitent des processus d’assemblage et de remodelage. Ce travail de thèse a été consacré à la caractérisation de deux facteurs de la machinerie d’assemblage de la chromatine. Le premier facteur étudié dans ce travail était HIRIP3, un homologue mammifère de la levure H2A.Z chaperon Chz1. Nous voulions vérifier si HIRIP3 est une chaperon d'histone par elle-même. Pour commencer, nous avons décrit l'interaction de HIRIP3 avec les histones in vivo. Ensuite, nous avons étudié la spécificité structurale de cette interaction in vitro. Nous avons caractérisé HIRIP3 comme une nouvelle chaperon d'histone H2A qui utilise le motif CHZ pour sa fonction. La deuxième partie de ce travail a été axée sur le complexe de remodelage de la chromatine SRCAP. Nous avons cherché à décoder son réseau d'interaction et à décrire ses sous-complexes. Nous avons reconstitué le complexe de base YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B et H2A.Z / H2B en utilisant le système d'expression chez baculovirus. Notre protocole nous a permis de purifier un complexe de base adapté aux futures études structurelles par microscopie cryo-électroniqueThe genome of eukaryotic cells is packaged into chromatin, which establishment and maintenance require mechanisms of assembly and remodelling. This thesis work was dedicated to the characterization of two factors of chromatin assembly machinery. The first factor studied in this work was HIRIP3, a mammalian homologue of yeast H2A.Z chaperone Chz1. We aimed to test whether HIRIP3 is a histone chaperone by itself. At first, we established HIRIP3 interaction with histones in vivo. After then, we studied the structural specificity of this interaction in vitro. We have characterized HIRIP3 as a novel H2A histone chaperone that utilizes the CHZ motif for its function. The second part of this work was focused on SRCAP chromatin remodelling complex. We aimed to decipher its interaction network and to describe its sub-complexes. We have reconstituted YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B and H2A.Z/H2B core complex using baculovirus expression system. Our protocol allowed us to purify core complex suitable for future structural studies by cryo-electron microscopy
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Stadelmayer, Bernd. „Le noyau cellulaire et la régulation génique par les protéines du groupe Polycomb“. Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON13507/document.
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Les protéines des groupes Polycomb et trithorax sont des régulateurs épigénétiques très conservés qui permettent le maintient de l'identité cellulaire en régulant le niveau d'expression des gènes. Ils agissent sur leurs gènes cibles à travers des éléments régulateurs en cis, appelés éléments de réponse aux Polycombs (PRE). Dans des tests transgéniques, il a été montré que deux copies du même PRE sont fréquemment regroupés dans la même région nucléaire. Dans le cas particulier du PRE Fab-7, ce regroupement corrèle avec sa fonction répressive. Durant ma thèse, j'ai tenté de cloner un outil bicolore qui permet la visualisation en 4D de deux PRE Fab-7 stablement intégrés dans le génome de Drosophila melanogaster. De plus, j'ai amélioré le protocole de DNA-FISH du labo. Ceci m'a permis d'identifier vestigial et apterous comme étant des loci qui forment des associations nucléaires, de façon dépendante de la transcription, dans Drosophila melanogasterPolycomb- and trithorax-Group proteins are highly conserved epigenetic regulators which maintain cell identities by maintaining states of gene expression. They act on their target genes through /cis/ regulatory elements, named Polycomb Response Elements (PREs). In transgene assays it has been shown that two copies of the same PRE are frequently found clustered in nuclear space and for one particular PRE named Fab-7 clustering is correlated with its repressive function. In the course of this thesis I tried to clone a two colour real-time tool which allows distinguishing in 4D two /Fab-7/s stably integrated into the genome of Drosophila melanogaster. Additionally, I improved the DNA-FISH protocol of the lab and identified vestigial and apterous as potential gene loci forming nuclear associations dependent on transcription in Drosophila melanogaster
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Montibus, Bertille. „Régulation et fonction de la chromatine bivalente chez les mammifères : l'emprunte parentale comme modèle“. Thesis, Clermont-Ferrand 1, 2016. http://www.theses.fr/2016CLF1MM23.
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La différenciation et le développement requièrent une régulation fine de l’expression desgènes, médiée en partie par les modifications épigénétiques. Parmi les modificationsd’histones, la chromatine bivalente, signature chromatinienne atypique associant lesmarques permissive H3K4me2/3 et répressive H3K27me3, est de par sa plasticité, pressentiepour jouer un rôle décisionnel dans l’acquisition d’une identité cellulaire. Pour étudier le rôlede la chromatine bivalente au cours du développement, nous avons choisi d’utiliserl’empreinte parentale. Ce cadre développemental bien caractérisé, conduit à l’expression decertains gènes à partir d’un seul des deux allèles selon son origine parentale. La méthylationdifférentielle de l’ADN d’une région clé, appelée ICR (Imprinting Control Region), bienqu’absolument requise pour l’expression mono-allélique de ces gènes, n’est pas suffisantepour rendre compte de la complexité du profil d’expression de ces gènes suggérantl’implication d’autres mécanismes. Sur 15 ICR méthylés sur l’allèle maternel, nous avonsprécisément mis en évidence que la chromatine bivalente est présente par défaut sur l’allèlenon-méthylé lorsque celui-ci est transcriptionnellement inactif, quel que soit le stadedéveloppemental ou le tissu étudié, participant ainsi à la régulation fine de l’expressiontissu-spécifique à partir de ces régions. Dans leur ensemble, nos données révèlent que lachromatine bivalente joue un rôle moins dynamique que pressentie. Ainsi, au niveau del’empreinte parentale, sa fonction principale serait de protéger l’allèle non-méthylé des ICRcontre l’acquisition de méthylation tout en aidant à le maintenir réprimé dans certainstissus. Nous proposons que la chromatine bivalente joue un rôle similaire sur l’ensemble desîlots CpG du génome, contribuant ainsi à la protection de l’identité cellulaire. Afin decompléter cette première étude, j’ai étudié la régulation de l’expression d’un candidat de larégulation de la dynamique de la chromatine bivalente, l’histone déméthylase pourH3K27me3, JMJD3. Les résultats obtenus suggèrent que l’induction d’expression observéeau cours de la différenciation neurale s’appuie sur une dynamique de la structuretridimensionnelle de la chromatine qui pourrait elle-même être régulée par la transcriptiond’un eARN (enhancer ARN) et l’hydroxyméthylation. Ce modèle souligne un mode derégulation complexe de ce nouvel acteur épigénétique, impliquant des régionsintragéniques, et pourrait notamment permettre de comprendre les mécanismes impliquésdans sa dérégulation dans les cancersFine-tuned regulation of gene expression is required for cell fate determination anddevelopment. Epigenetics modifications are well documented to be instrumental in thisprocess. Among them, bivalent chromatin, an unusual chromatin signature, which associatesthe permissive mark H3K4me2/3 and the repressive mark H3K27me3, is believed to arbitrategene expression during cell commitment. To study its precise role in development, we haveundertaken to study bivalency in the context of genomic imprinting. This well-defineddevelopmental frame is a process restricting expression of some genes to one parental alleleonly. The constitutive differential DNA methylation at the key region called ICR (ImprintingControl Region), is absolutely required but not sufficient to explain the complexity of themono-allelic expression pattern of imprinted genes, indicating that other mechanisms couldbe involved. Specifically, on 15 maternally methylated ICR, we showed that bivalentchromatin is acquired by default on the unmethylated allele of ICR when it istranscriptionally inactive whatever the developmental stage or the tissue studied and thuscontribute to tissue-specific expression from these regions. Altogether, our results revealthat chromatin bivalency is much less dynamic than proposed. In the context of genomicimprinting, it seems to plays more a safeguard function at ICR by protecting theunmethylated allele against DNA methylation acquisition while keeping it silent in a subsetof tissues. To complete this study, I studied the regulation of JMJD3, a histone demethylasefor H3K27me3, candidate to regulate bivalency dynamic. Our results suggest that theinduction of Jmjd3 expression observed during neural differentiation rely on the dynamic ofthe tridimensional architecture at the locus which could be regulated by the transcription ofan eRNA (enhancer RNA) and by hydroxymethylation. This model highlight a complex way ofregulation for this new epigenetics actor, involving intragenic regions and could help tounderstand how Jmjd3 expression is deregulated in a pathological context such as in cancer
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Hoghoughi, Naghmeh. „Base moléculaire de la programmation post-méiotique du génome mâle Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase Histone variants: essential actors in the male genome programing“. Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2019. https://thares.univ-grenoble-alpes.fr/2019GREAV054.pdf.
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La chromatine des cellules spermatogèniques subit une réorganisation radicale pendant la spermiogenèse. Ce phénomène se produit pour deux raisons principales : premièrement, pour établir un génome très compact par l'incorporation de protamine, afin de protéger le génome du sperme avant et pendant la fécondation. Deuxièmement, afin de transférer avec succès l'information paternelle portée par le génome du sperme, à la génération suivante. Récemment, notre laboratoire a identifié différents acteurs et mécanismes moléculaires, qui sont au cœur de cette réorganisation radicale du génome. Une hyperacétylation des histones à l'échelle du génome amorce le processus de remplacement des histones par des protéines de transition et des protamines. Notre laboratoire a identifié NUT (Nuclear protein in Testis) comme le principal regulateur de l'hyperacétylation des histones au début du processus de transition histone-protamine. NUT par recrutement d'histone acétyltransférase CBP/p300, induit une hyperacétylation de l'histone H4 principalement au niveau des résidus lysine 5 et lysine 8. Ensuite, le premier bromodomaine de BRDT (bromodomaine contenant le facteur spécifique du test) reconnaît l'acétylation des histones et déclenche le processus d'élimination des histones. Le variant H2A.L.2 (H2A.Like 2) spécifique au testicule, forme un dimère avec le variant d'histone H2B, TH2B, au moment de l’éviction des histones dans les spermatides allongés. Le dimère H2A.L.2-TH2B s'incorpore alors dans la chromatine et ouvre la structure du nucléosome. Ceci permet l'invasion des histones par les protéines de transition ainsi que le traitement pré-protaminique. Les protamines déplacent finalement les complexes histone-TPs et compactele génome. Auparavant, notre laboratoire a rapporté qu'une fraction de H2A.L.2 resteassociée à des régions hétérochromatines péricentriques dans les spermatozoïdes matures. Au cours de mon doctorat, nous avons d'abord découvert les bases structurelles et moléculaires de l'activation du CBP/p300. Nous spéculons que les mêmes mécanismes pourraient mener à l'acétylation des histones induite par Nut-p300-dépendante, menant à l'initiation de l'élimination des histones dans les phases post-méiotiques de la spermatogenèse. Nous avons démontré également que la dissociation des nucléosomes à la suite de l'incorporation du H2A.L.2-TH2B permet au dimère H2A.L.2-TH2B de s'associer à l'ADN de façon stable, tandis que le tétramère H3-H4 est déplacé. Ceci conduit à la génération de structures à base de dimères H2A.L.2-TH2B, qui persistent dans le sperme mature. De plus, nous avons déchiffré la base moléculaire de la capacité intrinsèque de H2A.L.2 à cibler les régions hétérochromatines péricentriques. Nous avons également identifié un rôle critique vis-à-vis de l'ARN dans la régulation et le contrôle du renouvellement et de la localisation d’ H2A.L.2 dans les régions hétérochromatines péricentriques. En conclusion, nos travaux mettent en évidence la présence de structures à base de dimères dans la chromatine du sperme, ainsi qu'une reprogrammation spécifique de l'hétérochromatine péricentrique masculine. Ceci pourrait porter des informations essentielles transmissibles à la génération suivanteSpermatogenic cell chromatin undergoes a drastic reorganisation during spermiogenesis. This phenomenon occurs for two principles reasons: first, to establish a highly compact genome through protamine incorporation, in order to protect the sperm genome before and upon fertilization. Second, in order to successfully transfer the paternal information carried by the sperm genome, to the next generation. Recently, our laboratory identified various actors and molecular mechanisms, which are at the heart of this drastic genome reorganisation. A genome-wide histone hyperacetylation initiates the process of histone replacement by transition proteins and protamines. Our laboratory identified NUT (Nuclear protein in Testis) as the main player of histone hyperacetylation at the onset of histone-to-protamine transition process. NUT through recruitment of histone acetyltransferase CBP/p300, induces histone H4 hyperacetylation mainly at lysine 5 and lysine 8 residues. Next, first bromodomain of BRDT (Bromodomain containing Testis-specific factor) recognizes histone acetylation and initiates the process of histone removal. Previously identified testis-specific H2A variant, H2A.L.2 (H2A.Like 2), forms dimer with histone H2B variant TH2B at the time of histone eviction in elongating spermatids. The dimer H2A.L.2-TH2B then incorporates into the chromatin and opens the nucleosome structure, which allows the invasion of histones by transition proteins as well as pre-protamine processing. Protamines finally displace histone-TPs complexes and re-package the genome. Previously, our laboratory reported that a fraction of H2A.L.2 is associated with pericentric heterochromatin regions in mature spermatozoa. During my PhD, first we discovered the structural and molecular basis of the activation of CBP/p300. We speculate that the same mechanisms could lead to the Nut-p300-dependent induced histone acetylation, leading to the initiation of histone removal in post-meiotic phases of spermatogenesis. Second, we demonstrated that nucleosome dissociation following H2A.L.2 incorporation provides an opportunity for H2A.L.2-TH2B dimer to associate to DNA in a stable manner, while H3-H4 tetramer is being displaced. This leads to the generation of H2A.L.2-TH2B dimer-based structures, which persist in mature sperm. In addition, we deciphered the molecular basis of the intrinsic ability of H2A.L.2 to target the pericentric heterochromatin regions. We also identified a critical role for RNA in regulating and in controlling the turnover and localisation of H2A.L.2 in pericentric heterochromatin regions. In conclusion, our work highlights the presence of dimer-based structures within the sperm chromatin, as well as a specific re-programming of the male pericentric heterochromatin, which might bear crucial information transmittable to the next generation
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Goutte-Gattat, Damien. „Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A“. Thesis, Grenoble, 2011. http://www.theses.fr/2011GRENV079/document.
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Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylationThe histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter- mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in some species that the mere presence of that domain is required for proper centromere func- tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell lines stably expressing GFP-tagged CENP-A constructs, allowing us to perform pseudoge- netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event
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Bellegarde, Fanny. „Rôle de la régulation chromatinienne dans le contrôle de l’expression des gènes en réponse aux variations nutritionnelles en azote chez Arabidopsis“. Thesis, Montpellier, SupAgro, 2017. http://www.theses.fr/2017NSAM0037/document.
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Le nitrate est une source essentielle d’azote pour les plantes. Les transporteurs racinaires qui prélèvent le nitrate du sol sont soumis à des régulations transcriptionnelles qui modulent les capacités de prélèvement du nitrate. NRT2.1, transporteur de nitrate essentiel et majoritaire au niveau racinaire, est très fortement exprimé en condition limitante en nitrate, et réprimé sous forte nutrition azotée. Cette répression est corrélée avec un enrichissement en marque chromatinienne H3K27me3 qui semble dépendant du régulateur chromatinien HNI9. H3K27me3 est une marque chromatinienne répressive pour l’expression des gènes, catalysée par le complexe PRC2, et est impliquée dans la régulation du développement. Cependant, le rôle de H3K27me3 et de PRC2 dans l’adaptation à des environnements nutritionnels fluctuants reste à étudier. Le projet qui m’a été confié était d’étudier, chez Arabidopsis, la contribution de H3K27me3 dans la régulation du gène NRT2.1 en réponse à l'azote. Nous démontrons que H3K27me3 n’est pas le déterminant majeur de la répression de NRT2.1 par le fort statut azoté, mais que H3K27me3 régule directement NRT2.1, dans un contexte où NRT2.1 est fortement exprimé, afin de tempérer son expression. Nous montrons également que l’absence de limitation de l’hyperactivité du promoteur NRT2.1 peut in fine conduire à un état totalement réprimé par méthylation de l’ADN. Ce travail révèle une fonction insoupçonnée de PRC2 en tant que modulateur et protecteur de l’expression de gènes fortement exprimés. Nous montrons aussi que HNI9 aurait pour fonction d’activer des gènes de réponse à un stress oxydant mis en place lors d’une forte nutrition, et que PRC2 et NRT2.1 ont des rôles indépendants dans la régulation de l’architecture racinaire. L’ensemble de ce travail a permis de mettre en lumière de nouvelles fonctions de la dynamique chromatinienne dans la régulation de gènes majeurs pour la nutrition des plantesNitrate is an essential source of nitrogen for plants. Root nitrate transporters are subjected to transcriptional regulations that allow a fine control of nitrate uptake capacities. NRT2.1, an essential and major nitrate transporter in roots, is strongly expressed under limiting nitrate condition, and repressed under high nitrogen nutrition. This repression is correlated with an enrichment in chromatin mark H3K27me3, which seems to be dependent on the chromatin regulator HNI9. H3K27me3 is a chromatin mark repressive for gene expression, catalysed by the PRC2 complex, and involved in developmental regulation. However, the role of H3K27me3 and PRC2 in the adaptation to fluctuating nitrogen environments remains to be understood. My project was to study, in Arabidopsis, the contribution of H3K27me3 in the regulation of NRT2.1 gene in response to nitrogen provision.We demonstrate that H3K27me3 is not the major determinant of NRT2.1 repression by high nitrogen status, but that H3K27me3 directly regulates NRT2.1, in a context where NRT2.1 is strongly expressed, to temper its expression. We also show that the absence of limitation of NRT2.1 promoter hyperactivity can lead to a switch to full silencing by DNA methylation.This reveals an unexpected function of PRC2 as a safeguard for the expression of highly expressed genes. We also show that HNI9 is involved in the activation of oxidative stress responsive genes, which occurs under N-rich nutrition, and that PRC2 and NRT2.1 play independent roles in the regulation of root architecture. This work has highlighted new functions of chromatin dynamic in the regulation of genes with major significance for plant nutrition
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Ciabrelli, Filippo. „Stable transgenerational inheritance of alternative chromatin states in Drosophila melanogaster“. Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTT034.
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L’héritage épigénétique transgénérationnelle est un phénomène très controversé, selon lequel un phénotype non-génétiquement déterminé peut être transmis à la génération suivante. Jusqu'à présent, ce mode de transmission a été décrit dans quelques cas et il a été suggéré que les composants de la chromatine peuvent être impliqués, y compris des protéines du groupe Polycomb, qui agissent comme des répresseurs de gènes clés du développement et coordonnent la différenciation cellulaire et la prolifération. Les mécanismes moléculaires à la base du rôle de la répression génique Polycomb-dépendante à hérédité épigénétique transgénérationnelle sont loin d'être compris. Par conséquent, j’ai développé un système expérimental chez Drosophila melanogaster pour induire un héritage épigénétique transgénérationnelle stable, dans lequel des états d'expression génique alternatifs peuvent être transmis en présence de la même séquence d'ADN. A partir de ces « épilignes » stables, j’ai pu disséquer certaines des propriétés génétiques des épiallèles induits, tels que leur héritage quantitatif et leur capacité à communiquer à longue distance. En outre, les épiallèles montrent une synergie dans leur expression et transmission héréditaire. L'une des signatures moléculaires des épiallèles est une différence de répression médiée par les complexes Polycomb et par leur marque d’histone caractéristique. Cette distribution différente est indépendante de l’activité transcriptionnelles des gènes en aval, au moins dans un stade de développement précoce, et pourrait influer l'organisation tridimensionnelle du locus impliqué. Curieusement Ago2, un composant de la voie ARNi, a été montré interagir avec les épiallèles génétiquement et la protéine Ago2 se fixe directement à leur chromatine, ce qui indique un rôle possible pour le ncRNAs dans l'expression des épiallèles et éventuellement dans leur transmission. Ces résultats plaident en faveur e l’existence d’une hérédité épigénétique transgénérationnelle stable chez les métazoaires et fournissent un modèle qui se prête à une dissection moléculaire de ce phénomèneTransgenerational epigenetic inheritance is a hotly debated phenomenon whereby a non-genetically determined phenotype can be transmitted to the next generation. So far, this mode of inheritance has been described in few cases and it was suggested that chromatin components might be involved, including Polycomb group proteins, which act as repressors of key developmental genes and coordinate cell differentiation and proliferation. The molecular mechanisms linking Polycomb-mediated silencing to transgenerational epigenetic inheritance are far from being understood. Therefore, I developed an experimental system in Drosophila melanogaster to induce stable transgenerational epigenetic inheritance, in which alternative gene expression states can be transmitted in the presence of the same DNA sequence. Starting from these highly stable “epilines”, I could dissect some of the genetic properties of the induced epialleles, such as their quantitative inheritance and their ability to trans-communicate. Moreover, the epialleles displayed synergy in their expression and transmission. One of the molecular signatures of the epialleles is the differential presence of the Polycomb repressive complexes and their related epigenetic marks. This different distribution is independent of the transcriptional activity of the downstream genes, at least in an early developmental stage, and could influence the three-dimensional organization of the locus involved. Intriguingly Ago2, an RNAi pathway component, has been found to genetically interact with the epialleles and to be directly bound on their chromatin, indicating a possible role for the ncRNAs in the expression of the epialleles and possibly in their transmission. These results make a case for strong and stable transgenerational epigenetic inheritance in metazoan and provide a model that is amenable for the molecular dissection of this phenomenon
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Kirstein, Nina Danielle. „Chromatin-dependent pre-replication complex positioning and activation in mammals“. Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT005/document.
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Chaque division cellulaire requiert une duplication précise du génome. Des dizaines de milliers de sites d’initiation de la réplication d’ADN (origines de réplication) sont impliqués dans la réplication complète du génome humain. L’activation des origines de réplication est régulée précisément et des études génomiques extensives ont démontré la présence de caractéristiques génomiques associées à l’activation des origines de réplication. Le complexe de pré-réplication (pre-RC) est la base de l’initiation de la réplication et consiste en deux sous-complexes majeurs : l’ « origin recognition complex » (ORC) qui interagit directement avec l'ADN et est nécessaire pour recruter le second sous-complexe, les hélicases Mcm2 7, qui sont responsables de l'initiation de la réplication. La régulation de l’assemblage du pre-RC est bien étudiée, mais les caractéristiques de la chromatine qui déterminent le positionnement du pre-RC sur le génome restent peu connues. Les études génomiques par immuno-précipitation de la chromatine et séquençage à haut débit (ChIP-seq) des pre-RCs sont rares et jusqu’à aujourd’hui seulement disponibles pour ORC. Du fait que Mcm2-7 migre de son site de chargement initial, il est crucial d'obtenir des informations sur le positionnement des Mcm2-7 pour la compréhension complète de la régulation de la réplication. Ce travail présente la première analyse génomique par méthode ChIP-seq des deux sous-unités majeures du pre-RC, ORC et Mcm2-7, dans la lignée cellulaire de lymphome de Burkitt Raji infectée par le virus d’Epstein-Barr (EBV). La présence du génome d’EBV permet d'avoir un contrôle interne de la qualité de nos expériences, en comparant les positions de pre-RC déterminées avec des positions du pre-RC précédemment publiées. Sur le génome humain, les résultats de séquençage du pre-RC corrèlent bien avec des zones de réplication active. De façon intéressante, les zones de terminaison de la réplication étaient spécifiquement bas en pre-RC, spécialement en Mcm2-7. La localisation des sites d'initiation de la réplication identifiés est généralement bien corrélée avec les sites de transcription active. En effet, des sites d’assemblage du pre-RC de haute affinité sont localisés préférentiellement en voisinage de sites de transcription active, ce qui est possiblement dû à l’accessibilité de la chromatine dans ces régions. La fixation de Mcm2-7 fluctue de façon dépendante du cycle cellulaire, ce qui suggère des translocations de Mcm2 7 en G1, probablement dépendantes de la machinerie active de la transcription. Ces résultats indiquent que les positions de ORC et Mcm2-7 sont principalement dépendantes de l’accessibilité de la chromatine avec un accès privilégié dans la chromatine active et Mcm2 7 étant le déterminant majeur de l’initiation de la réplication. Au sein de l'hétérochromatine, ORC est enrichi dans des zones associées avec l'histone modifié H4K20me3. Cependant, cet enrichissement est moins important pour les Mcm2-7. En utilisant un système de réplication basé sur des plasmides, nous avons démontré que l’association d'ORC et H4K20me3 favorise l’assemblage du pre-RC et l’initiation de la réplication. Cette observation suggère que l’interaction ORC-chromatine est le déterminant majeur de la régulation de la réplication d’ADN au sein de l’hétérochromatine. En conclusion, cette étude propose deux mécanismes différents de la régulation de l'assemblage du pre-RC dépendants de l’environnement de la chromatineWith every cell division, the genome needs to be faithfully duplicated. Tens of thousands of DNA replication initiation sites (origins of replication) are involved in replicating the human genome. Origin activation is precisely regulated and extensive genome-wide studies found association of origin activation to several different genomic features. The pre-replication complex (pre RC) is the basis for replication initiation and consists of two major subcomponents: the origin recognition complex (ORC) binds DNA and is required for loading of the second component, Mcm2-7 helicases, which initiate DNA replication. Regulation of pre-RC assembly is well studied, however, chromatin features driving pre RC positioning on the human genome remain largely unknown. Genome-wide pre-RC chromatin immunoprecipitation experiments followed by sequencing (ChIP-seq) studies are rare and so far only performed for ORC. As Mcm2-7 can translocate from their initial loading site, information about Mcm2-7 positioning are required for full understanding of DNA replication regulation.This work presents the first genome-wide ChIP-seq analysis of the two major pre-RC subcomponents ORC and Mcm2-7 in the Epstein-Barr virus (EBV) infected Burkitt’s lymphoma cell line Raji. Successful ChIPs were validated on the EBV genome by comparing obtained pre RC positions with already existing pre-RC ChIP-on chip data. On the human genome, pre-RC sequencing results nicely correlated with zones of active replication. Interestingly, zones of replication termination were specifically depleted from pre-RC components, especially from Mcm2 7. Active DNA replication is known to correlate with active transcription. Indeed, strong pre-RC assembly preferentially occurred at sites of active transcriptional regulation, presumably determined by chromatin accessibility. Strong Mcm2-7 binding thereby fluctuated cell cycle-dependently, arguing for Mcm2-7 translocations during G1, possibly depending on the active transcriptional machinery. These results indicate ORC and Mcm2-7 positions being mainly dependent on chromatin accessibility in active chromatin, with Mcm2-7 being the major determinant of replication initiation. In heterochromatin, ORC was enriched at H4K20me3 sites, while Mcm2-7 enrichment was less prominent. Employing a plasmid-based replication system, ORC association to H4K20me3 was proven to promote successful pre-RC assembly and replication initiation, situating direct ORC-chromatin interactions being the major determinant for DNA replication regulation in heterochromatin. Taken together, this study proposes two different modes of pre-RC assembly regulation depending on chromatin environment
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Barthes, Pauline. „Modifications de la chromatine associées à l'initiation de la recombinaison méiotique, chez la souris“. Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON1T007.
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La méiose est une étape de la différenciation germinale qui permet la formation des gamètes. Elle est composée de deux divisions successives. La ségrégation des chromosomes homologues à la première division nécessite des connexions entre homologues, mises en place par des événements de crossing-over (CO). Les CO augmentent également la diversité génétique, et leur fréquence et leur distribution sont étroitement régulées. Ils sont générés par un mécanisme de formation et réparation de cassures double brins de l'ADN (CDBs), catalysées par la protéine SPO11 et préférentiellement localisées dans des régions de 1-2 kb appelées points chauds de recombinaison méiotique. Une question majeure est de comprendre comment sont régulés ces CO, ce qui détermine leur fréquence et leur distribution, car toute altération de cette régulation peut conduire à des anomalies chromosomiques graves.Dans ce travail de thèse, pour la première fois chez les mammifères, nous avons montré que des modifications de la chromatine sont associées à l'initiation de la recombinaison méiotique (formation des CDBs par SPO11). Ces résultats ont été obtenus par des analyses d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sur des spermatocytes purifiés ou non, isolés de différentes lignées de souris. Une des modifications associées à l'activité de deux points chauds testés est la triméthylation de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4Me3). Une analyse fonctionnelle et temporelle de cette modification a permis de montrer qu'elle ne dépend pas de SPO11 et apparaît avant la formation de CDBs. Nous avons montré ici que c'est la protéine PRDM9, récemment identifiée comme un déterminant majeur des points chauds de recombinaison chez les mammifères et possédant une activité méthyltransférase, qui appose H3K4Me3. Nous proposons un modèle où H3K4Me3 et d'autres caractéristiques inconnues constitueraient un substrat pour la machinerie d'initiation et recruteraient SPO11 en des points précis du génome, qui deviendront des points chaudsMeiosis is a specialized cell division to produce haploid gametes from a diploid cell. It segregates parental genomes by two successive divisions. The faithful segregation of homologous chromosomes is achieved during the first unique division via formation of crossovers (COs). COs establish physical connections between homologs by the reciprocal exchange of genetic material and require the formation and subsequent repair of SPO11-dependent DNA double-strand breaks (DSBs). Studies in many organisms revealed that COs are distributed in highly localized regions (1-2Kb) of genomes called recombination hotspots. The mechanisms of COs regulation are elusive and a main question in the field is to understand how the frequency and distribution of CO are regulated, because either absence or defects of recombination can lead to aneuploidy or reduced fertility. In the present study, for the very first time in mammals, we investigate whether recombination hotspots are associated with any chromatin modifications. We performed chromatin immunoprecipitation (ChIP) on spermatocytes isolated from different mice strains harbouring either active or inactive hotspots. Comparison of hot and cold spots revealed that a specific histone modification i.e. trimethylation of the lysine 4 of histone H3 (H3K4Me3) is enriched at two tested hotspots in mice. Temporal and functional analysis show that H3K4Me3 is not dependent on SPO11 and appears before DSBs formation. Furthermore, we demonstrate here that H3K4Me3 is methylated via the histone methyltransferase activity of PRDM9, recently identified as a major determinant of recombination hotspots in mammals. We propose a model that H3K4Me3 and other unknown chromatin features may specify recruitment of SPO11 initiation machinery to initiate meiotic recombination at the hotspots
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Dai, Dingli. „Caractérisation des interactions physiques et fonctionnelles entre le facteur d’assemblage de la chromatine, CAF-1, et des facteurs de la recombinaison homologue au cours de la réparation de l’ADN“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS498/document.
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L’ADN est constamment exposé à des insultes génotoxiques endogènes et exogènes. Plusieurs mécanismes de réparations de l’ADN sont mis en œuvre pour préserver la stabilité du génome et de l’épigénome. La recombinaison homologue (RH) joue un rôle central dans la réparation des cassures double brin de l’ADN (DSBs) et le redémarrage des fourches de réplication en réponse à un stress réplicatif. Ces deux processus sont tous deux couplés à l’assemblage de la chromatine. Le facteur d’assemblage de la chromatine 1 (CAF-1) est un chaperon d’histone conservé au cours de l’évolution qui fonctionne dans le processus d’assemblage des nucléosomes couplé à la réparation de l’ADN et à la réplication, en déposant sur l’ADN les tétramères d’histones (H3-H4)2 nouvellement synthétisés. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, le complexe CAF-1 est constitué de trois sous-unités, Pcf1, Pcf2 et Pcf3. Il a été montré que CAF-1 agit dans l’étape de synthèse de l’ADN durant le processus de réplication dépendante de la recombinaison (RDR) et protège le désassemblage des D-loop par l’hélicase Rqh1, membre de la famille des hélicases RecQ. Dans cette étude, nous avons adressé le rôle de CAF-1 pendant la réparation de l’ADN par recombinaison homologue chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Par l’utilisation d’approches in vivo et in vitro, nous avons validé des interactions protéines-protéines au sein d’un complexe contenant Rqh1, CAF-1, PCNA, et l’Histone H3. Nous avons montré que Rqh1 interagit avec Pcf1 et avec Pcf2 indépendamment l’un de l’autre, et que l’interaction Rqh1-Pcf1 est stimulée par des dommages à l’ADN. Nous avons mis en place une méthode d’analyse de liaison à la chromatine pour suivre l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse aux dommages à l’ADN. Nous avons observé qu’un stress réplicatif, mais pas l’induction de cassures double brin de l’ADN, favorise l’association de CAF-1 à la chromatine. Nous avons identifié plusieurs facteurs de la RH nécessaire pour l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse à un stress réplicatif. De plus, nous avons mis en évidence des interactions physiques entre Pcf1 et des facteurs de la recombinaison homologue, parmi lesquels RPA et Rad51. Nos données suggèrent que CAF-1 pourrait s’associer aux sites de synthèse d’ADN dépendent de la recombinaison via son interaction avec des facteurs de la RH. L’ensemble des données de cette étude contribuent à renforcer le role de CAF-1 couplé à réparation de l’ADN, et révèlent une interconnexion entre les facteurs de la RH et l’assemblage de la chromatineDNA is constantly exposed to both endogenous and exogenous genotoxic insults. Multiple DNA repair mechanisms are exploited to guard the genome and epigenome stability. Homologous recombination (HR) plays a major role in repairing DNA double strand breaks (DSBs) and restarting stalled replication forks under replicative stress. These two processes are both coupled to chromatin assembly. Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) is a highly conserved histone chaperone known to function in a network of nucleosome assembly coupled to DNA repair and replication, by depositing newly synthesized histone (H3-H4)2 tetramers onto the DNA. The fission yeast CAF-1 complex consists of three subunits Pcf1, Pcf2 and Pcf3. CAF-1 has been previously reported to act at the DNA synthesis step during the process of recombination-dependent replication (RDR) and protects the D-loop from disassembly by the RecQ helicase family member, Rqh1. In this study, we addressed the role of CAF-1 during homologous-recombination-mediated DNA repair in fission yeast.Using in vivo and in vitro approaches, we validated interactions within a complex containing Rqh1, CAF-1, PCNA, and Histone H3. We showed that Rqh1 interacts with both Pcf1 and Pcf2 independently of each other, and the Pcf1-Rqh1 interaction is stimulated by DNA damage. We developed an in vivo chromatin binding assay to monitor the association of CAF-1 to the chromatin upon DNA damage. We observed that replication stress but not double strand break favors CAF-1 association to the chromatin. We identified that several HR factors are required for CAF-1 association to the chromatin upon replication stress. In support of this, we have identified physical interactions between Pcf1 and HR factors, including RPA and Rad51. Our data suggest that CAF-1 would associate with the site of recombination-dependent DNA synthesis through physical interactions with HR factors. Put together, this work contributes to strengthening the role of CAF-1 coupled to DNA repair, and reveals the crosstalk between HR factors and chromatin assembly
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Walter, Marius. „Transposon regulation upon dynamic loss of DNA methylation“. Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066672/document.
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Les transposons sont des séquences d’ADN qui ont la capacité de se dupliquer de façon autonome, posant une menace pour l’intégrité et la stabilité du génome. De nombreux mécanismes existent pour contrôler l’expression des transposons, parmi lesquels la méthylation de l’ADN joue un rôle particulièrement important. Chez les mammifères, les profils de méthylation sont stables tout au long de la vie de l’individu, mis-à-part pendant deux moments clés du développement embryonnaire. Pendant ces deux périodes, la méthylation de l’ADN est globalement effacée, ce qui corrèle avec l’acquisition d’un état cellulaire pluripotent, puis rétablie. En utilisant un système cellulaire de reprogrammation de méthylation induite, ce travail s’est attaché à comprendre comment le génome parvient à maintenir le contrôle des transposons en l’absence de cette protection d’ordinaire essentielle, J’ai pu démontrer que divers mécanismes chromatiniens compensent progressivement la disparition de la méthylation de l’ADN pour le maintien de la répression des transposons. En particulier, la machinerie Polycomb prend en partie le relai et acquiert un rôle primordial, spécifiquement en l’absence de méthylation de l’ADN. Dans un second temps, la contribution du cofacteur d’ADN méthyltransférase DNMT3l lors de la méthylation de novo a été étudiée. Dans sa globalité, ces découvertes offrent des perspectives nouvelles sur la façon dont le génome se réorganise lors de moments clés du développement embryonnaireTransposons are DNA sequences that can duplicate autonomously in the genome, posing a threat for genome stability and integrity. To prevent their potentially harmful mobilization, eukaryotes have developed numerous mechanisms that control transposon expression, among which DNA methylation plays a particularly important role. In mammals, DNA methylation patterns are stable for life, at the exception of two key moments during embryonic development, gametogenesis and early embryogenesis. After a phase a global loss of genomic methylation accompanying the acquisition of pluripotent states, DNA methylation patterns are re- established de novo during differentiation. This work attempted to elucidate how the genome copes with the rapid loss of DNA methylation, in particular regarding the control of transposons in absence of this essential protective mark. Using an embryonic cellular model of induced methylation reprogramming, I showed that various chromatin-based mechanisms can compensate for the progressive loss of DNA methylation. In particular, my results suggest that the Polycomb machinery acquires a critical role in transposon silencing, providing a mechanistic relay specifically when DNA methylation patterns are erased. In a second phase, this work analyzed the contribution of the DNA methyltransferase cofactor DNMT3l during events of embryonic de novo methylation. Overall, these findings shed light onto the processes by which genome regulation adapts during DNA methylation reprogramming
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Meyer, Sam. „Multiscale modeling of DNA, from double-helix to chromatin“. Phd thesis, Ecole normale supérieure de lyon - ENS LYON, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00756315.
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In the nucleus of eukaryotic cells, DNA wraps around histone proteins to form nucleosomes, which in turn associate in a compact and dynamic fiber called chromatin. The physical properties of this fiber at different lengthscales, from the DNA double-helix to micrometer-sized chromosomes, are essential to the complex mechanisms of gene expression and its regulation. The present thesis is a contribution to the development of physical models, which are able to link different scales and to interpret and integrate data from a wide range of experimental and computational approaches. In the first part, we use Molecular Dynamics simulations of DNA oligomers to study doublehelical DNA at different temperatures. We estimate the sequence-dependent contribution of entropy to DNA elasticity, in relation with recent experiments on DNA persistence length. In the second part, we model the DNA-histone interactions within the nucleosome core particle,using DNA nanomechanics to extract a force field from a set of crystallographic nucleosome structures and Molecular Dynamics snapshots. In the third part, we consider the softer part of the nucleosome, the linker DNA between coreparticles which transiently associates with the histone H1 to form a "stem".We combine existing structural knowledge with experimental data at two different resolutions (DNA footprints and electro-micrographs) to develop a nanoscale model of the stem.
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Gaucher, Jonathan. „Rôle de la protéine à double bromodomaine BRDT dans le remodelage de la chromatine au cours de la spermatogenèse“. Thesis, Grenoble, 2011. http://www.theses.fr/2011GRENV088/document.
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BRDT et la réorganisation de la chromatine au cours de la spermatogénèsePendant la spermiogenèse, phase haploïde de la gamétogenèse mâle, le génome mâle subit une réorganisation majeure, durant laquelle la plupart des histones sont enlevées et remplacées par les protéines de transition (TP) et les protamines. Ce processus conduit à la compaction extrême du génome mâle au sein du noyau du spermatozoïde.Dans les spermatides allongées, les histones sont hyperacetylées juste avant leur éviction. Nous avons émis l'hypothèse que cette acétylation massive des histones pourrait être un signal pour l'enlèvement des histones et le recrutement de la machinerie de remodelage de la chromatine. BRDT est une protéine spécifique du testicule, appartenant à la famille BET, qui possède deux bromodomaines capables de reconnaitre les histones acétylées et qui a la capacité unique de compacter la chromatine hyperacétylée (Pivot-Pajot et al., 2003). Le premier bromodomaine de BRDT apparait crucial pour ces fonctions (Morinière et al., 2009). Les souris porteuses d'une délétion du premier bromodomaine de BRDT, BD1, présentent une stérilité des mâles associée à des anomalies survenant lors de la spermiogenèse (Shang et al, 2007). Nous avons pu caractériser la fonction physiologique du premier bromodomaine de BRDT et montrer son rôle crucial dans le remplacement des histones hyperacétylées par les TP et les protamines au cours de la spermiogenèse.Afin d'explorer les fonctions potentielles des autres domaines de BRDT, nous avons étudié des souris ayant une invalidation génétique complète de Brdt. Cette perte de BRDT engendre aussi une stérilité mâle, mais le phénotype montre une absence totale de cellules post-méiotiques. Enfin, un troisième modèle de souris a été obtenu suite à notre tentative de produire des souris porteuses d'une version tagguée de la protéine. L'exploration de ces modèles a permis de démontrer un rôle de BRDT, indépendant de la présence de BD1, dans la régulation du programme d'expression des gènes lors de l'entrée en méiose.BRDT possède à la fois une fonction méiotique et post-méiotique avec l'implication de différents domaines protéiquesInvolvement of BRDT in chromatin reorganization during spermatogenesisDuring spermiogenesis, the haploid phase of male gametogenesis, the male genome undergoes a major chromatin reorganization, during which most histones are removed and replaced by transition proteins (TP) and protamines. This process led to the extreme compaction of the genome in the male sperm nucleus.In elongating spermatids, histones are hyperacetylated just before their eviction. We have hypothesized that acetylation of histones mass could be a signal for the removal of histones and recruitment of chromatin remodeling machinery. BRDT is a testis-specific protein, xhich belongs to the BET family, which has two bromodomains able to recognize acetylated histones and has the unique ability to compact hyperacetylated chromatin (Pivot-Pajot et al., 2003). The first of bromodomain BRDT appears crucial for these functions (Morinière et al., 2009). Mice carrying a deletion of the first bromodomaine BRDT, BD1, exhibit male sterility associated with abnormalities occurring during spermiogenesis (Shang et al, 2007). We were able to characterize the physiological function of the first bromodomaine BRDT and demonstrate its crucial role in the replacement of hyperacetylated histones by TP and protamines during spermiogenesis.To explore the potential functions of other domains of the BRDT protein, we have studied mice with invalidation of the Brdt gene. This loss of BRDT also produces male sterility, but the phenotype shows a complete lack of post-meiotic cells. A third mouse model was obtained following our attempt to produce mice with a version of taggued protein. The exploration of these models has demonstrated a role of BRDT, independent of the presence of BD1, in regulating the program of gene expression during entry into meiosis.BRDT has both functions in meiotic and post-meiotic meiotic with the involvement of different protein domains
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Tardat, Mathieu. „Contrôles épigénétiques du cycle cellulaire : fonctions et régulation de la lysine méthyltransférase PR-Set7“. Thesis, Montpellier 2, 2010. http://www.theses.fr/2010MON20102.
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La lysine méthyltransférase PR-Set7 est responsable de la monométhylation de la lysine 20 de l'histone H4 (H4K20me1). Son expression varie au cours du cycle cellulaire. D'un niveau peu élevé en phase S, l'enzyme atteint un niveau maximum au cours de la mitose. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les fonctions de PR-Set7 et les raisons de cette régulation au cours du cycle. Présentés sous forme de publication, les résultats de ma thèse montrent que PR-Set7 induit un signal H4K20me1 au niveau des origines de réplication pendant la mitose, ce qui permet le recrutement des complexes de pré-réplication (Pre-RC) contenant les facteurs nécessaires à la formation des fourches de réplication lors la phase S suivante. En effet, la présence de PR-Set7 sur une séquence d'ADN spécifique est suffisante pour induire le co-recrutement des protéines du complexe Pre-RC, tandis que l'inactivation de l'enzyme conduit au contraire à un défaut d'assemblage de ces complexes suivi d'un stress réplicatif. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée par le complexe Cul4-DDB1, via son interaction avec la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition du signal H4K20me1 des origines et l'inhibition des complexes Pre-RC, s'assurant ainsi que les origines sont actives une seule fois par cycle cellulaire. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la maintenance du signal H4K20me1 et une activation répétée des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). L'ensemble de mes résultats établissent PR-Set7 et le signal H4-K20me1 comme un nouveau mécanisme épigénétique de contrôle des origines de réplication chez les mammifèresThe lysine methyltransferase PR-Set7 is responsible of the monomethylation of lysine 20 of histone H4 (H4K20me1). Its expression is cell-cycle regulated. With weak levels in S phase, this enzyme reach a peak level during mitosis. My PhD project was to characterize the functions of PR-Set7 and the reasons underlying its cell-cycle regulation. Presented as publications, my results show that PR-Set7 induces H4K20me1 on replication origins during mitosis, which allows recruitment of pre-replication complexes (Pre-RC) containing all the factors required to create replication forks during the next S phase. Indeed, the presence of PR-Set7 on a specific DNA sequence is sufficient to induce the co-recruitment of Pre-RC complex proteins, whereas the inactivation of this enzyme leads to defects in the assembly of these complexes followed by a replicative stress. During S phase, PR-Set7 is degraded par the Cul4-DDB1 complex through its association with PCN A. This degradation induces the disappearance of H4K20me1 on origins and inhibition of Pre-RC complexes, ensuring that origins are activated only once per cell cycle. Mutations in the interaction domain with PCNA are sufficient to prevent PR-Set7 degradation, leading to the maintenance of H4K20me1 and a multiple activation of origins during S phase (over-replication phenotype). My results establish PR-Set7 and H4K20me1 as a new epigenetic mechanism to control replication origins in mammals
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Durut, Nathalie. „Etudes fonctionnelles des protéines nucléaires dupliquées chez Arabidopsis thaliana“. Thesis, Perpignan, 2014. http://www.theses.fr/2014PERP1208/document.
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Chez les eucaryotes, les gènes d’ARNr 45S sont présents en un grand nombre de copies organisées dans des régions chromosomiques appelées NOR pour « Nucleolus Organizer Region ». Cependant, seule une fraction de ces gènes est activement exprimée et leur activation/répression est majoritairement contrôlée par des mécanismes épigénétiques. Parmi les facteurs requis pour l’expression de ces gènes, se trouve la nucléoline, une protéine majeure du nucléole. Chez A. thaliana, la protéine NUC1 est nécessaire pour le maintien de la méthylation et le control de l’expression de variants spécifiques des gènes d’ARNr. De manière intéressante, contrairement aux animaux et aux levures, le génome des plantes possède un deuxième gène codant la nucléoline : NUC2. Au cours de cette étude, nous avons montré que les deux gènes NUC1 et NUC2 sont nécessaires pour la survie de la plante. L’étude de plantes mutées pour le gène NUC2 a révélé que cette protéine est impliquée dans l’organisation et l’expression des ADNr mais par des mécanismes antagonistes à ceux de son homologue NUC1. En effet, l’absence de la NUC2 induit une hyperméthylation des ADNr ainsi qu’une réorganisation spatiale et une variation du nombre de copie des différents variants des gènes d’ARNr. Par ailleurs, la protéine NUC1 se lie aux gènes actifs alors que la protéine NUC2 est associée à la chromatine condensée en périphérie du nucléole. En parallèle, nous avons montré que l’expression des ADNr est affectée en réponse à la chaleur et que le gène NUC2 est fortement induit. L’ensemble de ces données suggèrent un potentiel rôle de la NUC2 dans la répression des gènes d’ARNr au cours du développement et en réponse au stressIn eukaryotes, 45S rRNA genes are highly repeated and localize in chromosomal regions known as NOR for “Nucleolus Organizer Regions”. However, only a small proportion of these genes is transcriptionally active and their activation and/or repression depends on epigenetic mechanisms. One of the factors involved in rDNA expression is nucleolin, a major nucleolar protein. In A. thaliana, nucleolin protein NUC1 is required to maintain rDNA methylation and control expression of specific rDNA variants. Interestingly, in contrast to animals and yeast, plants encode a second nucleolin gene: NUC2. Here, we show that NUC1 and NUC2 genes are both required for plant survival. Analysis of nuc2 mutant plants reveals that NUC2 protein is required for rDNA organization and expression but with mechanisms antagonistic to those described for its homologue NUC1. In fact, loss of NUC2 induces rDNA hypermethylation and a spatial reorganization of rRNA genes with changes in copy numbers of rDNA variants. Moreover, NUC1 protein binds transcriptionally active rRNA genes while NUC2 protein associates with condensed chromatin in the periphery of the nucleolus. Furthermore, we show that rRNA gene expression is affected in response to heat shock and that the NUC2 gene is strongly induced. Altogether, our results suggest a potential role of NUC2 protein in rDNA repression during development and/or in response to stress
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Taty, Taty Gemael Cedrick. „Rôle des modifications de la chromatine dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN et la stabilité génétique“. Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30190/document.
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Le génome humain est constamment la cible d'agents qui endommagent l'ADN. Ces dommages sont multiples et variés tels que les cassures simple et double brin (DSB). Les DSBs sont des lésions très toxiques dont l'origine peut être multiple. Les cellules de mammifères réparent les DSBs en utilisant deux mécanismes principaux, la recombinaison homologue (RH) qui est dépendante du cycle cellulaire et utilise la chromatide sœur comme matrice de réparation et la jonction des extrémités non homologues (NHEJ) qui est indépendante du cycle cellulaire et consiste en la ligation des extrémités d'ADN endommagées. Cette réparation a lieu dans un contexte chromatinien qui nécessite un dynamisme pour rendre accessible les sites lésés aux différentes machineries de réparation. Lors de mes travaux, j'ai étudié le remodeleur de la chromatine p400 ainsi que le variant d'histone H2A.Z qui sont deux protéines impliquées dans la dynamique de la chromatine, afin de comprendre leur rôle dans les mécanismes de réparation des DSBs et la stabilité du génome. p400, une ATPase de la famille SWI2/SNF2 participe à l'incorporation du variant d'histone H2A.Z dans la chromatine. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la déplétion par siRNA du variant d'histone H2A.Z, dans la lignée d'ostéosarcome humain (U2OS) et dans des fibroblastes humains immortalisées, n'a pas d'effets sur la réparation des DSBs. Ces résultats sont corrélés avec une absence de recrutement de H2A.Z au niveau des cassures après étude par micro irradiation laser ou par immunoprécipitation de chromatine. Cependant, la déplétion de H2A.Z affecte la prolifération cellulaire en influençant l'efficacité de clonage et le cycle cellulaire. L'autre partie de mes travaux a mis en évidence que l'ATPase p400 est un frein à l'utilisation de la voie alternative de jonction des extrémités (alt-EJ) qui est un processus de réparation des DSBs très mutagène. L'augmentation des événements du NHEJ-Alternatif et la génération d'instabilité génétique observés lors de la déplétion de p400 par siRNA semblent tributaires de la résection des DSBs par CtIP. Ces résultats indiquent que p400 joue un rôle post-résection dans les étapes plus tardives de la RH. De plus, la déplétion de p400 conduit au recrutement de la polyADP ribose polymérase (PARP) et de l'ADN ligase 3 à la DSB, ce qui provoque la mort sélective de ces cellules lors d'un traitement par des inhibiteurs de PARP. Ces résultats montrent que P400 agit comme un frein pour empêcher l'utilisation du NHEJ-Alternatif et donc l'instabilité génétiqueThe human genome is constantly targeted by DNA damaging agents. These damages are many and varied, such as single and double strand breaks (DSBs). The DSB are highly toxic lesions whose origin can be multiple. Mammalian cells mainly use two DNA repair pathways to repair DSB, homologous recombination (RH), which is dependent on the presence of the intact homologous copy (the sister chromatid) and on the cell cycle stage and the non-homologous end joining (NHEJ) pathway, which is cell cycle independent and performs direct ligation of the two DNA ends. The repair of DNA damage takes place in a chromatin context that needs to be remodeled to give access to damaged sites. During my work, I studied the chromatin remodeler p400 and the histone variant H2A.Z both involved in chromatin remodeling, to understand their role in DSB repair and genome stability. p400, an ATPase of the SWI2/SNF2 family is involved in the incorporation of H2A.Z in chromatin. I have shown that H2A.Z depletion in the osteosarcoma cell line U2OS and in immortalized human fibroblasts did not alter DSB repair. These results are correlated with the lack of H2A.Z recruitment at DSB observed after local laser irradiation or Chromatin Immunoprecipitation. However, H2A.Z depletion affects cell proliferation and the cell cycle distribution. In addition, I have shown that the chromatin remodeler p400 is a brake to the use of alternative End Joining (alt-EJ) which is a highly mutagenic repair process. The increase in alt-EJ events observed in p400-depleted cells is dependent on CtIP- mediated resection of DNA ends. Moreover, p400 depletion leads to the recruitment of poly(ADP) ribose polymerase (PARP) and DNA ligase 3 at DSB, leading to selective cell killing by PARP inhibitors. Altogether these results show that p400 acts as a brake to prevent alt-EJ dependent genetic instability and underline its potential value as a clinical marker
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Clemot, Marie. „Role of CAF-1 in the establishment and maintenance of cellular identity during development in Drosophila“. Thesis, Paris 6, 2016. http://www.theses.fr/2016PA066149.
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L’organisation de l’ADN sous forme de chromatine joue un rôle crucial dans la régulation de l’identité cellulaire. De par son rôle clé dans l’assemblage de la chromatine couplé à la synthèse d’ADN, le chaperon d’histone CAF-1 apparaît comme un acteur potentiel dans la transmission de l’information portée par la chromatine au cours des générations cellulaires. Bien que CAF-1 soit essentiel pour la survie au stade larvaire chez la Drosophile, les outils génétiques disponibles chez cet organisme permettent d’analyser sa fonction dans des types cellulaires ciblés. Mon travail montre que la grande sous-unité de CAF-1 (P180) est essentielle pour le maintien de la lignée germinale femelle. L’arrêt précoce de l’ovogénèse induit par la perte de P180 dans les cellules germinales a pu être attribué à l’activation de checkpoints, vraisemblablement en réponse à une accumulation d’ADN simple-brin liée à des défauts de réplication. De façon remarquable, les cellules souches germinales (GSCs) traversent une « crise identitaire » en absence de P180 : elles présentent des caractéristiques de cellules en cours de différenciation, dont une abscission incomplète, tout en conservant des propriétés spécifiques aux GSCs. En revanche, mon analyse n’a pas révélé de défaut d’identité des neuroblastes, une autre population de cellules souches, qui continuent de se diviser de façon asymétrique sans P180. De même, les cellules des disques imaginaux se divisant de façon symétrique prolifèrent en absence de P180, bien que plus lentement. Des analyses complémentaires permettront de déterminer si des mécanismes alternatifs d’assemblage de la chromatine compensent la perte de CAF-1 dans ces cellulesThe organization of DNA into chromatin is dynamic and plays important roles in the establishment and the maintenance of cellular identity. By virtue of its central role in replication-coupled chromatin assembly, the histone chaperone CAF-1 constitutes an interesting candidate in a search for molecular players involved in the inheritance of chromatin states in mitotic cells. In Drosophila, dCAF-1 is essential for viability at the larval stage. Yet, the genetic tools available in the fruit fly allow to analyze the function of dCAF-1 in specific tissues. Mainly, my thesis work shows that the large subunit of dCAF-1 (P180) is essential for oogenesis. I have shown that the early arrest of oogenesis observed upon depletion of P180 in germ cells results from the activation of checkpoints pathways and cell death, possibly in response to the accumulation of single-strand DNA as a consequence of replication defects. Strikingly, P180 plays an essential role in the female germline stem cells (GSCs), which upon depletion of P180 enter an “identity crisis” and harbor features of differentiating cyst cells, including incomplete abscission, while maintaining at the same time some GSCs features. In contrast, the loss of P180 does not seem to alter the identity of larval neuroblasts, another population of stem cells, which continue to divide in an asymmetric fashion in its absence. Finally, the cells of the imaginal discs, which divide symmetrically, are able to proliferate upon loss of P180, albeit at a slower rate. Further analyses are required to determine whether alternative chromatin assembly pathways compensate for the loss of dCAF-1 activity in these cells
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Biedzinski, Stéphane. „Interplay between the nucleus and the microtubules : role in the regulation of chromatin organization in hematopoietic stem cells“. Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. https://theses.md.univ-paris-diderot.fr/BIEDZINSKI_Stephane_2_complete_20181116.pdf.
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Les cellules souches hématopoïétiques sont caractérisées, comme chaque cellule souche, par leur capacité à s'auto-renouveler et à se différencier, ce qui leur permettent de participer à l'homéostasie du système sanguin. Comment ces cellules souches entrent dans une voie de différenciation ou une autre est encore mal compris mais un nombre croissant d'éléments obtenus dans différents systèmes soulignent l'importance des signaux mécaniques dans ce choix. Les signaux physiques du microenvironnement de la cellule peuvent-être transduits au noyau par l'intermédiaire du cytosquelette, qui va alors moduler l'organisation de la chromatine et donc l'expression des gènes: c'est la mécano transduction. Plusieurs études illustrent l'importance du cytosquelette d'actine dans les cellules adhérentes dans ce phénomène mais le rôle d'autres éléments du cytosquelette, comme les microtubules, reste encore mal connu. De plus, la mécano transduction dans les cellules non-adhérentes a peu été étudiées, cellules où l'organisation de l'actine ne permet pas de générer des forces sur le noyau. Le travail présenté ici montre que les microtubules peuvent déformer le noyau et réguler l'organisation de la chromatine dans un système de cellules souches non adhérentes, les cellules souches hématopoïétiques (CSH)Hematopoietic stem cells are characterized, like every stem cells, by their self-renewal and differentiation ability so they can sustain mature blood cells populations. How stem cells engage in one or the other path is poorly understood but increasing number of evidence in different stem cell types highlight the importance of mechanical signal integration. Physical cues form the environment can be transduced to the nucleus via the cytoskeleton, to impact chromatin organization and therefore gene expression: this process is called mechanotransduction. Many studies bring light to the importance of the actin cytoskeleton in adherent cells in this process but very little is known about the contribution of microtubules in this process. Moreover, even less is known about mechanotransduction in non adherent cells, in which actin organization is likely to have smaller impact than in adherent cells. The present work show that microtubules can impact nuclear shape and chromatin organization in a system of non-adherent stem cells, the hematopoietic stem cells (HSCs)
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Bonnell, Erin. „The role of Tbf1 in telomere homeostasis in Saccharomyces cerevisiae“. Mémoire, Université de Sherbrooke, 2017. http://hdl.handle.net/11143/11077.
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Abstract: By differentiating chromosomal ends from internal breaks, telomeres prevent DNA damage checkpoint activation and provide protection from inappropriate DNA repair activity that could create genomic instability. In Saccharomyces cerevisiae, a large number of genes have been identified that are implicated in telomerase and telomere structure and/or function. However, a comprehension of the mechanism of action of these genes and how they relate to other genes is lacking. The function of end protection is based on the telomeric repeats and associated proteins, but evidence is accumulating that the subtelomeric region also plays a role. This region contains binding sites for various proteins, notably Tbf1. TBF1 is an essential gene and the protein has been implicated in telomere homeostasis, chromatin remodelling, and the DNA damage response. My master’s project is based on the observation that cells harbouring a thermosensitive (tbf1-ts) allele have abnormally short telomeres. However, all four known mutant tbf1 alleles have multiple point mutations, which renders their analyses difficult. In order to be able to more precisely determine the origin of the phenotypic variations, we used site-directed mutagenesis to create single point mutation tbf1 alleles. These experiments yielded two particular mutations, tbf1-82 and tbf1-453, which were found to have growth defects at various temperatures as well as increased sensitivity to DNA damaging drugs. Although the alleles had only minor telomere length phenotypes, it was discovered that Tbf1 could have a direct role in telomere stability in special situations. For example, in the absence of telomerase, which normally maintains telomeres, cells enter replicative senescence after about 60 population doublings and stop dividing. A small subset of the cellular population is able to evade this growth arrest by maintaining telomeres via a recombination-dependent process. An introduction of the tbf1-82 or tbf1-453 mutation into strains that also lacked telomerase caused a dramatic advance in time of onset of senescence. Thus this work uncovered that Tbf1 is a previously unknown regulator of senescence. Various genetic assays with homologous recombination genes and chromatin regulators were performed to help further characterize TBF1 and its interactors. Characterization of these novel tbf1 alleles has given new insights into the multiple roles of Tbf1.En différenciant les extrémités chromosomiques des cassures d’ADN internes, les télomères empêchent l'activation de la signalisation d’un dommage à l'ADN et fournissent une protection contre des activités inappropriées qui sont associées à une réparation de l'ADN. Une telle réparation pourrait en fait créer une instabilité génomique. Chez Saccharomyces cerevisiae, un nombre de protéines sont impliquées dans la structure du télomère et / ou la fonction de la élomérase. On pense que la protection des télomères est gérée par les répétitions télomériques et les protéines associées, mais il y a de plus en plus d’indices que la région sous-télomérique joue également un rôle. Cette région contient des sites de liaison pour plusieures protéines, notamment pour Tbf1. TBF1 est un gène essentiel et la protéine est impliquée dans l'homéostasie des télomères et dans la réponse aux dommages de l’ADN. Toutefois, les mécanismes moléculaires restent à être précisés. Mon projet de Maîtrise est basé sur l’observation que dans les cellules qui ont un allèle thermosensible (tbf1-ts), les télomères sont anormalement courts. Malheureusement, les 4 allèles mutants de tbf1 connus présentent tous des mutations ponctuelles multiples ce qui rend leur analyse difficile. Pour clarifier l'origine des variations phénotypiques de ces mutations, la mutagenèse dirigée a été utilisée pour créer des allèles tbf1 avec une seule mutation. Mes résultats montrent que deux mutations spécifiques, tbf1-82 et tbf1-453, causent des défauts de croissance cellulaires, ainsi qu'une sensibilité aux drogues qui endommageant l'ADN. Une analyse détaillée de ces nouveaux allèles de tbf1 a montré que la protéine pourrait avoir un rôle direct dans le maintien de la stabilité des télomères. Par exemple, en absence de la télomérase qui est responsable du maintien des télomères, les cellules entrent en sénescence réplicative après environ 60 générations et arrêtent de se diviser. Par contre, une petite fraction de la population est capable de contourner cet arrêt de croissance car ces cellules maintiennent les télomères par un processus dépendant de la recombinaison homologue. L'introduction de mutations tbf1 dans des souches sans télomérase provoque une accélération d’entrée en sénescence; donc Tbf1 est un régulateur précédemment inconnu de la sénescence. Divers tests génétiques avec des gènes de recombinaison homologue et des régulateurs de chromatine ont été effectués pour aider à caractériser TBF1 et ses interactions. La caractérisation de ces nouveaux allèles a permis de mieux comprendre les multiples rôles de Tbf1.
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Yung, Yuk Kwong. „Histone H3 Serine 28 is essential for efficient Polycomb-mediated gene repression in Drosophila“. Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTT001/document.
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Dans le noyau de nos cellules l’ADN est enroulé autour de petites protéines que l’on appelle les histones et forme ainsi ce que l’on nomme la chromatine. L’activation des gènes permet la production de protéines qui sont nécessaires au bon fonctionnement des différentes cellules de notre organisme. Notre corps est composé de différentes cellules dont l’identité est définie par un patron de gènes actifs et inactifs bien spécifique. Au cours de la mitose (division des cellules) il est crucial que les cellules conservent leur identité, faute de quoi des structures non adaptées peuvent apparaître et dans certains cas conduire à l’apparition de cancers. Les protéines du groupe Polycomb (PcG) constituent un important système de mémoire cellulaire qui permet de maintenir un gène inactif au cours du développement d’un organisme. Ces protéines sont ciblées sur des gènes spécifiques où elles modifient la nature chimique des histones, rendant la chromatine compacte, difficile d’accès et donc empêchant l’activation de ces gènes. Lors de la mitose, la chromatine va se compacter drastiquement pour faciliter la ségrégation des chromosomes. Les mécanismes par lesquels les protéines du PcG s’adaptent à cette restructuration massive du génome ne sont pas connus. Mon projet est d’étudier le comportement des protéines du PcG au niveau de la chromatine à travers la mitose et ainsi de comprendre comment est préservée l’identité des cellules. Historiquement, les protéines du PcG ont été découvertes chez la drosophile et leurs mutations entrainent des anomalies au niveau du plan corporel. Ces protéines existent également chez l’homme et jouent un rôle essentiel dans le contrôle du développement. Ainsi mes travaux effectués chez la drosophile pourront être repris pour l’étude de ces protéines chez l’homme. Par l’utilisation de techniques de microscopie à fluorescence, il est possible de détecter la fixation des protéines du PcG au niveau de la chromatine au cours de la mitose. Il a été observé que durant la mitose l’une des protéines du PcG est dissociée de la chromatine alors que deux autres protéines de ce groupe sont quant à elles maintenues. L’ancrage des protéines du PcG à la chromatine se fait par le dépôt d’une modification chimique spécifique sur une histone, la triméthylation de la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27me3). Pendant la mitose le résidu adjacent, la serine 28, va être phosphorylé (H3S28ph), et cette seconde modification perturbe la fixation des protéines du PcG. Pour mieux comprendre comment ces deux modifications (H3K27me3 et H3S28ph) définissent la fixation des protéines du PcG le long du chromosome lors de la mitose, j’analyserai la distribution de ces protéines le long du génome dans des cellules en mitose. D’autre part, j’étudierai les défauts développementaux provoques par l’absence de ces deux modifications chimiques à partir de drosophiles mutantes. La dérégulation des protéines du PcG entraine des défauts développementaux et est à l’origine de nombreux cancers chez l’homme. Des avancées dans le domaine pharmacologique ont permis d’élaborer des inhibiteurs de certaines des protéines du PcG qui pourraient constituer de nouvelles thérapies anti-cancer. Il est donc important de comprendre parfaitement les mécanismes d’actions de ces protéines, tout particulièrement au cours de processus biologiques cruciaux tel que la mitosePolycomb group (PcG) proteins maintain repression on key developmental genes to preserve cell fates. It is unknown on how PcG-mediated repressive chromatin is inherited across cell cycles. This project aims to study the chromatin-binding profile of PcG proteins and their cognate histone mark (H3K27me3) in mitosis. We observed that Polycomb (Pc) were dissociated from chromosomes during mitosis and reassociation begins from late anaphase onwards. In contrary, Ph, PSC and high level of H3K27me3 were detected on mitotic chromosomes. Importantly, drug-inhibition of Aurora B and hence depletion of H3S28ph retained Pc on mitotic chromosomes. To further understand how mitotic H3S28ph affects PcG proteins binding profile, a FACS-sorting protocol was optimized to isolate mitotic cells for ChIP-seq analyses. In parallel, Drosophila model of histone mutants (H3K27R and H3S28A) were established to assess the importance of these modifications on PcG-mediated epigenetics inheritance across mitoses
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Delamarre, Axel. „Etude des rôles et du mécanisme de chargement des complexes SMC dans la réponse au stress réplicatif chez S.cerevisiae“. Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT040/document.
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Les trois complexes SMC Cohésine, Condensine et SMC5/6 sont principalement étudiés pour leurs rôles mitotiques, cependant tous trois sont localisés à proximité des fourches de réplication en condition de stress réplicatif. Au cours de cette thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés aux complexes Cohésine et Condensine. Dans une première partie, nous décrivons un nouveau rôle des condensines dans la progression des fourches de réplication en condition de stress réplicatif à l’hydroxyurée (HU) et au Méthyl-Méthane-Sulfonate (MMS). Nos données montrent que dans ces conditions, les condensines limitent l’accumulation de la protéine de liaison à l’ADN simple-brin RPA (Replication Protein A) à proximité des fourches de réplication. Ces résultats révèlent que les condensines limitent l’exposition d’ADN simple brin et pourraient ainsi protéger l’intégrité des fourches de réplication et la stabilité du génome. Dans une seconde partie nous décrivons le mécanisme de recrutement du complexe Cohésine aux fourches de réplication en condition de stress réplicatif. Dans ces conditions, les cohésines renforcent la cohésion des chromatides sœurs afin de faciliter le redémarrage des fourches de réplication par recombinaison homologue. Nous montrons que le complexe SMC-like MRX (Mre11-Rad50-Xrs2), l’histone méthyle-transférase Set1 et l’histone acétyle-transférase Gcn5 sont requis pour le recrutement des cohésines aux fourches de réplication. Nos données révèlent qu’en réponse au stress réplicatif, Gcn5, Set1 et MRX modifient la dynamique des histones. Gcn5 et MRX réduisent la densité d’histone sur l’ADN répliqué alors que Set1 maintient la mobilité des nucléosomes. La modification de la dynamique des histones semble importante pour une réponse cellulaire efficace au stress réplicatif et pour le chargement de complexes SMC aux fourches de réplicationThe three SMC complexes Cohesin, Condensin and SMC5/6 are mainly studied for their role in mitosis, nevertheless they all localize at replication forks in replicative stress conditions. During this thesis, we focused on Cohesin and Condensin. In the first part we describe a new role for the condensin complex in response to replicative stress. In the presence of Hydroxyurea (HU) and Methyl-Methan-Sulfonate (MMS), condensin is required for cell growth and replication fork progression. Moreover, our results show that condensin limits the accumulation of the specific single-strand DNA (ssDNA) binding protein RPA (Replication Protein A) in the vicinity of replication forks under HU treatment, revealing that condensin limits ssDNA accumulation during replicative stress. In this way, Condensin could protect replication fork integrity and genome stability in response to replicative stress. In the second part, we decipher the cohesin recruitment mechanisms at replication fork under replicative stress. In that context, cohesin reinforces sister chromatid cohesion and facilitates homologous recombination (HR) dependent replication fork restart pathways. We show here that the SMC-like MRX complex, the histone methyl transferase Set1 and the histone acetyl transferase Gcn5 are required for cohesin recruitment at stalled replication forks. Our results show that these three proteins affect histone H3 dynamics on replicated DNA in response to replicative stress. Gcn5 and MRX reduce H3 density whereas Set1 maintains nucleosome mobility. These two parameters seem to be important for efficient response to replicative stress and for SMC complexes loading close to stressed replication forks
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Barral, Sophie. „L'organisation post-méiotique de l'épigénome mâle“. Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018GREAV058/document.
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La spermatogénèse, processus de production des gamètes mâles, représente un modèle physiologique pertinent pour l’étude de la dynamique de la chromatine. En effet, une réorganisation drastique du génome est observée en fin de spermatogénèse, lors des étapes post-méiotiques du développement de la lignée germinale mâle. Ces réorganisations visent d’une part à compacter le génome afin de le protéger avant et lors de la fécondation et d’autre part à établir un épigénome mâle spécifique nécessaire pour le développement embryonnaire précoce. La chromatine organisée en nucléosomes est alors totalement remaniée de manière à ce que les protamines remplacent les histones dans les spermatozoïdes. Cette réorganisation est initiée par une vague d’acétylation des histones à l’échelle du génome, suivie par un remplacement massif des histones par de petites protéines basiques, les protéines de transition et les protamines. Les mécanismes moléculaires responsables de cette réorganisation de la chromatine sont très mal connus. Mon travail de thèse vise à explorer ces mécanismes en utilisant une approche d’invalidation de gènes chez la souris correspondant à des acteurs épigénétiques exprimés spécifiquement en post-méiose : le facteur nucléaire Nut (Nuclear protein in Testis) et le variant de l’histone H2A, H2A.L.2. Nous avons démontré que la protéine Nut recrute l’acétyltransferase p300 et induit l’hyperacétylation de l’histone H4 précisément au niveau des résidus lysines en position 5 et 8. Cette acétylation est nécessaire à l’interaction avec le premier bromodomaine de Brdt initiant le processus de remplacement des histones par les protamines. Ainsi, le facteur Nut est l’élément majeur de la vague d’acétylation des histones. Nous avons également mis en évidence le rôle crucial de H2A.L.2 dans “ l’ouverture ” de la structure du nucléosome permettant ainsi son invasion par les protéines de transition. Ces protéines vont à leur tour générer une plateforme pour le recrutement et la maturation des protamines et induire la formation de structures transitoires avant l’étape de compaction finale du génome des spermatozoïdes matures. Ces études nous ont ainsi permis d’établir pour la première fois un modèle moléculaire cohérent permettant de comprendre la programmation épigénétique post-méiotique du génome mâle et son impact sur la fertilité masculineSpermatogenesis, the process of producing male gametes, represents a relevant physiological model for the study of chromatin dynamics. Indeed, a drastic reorganization of the genome is observed at the end of spermatogenesis, during post-meiotic stages of the development of the male germ cells. These reorganizations are intended both to compact the genome to protect it before and during fertilization and to establish a specific male epigenome necessary for early embryonic development. In spermatozoa, during these post-meiotic stages, chromatin is completely reorganized so that the protamines replace the histones. This reorganization is initiated by a wave of genome-wide histone acetylation, followed by massive replacement of histones by small basic proteins, transition proteins and protamines. The molecular mechanisms responsible for this reorganization of the genome remain very poorly known today. My thesis aims to explore these mechanisms by using gene inactivation in mouse of epigenetic actors specifically expressed in post-meiotic germ cells : the nuclear factor Nut (Nuclear protein in Testis) and the histone H2A variant, H2A.L.2. We have demonstrated that the Nut protein interacts and stimulates the p300 acetyltransferase activity and induces the hyperacetylation of histone H4 precisely on the lysine residues at 5 and 8 positions. This acetylation is necessary for the interaction with the first bromodomain of Brdt initiating the process of histone replacement by protamines. Thus, the Nut factor is the main element of the histone acetylation wave. We have also deciphered the crucial role of H2A.L.2 in the “opening ” of nucleosomal structures in post-meiotic germ cells thus allowing its invasion by the transition proteins. These transition proteins will in turn generate a platform for the recruitment and maturation of protamines and induce the formation of transient structures before the final compaction of the mature sperm genome. These studies allowed us to establish for the first time a coherent molecular model for understanding the post-meiotic epigenetic programming of the male genome and its impact on male fertility
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Izard, Fanny. „Étude du rôle des méthyltransférases de la Lysine 20 de l’Histone H4 dans la dynamique de la chromatine au cours du cycle cellulaire“. Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT136/document.
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Dans les cellules eucaryotes l’organisation de l’ADN en chromatine n’assure pas seulement la compaction de l’ADN dans le noyau mais sert aussi de structure dynamique qui permet la régulation des processus pour lesquels l’ADN est une matrice comme la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome qui est constitué de 147pb d’ADN qui s’enroule autour d’un octamère d’histones. Le nucléosome possède une structure flexible régulée par les modifications post-traductionnelles d’histones. Les modifications d’histones contribuent à la régulation des fonctions du génome en modérant directement la structure de la chromatine ou bien via le recrutement de protéines spécifiques liant la chromatine. La lysine 20 de l’histone H4 (H4K20) peut être modifiée pour générer 3 niveaux de méthylation : mono- (me1), di- (me2), et tri-méthylation (me3), chaque niveau de méthylation est associé à des fonctions spécifiques. PR-Set7 (aussi appelée Set8, Setd8 ou KMT5A) est l’unique enzyme connue pour catalyser la mono-méthylation H4K20 alors que les niveaux de di- et tri-méthylation sont le résultat de l’activité des enzymes Suv4-20h qui requièrent la mono-méthylation H4K20 induite par PR-Set7 comme substrat. Ces enzymes sont essentielles puisque des études de Knock-Out ont montré que PR-Set7 et les Suv4-20h sont requises pour le développement de la souris et que leur perte dans des modèles cellulaires entraine des dommages ADN et des défauts de cycle cellulaire. Toutefois, les fonctions des différents niveaux de méthylation et des enzymes associées restent peu claires. Le travail réalisé pendant cette thèse a révélé que l’action concertée des enzymes PR-Set7 et Suv4-20h est requise pour le contrôle (i) de l’assemblage de l’hétérochromatine sur l’ADN naissant, (ii) de la liaison du pre-RC sur un groupe d’origines de réplication tardives nécessaires pour la réplication de régions d’hétérochromatine dans le cycle cellulaire suivant. Les deux fonctions dépendent de la conversion de la mono-méthylation H4K20 en tri-méthylation H4K20 et du recrutement spécifique de la protéine liant la méthylation H4K20 ORCA/LRWD1. Ainsi, la déplétion de PR-Set7 par siRNA entraine des défauts de compaction de la chromatine en interphase des cellules qui sortent de mitose, ce qui favorise la fixation non spécifique des sous-unités MCMs et ORCs des complexes pre-RC. Finalement et étant donné le rôle clé de la méthylation H4K20 dans la formation de l’hétérochromatine et la réplication, mon travail de thèse a contribué à révéler que la surexpression de PR-Set7 est un facteur de mauvais pronostic dans le myélome multiple et que l’inhibition de cette enzyme par des composés chimiques pourrait dans le futur avoir un grand intérêt pour le traitement du cancerIn eukaryotic cells, the organization of DNA into chromatin not only ensures its compaction into nucleus, but also serves as a dynamic structure that offers a range of possibilities for regulating DNA transactions, such as transcription, DNA replication and repair. The basic unit of chromatin is the nucleosome, which is constituted of 147 bp of DNA wrapped with an octamer composed of histone proteins. This nucleosome structure is versatile showing distinct variations, including post-translational modifications of histone proteins. Histone modifications contribute to the regulation of genome functions by altering directly the nucleosome structure or through the recruitment of specific chromatin-binding proteins. In this regard, the lysine 20 of histone H4 (H4K20) can be modified to generate three different methylation states: mono- (me1), di- (me2), and trimethylation (me3), with a unique activity being coupled to the specific extent of methylation on this lysine residue. PR-Set7 (also known as SET8 or SETD8) is the sole enzyme that catalyzes H4K20me1, whereas H4K20me2 and H4K20me3 occur through the action of Suv4-20h, which requires PR-Set7-induced H4K20me1 as a substrate. These enzymes are essential since knockout studies have shown that both PR-Set7 and Suv4-20h are required for mouse development and their loss causes DNA damage and cell cycle defects. However, the functions of different H4K20 methylation states and the associated enzymes still remain poorly understood.The work carried out during this thesis reveals that the concerted activity of PR-Set7 and Suv4-20h is required for the timely control of (i) heterochromatin assembly on nascent DNA and (ii) the licensing of a critical subset of late-firing origins necessary for the replication of heterochromatin regions in the following cell cycle. Both functions depend on the conversion of H4K20me1 to H4K20me3 and the specific recruitment of the H4K20me-binding protein LRWD1/ORCA. Accordingly, siRNA-mediated PR-Set7 depletion triggers a defective interphase chromatin compaction in cells that exit of mitosis, which in turn favor a non-specific chromatin loading of ORC and MCMs subunits of pre-replication complexes. Finally and consistent with a key role of H4K20 methylation in heterochromatin formation and replication, my thesis work contributes to reveal that up-regulation of PR-Set7 is a poor prognosis factor in multiple myeloma and that its inhibition by specific chemical compounds might be a great interest for cancer treatment in near future
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Mauro, Eric. „Etude fonctionnelle de l'interaction entre l'intasome du VIH-1 et le nucléosome : la queue d'histone H4 comme nouveau partenaire de l'intégration“. Thesis, Bordeaux, 2018. http://www.theses.fr/2018BORD0273/document.
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L'intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme qui catalyse l'intégration du génome du virus dans celui de la cellule infectée. Cette étape d'intégration est cruciale pour le virus pour qu'il puisse se répliquer de manière efficace, l'intégration est donc une cible de choix dans les thérapies antivirales. Comprendre les mécanismes qui participent à l'intégration est donc nécessaire afin de développer des solutions efficaces pour contrecarrer le virus.L’intégration rétrovirale est catalysée par une structure oligomérique d’IN et d’ADN viral bien particulière appelée intasome. Les intasomes rétroviraux catalysent l’intégration préférentiellement sur des nucléosomes, composés d’ADN enroulé de protéines histones, plutôt que sur de l’ADN nu. Ceci est en parti du aux contraintes physiques imposés par la structure de l’intasome, mais également grâce à des facteurs de ciblage cellulaires qui vont interagir avec à la fois l’intasome et des composants du nucléosome.Dans ce projet de thèse, nous avons pu mettre en évidence une nouvelle interaction hôte-pathogène entre l’IN du VIH-1 et la queue d’histone H4 (une des protéines constituant le nucléosome). Ce projet s’est ainsi focalisé autour de cette interaction et a permis de :• Démontrer l’importance de l’interaction entre l’IN du VIH-1 et la queue d’histone H4 lors du cycle viral et plus précisément pour l’étape d’intégration, validant ainsi cette interaction comme une nouvelle interaction hôte-pathogène.• D’identifier que la queue d’histone H4 est un partenaire essentiel de l’intasome du VIH-1 pour qu’il puisse s’ancrer sur le nucléosome.• Développer une nouvelle stratégie antivirale visant à bloquer cette interaction dans les cellules infectées grâce à des composés chimiquesHIV-1 integrase (IN) catalyzes the insertion of the viral genome into the host cell chromatin. This step is crucial for the virus for its efficient replication, integration is thus of interest to target for antiviral strategies. Understanding the mechanisms involved in integration is important in order to develop efficient tools to fight the virus.Retroviral integration is catalyzed by the intasome, an oligomer of IN and viral DNA. Intasomes integrate onto nucleosomes, composed of DNA wrapped around histone proteins, over naked DNA.In this thesis project, we have identified a new host-pathogen interaction between HIV-1 IN and the H4 histone tail. The topic of the project was then focus on this interaction and has highlighted:• The importance of the HIV-1 IN – H4 histone tail interaction for the viral cycle, especially onto the integration step, validating a new host-pathogen interaction.• The identification of the H4 histone tail as an essential partner for HIV-1 intasome for its anchoring onto nucleosomes.• The development of a novel antiviral strategy aiming to block this interaction in infected cells using chemical compounds
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Mahé, Elise. „Dynamique chromatinienne lors de l'activation des enhancers au cours de la différenciation cellulaire“. Thesis, Rennes 1, 2016. http://www.theses.fr/2016REN1B056/document.
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La différenciation cellulaire implique une régulation transcriptionnelle coordonnée et finement contrôlée qui passe par le recrutement de facteurs de transcription (FT) cellules-spécifiques sur des régions génomiques régulatrices appelées enhancers. Parmi ces FT, des protéines nommées « facteurs pionniers » (FP) lient la chromatine condensée et favorisent la transition des enhancers d’un état inactif vers un état « préparé » (étape de « priming »), facilitant ainsi la fixation d’autres FT et permettant l’activation de ces régions. L’engagement vers un lignage cellulaire particulier est donc associé à l’engagement des FP au niveau d’enhancers dont la structure chromatinienne subit des changements architecturaux associés à la mise en place de marques spécifiques. Celles-ci incluent, la monométhylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me1), l’acétylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27ac) ou encore des modifications des résidus cytosine (5-méthylcytosine, 5mC ; 5-hydroxyméthylcytosine, 5hmC). La 5hmC est un intermédiaire de la voie de déméthylation active : elle résulte de l’oxydation de la 5mC par les enzymes « Ten Elven Translocation » (TET) et peut être à son tour oxydée en 5-formylcytosine (5fC) et 5-carboxylcytosine (5caC) qui sont ensuite remplacées par des cytosines via l’intervention du système « Base Excision Repair ». Cependant, du fait de sa stabilité et de sa capacité à lier des protéines particulières, la 5hmC pourrait également jouer un rôle spécifique. De précédents travaux ont d’ores et déjà mis en évidence un lien entre le recrutement des FP et les modifications des cytosines. Néanmoins, l’implication des processus de méthylation/déméthylation dans la régulation spatio-temporelle des étapes de « priming » et d’activation des enhancers n’a pas encore été caractérisée. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude à été de définir le rôle des modifications de cytosines (5mC et 5hmC) lors de l’activation des enhancers liés par des FP. Pour ceci, nous avons analysé d’une part, l’implication des processus de méthylation et déméthylation des cytosines sur le « priming » et l’activation des enhancers, en utilisant des inhibiteurs des ADN méthyltransférases ou des enzymes TET. D’autre part, nous avons entrepris d’identifier les dynamiques de « priming » et d’activation des enhancers à l’échelle du génome au cours de la différenciation neurale, en lien avec la présence de la 5hmC. Les résultats obtenus nous ont notamment permis de proposer un schéma d’activation des enhancers dans lequel les dynamiques de méthylation/déméthylation de l'ADN jouent un rôle essentiel dans la structuration de la chromatineCell differentiation relies on a coordinated and finely regulated transcriptional regulation involving the recruitment of cell-type transcription factors (TFs) on genomic regions called enhancers. Some of these TFs, named pioneer factors (PFs), are able to bind to condensed chromatin and favour enhancer transition from an inactive to a primed state, thus facilitating the binding of other TFs and enhancer activation. Therefore, lineage commitment is associated to the engagement of PFs at enhancers where the chromatin structure undergoes architectural modifications related to the set up of specific marks. These include, the monomethylation of the lysine 4 of the histone H3 (H3K4me1), the acetylation of the lysine 27 of the histone H3 (H3K27ac) or cytosine modifications (5-methylcytosine, 5mC; 5-hydroxymethylcytosine, 5hmC). The 5hmC base is an intermediate in the process of active demethylation coming from the oxidation of the 5mC by the Ten Elven Translocation (TET) enzymes and can itself be further oxidized in 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC), two bases which are then replaced by cytosines through the Base Excision Repair mechanism. Nevertheless, due to its stability and its ability to bind some specific proteins, 5hmC might also play specific roles. Previous works already highlighted a link between the recruitment of PFs and cytosine modifications. However, the involvement of the methylation/demethylation processes in the spatio-temporal regulation of the priming and activation of enhancers has not yet been characterized. In this context, the aim of this study was to define the role of cytosine modifications (5mC and 5hmC) during the activation of enhancers bound by PFs. For this, we analyzed the implication of cytosine methylation and demethylation processes on enhancer priming and activation by using DNA methyltransferases or TET inhibitors. In addition, we identified the dynamics of enhancer priming and activation genome-wide during neural differentiation, in relation to the presence of 5hmC. The results allow us to propose a scheme of enhancer activation in which DNA methylation/demethylation dynamics play an essential role in the chromatin structure of these regulatory elements
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Del, Prete Stefania. „Characterisation of transcriptional and chromatin events in relation to floral transition and identification of nuclear organisation determinants“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS022.
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La transition florale résulte d’un jeu complexe d’interactions entre des signaux endogènes et environnementaux. Les feuilles jouent un rôle crucial dans ce processus en percevant les changements associés à la lumière et en produisant les photosynthétats qui participant à la signalisation de la floraison. Toutefois, notre connaissance des changements se produisant dans les feuilles lors de la transition florale reste limitée. Nous avons caractérisé les événements morphologiques, moléculaires et transcriptionnels en relation avec la floraison florale dans les feuilles matures chez Arabidopsis, en exploitant un système de transfert de conditions en jours courts vers des jours longs, transfert qui permet d’induire et synchroniser la floraison. Nous avons identifié la fenêtre temporelle de la transition florale, mesuré la croissance foliaire, et observé un accroissement de la ploïdie au cours du processus. Par une approche de RNA-seq, nous avons étudié la dynamique transcriptionnelle des réseaux de gènes dans la feuille, et comparé avec des données dans la racine et le méristème pour avoir une vue plus intégrée de la floraison dans la plante. De plus, nous avons analysé le mode d’action de LHP1 (LIKE HETEROPROTEIN 1), une sous unité du complexe PRC1, en exploitant des lignées transgéniques avec des modifications conditionnelles du dosage de LHP1 et en analysant les effets sur la chromatine et la transcription des gènes impliqués dans la floraison. Une modulation courte du dosage en LHP1 modifie le dépôt des marques H3K27me3 et H3K4me3, démontrant une interaction fonctionnelle entre LHP1 et le complexe PRC2, et suggérant aussi un nouveau rôle dans la formation de régions chromatiniennes de type bivalent. Enfin, étant donné le rôle clé de l’organisation nucléaire dans la régulation génique, nous avons recherché et identifié des déterminants de l’architecture nucléaire en utilisant de nouveaux outils de statistiques spatialesThe transition to flowering results from a complex interplay between endogenous and environmental cues. The leaves play a key role in this process, by perceiving the light changes and producing photosynthates, which participate to the floral signalling. However, our knowledge on the changes occurring in leaves during floral transition is still limited. We characterised the morphological, molecular and transcriptional events related to floral transition in mature leaves in Arabidopsis, using a short-day to long-day shift to induce a synchronized flowering. We identified the temporal window of the floral transition, monitored the leaf growth and observed an increase in their ploidy level during the process. By RNA-seq we studied the transcriptional dynamics of the leaf gene network, and compared with events occurring in roots and meristems to get an integrated view of floral transition in the whole plant. Furthermore, we investigated the mode of action of LIKE HETEROPROTEIN 1 (LHP1), a PRC1 subunit, by exploiting transgenic lines with conditional alterations of LHP1 dosage and analysing the effects on chromatin and transcription of flowering genes. A short-term modulation of LHP1 dosage altered the deposition of H3K27me3 and H3K4me3, showing a functional interaction between LHP1 and PRC2, and also suggesting a new role in the formation of bivalent chromatin regions. Finally, since nuclear organisation plays a key role in gene regulation, we searched and identified determinants of the nuclear architecture by using innovative spatial statistical tools
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Walter, Marius. „Transposon regulation upon dynamic loss of DNA methylation“. Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066672.
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Les transposons sont des séquences d’ADN qui ont la capacité de se dupliquer de façon autonome, posant une menace pour l’intégrité et la stabilité du génome. De nombreux mécanismes existent pour contrôler l’expression des transposons, parmi lesquels la méthylation de l’ADN joue un rôle particulièrement important. Chez les mammifères, les profils de méthylation sont stables tout au long de la vie de l’individu, mis-à-part pendant deux moments clés du développement embryonnaire. Pendant ces deux périodes, la méthylation de l’ADN est globalement effacée, ce qui corrèle avec l’acquisition d’un état cellulaire pluripotent, puis rétablie. En utilisant un système cellulaire de reprogrammation de méthylation induite, ce travail s’est attaché à comprendre comment le génome parvient à maintenir le contrôle des transposons en l’absence de cette protection d’ordinaire essentielle, J’ai pu démontrer que divers mécanismes chromatiniens compensent progressivement la disparition de la méthylation de l’ADN pour le maintien de la répression des transposons. En particulier, la machinerie Polycomb prend en partie le relai et acquiert un rôle primordial, spécifiquement en l’absence de méthylation de l’ADN. Dans un second temps, la contribution du cofacteur d’ADN méthyltransférase DNMT3l lors de la méthylation de novo a été étudiée. Dans sa globalité, ces découvertes offrent des perspectives nouvelles sur la façon dont le génome se réorganise lors de moments clés du développement embryonnaireTransposons are DNA sequences that can duplicate autonomously in the genome, posing a threat for genome stability and integrity. To prevent their potentially harmful mobilization, eukaryotes have developed numerous mechanisms that control transposon expression, among which DNA methylation plays a particularly important role. In mammals, DNA methylation patterns are stable for life, at the exception of two key moments during embryonic development, gametogenesis and early embryogenesis. After a phase a global loss of genomic methylation accompanying the acquisition of pluripotent states, DNA methylation patterns are re- established de novo during differentiation. This work attempted to elucidate how the genome copes with the rapid loss of DNA methylation, in particular regarding the control of transposons in absence of this essential protective mark. Using an embryonic cellular model of induced methylation reprogramming, I showed that various chromatin-based mechanisms can compensate for the progressive loss of DNA methylation. In particular, my results suggest that the Polycomb machinery acquires a critical role in transposon silencing, providing a mechanistic relay specifically when DNA methylation patterns are erased. In a second phase, this work analyzed the contribution of the DNA methyltransferase cofactor DNMT3l during events of embryonic de novo methylation. Overall, these findings shed light onto the processes by which genome regulation adapts during DNA methylation reprogramming
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González, Morao Ana Karina. „Rôle des complexes PRC2 dans la régulation de la différenciation cellulaire chez Arabidopsis thaliana“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS153.
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Les protéines du groupe Polycomb (PcG) ont initialement été identifiées chez la Drosophile, en tant que facteurs nécessaires au maintien de l’expression spatio-temporelle de gènes homéotiques le long de l’axe antéro-postérieur. Depuis, leur rôle en tant que régulateurs du développement a été mis en évidence chez la plupart des métazoaires ainsi que chez les plantes, chez lesquelles elles orchestrent les transitions développementales, l’organogenèse et la différenciation cellulaire. Les protéines PcG sont nécessaires au maintien de la répression transcriptionnelle de gènes cibles, par la régulation de leur structure chromatinienne via des modifications post-traductionnelles des histones. Elles forment des complexes multiprotéiques, notamment les Complexes Répressifs Polycomb PRC1 et PRC2. PRC2 est responsable de la tri-méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3) et est constitué de 4 sous-unités principales qui, pour la plupart, sont présentes sous forme de familles multigéniques dans le génome d’Arabidopsis thaliana. Ainsi, il existe plusieurs complexes PRC2 constitués de combinaisons alternatives de ces sous-unités, qui sont potentiellement présents au sein d’une même cellule et dont les rôles sont considérés comme partiellement redondants. En utilisant des approches moléculaires, génétiques et génomiques, nous avons analysé le rôle des sous-unités PRC2 exprimées dans la pointe racinaire d’Arabidopsis. Nous avons montré que l’interaction entre différents PRC2 est nécessaire pour réguler l’activité du méristème, le déroulement temporel de la différenciation cellulaire, ainsi que pour le maintien de l’identité des cellules matures. De plus, notre travail montre que les complexes PRC2 contenant l’une ou l’autre des deux méthyltransférases, CLF et SWN, régulent des groupes de gènes communs ainsi que distincts, à travers des mécanismes différents incluant une fonction non-canonique. Par ailleurs, nos résultats indiquent que les différences fonctionnelles entre CLF-PRC2 et SWN-PRC2 reposent, au moins en partie, sur les sous-unités non-catalytiques avec lesquelles la méthyltransférase interagit. Pour identifier les gènes régulés dynamiquement par PRC2 durant la différenciation cellulaire, nous avons développé des approches permettant d’accéder à la résolution des types cellulaires afin d’analyser les états chromatiniens à l’intérieur de la niche de cellules souches et de la zone de maturation de la racine. Nos données suggèrent que PRC2 participe au maintien de l’identité du Centre Quiescent (QC) en réprimant des voies de signalisations spécifiques. De plus, la différenciation cellulaire en direction de la zone de maturation est accompagnée par un accroissement du répertoire des cibles PRC2, incluant des régulateurs méristématiques ainsi que des gènes spécifiquement exprimés dans différents types cellulaires. Enfin, nos résultats suggèrent qu’une proportion significative des cibles PRC2 sont présentes sous la forme de domaines bivalents H3K27me3-H3K4me3 dans les cellules souches végétales, cette proportion étant moins importante que celle décrite chez les cellules souches embryonnaires de mammifères. Dans l’ensemble, ce travail apporte une vue intégrée de la fonction, la dynamique et la multiplicité de l’activité PRC2 au cours du processus de différenciation cellulaire, dans le contexte d’un organe en développement. Nos résultats mettent en évidence le rôle de PRC2 en tant que régulateur majeur de la différenciation cellulaire, qui apporte à la fois robustesse et plasticité aux programmes transcriptionnels qui sous-tendent l’acquisition spatio-temporelle et le maintien de l’identité cellulaireThe Polycomb group (PcG) proteins were originally identified in Drosophila as factors required for maintaining the spatio-temporal expression of homeotic genes along the head-to-tail axis. Since then, their role as developmental regulators has been highlighted in most metazoans as well as plants, in which they orchestrate developmental transitions, organogenesis and cell differentiation. PcG proteins are required to maintain the transcriptional repression of target genes by regulating their chromatin structure via post-translational histone modifications. They are found in multiprotein complexes, including Polycomb Repressive Complexes PRC1 and PRC2. PRC2 is responsible for the trimethylation of histone H3 at lysine 27 (H3K27me3) and consists of four core subunits, most of which are represented by multigene families in Arabidopsis thaliana. Thus, distinct PRC2 complexes formed by alternative subunit combinations exist, possibly in the same cell, and are thought to play partly overlapping roles. By combining molecular, genetic and genomic approaches, we have analyzed the role of the PRC2 subunits expressed in the Arabidopsis root tip used as a model. We show that the interplay between distinct PRC2s is necessary to regulate the activity of the meristem and the timing of cell differentiation, as well as the maintenance of cell identity. In addition, our work reveals that PRC2 complexes containing either of the two related methyltransferases CLF or SWN regulate common as well as specific sets of genes through distinct mechanisms, including a non-canonical function. Furthermore, our results indicate that the functional differences between CLF-PRC2 and SWN-PRC2 rely, at least in part, on the non-catalytic subunit they are interacting with. To identify the genes dynamically regulated by PRC2 during cell differentiation, we have developed cell type-specific approaches to analyze chromatin marks in cell populations within the stem cell niche and the maturation zone of the root. Our data suggest that PRC2 participates in the maintenance of the quiescent center (QC) identity by repressing specific signaling pathways. In addition, cell differentiation towards the maturation zone is accompanied by an increase of the repertoire of PRC2 targets including stem cell and meristem regulators, as well as cell type-specific genes. Finally, our findings suggest that bivalent H3K27me3-H3K4me3 domains in the QC represent a significant, though smaller proportion of PRC2 targets in plant stem cells compared to what has been described in mammalian embryonic stem cells. Overall, this work provides an integrated view of the function, dynamics and multiplicity of PRC2 activity during the cell differentiation process, in the context of a developing organ. Our results highlight the role of PRC2s as major regulators of cell differentiation that provide both robustness and plasticity to the transcriptional programs underlying cell fate acquisition and identity maintenance
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Tarhini, Batoul. „Oriented paths in digraphs and the S-packing coloring of subcubic graph“. Electronic Thesis or Diss., Bourgogne Franche-Comté, 2023. http://www.theses.fr/2023UBFCK079.
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Cette thèse de doctorat est divisée en deux parties principales: La partie I explore l'existence de chemins orientés dans les digraphes, cherchant à établir un lien entre le nombre chromatique d'un digraphe et l'existence de chemins orientés spécifiques en tant que sous-digraphes. Les digraphes contenus dans n'importe quel digraphe n-chromatique sont appelés n-universels. Nous examinons deux conjectures : la conjecture de Burr, qui affirme que chaque arbre orienté d'ordre n est (2n-2)-universel, et la conjecture d'El Sahili, qui déclare que chaque chemin orienté d'ordre n est n-universel. Pour les chemins orientés en général, la meilleure borne est donnée par Burr, à savoir que chaque chemin orienté d'ordre n est (n - 1)²-universel.Notre objectif est d'étudier des chemins à trois blocs. Pour atteindre nos objectifs, nous nous appuyons fortement sur des concepts fondamentaux, y compris l'induction sur l'ordre d'un digraphe donné, les forêts finales, les techniques de nivellement et les méthodes de décomposition stratégique de digraphes. Un chemin comportant trois blocs est désigné par P(k1, k2, k3). Pour le chemin P(k,1,l), nous avons confirmé la conjecture d'El Sahili dans les digraphes Hamiltoniens. En se basant sur ce résultat pour les digraphes Hamiltoniens, nous avons confirmé la conjecture d'El Sahili pour une classe plus générale de digraphes, ceux qui incluent un chemin dirigé hamiltonien. Nous introduisons une technique novatrice : une décomposition du digraphe en sous-digraphes résultant d'une série d'opérations basées sur le fameux théorème de Roy, qui garantit l'existence d'un chemin orienté dirigé d'ordre n dans tout digraphe n-chromatique. Cette technique s'est avérée cruciale pour établir de nouvelles bornes linéaires pour le nombre chromatique de digraphes qui ne comportent pas de chemin orienté avec trois blocs. En effet, en utilisant cette technique, nous avons prouvé que le chemin P(k,1,l) satisfait la conjecture de Burr. De plus, pour n'importe quel chemin à trois blocs, P(k,l,r), nous avons établi une borne linéaire pour le nombre chromatique qui améliore toutes les bornes précédemment atteintes. Dans la partie II, nous étudions le problème de la coloration de packing dans les graphes. Étant donnée une séquence non décroissante S = (s1, s2, . . . , sk) d'entiers positifs, une S-coloration (de packing) d'un graphe G est une partition de l'ensemble des sommets de G en k sous-ensembles {V1, V2, . . . , Vk} tels que pour chaque 1 ≤ i ≤ k, la distance entre deux sommets distincts u et v dans Vi est d'au moins si + 1. Notre attention est centrée sur une conjecture intrigante proposée par Brešar et al., qui affirme que l'arête subdivision de n'importe quel graphe subcubique admet une (1,2,3,4,5)-coloration de packing. Notre objectif est de confirmer cette conjecture pour des classes spécifiques de graphes subcubiques et de traiter les questions non résolues soulevées dans ce domaine. Une observation de Gastineau et Togni indique que si un graphe G est (1, 1, 2, 2)-colorable, alors son graphe subdivisé S(G) est (1,2,3,4,5)-colorable, et donc il satisfait la conjecture. En nous basant sur cette observation et afin de prouver la véracité de la conjecture pour la classe des graphes de Halin cubiques, nous avons étudié leur S-coloration de packing visant à prouver qu'ils admettent une coloration en (1, 1, 2, 2). Nous avons prouvé que tout graphe de Halin cubique est (1, 1, 2, 3)-colorable, et donc (1, 1, 2, 2)-colorable, et ainsi nous confirmons la conjecture pour cette classe. De plus, Gastineau et Togni, après avoir prouvé que chaque graphe subcubique est (1, 2, 2, 2, 2, 2, 2)-colorable, ont posé un problème ouvert sur le fait de savoir si chaque graphe subcubique est (1, 2, 2, 2, 2, 2)-colorable. Nous répondons affirmativement à cette question dans la classe particulière sur laquelle nous avons travaillé : nous avons prouvé que les graphes d'Halin cubiques sont (1, 2, 2, 2, 2, 2)-colorablesThis PhD thesis is divided into two principal parts: Part I delves into the existenceof oriented paths in digraphs, aiming to establish a connection between a digraph'schromatic number and the existence of specific oriented paths within it as subdigraphs. Digraphs contained in any n-chromatic digraph are called n-universal. We consider two conjectures: Burr's conjecture, which states that every oriented tree of order n is (2n-2)-universal, and El Sahili's conjeture which states that every oriented path of order n is n-universal. For oriented paths in general, the best bound is given by Burr, that is every oriented path of order n is (n − 1)^2-universal. Our objective is to study the existence of an integer k such that any digraph with a chromatic number k, contains a copy of a given oriented path with three blocks as its subdigraph. To achieve our goals, we rely significantly on fundamental concepts, including, induction on the order of a given digraph, final forests, leveling techniques, and strategic digraph decomposition methods. A path P (k1, k2, k3) is an oriented path consisting of k1 forward arcs, followed by k2 backward arcs, and then by k3 forward arcs. For the path P(k,1,l), we have confirmed El Sahili's conjecture in Hamiltonian digraphs. More clearly, we have established the existence of any path P (k, 1, l) of order n in any n-chromatic Hamiltonian digraph. And depending on this result concerning Hamiltonian digraphs, we proved the correctness of El Sahili's conjecture on a more general class of digraphs which is digraphs containing a Hamiltonian directed path. We introduce a new technique which is represented by a decomposition of the digraph into subdigraphs defined by a series of successive operations applied to the digraph relying on the famous theorem of Roy which establishes the existence of a directed path of order n in any n-chromatic digraph. This technique has proven to be instrumental in establishing new linear bounds for the chromatic number of digraphs that lack an oriented path with three blocks. In deed, using this technique, we proved that the path P(k,1,l) satisfies Burr's conjecture.Moreover, for any path with three blocks, P(k,l,r) we establish a linear bound for the chromatic number which improves all the previously reached bounds. In Part II we study the problem of S-packing coloring in graphs. Given a non-decreasing sequence S = (s1, s2, . . . , sk) of positive integers, an S-packing coloring of a graph G is a partition of the vertex set of G into k subsets{V1, V2, . . . , Vk} such that for each 1 ≤ i ≤ k, the distance between any two dis-tinct vertices u and v in Vi is at least si + 1. Our focus is centered on an intriguing conjecture proposed by Brešar et al., which states that packing chromatic number of the subdivision of any subcubic graph is at most 5. Our desired aim is to provide a confirmation of this conjecture for specific classes of subcubic graphs, and to address the unresolved issues raised within this subject matter. An observation for Gastineau and Togni states that if a graph G is (1, 1, 2, 2)-packing colorable, then the chromatic number of its subdivision graph S(G) is at most 5, and hence it satisfies the conjecture. Depending on this observation, and in order to prove the correctness of the conjecture for the class of cubic Halin graphs, we studied its S-packing coloring aiming to prove that it admits a (1, 1, 2, 2)- packing coloring. We proved that a cubic Halin graph is (1, 1, 2, 3)-packing colorable, then it is (1, 1, 2, 2)-packing colorable, and so we confirm the conjecture for this class. Moreover, Gastineau and Togni, after proving that every subcubic graph is (1, 2, 2, 2, 2, 2, 2)-packing colorbale, have posed an open problem on whether every subcubic graph is (1, 2, 2, 2, 2, 2)-packing colorable. We answer this question in affirmative in the particular class we worked on; we proved that cubic Halin graphs are (1, 2, 2, 2, 2, 2)-packing colorable
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Jiao, Yue. „Rôle de l'intéraction Asf1-Rad53 dans la stabilité génomique chez S.cerevisiae“. Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112105/document.
Der volle Inhalt der QuelleAnnotation:
Asf1 est une protéine chaperon d’histone, qui participe à l’assemblage et au désassemblage des histones H3/H4 sur l’ADN. Asf1 n’est pas essentiel pour la viabilité cellulaire chez S. cerevisiae, mais les voies de surveillance des dommages à l’ADN sont activées de façon constitutive dans les cellules dépourvues d’Asf1 et celles-ci sont hypersensibles à plusieurs types de stress génotoxiques. Chez S. cerevisiae, Asf1 forme un complexe stable avec Rad53 en absence de stress génotoxique. Nos résultats suggèrent qu’au moins trois surfaces d’interaction sont impliquées dans le complexe Asf1-Rad53. Le domaine FHA1 de Rad53 fixe Asf1 phosphorylé sur T270, l’extrémité C-terminale de Rad53 fixe la même surface d’Asf1 impliquée dans la fixation des co-chaperones HirA/CAF-1, et un troisième site putative est constituée de la surface d’Asf1 impliquée dans la fixation de l’histone H3 avec le domaine kinase de Rad53. Lors des stress génotoxiques, Rad53 est phosphorylée et activée. Mes résultats montrent une dissociation totale du complexe Rad53-Asf1 après traitement HU, mais la préservation du complexe après traitement des cellules avec une gamme de concentration de MMS. Nous pensons que la régulation du complexe traduisent des réponses cellulaires distinctes adaptées à des stress génotoxiques spécifiques. Par ailleurs, grâce à la structure du complexe formé par un peptide C-terminal de Rad53 et le domaine N-terminal d’Asf1, nous avons isolé une mutation rad53_A806R-L808R. Nous avons constaté que cette mutation déstabilise l’interaction entre Asf1 et Rad53 et augmente la viabilité des mutants rad9 et rad24 aux stress génotoxiquex. Ce mutant rad53_A806R-L808R semble retourne plus vite dans le cycle cellulaire et/ou traverse plus vite la phase S par rapport à Rad53-WT, et augmente la réparation de l’ADN ou l’adaptation aux dommages du simple mutant rad24ΔAsf1 is a histone chaperone, which participates in the assembly and disassembly of histones H3/H4 on DNA. Asf1 is not essential for cell viability in yeast, but the DNA damage checkpoints are constitutively activated in cells lacking Asf1 and they are hypersensitive to several types of genotoxic stress. In yeast, Asf1 forms a stable complex with Rad53 in the absence of genotoxic stress. Our results suggest that this complex involves at Ieast three interaction surfaces. One site involves the H3-binding surface of Asf1 with an as yet undefined surface of Rad53, probably reside in the kinase domain of Rad53. A second site is formed by the Rad53-FHA1 domain binding to Asf1-T270. The third site involves the C-terminal 21 aa of Rad53 bound to the conserved Asf1 N-terminal domain, where Rad53 competes with histone H3/H4 and co-chaperones HirA/CAF-1 for binding to the same surface of Asf1. Rad53 is phosphorylated and activated upon genotoxic stress. The Asf1-Rad53 complex dissociated when cells were treated with hydroxyurea but not methyl methane sulfonate, suggesting a regulation of the complex as a function of the stress.In addition to these results, we also found that the rad53-A806R+L808R mutation at the C-terminus of Rad53 destabilized the Asf1-Rad53 interaction and increased the viability of rad9 and rad24 mutants to genotoxic stress. The rad53-ALRR mutant also appeared to re-enter the cell cycle and/or traverse S-phase more rapidly than wild type and increased repair or adaptation when combined with the rad24 mutant
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Tisseur, Mathieu. „Rôle de Hda1 dans la régulation de l'expression gènes par les longs ARN“. Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112100/document.
Der volle Inhalt der QuelleAnnotation:
Les ARNnc sont impliqués dans la régulation de l’expression de gènes chez les Procaryotes, les Archées et les Eucaryotes. Cette régulation peut être effectuée au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Elle fait parfois intervenir des modifications des histones comme la méthylation ou l’acétylation. J’ai étudié le gène TIR1 dont l’expression est fortement réduite lorsqu’un ARNnc codant antisens nommé TIR1axut est stabilisé. J’ai montré que cette régulation est dépendante de l’histone déacétylase Hda1. De plus, j’ai montré que l’acétylation de H3K14 et H3K18 ne sont pas directement impliquées dans la régulation de TIR1 mais qu’un résidu polaire est nécessaire pour la répression de TIR1 en présence de l’ARNnc antisens. En outre, j’ai mis en évidence que la répression de TIR1 par son XUT est en parti post-transcriptionnel, mais ne fait pas varier la stabilité de l’ARNm. Finalement, j’ai tenté en vain de comprendre le ciblage de l’activité histone déacétylase de Hda1 le long de TIR1 en cherchant la présence d’hybride ARN/ADN grâce à un anticorps reconnaissant ce type de structureNcRNAs are involved in gene regulation in Prokaryotes, Eukaryotes and Archaea. This regulation could be transcriptional or post-transcriptional. Histone modifications could be involved such as methylation or acetylation. I studied TIR1 gene whose expression is highly reduced when an antisense ncRNA called TIR1axut is stabilized. I showed that this regulation is Hda1-dependant. In addition to that, I showed that H3K14ac and H3K18ac are not directly responsible for TIR1 repression but a polar residue is required for a proper silencing of TIR1 in a XUT depending manner. Moreover, I showed that TIR1 repression is due to a post-transcriptional effect but does not affect mRNA stability. Finally, I tried in vain to understand Hda1 targeting on TIR1 searching for RNA/DNA hybrids using an antibody that recognizes such structures