Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Chaperons d'histone“

ASF1 est un chaperon d’histones H3-H4 impliqué dans de nombreux cancers. Comme bon nombre de protéines, ce chaperon exerce ses fonctions dans la cellule à travers des interactions protéine-protéine qu’il établit avec d’autres partenaires protéiques. La présente thèse porte sur le développement d’une stratégie originale de design de peptides inhibiteurs de ce type d’interactions souvent associées à des maladies. Cette stratégie rationnelle et itérative repose sur le couplage d’épitopes de liaison provenant de différents partenaires de l’interaction, et leur stabilisation par l’introduction de résidus « ancre » permettant ainsi d’engager un grand nombre de contacts avec la cible. L’extension de cette approche vers des peptidomimes permet par la suite de surmonter les obstacles liés à l’utilisation des peptides en thérapeutique tels que la biodisponibilité et la demi-vie. Appliquée au ciblage d’ASF1, cette méthode a permis de concevoir un peptide, ip4, présentant une affinité de 3nM pour sa cible, soit 3000 fois supérieure au partenaire naturel H3. Ce même peptide a été mimé avec succès par un composé, if3, de nature oligourée. Efficacement internalisés à l’aide d’une Cell Penetrating Peptide clivable, ces inhibiteurs présentent un effet antiprolifératif provoquant la mort des cellules cancéreuse, vraisemblablement dû au ciblage spécifique d’ASF1
ASF1 is a histone H3-H4 chaperone implicated in several cancers. Like many proteins, this chaperone mediates its cellular functions through protein-protein interactions involving various protein partners. The present thesis focuses on the development of an original strategy to design inhibitory peptides targeting such disease-associated type of biological interactions. This rational and iterative strategy relies on the tethering of binding epitopes isolated from different partners, and stabilized by “anchor” residues that engage large number of atomic contacts with the target. The further progression of this approach toward a peptidomimetic strategy overcomes obstacles commonly associated to the therapeutic use of peptides such as biodisponibility and half-life. Applied for targeting ASF1, such method allowed the conception of a peptide, ip4, presenting a 3nM affinity for its target, which is 3000 fold higher than that of the natural partner H3. This peptide could be successfully mimicked by an oligourea structure, giving rise to the peptidomimetic if3. When coupled to a cleavable Cell Penetrating Peptide, these inhibitors displayed an on-target effect where they impeded cancerous cells proliferation, ultimately resulting in cells death

Le génome des cellules eucaryotes est empaqueté dans la chromatine, dont l’établissement et la maintenance nécessitent des processus d’assemblage et de remodelage. Ce travail de thèse a été consacré à la caractérisation de deux facteurs de la machinerie d’assemblage de la chromatine. Le premier facteur étudié dans ce travail était HIRIP3, un homologue mammifère de la levure H2A.Z chaperon Chz1. Nous voulions vérifier si HIRIP3 est une chaperon d'histone par elle-même. Pour commencer, nous avons décrit l'interaction de HIRIP3 avec les histones in vivo. Ensuite, nous avons étudié la spécificité structurale de cette interaction in vitro. Nous avons caractérisé HIRIP3 comme une nouvelle chaperon d'histone H2A qui utilise le motif CHZ pour sa fonction. La deuxième partie de ce travail a été axée sur le complexe de remodelage de la chromatine SRCAP. Nous avons cherché à décoder son réseau d'interaction et à décrire ses sous-complexes. Nous avons reconstitué le complexe de base YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B et H2A.Z / H2B en utilisant le système d'expression chez baculovirus. Notre protocole nous a permis de purifier un complexe de base adapté aux futures études structurelles par microscopie cryo-électronique
The genome of eukaryotic cells is packaged into chromatin, which establishment and maintenance require mechanisms of assembly and remodelling. This thesis work was dedicated to the characterization of two factors of chromatin assembly machinery. The first factor studied in this work was HIRIP3, a mammalian homologue of yeast H2A.Z chaperone Chz1. We aimed to test whether HIRIP3 is a histone chaperone by itself. At first, we established HIRIP3 interaction with histones in vivo. After then, we studied the structural specificity of this interaction in vitro. We have characterized HIRIP3 as a novel H2A histone chaperone that utilizes the CHZ motif for its function. The second part of this work was focused on SRCAP chromatin remodelling complex. We aimed to decipher its interaction network and to describe its sub-complexes. We have reconstituted YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B and H2A.Z/H2B core complex using baculovirus expression system. Our protocol allowed us to purify core complex suitable for future structural studies by cryo-electron microscopy

La variante d'histone H2AZ joue un rôle important dans l'activation de la transcription, la prolifération cellulaire, le développement et la différentiation. H2AZ orne les promoteurs de la majorité des gènes, mais les mécanismes de bases de cette localisation sont inconnus. La compréhension de l'assemblage et du désassemblage du nucléosome passe par la caractérisation de la dynamique du nucléosome et des chaperonnes d'histones. L'objectif de ma thèse était d'identifier des chaperonnes spécifiques impliqués dans la dynamique de H2AZ en utilisant une approche de protéomique. Pour élucider les mécanismes de déposition/éviction de H2AZ, j'ai purifié le complexe prénucléosomale de H2AZ et j'ai caractérisé toutes les protéines associées. J'ai trouvé que Anp32e fait partie du complexe p400/TIP60 qui est présumée pour être responsable de l'échange d'H2AZ sur la chromatine. Anp32e présente une spécificité pour le dimère H2AZ-H2B, car il n'interagit pas avec le dimère H2A-H2B. L'interaction est accomplie au niveau d'une petite région dans le domaine d'ancrage sur H2AZ et au niveau d'un nouveau domaine ZID sur Anp32e. Finalement, j'ai montré que la suppression d'Anp32e entraine : un défaut dans la dé-répression des gènes dont l'expression est contrôlée par une hormone et une accumulation sur les promoteurs de ces derniers. Dans l'ensemble ces résultats identifient Anp32e comme une nouvelle chaperonne de la variante d'histoneH2AZ impliquée dans l'éviction de H2AZ chez les mammifères.

Lors de la transcription, le passage de l'ARN polymérase II (RNAPII) entraine des perturbations dans l’organisation des nucléosomes. Ces perturbations posent un vrai défi majeur pour le maintien de l'intégrité de la chromatine et des informations épigénétiques associées aux histones. En particulier, les régions transcrites incorporent le variant d’histone H3.3 s’accumule via une déposition de novo indépendante de la synthèse d’ADN s’appuyant sur un chaperon d’histone dédié à H3.3, le complexe HIRA. Cependant, reste à déterminer comment la chromatine est rassemblé pendant/après la transcription et si les histones préexistantes sont recyclées pour maintenir le profil épigénétique des gènes. En exploitant le système d’étiquette SNAP-tag pour suivre différentes populations d’histones H3.3 par microscopie, j’ai montré que non seulement les nouvelles histones H3.3 mais aussi les anciennes sont localisées aux sites de transcription active. L’arrêt de la transcription par une drogue inhibant la RNAPII, le Flavopiridol, entraîne une augmentation de la quantité de H3.3 retenu, suggérant qu’une partie des anciennes H3.3 sont recyclées pour reconstituer la chromatine suite à la transcription. J’ai montré de même que le chaperon HIRA est essentiel au maintien de ces H3.3 anciennes. Mécaniquement, nous démontrons que le chaperon HIRA est essentiel pour gérer les nouveaux et les anciens H3.3, mais implique différentes voies. Le dépôt de novo H3.3 dépend strictement de HIRA ainsi que son partenaire UBN1 tandis que l'interaction ASF1 avec HIRA peut être contourné. En revanche, le recyclage de H3.3 nécessite HIRA mais se déroule indépendamment d'UBN1 et montre une dépendance absolue d'ASF1. Par conséquent, nous proposons un modèle où HIRA peut coordonner ces différentes voies pour le recyclage de l'ancien H3.3 et le nouveau dépôt de H3.3 pendant la transcription pour réguler différents états de chromatine
The packaging of DNA into nucleosomes represents a challenge for transcription. Nucleosome disruption and histone eviction enables RNA Polymerase II progression through DNA, a process that compromises chromatin integrity and the maintenance of epigenetic information. Here, we used the imaging SNAP-tag system to distinguish new and old histones and monitor chromatin re-assembly coupled to transcription incells. First, we uncovered a loss of both old variants H3.1 and H3.3 that depends on transcriptional activity, with a major effect on H3.3. Focusing on transcriptionally active domains, we revealed a local enrichment in H3.3 with dynamics involving both new H3.3 incorporation and old H3.3 retention. Mechanistically, we demonstrate that the HIRA chaperone is critical to handle both new and old H3.3, and showed that this implicates different pathways. The de novo H3.3 deposition depends strictly on HIRA trimerization as well as its partner UBN1 while ASF1 interaction with HIRA can be bypassed. In contrast, the recycling of H3.3 requires HIRA but proceeds independently of UBN1 or HIRA trimerization and shows an absolute dependency on ASF1-HIRA interaction. Therefore, we propose a model where HIRA can coordinate these distinct pathways for old H3.3 recycling and new H3.3 deposition during transcription to finetune chromatin states

Le rôle fonctionnel des transcrits de l’hétérochromatine péricentromérique reste à ce jour largement incompris chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il a été montré que ces transcrits sont soumis à un contrôle très précis, fonction du cycle cellulaire. La régulation de la transcription est fortement contrôlée par la structure de la chromatine qui peut être modifiée localement en changeant la composition biochimique du nucléosome, notamment par l’utilisation des variantes d’histones. L’objectif de ma thèse a été de mieux comprendre le rôle de la protéine chaperonne d’histone DAXX et de sa variante d’histone H3.3 dans la régulation de la transcription des séquences répétées péricentromériques. Par la méthode de purification TAP-TAG, les partenaires spécifiques de DAXX ont été identifiés à partir d’extraits solubles nucléaires de fibroblastes embryonnaires murins. Ces analyses ont mis en évidence que CAF-1, classiquement associé à H3.1, et les facteurs de remodelage de la chromatine ATRX et CHD4 interagissent spécifiquement avec DAXX. Le rôle de ces protéines dans le contrôle de la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique a ensuite été mis en évidence par une approche combinant l’interférence ARN et la Q-PCR. Enfin, les résultats suggèrent fortement que ces mécanismes de régulation ont lieu au niveau des corps nucléaires PML. L’ensemble de ces données montre qu’il existe une régulation spatio-temporel très fine de la structure de la chromatine régulant la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique
The functional role of pericentromeric heterochromatin transcripts remains largely unknown in higher eukaryotes. Nevertheless, it has been shown that these transcripts are subject to very precise control, depending on the cell cycle. Regulation of transcription is tightly controlled by chromatin structure that can be modified locally by changing the biochemical composition of the nucleosome, including the use of histone variants. The aim of my thesis was to better understand the role of the histone chaperone protein DAXX and its histone variant H3.3 in the regulation of transcription of pericentromeric repeats. By the method of TAP-TAG purification, DAXX specific partners were identified from soluble nuclear extracts of murine embryonic fibroblasts. These analyzes revealed that CAF-1, classically associated with H3.1, and the chromatin remodeling factors, ATRX and CHD4, specifically interact with DAXX. The role of these proteins in the control of transcription of pericentromeric heterochromatin was then highlighted by an approach combining RNAi and Q-PCR. Finally, the results strongly suggest that these regulatory mechanisms take place at PML nuclear bodies. Taken together, these data show that there is a spatio-temporal regulation of the fine structure of chromatin regulates transcription of pericentromeric heterochromatin

La chromatine chez les eucaryotes, porte des informations génétiques et épigénétiques. Les mécanismes garantissant le maintien de ces informations lors de la division cellulaire ou la réparation de l’ADN sont encore mal connus et ils constituent l’enjeu principal du projet de thèse. Plus particulièrement, l’objectif du projet de thèse est de chercher à comprendre comment les chaperons d’histones coordonnent leur action avec des partenaires associés à la fourche de réplication pour conserver les marques épigénétiques portées par les histones parentales et les reporter sur les histones nouvellement synthétisées. Cette thèse décrit précisément comment ASF1 (Anti Silencing Function 1) coopère avec le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et la sous-unité de l’hélicase réplicative MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), pour la prise en charge des H3-H4 dans la réplication et la réparation de l’ADN.La thèse s’intéresse également à la régulation de l’activité de ces chaperons d’histones par des kinases activées suite à des stress réplicatifs ou des dommages de l’ADN. En particulier nous avons cherché à mieux comprendre comment l’ajout de groupements phosphate sur ASF1 par une enzyme appelée TLK (Tousled Like Kinase) module son activité au cours du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l’ADN. La caractérisation de l'importance des sites phosphorylés sur les propriétés de liaison du chaperon, permet de mieux comprendre le rôle joué par différent forme d’ASF1 dans l’assemblage des histones sur l’ADN et le maintien des informations épigénétiques. Le travail de thèse contient d’analyses biochimiques et structurales par une combinaison de techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, RMN, cristallographie des rayons X) et d’analyses fonctionnelles sur des modèles cellulaires
In eukaryotes, chromatin carries both, the genetic and epigenetic information. Mechanisms implicated in maintenance of these information during cell division or DNA repair remain poorly understood and they constitute the main issue of this thesis project. More specifically, the goal of the project is to understand how histone chaperones coordinate their action with partners associated with the replication fork to recognize and preserve the epigenetic marks carried by parental histones and to copy on the newly synthesized histones. The work unravels how ASF1 (Anti-Silencing Function 1) cooperates with the CAF-1 complex (Chromatin Assembly Factor 1) and with the replicative helicase subunit MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), for the management of H3-H4 histones in DNA replication and repair.Moreover, this thesis investigates the regulation of histone chaperones activities by kinases activated after a replicative stress or DNA damage. In particular, we analyzed the consequences of ASF1 phosphorylation by the enzyme called TLK (Tousled like kinase). The activity of TLK is modulated during the cell cycle and after DNA damage. Characterization of the importance of phosphorylated sites on the chaperone binding properties, allows a better understanding of the role played by different forms of ASF1 in the assembly of histones on DNA and maintenance of epigenetic information. The thesis work included biochemical and structural analysis with a combination of different techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, NMR, X-ray crystallography) and functional analysis in cellular models

L'établissement de latence du virus de l'Herpès simplex 1 (HSV1) est contrôlé par les corps nucléaires PML (PML-NBs) mais leur implication exacte reste encore confuse. Une des caractéristiques majeures de la latence du virus est l'interaction entre le génome viral et les PML-NBs formant des structures nommées viral DNA-containing PML-NBs (vDCP-NBs). L'utilisation d'un modèle d'infection de fibroblastes primaires humains, qui reproduit la formation des vDCP-NBs, combinée à une approche par immuno-FISH, a permis de montrer que les vDCP-NBs contiennent l'histone H3.3 et ses chaperons, les complexes DAXX-ATRX et HIRA. La protéine HIRA a été également observé au sein des vDCP-NBs dans les neurones des ganglions trijumeaux de souris infectées par HSV1. Des expériences de ChIP-qPCR dans des cellules exprimant H3.3 ou H3.1 tagguées, nous a permis de déterminer que le génome viral est spécifiquement chromatinisé avec l'histone H3.3. La déplétion d'une seule protéine des complexes chaperons de H3.3 affecte légèrement l'incorporation de H3.3 dans les génomes viraux latents. Au contraire, l'absence de PML diminue significativement la chromatinisation H3.3 du génome HSV-1 latent sans remplacement par H3.1. Cette étude démontre une régulation épigénétique du génomes HSV1 latent par une chromatinisation dépendante de H3.3 impliquant les complexes chaperons DAXX-ATRX et HIRA. De plus, cette étude révèle un rôle majeur des PML-NBs dans la chromatinisation H3.3 des génomes HSV1 latent
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) latency establishment is tightly controlled by PML nuclear bodies (PML-NBs) although their exact implication is still elusive. A hallmark of HSV-1 latency is the interaction between latent viral genomes and PML-NBs leading to the formation of viral DNA-containing PML-NBs (vDCP-NBs). Using a replication defective HSV-1 infected human primary fibroblast model reproducing the formation of vDCP-NBs, combined with an IF-FISH approach developed to detect latent HSV-1, we show that vDCP-NBs contain both histone H3.3 and its chaperone complexes, i.e. the DAXX/ATRX and the HIRA complex. HIRA was also detected co-localizing with vDCP-NBs present in trigeminal ganglia neurons from HSV-1 infected WT mice. ChIP-qPCR performed on fibroblasts stably expressing tagged H3.3 or H3.1 show that latent HSV1 genomes are chromatinized almost exclusively with H3.3. Depletion of single proteins from the H3.3 chaperone complexes only mildly affects H3.3 deposition on the latent HSV1 genome. In contrast, absence of PML significantly impacts on the chromatinization of the latent genomes with H3.3 without replacement with H3.1. Consequently, the study demonstrates a specific epigenetic regulation of latent HSV-1 through an H3.3-dependent HSV-1 chromatinization involving both H3.3 chaperones DAXX/ATRX and HIRA complexes. Additionally, the study reveals that PML-NBs are major actors of the latent HSV-1 H3.3 chromatinization through a PML-NBs/histone H3.3/H3.3 chaperones axis

Au sein des cellules eucaryotes, l'ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l'ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d'histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d'une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d'autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d'étude des mécanismes moléculaires d'assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1.

Au sein des cellules eucaryotes, l’ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l’unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l’ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d’histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d’une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d’autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d’étude des mécanismes moléculaires d’assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1

Au coeur du noyau des cellules eucaryotes se trouve l'ADN génomique organisé en une structure complexe: la chromatine. Cette organisation est essentielle pour la compaction de l'ADN et le maintien d'une identité cellulaire. L'unité de base de la chromatine, le nucléosome, est formé d'un octamère de protéines histones autour duquel s'enroule environ 147 pb de l'ADN. Au cours de ma thèse, mon attention s'est portée sur la protéine chaperon d'histones Asf1, impliquée dans la dynamique de la chromatine. J'ai abordé deux questions essentielles :(1) Quel est le rôle d'Asf1 dans la dynamique des histones au cours de la réplication ? La protéine Asf1 humaine s’associe en complexe avec les histones H3-H4 et les protéines MCMs, l'hélicase putative qui déroule l'ADN lors de la réplication. J'ai montré que la déplétion d'Asf1 par siARN entraîne une progression ralentie de la phase S, ainsi qu'une diminution de la quantité d'ADN simple brin généré en amont de la fourche de réplication par l’activité hélicase. Nous proposons un modèle selon lequel Asf1 participerait au transfert des histones parentales sur les brins filles de l’ADN. (2) Quelles sont les fonctions spécifiques des deux isoformes humaines d'Asf1, Asf1a et Asf1b, au regard de la prolifération cellulaire ? J'ai montré que l'expression d'Asf1b, mais pas celle d'Asf1a, est corrélée avec la prolifération cellulaire et que sa déplétion altère la prolifération. Asf1b est surexprimé dans de nombreux cancers et ceci corrèle avec l'apparition de métastases et une faible survie des patientes. Nous proposons Asf1b comme un nouveau marqueur pronostique et une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le cancer du sein.