Dissertationen zum Thema „Chaperones d'histone“

Le rôle fonctionnel des transcrits de l’hétérochromatine péricentromérique reste à ce jour largement incompris chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il a été montré que ces transcrits sont soumis à un contrôle très précis, fonction du cycle cellulaire. La régulation de la transcription est fortement contrôlée par la structure de la chromatine qui peut être modifiée localement en changeant la composition biochimique du nucléosome, notamment par l’utilisation des variantes d’histones. L’objectif de ma thèse a été de mieux comprendre le rôle de la protéine chaperonne d’histone DAXX et de sa variante d’histone H3.3 dans la régulation de la transcription des séquences répétées péricentromériques. Par la méthode de purification TAP-TAG, les partenaires spécifiques de DAXX ont été identifiés à partir d’extraits solubles nucléaires de fibroblastes embryonnaires murins. Ces analyses ont mis en évidence que CAF-1, classiquement associé à H3.1, et les facteurs de remodelage de la chromatine ATRX et CHD4 interagissent spécifiquement avec DAXX. Le rôle de ces protéines dans le contrôle de la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique a ensuite été mis en évidence par une approche combinant l’interférence ARN et la Q-PCR. Enfin, les résultats suggèrent fortement que ces mécanismes de régulation ont lieu au niveau des corps nucléaires PML. L’ensemble de ces données montre qu’il existe une régulation spatio-temporel très fine de la structure de la chromatine régulant la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique
The functional role of pericentromeric heterochromatin transcripts remains largely unknown in higher eukaryotes. Nevertheless, it has been shown that these transcripts are subject to very precise control, depending on the cell cycle. Regulation of transcription is tightly controlled by chromatin structure that can be modified locally by changing the biochemical composition of the nucleosome, including the use of histone variants. The aim of my thesis was to better understand the role of the histone chaperone protein DAXX and its histone variant H3.3 in the regulation of transcription of pericentromeric repeats. By the method of TAP-TAG purification, DAXX specific partners were identified from soluble nuclear extracts of murine embryonic fibroblasts. These analyzes revealed that CAF-1, classically associated with H3.1, and the chromatin remodeling factors, ATRX and CHD4, specifically interact with DAXX. The role of these proteins in the control of transcription of pericentromeric heterochromatin was then highlighted by an approach combining RNAi and Q-PCR. Finally, the results strongly suggest that these regulatory mechanisms take place at PML nuclear bodies. Taken together, these data show that there is a spatio-temporal regulation of the fine structure of chromatin regulates transcription of pericentromeric heterochromatin

Le génome des cellules eucaryotes est empaqueté dans la chromatine, dont l’établissement et la maintenance nécessitent des processus d’assemblage et de remodelage. Ce travail de thèse a été consacré à la caractérisation de deux facteurs de la machinerie d’assemblage de la chromatine. Le premier facteur étudié dans ce travail était HIRIP3, un homologue mammifère de la levure H2A.Z chaperon Chz1. Nous voulions vérifier si HIRIP3 est une chaperon d'histone par elle-même. Pour commencer, nous avons décrit l'interaction de HIRIP3 avec les histones in vivo. Ensuite, nous avons étudié la spécificité structurale de cette interaction in vitro. Nous avons caractérisé HIRIP3 comme une nouvelle chaperon d'histone H2A qui utilise le motif CHZ pour sa fonction. La deuxième partie de ce travail a été axée sur le complexe de remodelage de la chromatine SRCAP. Nous avons cherché à décoder son réseau d'interaction et à décrire ses sous-complexes. Nous avons reconstitué le complexe de base YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B et H2A.Z / H2B en utilisant le système d'expression chez baculovirus. Notre protocole nous a permis de purifier un complexe de base adapté aux futures études structurelles par microscopie cryo-électronique
The genome of eukaryotic cells is packaged into chromatin, which establishment and maintenance require mechanisms of assembly and remodelling. This thesis work was dedicated to the characterization of two factors of chromatin assembly machinery. The first factor studied in this work was HIRIP3, a mammalian homologue of yeast H2A.Z chaperone Chz1. We aimed to test whether HIRIP3 is a histone chaperone by itself. At first, we established HIRIP3 interaction with histones in vivo. After then, we studied the structural specificity of this interaction in vitro. We have characterized HIRIP3 as a novel H2A histone chaperone that utilizes the CHZ motif for its function. The second part of this work was focused on SRCAP chromatin remodelling complex. We aimed to decipher its interaction network and to describe its sub-complexes. We have reconstituted YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B and H2A.Z/H2B core complex using baculovirus expression system. Our protocol allowed us to purify core complex suitable for future structural studies by cryo-electron microscopy

La variante d'histone H2AZ joue un rôle important dans l'activation de la transcription, la prolifération cellulaire, le développement et la différentiation. H2AZ orne les promoteurs de la majorité des gènes, mais les mécanismes de bases de cette localisation sont inconnus. La compréhension de l'assemblage et du désassemblage du nucléosome passe par la caractérisation de la dynamique du nucléosome et des chaperonnes d'histones. L'objectif de ma thèse était d'identifier des chaperonnes spécifiques impliqués dans la dynamique de H2AZ en utilisant une approche de protéomique. Pour élucider les mécanismes de déposition/éviction de H2AZ, j'ai purifié le complexe prénucléosomale de H2AZ et j'ai caractérisé toutes les protéines associées. J'ai trouvé que Anp32e fait partie du complexe p400/TIP60 qui est présumée pour être responsable de l'échange d'H2AZ sur la chromatine. Anp32e présente une spécificité pour le dimère H2AZ-H2B, car il n'interagit pas avec le dimère H2A-H2B. L'interaction est accomplie au niveau d'une petite région dans le domaine d'ancrage sur H2AZ et au niveau d'un nouveau domaine ZID sur Anp32e. Finalement, j'ai montré que la suppression d'Anp32e entraine : un défaut dans la dé-répression des gènes dont l'expression est contrôlée par une hormone et une accumulation sur les promoteurs de ces derniers. Dans l'ensemble ces résultats identifient Anp32e comme une nouvelle chaperonne de la variante d'histoneH2AZ impliquée dans l'éviction de H2AZ chez les mammifères.

ASF1 est un chaperon d’histones H3-H4 impliqué dans de nombreux cancers. Comme bon nombre de protéines, ce chaperon exerce ses fonctions dans la cellule à travers des interactions protéine-protéine qu’il établit avec d’autres partenaires protéiques. La présente thèse porte sur le développement d’une stratégie originale de design de peptides inhibiteurs de ce type d’interactions souvent associées à des maladies. Cette stratégie rationnelle et itérative repose sur le couplage d’épitopes de liaison provenant de différents partenaires de l’interaction, et leur stabilisation par l’introduction de résidus « ancre » permettant ainsi d’engager un grand nombre de contacts avec la cible. L’extension de cette approche vers des peptidomimes permet par la suite de surmonter les obstacles liés à l’utilisation des peptides en thérapeutique tels que la biodisponibilité et la demi-vie. Appliquée au ciblage d’ASF1, cette méthode a permis de concevoir un peptide, ip4, présentant une affinité de 3nM pour sa cible, soit 3000 fois supérieure au partenaire naturel H3. Ce même peptide a été mimé avec succès par un composé, if3, de nature oligourée. Efficacement internalisés à l’aide d’une Cell Penetrating Peptide clivable, ces inhibiteurs présentent un effet antiprolifératif provoquant la mort des cellules cancéreuse, vraisemblablement dû au ciblage spécifique d’ASF1
ASF1 is a histone H3-H4 chaperone implicated in several cancers. Like many proteins, this chaperone mediates its cellular functions through protein-protein interactions involving various protein partners. The present thesis focuses on the development of an original strategy to design inhibitory peptides targeting such disease-associated type of biological interactions. This rational and iterative strategy relies on the tethering of binding epitopes isolated from different partners, and stabilized by “anchor” residues that engage large number of atomic contacts with the target. The further progression of this approach toward a peptidomimetic strategy overcomes obstacles commonly associated to the therapeutic use of peptides such as biodisponibility and half-life. Applied for targeting ASF1, such method allowed the conception of a peptide, ip4, presenting a 3nM affinity for its target, which is 3000 fold higher than that of the natural partner H3. This peptide could be successfully mimicked by an oligourea structure, giving rise to the peptidomimetic if3. When coupled to a cleavable Cell Penetrating Peptide, these inhibitors displayed an on-target effect where they impeded cancerous cells proliferation, ultimately resulting in cells death

Au sein des cellules eucaryotes, l'ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l'ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d'histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d'une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d'autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d'étude des mécanismes moléculaires d'assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1.

Au sein des cellules eucaryotes, l’ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l’unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l’ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d’histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d’une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d’autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d’étude des mécanismes moléculaires d’assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1

Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels.

Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels
Production of functional messenger RNA (mRNA) requires a complex mechanism that couples transcription with maturation and export of the mRNA. In addition to this mechanism, chromatin needs to be unwound to allow the transcription machinery access the DNA, this unwinding being also highly regulated. Thus, production of a functional mRNA requires a huge number of factors implicated in these different processes. Among these proteins Spt6 and Iws1 are participating in the mechanism of transcription, chromatin unwinding, and maturation and export of the mRNA. The work carried out during this thesis has enabled the biochemical, structural and functional characterization of these proteins, their complex and their interaction with other effectors of transcription. This work has specifically enabled the molecular and functional characterization (i) of the recruitment of Spt6 by RNA polymerase II and (ii) of the formation of the Spt6/Iws1 complex. Moreover, this work has identified putative new partners of Spt6, not ably the elongation factor TFIIS. Thus, our work has highlighted the essential and complex role of Spt6 and Iws1 during the production of functional mRNA, and has also enabled future studies of the complexes formed by these two proteins with other transcriptional factors

L'organisation en chromatine permet de compacter l'ADN génomique et de réguler finement l'expression du génome. La particule cœur du nucléosome, composée d'un octamère de protéines histones autour desquelles s'enroule l'ADN, peut être modulée par l'incorporation de variants d'histones. Pour l'histone H3, les variants réplicatifs H3.1 et H3.2 permettent une incorporation lors de la réplication de l'ADN, tandis que le variant H3.3 est incorporé tout au long du cycle cellulaire. Les données dans la littérature établissent un lien entre H3.3 et la transcription. L'incorporation d'H3.3 dépend d'une voie d'assemblage faisant intervenir le chaperon HIRA. Mon projet de recherche visait à déterminer si H3.3 et son incorporation via HIRA possédaient un rôle spécifique. Le développement embryonnaire via une régulation fine de l'expression des gènes représentait une situation idéale pour aborder ces questions. L'utilisation du vertébré Xenopus laevis qui ne possède qu'un variant H3 réplicatif : H3.2, m'a permis d'évaluer la fonction de ces variants au cours du développement. J'ai pu montrer que, malgré leur similarité, les variants H3.2 et H3.3 ne sont pas interchangeables. Une altération d'expression d'H3.3 ou l'interférence dans sa voie d'assemblage via son chaperon HIRA conduisent à des défauts majeurs à la gastrulation. Ce phénotype s'accompagne d'un défaut d'expression de gènes mésodermiques, dont le marqueur Xbra. Une désorganisation globale de la chromatine est également observée chez ces embryons. Ces données mettent en lumière l'importance de l'incorporation du variant d'histone H3.3 dans la chromatine au cours d'une étape clé du développement embryonnaire, la gastrulation

Au coeur du noyau des cellules eucaryotes se trouve l'ADN génomique organisé en une structure complexe: la chromatine. Cette organisation est essentielle pour la compaction de l'ADN et le maintien d'une identité cellulaire. L'unité de base de la chromatine, le nucléosome, est formé d'un octamère de protéines histones autour duquel s'enroule environ 147 pb de l'ADN. Au cours de ma thèse, mon attention s'est portée sur la protéine chaperon d'histones Asf1, impliquée dans la dynamique de la chromatine. J'ai abordé deux questions essentielles :(1) Quel est le rôle d'Asf1 dans la dynamique des histones au cours de la réplication ? La protéine Asf1 humaine s’associe en complexe avec les histones H3-H4 et les protéines MCMs, l'hélicase putative qui déroule l'ADN lors de la réplication. J'ai montré que la déplétion d'Asf1 par siARN entraîne une progression ralentie de la phase S, ainsi qu'une diminution de la quantité d'ADN simple brin généré en amont de la fourche de réplication par l’activité hélicase. Nous proposons un modèle selon lequel Asf1 participerait au transfert des histones parentales sur les brins filles de l’ADN. (2) Quelles sont les fonctions spécifiques des deux isoformes humaines d'Asf1, Asf1a et Asf1b, au regard de la prolifération cellulaire ? J'ai montré que l'expression d'Asf1b, mais pas celle d'Asf1a, est corrélée avec la prolifération cellulaire et que sa déplétion altère la prolifération. Asf1b est surexprimé dans de nombreux cancers et ceci corrèle avec l'apparition de métastases et une faible survie des patientes. Nous proposons Asf1b comme un nouveau marqueur pronostique et une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le cancer du sein.

La chromatine chez les eucaryotes, porte des informations génétiques et épigénétiques. Les mécanismes garantissant le maintien de ces informations lors de la division cellulaire ou la réparation de l’ADN sont encore mal connus et ils constituent l’enjeu principal du projet de thèse. Plus particulièrement, l’objectif du projet de thèse est de chercher à comprendre comment les chaperons d’histones coordonnent leur action avec des partenaires associés à la fourche de réplication pour conserver les marques épigénétiques portées par les histones parentales et les reporter sur les histones nouvellement synthétisées. Cette thèse décrit précisément comment ASF1 (Anti Silencing Function 1) coopère avec le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et la sous-unité de l’hélicase réplicative MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), pour la prise en charge des H3-H4 dans la réplication et la réparation de l’ADN.La thèse s’intéresse également à la régulation de l’activité de ces chaperons d’histones par des kinases activées suite à des stress réplicatifs ou des dommages de l’ADN. En particulier nous avons cherché à mieux comprendre comment l’ajout de groupements phosphate sur ASF1 par une enzyme appelée TLK (Tousled Like Kinase) module son activité au cours du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l’ADN. La caractérisation de l'importance des sites phosphorylés sur les propriétés de liaison du chaperon, permet de mieux comprendre le rôle joué par différent forme d’ASF1 dans l’assemblage des histones sur l’ADN et le maintien des informations épigénétiques. Le travail de thèse contient d’analyses biochimiques et structurales par une combinaison de techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, RMN, cristallographie des rayons X) et d’analyses fonctionnelles sur des modèles cellulaires
In eukaryotes, chromatin carries both, the genetic and epigenetic information. Mechanisms implicated in maintenance of these information during cell division or DNA repair remain poorly understood and they constitute the main issue of this thesis project. More specifically, the goal of the project is to understand how histone chaperones coordinate their action with partners associated with the replication fork to recognize and preserve the epigenetic marks carried by parental histones and to copy on the newly synthesized histones. The work unravels how ASF1 (Anti-Silencing Function 1) cooperates with the CAF-1 complex (Chromatin Assembly Factor 1) and with the replicative helicase subunit MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), for the management of H3-H4 histones in DNA replication and repair.Moreover, this thesis investigates the regulation of histone chaperones activities by kinases activated after a replicative stress or DNA damage. In particular, we analyzed the consequences of ASF1 phosphorylation by the enzyme called TLK (Tousled like kinase). The activity of TLK is modulated during the cell cycle and after DNA damage. Characterization of the importance of phosphorylated sites on the chaperone binding properties, allows a better understanding of the role played by different forms of ASF1 in the assembly of histones on DNA and maintenance of epigenetic information. The thesis work included biochemical and structural analysis with a combination of different techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, NMR, X-ray crystallography) and functional analysis in cellular models

Chez les eucaryotes, l’ADN s’enroule autour de protéines appelées histones pour former la chromatine. Cette structure permet, d’une part, de compacter le génome dans le noyau, mais également de réguler son expression. En effet, les histones sont porteuses d’information dite « épigénétique » : elles existent sous différentes formes, les variants d’histone, et peuvent porter des modifications post-traductionnelles. La présence de tels variants et modifications organise le génome en domaines au statut transcriptionnel différent.La réplication de l’ADN déstabilise la structure chromatinienne, et représente ainsi un défi pour la cellule qui doit à la fois dupliquer son matériel génétique et transmettre son paysage épigénétique pour garantir le maintien de son identité. Ceci passe par le recyclage des histones parentales, processus essentiel pour transmettre de manière fidèle les variants d’histone et leurs modifications.Au cours de ma thèse, j’ai tenté de répondre à la question : comment les variants d’histone H3.1 et H3.3 sont-ils recyclés au cours de la réplication de l’ADN ? En particulier, je me suis intéressée au rôle du chaperon d’histone Anti-Silencing Function 1 (ASF1) dans ce processus.Mon approche a été de développer une technique de microscopie de super-résolution (STORM) pour visualiser les variants d’histone parentaux précisément aux sites de réplication. Grâce à cette technologie, j’ai pu étudier l’impact de la déplétion d’ASF1 sur le recyclage des histones parentales, apportant ainsi des éléments de compréhension sur les mécanismes fondamentaux qui transmettent l’information épigénétique
In eukaryotes, DNA wraps around proteins called histones to form chromatin. This structure allows, first, the compaction of the genome in the nucleus, but also the regulation of its expression. Indeed, histones can be a source of information referred to as “epigenetic”: they exist under different forms, histone variants, and can have post-translational modifications. The presence of these variants and modifications organizes the genome into domains with different transcriptional status.DNA replication destabilizes chromatin structure and, therefore, represents a challenge for the cell, which must duplicate its genetic material while also transmitting its epigenetic landscape in order to maintain its identity. In this context, recycling parental histones is essential to faithfully transmit histone variants and their modifications.During my PhD, I tried to address the question: how are the histone variants H3.1 and H3.3 recycled during DNA replication? In particular, I investigated the role of the histone chaperone Anti-Silencing Function 1 (ASF1) in this process.My approach was to develop a super-resolution microscopy technique (STORM) to visualize parental histone variants precisely at replication sites. Using this technology, I could study the impact of ASF1 depletion on the recycling of parental histones, and further our understanding of fundamental mechanisms that transmit epigenetic information

Les gènes du groupe Polycomb (PcG) ont été identifiés chez D. Melanogaster. Leur rôle est de maintenir les états réprimés des gènes homéotiques. Les produits des gènes PcG agissent en complexes multi-protéiques, les Polycomb Repressive Complexes, qui interagissent au niveau de la chromatine affectant sa structure. L'objectif du projet a été l'étude structurale du Polycomb Repressive Complex 2 (PRC 2), qui possède une activité histone methyltransferase, spécifique pour la lysine 27 du histone H3. Ce manuscrit décrit les études structurales et fonctionnelles d'une sous-unité de PRC2, une chaperon d'histone Nurf55. Par cristallographie aux rayons X nous avons obtenu la structure atomique de Nurf55 en complexe avec un fragment hélical de l'histone H4 à une résolution de 1. 7Â. Nous avons identifié les acides aminés nécessaires à l'interaction de ces deux protéines puis validé les observations par calorimétrie isotherme à titration (ITC). Nous avons aussi observé que cette même région de Nurf55 interagit avec la partie N-terminale de l'histone H3 et que cette interaction implique deux sites. On a proposé un modèle d'interaction entre Nurf55 et un dimère composé des histones H3 et H4. Finalement, l'interaction de Nurf55 avec la partie N-terminale d'une autre protéine composante de PRC2, Su(z)12, a été charterisée. Cette interaction implique les mêmes résidus de Nurf55 responsables de l'interaction avec les histones H3 et H4. On propose l'hypothèse que Nurf55 interagirait avec une hélice a de la partie N-terminale de Su(z)12 d'une manière similaire qu'avec l'hélice a de l'histone H4 observée dans notre structure atomique
Polycomb genes (PcG) were first discovered by genetic screens in D. Melanogaster, where they act as repressors of key developmental genes, known as homeotic genes. The protein products of PcG genes form large multi protein complexes, called Polycomb Repressive Complexes, which regulate the expression of target genes via modification of the local chromatin structure and probably via direct interaction with the transcription machinery. The objective of the project described here was structural characterization of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), which has a histone methyltransferase activity specific for lysine 27 of histone H3. Ln this manuscript 1 present a high resolution X¬ray structure (1. 7 Â) of one of the PRC2 subunits, the histone-chaperone Nurf55, in complex with a fragment of histone H4. The importance of individual interactions observed in the crystal structure was confirmed by ITC measurements with mutant Nurf55 proteins and mutant H4 peptides. Additionally, a novel interaction between Nurf55 and the N¬terminal tail of histone H3 has been characterized. This interaction is mediated by two binding sites on the surface of Nurf55, one of which overlaps with the H4 binding site. Based on these observations we propose a model of how Nurf55 may bind the dimer of histones H31H4 and perform its role of a histone chaperone. We also found out that in the context of the PRC2 Nurf55 interacts with the N-terminal part ofanother subunit of the complex, protein Su(z)12 and that this interaction is mediated by the same binding pocket of Nurf55"which also mediates the binding of the H4 and H3 peptides

La chaperone d'histones DAXX cible H3.3 à l'hétérochromatine péricentrique et télomérique d'une manière indépendante de la réplication. Le mécanisme qui assure le recrutement de DAXX dans les régions hétérochromatiques est largement inconnu. En utilisant des approches protéomiques et biochimiques, nous montrons qu'en plus du complexe bien connu ATRX/H3/3, DAXX forme un complexe alternatif avec CAF-1, ADNP, HP1 et Trim28. DAXX interagit physiquement avec la partie C-terminal de la sous-unité CAF1-p150 via son domaine N-terminal. Le domaine SIM de DAXX est essentiel à son ciblage aux corps PML et pour le recrutement de CAF-1 au chromosome X et aux éléments répétés. L'inactivation de DAXX entraîne une déplétion importante de CAF-1 des éléments répétés SINEs et LINEs du chromosome X. Nos données révèlent une nouvelle fonction de DAXX et de CAF-1 dans le ciblage de H3.3 au chromosome X
The histone chaperone DAXX targets H3.3 to pericentric and telomeric heterochromatin in a replication independent manner. The mechanism that ensures appropriate recruitement of DAXX to heterochromatic region is largely unknown. Using proteomic and buochemical approaches, we show that in addition to the well-known ATRX/H3.3 complex, DAXX forms an alternative complex with CAF-1, ADNP, HP1 and trim28. DAXX physically interact with the C-terminus of CAF1-p150 subunit through its N-terminal domain. The DAXX SIM domain was found to be essential for targeting DAXX to PML-NBs, for the recruitment of CAF-1 to heterochromatin. Our genomic date further revealed that DAXX targets CAF-1 to X-chromosome and repetitive elements. Inactivation of DAXX results in major depletion of CAF-1 from X-chromosome SINEs and LINEs. Our data point to a novel function of DAXX and CAF-1 in targeting H3.3 to X-chromosome

La ségrégation fidèle des chromosomes est dirigée par le centromère, un locus chromosomique spécialisé qui est requis pour l'assemblage des kinetochores actifs. Les centromères sont marqués épigénétiquement par la présence d'un nucléosome unique qui contient un variant centromérique de l'histone H3 appelé Centromere protein A (CENP-A). Une question fondamentale est comment CENP-A est spécifiquement déposé aux centromères. L'objectif de ma thèse a été d'identifier les facteurs spécifiques de la déposition de CENP-A. Pour identifier les facteurs spécifiques impliqués dans la déposition de CENP-A aux centromères, j'ai utilisé la méthode de purification TAP-TAG à partir d'une fraction nucléaire soluble de cellules HeLa exprimant stablement une copie ectopique de CENP-A (e-CENP-A). J'ai ainsi pu identifié la protéine Holliday Junction Recognition protein (HJURP). En utilisant un siRNA spécifique de HJURP, j'ai montré que la localisation et la déposition de CENP-A étaient fortement affectées. La protéine recombinante HJURP lie de manière stoechiométrique le tétramère CENP-A/H4 mais il ne lie pas le tétramère H3/H4. La liaison se fait grâce à un petit domaine conservé en position N-terminal de HJURP, dénommé CBD (CENP-A binding domain). De plus, j'ai pu mettre en évidence in vitro que HJURP facilitait la déposition du tétramère CENP-A/H4 sur de l'ADN satellite. L'ensemble de mes résultats démontre très clairement que HJURP est la principale chaperone responsable de la déposition de CENP-A aux centromères.

Chez les eucaryotes, l’organisation de la chromatine est indispensable à la régulation de l’expression des gènes et la stabilité du génome. Les ciliés constituent un excellent modèle d’étude des mécanismes qui permettent de maintenir l’intégrité du génome eucaryote. Notre modèle d’étude, l’eucaryote unicellulaire Paramecium tetraurelia, se distingue par l’élimination massive et reproductible de près de 30% de séquences d’ADN germinal lors du développement du macronoyau somatique après les événements sexuels. Ces séquences sont éliminées grâce à un processus en plusieurs étapes impliquant la formation d’hétérochromatine dirigée par de petits ARN suivi d’excision par la transposase domestiquée Piggy Mac (Pgm) et de réparation. Les mécanismes moléculaires permettant de comprendre la reconnaissance spécifique de ces séquences germinales dans le contexte de la chromatine ainsi que la précision de la coupure demeurent mal compris.Le chaperon d’histone Spt16, associée au partenaire Pob3, fait partie du complexe hétéro-dimérique FACT (FAcilitates Chromatin Transactions). FACT intervient dans de nombreux mécanismes liés au métabolisme de l’ADN tels que la transcription, la réparation, la réplication ou l’accessibilité de la chromatine. Chez Paramecium tetraurelia, on a identifié deux protéines homologues de Spt16 et Pob3 exprimées uniquement durant le développement du macronoyau au moment où se produisent les réarrangements. Les protéines Spt16-1 et Pob3-1 fusionnées à la GFP se localisent dans les macronoyaux en développement. Nous avons montré que la protéine Spt16-1 est essentielle à la production d’une descendance sexuelle viable. Le reséquençage du génome après inactivation de SPT16-1 a montré que Spt16-1 est nécessaire à l‘ensemble des réarrangements du génome et conduit à des défauts semblables à ceux obtenus suite à l’inactivation de PGM. Spt16-1 agit en aval des voies de dépôt des marques d’hétérochromatine guidées par les petits ARNs mais en amont de l’endonucléase Pgm. Nous avons montré que Spt16-1 était nécessaire à la localisation correcte de Pgm responsable de l’introduction des cassures double brin dans les macronoyaux en développement. Nous proposons un modèle dans lequel Spt16-1 favorise l’interaction de la machinerie d’excision avec la chromatine pour rendre accessible les sites de coupure sur l’ADN à Pgm.La méthylation des adénines sur l’ADN (6mA), bien connue chez les bactéries pour son rôle dans le système de restriction modification, a été décrite ces deux dernières années chez plusieurs eucaryotes en faible proportion dans le génome. Cependant son rôle chez les eucaryotes est encore peu compris. D’anciennes analyses par chromatographie à l’aide de nucléotides marqués détectaient de l’ordre de 2,5% des adénines méthylées chez P. tetraurelia mais sa localisation précise n’avait jamais été montrée. Il avait été proposé que cette modification pourrait signaler avec précision les sites de coupures pendant les réarrangements d’ADN où une partie des séquences germinales présentent des bornes AT. L’abondance des adénines méthylées fait de la paramécie un excellent modèle d’étude de cette modification. En combinant des techniques d’Immunofluorescence, d’HPLC-MS et de séquençage, nous avons ainsi décrit la présence et la localisation dans la cellule et au cours du cycle de vie de 6mA chez P. tetraurelia. Ces approches ont également permis de montrer l’absence de cytosine méthylée chez la paramécie. Nous avons montré que la méthylation des adénines était retrouvée majoritairement dans le génome somatique et de manière transitoire dans le génome germinal. Elle est établie au cours du développement du macronoyau somatique quand se produisent les réarrangements du génome. Ces résultats préliminaires permettront de poursuivre l’étude de la méthylation afin d’identifier les enzymes responsables et son rôle dans la cellule
In eukaryotes, chromatin organization is required for the regulation of gene expression and genome stability. Ciliate provide excellent model to study mechanisms involved in maintain of genome integrity. Our study model, the unicellular eukaryote Paramecium tetraurelia, has the particularity to eliminate massively and reproducibly 30% of germinal DNA sequences during the development of the somatic macronucleus after sexual events. Those sequences are eliminated by a multi-step process involving small RNA-directed heterochromatin formation followed by DNA excision by the domesticated transposase Piggy Mac (Pgm) and DNA repair. Molecular mechanisms underlying the specific recognition of those germinal sequences in chromatin context and the precision of the excision, remain elusive. The histone chaperone Spt16, associated to its partner Pob3, is part of the heterodimeric complex FACT (FAcilitates Chromatin Transactions). FACT is implicated in many mechanisms involving DNA metabolism such as transcription, repair, replication or chromatin accessibility. In P. tetraurelia, we identified two homologous proteins to Spt16 and Pob3 expressed only during macronucleus development at the time when genome rearrangements occur. Spt16-1 and Pob3-1 fused to GFP are localized in developing macronuclei. We showed that Spt16-1 is required to obtain a viable sexual progeny. Genome re-sequencing after SPT16-1 inactivation showed that Spt16-1 was required for all DNA elimination events and leads to similar phenotypes and defects to those obtained after PGM inactivation. Spt16-1 acts downstream of small RNA-directed heterochromatin formation and upstream of Pgm. We showed that Spt16-1 was required for the correct localization of Pgm responsible for DNA double strand breaks in developing macronuclei. We proposed a model in which Spt16-1 mediates interaction between chromatin and excision machinery that facilitates access to DNA cleavage sites for the Pgm endonuclease. Adenine DNA methylation, well known in bacteria for its role in restriction modification system, has been described during the last two years in several eukaryotes but in low proportion in the genome. However, its role in eukaryotes remains elusive. Previous analyses by chromatography with radio labelled nucleotides detected around 2,5% of methylated adenine in P. tetraurelia but its precise localization and role have never been analyzed. It has been proposed that this modification could mark with precision the excision sites during genome rearrangements when part of the eliminated sequences carry AT boundaries. The abundance of methylated adenine makes of Paramecium an excellent model to study this modification. Combining immunofluorescence techniques, HPLC-MS and sequencing, we described the presence and the cellular localization during life cycle of 6mA in P. tetraurelia. Those approaches allowed us to show that methylated cytosine are absent in Paramecium. We showed that methylation is mainly found in the somatic genome and transiently in germinal genome. It appears during somatic macronucleus development when genome rearrangements occur. Those preliminary results will allow us to pursue the study of adenine methylation by identifying responsible enzymes and its role in the cell

Dans les cellules eucaryotes, la réponse aux lésions de l'ADN s'accompagne d'une réorganisation de la chromatine. Cette structure, associant l'ADN aux protéines histones, est porteuse de l'information épigénétique, qui définit l'identité cellulaire. Cependant, nos connaissances concernant les mécanismes impliqués dans la réorganisation de la chromatine dont l'intégrité structurale et fonctionnelle a été menacée par un stress génotoxique sont encore limitées, en particulier dans les cellules humaines. Au cours de ma thèse, je me suis donc intéressée à cette thématique en me concentrant sur l'étude de la dynamique des variants de l'histone H3 et de leurs chaperons associés après dommages UVC. En combinant une technologie innovante de suivi spécifique des histones parentales ou néo-synthétisées à des techniques de pointe d'induction de dommages locaux dans l'ADN, j'ai ainsi mis en évidence que le chaperon HIRA (Histone Regulator A) est recruté tôt aux sites de lésions où il stimule l'incorporation locale de nouveaux variants H3.3 et assure la reprise de la transcription après réparation des dommages UVC. Nous avons aussi démontré que les anciennes histones sont initialement redistribuées dans la chromatine autour des sites de lésions par un mécanisme faisant appel au facteur de détection des dommages DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). A plus long terme, des histones parentales " reviennent " dans les régions de chromatine en cours de réparation où elles se mélangent aux nouvelles histones incorporées. Le " retour " d'histones préexistantes contribuerait ainsi au maintien de l'intégrité de l'information épigénétique véhiculée par la chromatine avant stress génotoxique
In eukaryotic cells, the DNA damage response involves a reorganization of chromatin structure. This structure, in which DNA is associated with histone proteins, conveys the epigenetic information, which is critical for cell identity. However, we are still far from understanding the mechanisms underlying chromatin dynamics in response to DNA damage, which challenges both the structural and functional integrity of chromatin architecture. During my PhD, I thus decided to explore this issue in human cells, by deciphering the dynamics of histone H3 variants and their dedicated chaperones in response to UVC lesions. By combining local UVC irradiation with an innovative technology that allows specific tracking of parental and newly synthesized histones, I revealed that the histone chaperone HIRA (Histone Regulator A) is recruited early to UVC-damaged chromatin regions, where it promotes local deposition of new histone H3.3 variant and facilitates transcription recovery upon repair completion. We also demonstrated that old H3 histones are initially redistributed around the damaged chromatin zone, this conservative redistribution requiring the UVC damage sensor DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). Later in the repair process, most parental histones recover and mix with newly deposited histones in repairing chromatin regions. The recovery of pre-existing histones may contribute to preserve the integrity of the epigenetic information conveyed by chromatin before genotoxic stress

Au cours de la méiose, des centaines de cassures doubles brins (CDB) sont générées et réparées par recombinaison homologue. Ces CDB peuvent être réparés par deux voies différentes donnant lieu à des crossing-overs (CO) ou des non crossing-overs (NCO). Le choix entre les deux voies est finement régulé pour assurer un nombre suffisant de CO; les facteurs influençant ce choix n’ont pas encore été bien caractérisés. L’environnement chromatinien pourrait jouer un rôle important dans ce processus.Peu d’études ont été réalisées sur l’influence de la chromatine sur la recombinaison méiotique. Le but de ma thèse a été de caractériser les facteurs chromatiniens nécessaires au remaniement de la chromatine pendant la recombinaison méiotique chez Saccharomyces cerevisiae.J’ai pu montrer que CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et Hir (Histone Regulator), deux protéines chaperons capables de réassembler les histones, s’associent aux sites de cassures doubles brins méiotiques lors de la recombinaison. L’absence de CAF-1 et Hir n’a pas d’effet sur la progression et la formation de CO. Cependant, par des études de recombinaison sur l’ensemble du génome, j’ai pu observer que l’absence de CAF-1 tend à réduire l’interférence des CO. Ce résultat suggère que CAF-1 pourrait être un des facteurs régulant la réparation au cours de la recombinaison méiotique. Pour finir, je me suis aussi intéressée à un troisième chaperon d’histone H3/H4, Asf1. J’ai aussi pu montrer que la délétion d’un autre chaperon Asf1 (Anti-silencing Function 1) entraîne des défauts de progression méiotique et de formation des spores.Ce travail aide à mieux comprendre l'impact de la chromatine sur la réparation de la méiose et le rôle des facteurs d'assemblage de la chromatine
During meiosis, hundreds of programmed double strand breaks (DSB) are generated and repaired by homologous recombination. Meiotic DSB can be repaired by two major alternative pathways, which generate either crossing-over (CO) or non-crossing-over (NCO) products. The choice between the two repair pathways is tightly controlled to ensure sufficient and accurate CO formation. The chromatin environment could play a crucial role in this process that has not been elucidated yet. Little information is available about the importance of chromatin factors for meiotic recombination. The aim of my PhD was to study chromatin factors necessary for chromatin dynamic during meiotic recombination. I have shown that CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) and Hir (Histone Regulator), two chaperone proteins that are able to incorporate histones into chromatin, associate with DSB sites during meiotic recombination. CAF-1 and Hir deletion have no effect on the outcome of meiosis and CO formation. However, by genome-wide recombination studies, I have observed that the absence of CAF-1 histone chaperone results in a slight decrease in CO interference. The result suggests that CAF-1 could be one of the factors regulating DNA repair during meiotic recombination. Finally, I have also studied another H3/H4 chaperone, Asf1 (Anti-silencing Function1). Asf1 deletion gives rise to a defect in meiotic progression and spore formation. This work helps to better understand the impact of chromatin on meiotic repair and the role of chromatin assembly factors

L'établissement de latence du virus de l'Herpès simplex 1 (HSV1) est contrôlé par les corps nucléaires PML (PML-NBs) mais leur implication exacte reste encore confuse. Une des caractéristiques majeures de la latence du virus est l'interaction entre le génome viral et les PML-NBs formant des structures nommées viral DNA-containing PML-NBs (vDCP-NBs). L'utilisation d'un modèle d'infection de fibroblastes primaires humains, qui reproduit la formation des vDCP-NBs, combinée à une approche par immuno-FISH, a permis de montrer que les vDCP-NBs contiennent l'histone H3.3 et ses chaperons, les complexes DAXX-ATRX et HIRA. La protéine HIRA a été également observé au sein des vDCP-NBs dans les neurones des ganglions trijumeaux de souris infectées par HSV1. Des expériences de ChIP-qPCR dans des cellules exprimant H3.3 ou H3.1 tagguées, nous a permis de déterminer que le génome viral est spécifiquement chromatinisé avec l'histone H3.3. La déplétion d'une seule protéine des complexes chaperons de H3.3 affecte légèrement l'incorporation de H3.3 dans les génomes viraux latents. Au contraire, l'absence de PML diminue significativement la chromatinisation H3.3 du génome HSV-1 latent sans remplacement par H3.1. Cette étude démontre une régulation épigénétique du génomes HSV1 latent par une chromatinisation dépendante de H3.3 impliquant les complexes chaperons DAXX-ATRX et HIRA. De plus, cette étude révèle un rôle majeur des PML-NBs dans la chromatinisation H3.3 des génomes HSV1 latent
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) latency establishment is tightly controlled by PML nuclear bodies (PML-NBs) although their exact implication is still elusive. A hallmark of HSV-1 latency is the interaction between latent viral genomes and PML-NBs leading to the formation of viral DNA-containing PML-NBs (vDCP-NBs). Using a replication defective HSV-1 infected human primary fibroblast model reproducing the formation of vDCP-NBs, combined with an IF-FISH approach developed to detect latent HSV-1, we show that vDCP-NBs contain both histone H3.3 and its chaperone complexes, i.e. the DAXX/ATRX and the HIRA complex. HIRA was also detected co-localizing with vDCP-NBs present in trigeminal ganglia neurons from HSV-1 infected WT mice. ChIP-qPCR performed on fibroblasts stably expressing tagged H3.3 or H3.1 show that latent HSV1 genomes are chromatinized almost exclusively with H3.3. Depletion of single proteins from the H3.3 chaperone complexes only mildly affects H3.3 deposition on the latent HSV1 genome. In contrast, absence of PML significantly impacts on the chromatinization of the latent genomes with H3.3 without replacement with H3.1. Consequently, the study demonstrates a specific epigenetic regulation of latent HSV-1 through an H3.3-dependent HSV-1 chromatinization involving both H3.3 chaperones DAXX/ATRX and HIRA complexes. Additionally, the study reveals that PML-NBs are major actors of the latent HSV-1 H3.3 chromatinization through a PML-NBs/histone H3.3/H3.3 chaperones axis

Dans ce travail, nous avons étudié en détails l'interaction de l'histone H1 avec l'ADN nucléosomal afin de comprendre comment cette interaction conduit à l'organisation en fibre nucléosomale. Nous avons pu résoudre ce problème ancien par l'utilisation de : (i) l'incorporation de H1 par une chaperonne d'histone physiologique, NAP-1, (ii) la reconstitution de nucléosomes parfaitement homogènes sur une matrice d'ADN contenant la séquence 601 fortement positionnante, (iii) une combinaison de cryo-microscopie électronique (EC-M) et de technique d'empreinte aux radicaux OH°, (iv) une modélisation mécanique du polymère ADN de type « coarse-grain ». Notre « cartographie » par empreinte OH° de résolution d'un nucléotide montre que le domaine globulaire de H1 (GH1) interagit à travers le petit sillon avec des « patch » d'ADN de 10 pb de part et d'autre de la dyade du nucléosome. De plus, GH1 organise environ un tour d'hélice d'ADN de chaque ADN de liaison du nucléosome. En même temps, une suite de 7 acides aminés (120-127) de la partie COOH-terminale est requise pour la formation de la structure en tige de l'ADN de liaison
In this work we have been able to dissect how histone H1 interacts with the nucleosomal DNA and to understand how this interaction leads to the spatial organization of the nucleosomal templates. We have solved this long-stayed problem in the field thanks to the use of: (i) physiologically relevant linker histone chaperone NAP-1 assisted deposition of histone H1, (ii) 601 DNA sequence for reconstitution a strongly positioned nucleosomes, (iii) a combination of electron cryo-microscopy with OH0 footprinting techniques and, (iv) Coarse-grain DNA mechanics. The one base pair resolution mapping by OH0 footprinting showed that the globular domain of histone H1 (GH1) interacts, through the minor groove of DNA, with 10 bp localized symmetrically to the nucleosomal dyad. In addition, GH1 organizes nearly one helical turn of DNA from both linkers of the nucleosome. A row of seven AA (120-127) of the COOH-terminus of histone H1 was required for the formation of the stem structure of the linker

Dans ce travail, nous avons étudié en détails l'interaction de l'histone H1 avec l'ADN nucléosomal afin de comprendre comment cette interaction conduit à l'organisation en fibre nucléosomale. Nous avons pu résoudre ce problème ancien par l'utilisation de : (i) l'incorporation de H1 par une chaperonne d'histone physiologique, NAP-1, (ii) la reconstitution de nucléosomes parfaitement homogènes sur une matrice d'ADN contenant la séquence 601 fortement positionnante, (iii) une combinaison de cryo-microscopie électronique (EC-M) et de technique d'empreinte aux radicaux OH°, (iv) une modélisation mécanique du polymère ADN de type « coarse-grain ». Notre « cartographie » par empreinte OH° de résolution d'un nucléotide montre que le domaine globulaire de H1 (GH1) interagit à travers le petit sillon avec des « patch » d'ADN de 10 pb de part et d'autre de la dyade du nucléosome. De plus, GH1 organise environ un tour d'hélice d'ADN de chaque ADN de liaison du nucléosome. En même temps, une suite de 7 acides aminés (120-127) de la partie COOH-terminale est requise pour la formation de la structure en tige de l'ADN de liaison.