Dissertationen zum Thema „Cellules – Vieillissement – Génétique“

Après un certain nombre de divisions, les cellules primaires entrent en sénescence, un état caractérisé par des modifications morphologiques, biochimiques et un arrêt de croissance. Deux principaux mécanismes concourent à l'établissement de la sénescence: le raccourcissement Après un certain nombre de divisions, les cellules primaires entrent en sénescence, un état caractérisé par des modifications des télomères et l'accumulation de dommages oxydants. La sénescence est généralement considérée comme une barrière au développement tumoral. Nous montrons dans ce travail que la sénescence pourrait aussi contribuer à l'initiation cancéreuse. En effet, dans des cultures de kératinocytes sénescents nous observons l'émergence systématique de cellules transformées et tumorigènes. Ces cellules se forment à partir d'une fraction de cellules sénescentes, par un mécanisme de mitose atypique. La sénescence des kératinocytes s'accompagne d'une accumulation de dommages oxydants mutagènes (cassures simple brin, guanines oxydées et pontages moléculaires). Par ailleurs, les télomères ne sont que très peu érodés et les voies d'arrêt dans le cycle cellulaire induites par les cassures double-brin ne sont pas activées. Pour comparaison, dans les fibroblastes, qui n'émergent jamais, on observe à la sénescence moins de dommages oxydants dans le noyau, des télomères devenus très courts et l'activation des voies d'arrêt dans le cycle. Ainsi, l'émergence résulterait de l'effet mutagène du stress oxydant associé et nécessiterait des télomères suffisamment longs. En conclusion, nous mettons en évidence dans ces travaux un nouveau mécanisme potentiel de cancérisation des cellules épithéliales, dans lequel la sénescence constituerait l'étape initiale et le stress oxydant jouerait le rôle de carcinogène endogène
After a finite number of divisions, primary cells enter senescence, a state characterized by morphological and biochemical modifications, and by cell cycle arrest. Two mains events promote the establishment of senescence: telomere shortening and cumulative oxidative stress. Senescence is generally considered as a barrier against tumorigenesis. We show in this work that senescence could also contribute to the cancerous initiation. Indeed, in culture of senescent keratinocytes we observe the systematic emergence of transformed and tumorigenic cells. These cells arise from a fraction of the senescent cell population, by a mechanism of atypical mitosis. Keratinocyte senescence is accompanied by an accumulation of mutagenic oxidative damages (single-strand breaks, oxidized guanines, and cross-linkings). ln addition, telomeres are weakly eroded and cell cycle arrest pathways induced by double-strand breaks are not activated. ln comparison, in fibroblasts, which never emerge, we observe less oxidative damages in nucleus, very short telomeres, and the activation of cel! cycle arrest pathways. Hence, emergence would result from mutagenic oxidative stress and would require enough long telomeres. ln conclusion, we highlight in this work a new potential mechanism of epithelial cel! carcinogenesis, wherein senescence would constitute the initial step and oxidative stress would act as an endogenous carcinogen

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques, localisés à l’extrémité de l’ADN des cellules eucaryotes, qui préservent l’intégrité des chromosomes. Ces structures subissent des changements au cours du développement et du vieillissement, comme un raccourcissement de leurs tailles ou une altération dans leur composition en protéines (notamment le complexe shelterin). Cependant, les télomères n’ont pas qu’une fonction protectrice et peuvent aussi réguler l’expression des gènes présent dans les régions adjacentes, i.e. subtélomères, voir plus distantes. Ce processus est connu comme l’Effet de Position Télomérique (TPE), découvert initialement chez la levure Saccaromyces cerevisiae, puis chez la drosophile et Schizosaccharomyces pombe et plus récemment chez l’humain. Dans ces organismes, les gènes situés en position subtélomérique sont réprimés par un mécanisme épigénétique qui est dépendant de la taille des télomères et des protéines les composant ainsi que des structures tridimensionnelles adoptées par la chromatine télomérique et subtélomérique. Le TPE peut être décrit comme un mécanisme de propagation de l’hétérochromatine, du télomère vers le centromère, accompagné de boucle de chromatine permettant d’étendre la répression de la transcription dans des régions plus interne.Dans ce contexte, le but de ma thèse est de déterminer l’impact des télomères sur les changements transcriptionnels observés lors de la sénescence cellulaire. A cette fin, nous avons séquencé les ARNm de fibroblastes de poumon (MRC-5) jeunes et sénescents (RNAseq). Nous avons observé un enrichissement subtelomérique des gènes dont l’expression est augmentée en sénescence. Ce résultat suggère une levée de la répression induite par le TPE à la sénescence. Cette dérépression ne concerne que certains gènes et certains subtélomères.Nous avons aussi testé l’hypothèse que les protéines shelterin puissent prendre part au TPE, notamment TRF2 (Telomeric Repeat Binding Factor 2) dont l’expression est diminuée à la senescence. Nous avons donc augmenté le niveau d’expression de TRF2 dans les cellules sénescentes. Ainsi, nous avons pu observer que TRF2 modulait l’expression de certains gènes subtélomériques dans les cellules sénescentes. Par 3D-FISH, nous avons montré que cet effet de TRF2 s’accompagnait d’un remodelage spatial des subtélomères.Dans son ensemble, ce travail révèle la contribution des télomères au programme transcriptionnel des cellules sénescentes et jette ainsi les bases de l’importance du TPE dans le processus de la senescence
Telomeres, the nucleoprotein structures located at the end of eukaryotic DNA, protect chromosomal integrity. These structures undergo changes during development and aging, including length shortening and alterations in the levels of the proteins associated to them called sheltering, all this affecting genome stability as the cells age. However, telomeres also behave as transcriptional regulators acting not only on genes present at subtelomeres but also on more distantly located genes presented throughout the genome. This process is referred as Telomere Position Effect (TPE) and was initially discovered in budding yeast, but also seen in drosophila, fission yeast, plasmodium and more recently in humans. In all these organisms, genes located in the subtelomeres are repressed by an epigenetic mechanism that is dependent on telomere DNA length, telomere nucleoprotein composition and higher order chromatin organization adopted by telomeres and subtelomeres. The TPE mechanism can be described as the spreading of a heterochromatin-like structure toward the centromere most likely accompanied by the formation of large chromatin loops to further extend the transcriptional regulation emanating from a telomere to genes internally located.In this context, the goal of my thesis is to decipher whether telomeres are involved in the transcriptional remodelling occurring in human cellular senescence. For that, we performed RNA-sequencing in young versus replicative senescent lung fibroblast MRC-5 cells. Interestingly, we found an enrichment of upregulated genes in the subtelomeric regions of senescent cells suggesting a TPE alleviation. This alleviation is not homogeneous in the genome, as only some subtelomeres were enriched in upregulated genes at senescence.Finally, we tested the hypothesis that shelterin proteins may also be part of the TPE regulation. For that, we re-stored the levels of the shelterin protein TRF2 (Telomeric Repeat Binding Factor 2) whose expression is decreased as the cells approach senescence. We found that TRF2 is indeed modulating the expression of subtelomeric genes in senescent cells, and this is in part mediated by a long-range chromatin reorganization of subtelomeres as observed by conformation changes in 3D chromatin conformation by FISH.Overall, this work reveals the contribution of telomeres in the transcriptional program of senescent cells and set the basis for the relevance of TPE in the senescence/aging process

Les hélicases sont des enzymes ubiquitaires catalysant la séparation de l’ADN double-brin et impliquées dans la réplication, la réparation de l’ADN et dans le maintien des télomères. Chez l’Homme, 3 hélicases présentent des mutations responsables de syndromes cliniques : WRN pour le syndrome de Werner, BLM pour le syndrome de Bloom et RECQL4 pour le syndrome de Rothmund-Thomson. Tous ces syndromes associent un vieillissement pathologique accéléré à un risque accru de développement de cancer notamment par une augmentation de l’instabilité génomique. Les connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces maladies du vieillissement sont encore très partielles, notamment en ce qui concerne le lien entre l’instabilité génomique et le vieillissement. Au cours de ce projet, l'utilisation de prélèvements sanguins et cutanés de patients atteints de ces pathologies rares a permis de générer des modèles de cellules souches pluripotentes induites (iPS). Ces cellules présentent l’avantage de s’auto-renouveler et de pouvoir théoriquement se différencier dans tous les types cellulaires d’un organisme. Parallèlement, un témoin de sénescence a été généré de la même manière avec des cellules d’un patient souffrant du syndrome de la progéria de Hutchinson-Gilford. Après caractérisation de ces cellules, nous avons identifié des ensembles de phénotypes cellulaires et moléculaires dans le but de récapituler in vitro les pathologies. Nous avons également engagé les cellules iPS dans des voies de différenciation proches des tissus atteints dans les pathologies in vivo. Enfin, nous avons étudié la stabilité génomique de ces lignées dans les différents types cellulaires cultivés. Ainsi nous avons observé que la lignée Bloom est le siège de recombinaisons particulièrement fréquentes et est caractérisée par une instabilité du génome dans tous les types cellulaires étudiés. Egalement, la lignée Werner semblerait se distinguer par une instabilité de ses télomères. Enfin, l’ensemble des lignées des pathologies du vieillissement prématuré présenterait un défaut mitochondrial
Helicases process the double-stranded DNA dissociation. They are involved in replication, DNA repair and maintenance of telomeres. In human, 3 helicases display mutations responsible for clinical syndromes: WRN for the Werner syndrome, BLM for the Bloom syndrome and RECQL4 for the Rothmund-Thomson syndrome. All these diseases cause premature ageing and high risk of cancer. Molecular and cellular mechanisms involved in these diseases are not well defined. Particularly, little is known concerning the link between genomic instability and ageing. During this project, we used blood samples and skin biopsies of affected patients to generate models by reprogramming cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs). These cells have the advantage of self-renewing and theoretically could be differentiated in all cell types. At the same time, an iPSC senescence control was performed from cells of a Hutchinson-Gilford Progeria syndrome patient. iPSCs were characterized for pluripotency. In the aim of recapitulate these pathologies in vitro, we identified sets of cellular and molecular phenotypes. We also engaged differentiation of iPSCs in cell pathways closed to the affected tissues in vivo. Finally, we studied the genomic stability of iPSCs and derived cells. We observed that Bloom cells are susceptible to frequent recombinations and are characterized by a genome instability through all studied cell types. Werner cells showed an instability of telomeres length. Finally, all premature ageing diseases displayed mitochondrial defects

Activée dans les stades précoces du développement tumoral, la sénescence empêche la progression tumorale en induisant un arrêt de prolifération cellulaire. Ainsi, tout comme l’apoptose, ce mécanisme doit être altéré pour qu’une cellule devienne tumorale. Malgré ce rôle crucial de protection contre la progression tumorale, nous connaissons peu les mécanismes moléculaires qui régulent l’échappement à la sénescence. A l’aide d’une banque de shRNA ciblant 8000 gènes, nous avons réalisé un criblage génétique dans le but d’isoler de nouveaux régulateurs, qui lors qu’ils sont inhibés, favorisent un échappement à la sénescence. Ce criblage nous a ainsi permis d’isoler PLA2R1 comme un nouveau régulateur de la sénescence. Nous avons montré que ce gène régulait la sénescence par l’activation du gène suppresseur de tumeurs p53. Un deuxième travail nous a ensuite permis d’identifier PLA2R1 comme un nouveau gène suppresseur de tumeurs. Dans un futur proche PLA2R1 pourra, peut-être, être utilisé comme bio-marqueur. De plus nous avons récemment démontré que cette protéine pourrait avoir un potentiel à visée thérapeutique étant donné son potentiel d’action sur les cellules tumorales. L’ensemble de ces travaux nous ont donc permis d’isoler PLA2R1 comme un nouveau régulateur de la sénescence et gène suppresseur de tumeurs
Activated in early stages of tumorigenesis, senescence, by blocking proliferation, inhibits tumour growth. Therefore, just like other fails safe mechanisms such as apoptosis, its escape is a property that cancer cell acquire. Although senescence plays a crucial role in tumour suppression and blockade, there is still much to learn about the mechanisms regulating this phenomenon. Using a shRNA library targeting 8000 human genes, we performed a loss of function genetic screen in order to identify genes that when down-regulated, would allow a senescence escape. Using this strategy, we were able to identify PLA2R1 as a novel regulator of cellular senescence by modulating the activation of the p53 tumour suppressor gene. In a second work, we demonstrated that PLA2R1 is a candidate tumour suppressor gene. In the future, PLA2R1 might be used as a biomarker. Finally, we have demonstrated that PLA2R1 could have therapeutic potential as it induces apoptosis in a myriad of cancer cell lines. Altogether, the work performed during my thesis as enabled us to identify PLA2R1 as a novel cellular senescence regulator and a putative new tumour suppressor gene with therapeutic potential

La première molaire inférieure est un modèle utilisé dans l'étude des interactions épithélio-mésenchymateuses contrôlant la morphogenèse et les cytodifférenciations. Dans certains cas pathologiques, ces interactions sont altérées, ce qui conduit à des anomalies de l'odontogenèse. La mutation Tabby chez la souris est homologue de celle conduisant à la dysplasie ectodermique hypohidrotique liée à l'X chez l'homme. Chez la souris comme chez l'homme, la mutation entraîne des anomalies du nombre, de la taille et de la forme des dents. Nous avons étudié les conséquences de la mutation Tabby sur la dentition molaire de la mâchoire inférieure chez la souris. Cette mutation affecte la morphologie coronaire et nous avons mis en évidence l'existence de plusieurs morphotypes avant et après la naissance. Le nombre de molaires par demi-mâchoire et la morphologie des dents permettent de distinguer deux morphotypes de base. Le morphotype I est caractérisé par la présence de trois molaires au lieu de deux pour le morphotype II. Ces morphotypes ont été retrouvés pendant la période embryonnaire par reconstructions 3D des composantes épithéliales et mésenchymateuses. Ils sont reconnaissables à partir du jour 15. 5 du développement et semblent résulter d'altérations de la segmentation mesio-distale de l'épithélium dentaire. Le patron des cuspides est très différent chez Tabby de ce qu'il est chez les contrôles. L'enamel-knot (EK) primaire, structure épithéliale transitoire exprimant des molécules de signalisation, est impliqué dans le contrôle de la morphogenèse coronaire. Les cellules hors cycle de l'épithélium dentaire interne de l'EK semblent jouer le rôle d'organisateurs des unités morphogénetiques (OUM) que sont les cuspides. Nous avons étudié le devenir de ces cellules après incorporation de BrdU in vivo chez des embryons contrôles et Tabby. Dans les deux cas, nous avons observé une ségrégation des zones BrdU-négatives à partir de l'EK primaire. Le patron cuspidien étant modifié chez Tabby, la géométrie de la ségrégation doit être altérée. Notre étude préliminaire n'en a pas apporté d'évidence claire pour le morphotype Ib, mais elle devra être étendue aux autres morphotypes. La comparaison des patrons de ségrégation des OUM, de l'apparition des cuspides et de différenciation des odontoblastes nous a permis de confirmer l'altération de la segmentation mésio-distale de l'épithélium dentaire chez le mutant Tabby
The first lower molar is used as a model to investigate the epithelial-mesenchymal interactions, which control the morphogenesis and cytodifferentiations. In some pathological instances, these interactions are altered, leading to anomalies in odontogenesis. The Tabby mutation in the mouse is homologous to this leading to the X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia in man. In the mouse as in man, the mutation leads to defects in the tooth number, size and shape. We have investigated the consequences of the Tabby mutation on the molar dentition in the mandible. This mutation alters the crown morphology and we have shown the existence of several morphotypes both postnatally and prenatally. Depending on the number and shape of the molars present in each lower quadrant, we have distinguished two basic morphotypes. The morphotype I is caracterized by the presence of three molars instead of two molars in the morphotype II. These morphotypes have been characterized in the embryo after 3D reconstructions of the enamel organs and dental papillae. They were identified from ED15. 5 and seem to result from an altered mesio-distal segmentation of the dental epithelium. The cusp pattern is different in Tabby vs control mice. The primary enamel knot (EK), a transitory epithelial structure expressing signaling molecules, plays a role in the control of crown morphogenesis. Non-dividing or slow-cycling inner dental epithelial cells of the EK might play a role of organizers of morphogenetic units (OMU): the cusps. The distribution pattern of these cells was investigated after in vivo incorporation of BrdU in control and Tabby embryos. In both cases there was a segregation of BrdU-negative areas from the primary EK. Since the cusp pattern is altered in Tabby, there should be a modification in the pattern of segregation. Our preliminary observations did not bring a clear evidence for that in the morphotype Ib. This study will have to be extended to the other morphotypes. Nevertheless, the comparison of the pattern of segregation of the OMU with that of cusp formation and that of odontoblast differentiation supported the hypothesis of an altered mesio-distal segmentation of the dental epithelium in Tabby

Parmi les processus conduisant au vieillissement, le raccourcissement des télomères est le seul clairement programmé au cours du développement dans de nombreux vertébrés. Ceci est dû au problème de réplication observé à chaque division cellulaire. Les télomères sont composés par des répétitions d’ADN (T2AG3), d’un complexe de protéines spécifique (shelterin), d’un ARN non-codant (TERRA) et d’un ensemble de facteurs ayant des fonctions dans les mécanismes de réparation et de réplication. Chez l’humain, le complexe shelterin est composé de six protéines dont TRF2 (telomere repeat-binding factor 2) qui permet la formation d’une boucle d’ADN (t-loop), qui cache l’extrémité des chromosomes d’une activation non voulue de la réponse à l’ADN endommagé. Étant donné que les cellules post-mitotiques différentiées ne se divisent pas, le rôle des télomères dans ces cellules a été longtemps négligé. Donc pendant ma thèse, je me suis intéressée au rôle des télomères dans les cellules musculaires squelettiques différentiées.Dans la première partie de mon projet, j’ai contribué à un travail déterminant que l’expression de TRF2 diminue dans le muscle squelettique humain, cette diminution commençant chez le jeune adulte. Par la suite, j’ai étudié les conséquences d’une inhibition de l’expression du gène codant pour TRF2 (TERF2) dans les cellules musculaires squelettiques différentiées. Contrairement à ce que l’on aurait pu s’attendre, l’inhibition de TRF2 n’expose pas les télomères aux facteurs de reconnaissance et de réparation de l’ADN endommagé. Ceci est observé dans des cellules musculaires humaines en cultures (myotube) et dans les cellules musculaires d’un modèle de souris où le gène TERF2 est invalidé spécifiquement dans les cellules musculaires squelettiques différentiées. Nonobstant, ces cellules musculaires privées de TRF2 développent un phénotype de dysfonctionnement mitochondrial avec une augmentation du contexte oxydatif qui s’explique, au moins en partie, par un rôle de TRF2 dans l’expression de la sirtuine mitochondriale SIRT3. Dans la deuxième partie de mon travail de Thèse, j’ai étudié les mécanismes de protection des télomères dans les myotubes privés de TRF2. J’ai pu mettre en évidence un rôle non-canonique du facteur de longévité FOXO3a dans la protection de ces télomères dépourvus de TRF2. Enfin, dans la troisième partie de mes études, j’ai caractérisé le modèle de souris d’inhibition de Terf2 spécifiquement dans la fibre musculaire mature. Cette inhibition entraîne, chez les femelles, un retard dans le vieillissement des cellules musculaires squelettiques associé à une légère augmentation de la force musculaire et un rallongement de leur longévité.En résumé, mes résultats ont révélé dans les cellules musculaires squelettiques différentiées un mécanisme inédit de protection des télomères impliquant un rôle non-canonique de FOXO3a, une connexion entre le facteur shelterin TRF2 et le fonctionnement des mitochondries ainsi qu’une fonction paradoxale deTRF2 dans le vieillissement musculaire et la longévité. Je discute ces résultats dans le contexte d’un continuum développement-vieillissement
Among the processes leading to aging, telomere shortening is the only one normally programmed during development in many vertebrates. This is due to the replication problem observed at each round of replication. Telomeres are composed of DNA repeats (T2AG3), a specific protein complex (shelterin), a non-coding RNA (TERRA) and a set of factors having functions in DNA repair and of replication. In humans, the shelterin complex is composed of six proteins including TRF2 (telomere repeat-binding factor 2) which allows the formation of a DNA loop (t-loop), hiding the ends of the DNA from unwanted activation of the DNA damage response (DDR). Since differentiated post-mitotic cells do not divide, the role of telomeres in these cells has long been overlooked. So during my thesis, I was interested in the role of telomeres in differentiated skeletal muscle cells.In the first part of my PhD project, I contributed to a work showing that the expression of TRF2 decreased in human skeletal muscle cells, this decrease starting in young adults. Subsequently, I studied the consequences of inhibiting the expression of the gene encoding TRF2 (TERF2) in differentiated skeletal muscle cells. Contrary to what one might have expected, inhibition of TRF2 does not expose telomeres to a deprotection toward DDR. This is observed in cultured human muscle cells (myotube) and in muscle cells from a mouse model where the TERF2 gene is specifically invalidated in differentiated skeletal muscle cells. Notwithstanding, these TRF2-deprived muscle cells develop a mitochondrial dysfunction phenotype with an increase in oxidative context, which is explained, at least in part, by a role of TRF2 in the expression of the mitochondrial sirtuin SIRT3.In the second part of my PhD work, I studied the mechanisms of telomere protection in myotubes deprived of TRF2. I was able to demonstrate a non-canonical role of the longevity factor FOXO3a in the protection of muscle cell telomeres lacking in TRF2.Finally, in the third part of my PhD work, I characterized the mouse model of inhibition of Terf2 specifically in mature muscle fiber. This inhibition causes, in females, a delay in the aging of skeletal muscle cells associated with a slight increase in muscle strength and a lengthening of their longevity.In summary, my results revealed in differentiated skeletal muscle cells a telomere protection mechanism involving a non-canonical role of FOXO3a, a connection between the shelterin factor TRF2 and the functioning of the mitochondria as well as a paradoxical function of TRF2 in muscle aging and mouse longevity. I discuss these findings by putting them in the context of a development-aging continuum

La sénescence cellulaire est un état cellulaire caractérisé par un arrêt stable du cycle cellulaire, de nombreux changements intracellulaires et un phénotype de sécrétion. Ce processus peut être néfaste dans de nombreux contextes, mais il peut aussi être bénéfique, comme au cours du développement embryonnaire. A ce jour, il n'existe pas de marqueurs spécifiques de la sénescence cellulaire. Dans ce projet de thèse, j'ai validé un nouveau modèle murin de sénescence, la souris p21-mCherry-CreERT2, in vitro et in vivo. J'ai ensuite utilisé cette souris pour définir le transcriptome de la sénescence développementale des membres embryonnaires. Cette signature de la sénescence développementale a ensuite été utilisée pour réaliser une méta-analyse avec 18 autres études sur la sénescence, et a permis d'identifier de nombreux gènes candidats qui pourraient être de nouveaux marqueurs ou médiateurs de la sénescence
Cellular senescence is a cellular state characterized by stable cell cycle arrest, numerous intracellular changes and a secretory phenotype. This process can be detrimental in many contexts, but can also be beneficial, for example during embryonic development. To date, there are no specific markers of cellular senescence. In this thesis project, I validated a new mouse model of senescence p21-mCherry-CreERT2, in vitro and in vivo. I then used this mouse to define the transcriptome of embryonic limb developmental senescence. This developmental senescence signature was then used to perform a meta-analysis with 18 other senescence studies, and identified numerous candidate genes that could be novel markers or mediators of senescence

TRF1 est une protéine télomérique essentielle pour la stabilité et la régulation de la longueur des télomères. Son expression est altérée dans de nombreux cancers humains, et son inhibition, dans un contexte p53 déficient, favorise le développement de tumeurs chez la souris. Nous montrons ici que l'inhibition de TRF1 dans les fibroblastes primaires humains conduit à une accumulation télomérique de γ-H2AX et à une activation de la voie de réponse aux dommages de l'ADN dépendante des kinases ATR/Chk1, menant rapidement les cellules vers la sénescence. En revanche, lorsque les voies p53 et pRb sont défaillantes, les cellules échappent à la sénescence. L'érosion accrue des télomères engendre alors une fragilité télomérique et une instabilité chromosomique, caractérisées par la présence de fusions entres chromatides soeurs et de signaux multi-télomériques (MTS). Un niveau élevé de MTS, associés à la présence de télomères courts, est également retrouvé après la surexpression de TRF1. Cette fragilité télomérique conduit à une extension de la capacité proliférative des cellules, due à une stabilisation de la longueur des télomères par réactivation de la télomérase. Nous proposons que la fragilité des télomères, induit par l'altération de la charge télomérique de TRF1, conduit à une instabilité chromosomique qui facilite la réactivation de la télomérase et à des anomalies chromosomiques comparables à celles retrouvées dans les tumeurs. La dérégulation de l'expression de TRF1 joueraient un rôle dans la progression tumorale des cellules p53 et pRb déficientes
TRF1 is a telomere-binding protein which is essential for both telomere stability and telomere length regulation. TRF1 depletion in the context of p53 deficiency promotes tumor development in the mouse, and TRF1 expression is altered in some human cancers. We report here that inhibition of TRF1 in human primary fibroblast results in rapid induction of senescence, which is concomitant with telomeric accumulation of γ-H2AX and phosphorylation of the ATR downstream checkpoint kinase Chk1. Abrogation of p53 and pRb pathways bypasses senescence but leads to accelerated telomere shortening and early onset of chromosomal instability, including sister chromatid fusions and the occurrence of multi-telomeric signals (MTS) related to telomere fragility. MTS are also elevated in TRF1-overexpressing cells and are coincident with the presence of short telomeres. Elevated telomere fragility was associated with greater immortalization potential and resultant cells maintained their telomeres via telomerase reactivation. We propose that changes in TRF1 occupancy at telomeres lead to telomere-fragility driven chromosome instability, which facilitates the reactivation of telomerase and engenders cancer-relevant chromosomal aberrations. These events would occur at early stages of the tumor progression process in the context of an impaired p53 and pRb response

Comprendre les mécanismes de sénescence ou développer de nouveaux anti-cancéreux impose d’utiliser des modèles biologiques divers et complémentaires. De par sa facilité de mise en œuvre, la culture cellulaire est une des méthodes les plus employées. Cependant, travailler sur des cellules isolées ne permet pas toujours d’extrapoler les résultats à des conditions plus complexes comme un organisme entier. Les biologistes disposent alors de modèles intégrés plus ou moins évolués : levures, poissons (zebrafish …), grenouille (xénope …), insectes (drosophile …), rongeurs (souris, rats …), chien, primates, etc. Cependant leur mise en œuvre est souvent difficile, tant d’un point de vue administratif que technologique.L’objectif de notre travail a été d’initier le développement de deux nouveaux modèles biologiques intégrés (Caenorhabditis elegans et Hypsibius dujardini), beaucoup plus facilement manipulables, pour des études en oncopharmacologie et sénescence.Le potentiel de Caenorhabditis elegans a été évalué au travers de deux axes : (i) nous avons utilisé le nématode pour déterminer les potentiels toxiques, mutagènes et cancérogènes de gaz candidats au remplacement du gaz SF6 (ii) à l’aide du Seahorse XF24 Analyzer, nous avons mis au point un test fonctionnel original : la mesure de la respiration mitochondriale du nématode entier.Nous avons choisi de développer comme second modèle, Hypsibius dujardini, beaucoup moins travaillé que C. elegans. C’est un tardigrade connu pour sa résistance aux conditions extrêmes, notamment à la dessication. Afin de mieux comprendre cette résistance, nous avons choisi d’analyser le fonctionnement mitochondrial de cet organisme en sortie d’anhydrobiose, en utilisant des marquages mitochondriaux et en mesurant sa respiration à l’aide du Seahorse XF24 Analyzer
Biological models are necessary to understand how organisms works, how evolution of living run, to test new treatments or to perform toxicological assessments as well. Cellular culture is one of the methods employed because it is easy to use. However, working on isolated cells doesn’t always allow to challenge of the results with more complex conditions as found in full organisms. Biologist needs to develop new biological models for new assessments but the new model choice can be a problem. Murine model, frog, drosophila, yeast, zebrafish,… have each other some benefits and limits. Their choice is directly linked with their use and with the type of research we intend to make.The aim of our work was to develop biological models to oncopharmacology and aging studies.The nematode model with Caenorhabditis elegans was used in several projects. One study was made on gases. They were tested in terms of toxicity, mutagenicity and cancerogenicity. On the other hand, a new tool was developed for prospective studies on either toxicology or mechanistic with the mitochondrial respiration measure with the Seahorse XF24 Analyzer device.The second biological model studied is the tardigrade and more exactly Hypsibius dujardini. Tardigrades are extremely resistant organisms to harshest conditions. They can resist to desiccation. To gain insights on tardigrade resistance, we have choice to analyze the mitochondrial dynamics in the course of anhydrobiosis exit by using mitochondrial dyes and respiration measurements

Le thymus est un organe clé de l’immunité, permettant tout au long de la vie la production de cellules T naïves. L'involution thymique associée à l'âge est liée à une réduction de la masse tissulaire et de la cellularité thymique, ainsi que la perte de la structure tissulaire et de l’architecture normale conduisant à une baisse de la production de cellules T naïfs. Cependant, à l'exception de l'âge, les facteurs environnementaux ou génétiques susceptibles de régir la fonction thymique chez l'Homme restent mal connus. Nous avons caractérisé la variabilité de la fonction thymique chez 1000 adultes sains stratifiés par l’âge et par sexe sur la cohorte Milieu Intérieur, en utilisant la quantification des cercles d’excision (TRECs) dans le sang périphérique comme marqueur de la thymopoïèse. L'âge et le sexe sont les seuls facteurs non héritables identifiés qui affectent la fonction thymique. Les quantités de TREC diminuent avec l'âge étant plus élevée chez les femmes de tout âge. Surtout, une étude d'association pangénomique a révélé l’existence d’un variant génétique (rs2204985) dans le locus TCRA-TCRD, situé entre les segments géniques DD2 et DD3, l’allèle G étant associé à un niveau de TRECs supérieur à l’allèle A. Cette association a été validée dans une cohorte de réplication (cohorte MARTHA). La transplantation de cellules souches hématopoïétiques humaines de foie fetal avec le génotype GG dans des souris immunodéficientes est associée à une thymopoïèse accrue avec des TRECs plus élevés, une augmentation du nombre de thymocytes et aussi une plus grande diversité du répertoire TCRA-TCRD. Notre approche d’immunologie des populations a mis en évidence un variant génétique influençant la thymopoïèse l’adulte sain. Ceci pourrait avoir un impact direct en médecine dite de précision dans les domaines du vieillissement et de la vaccination, en transplantation de cellules souches hématopoïétiques, ainsi qu’en autoimmunité. Ces travaux conduisent également à étudier plus en détail les mécanismes de la thymopoïèse précoce et des réarrangements du locus TCRATCRD
The thymus is a vital organ for homeostatic maintenance of the peripheral immune system. Age-associated thymic involution is associated with a reduction in tissue mass and thymic cellularity, loss of tissue structure and abnormal architecture leading to a decline in naïve T cell output. However, with the exception of age, the underlying parameters that govern thymic function in healthy humans remain to be defined. We characterized the variability of thymic function among 1000 age- and sex-stratified healthy adults of the Milieu Intérieur cohort, using quantification of TRECs in peripheral blood T cells as a surrogate marker of thymopoiesis. Age and sex were the only nonheritable factors identified that affect thymic function. TREC amounts decreased with age and were higher in women compared to men of all ages. In addition, a genome-wide association study revealed a common variant (rs2204985) within the T cell receptor TCRA-TCRD locus, between the DD2 and DD3 gene segments, which associated with TREC amounts. This association was validated in a replication cohort (MARTHA cohort). Strikingly, transplantation of human hematopoietic stem cells with the rs2204985 GG genotype into immunodeficient mice led to thymopoiesis with higher TRECs, increased thymocyte counts, and a higher TCR repertoire diversity. Our population immunology approach revealed a genetic locus that influences thymopoiesis in healthy children and adults, with potentially broad implications in precision medicine, especially in aging and vaccines, hematopoietic stem cell transplantation and autoimmunity. This study leads also to further study the precise mechanisms of TCRA-TCRD rearrangements at early steps of thymopoiesis

Molécules du goût et odeurs se fixent sur des récepteurs dits gustatifs et olfactifs, présents dans la bouche et le nez. Ils sont donc en contact avec le monde environnant. Toutefois, on les trouve également dans des organes isolés de l’extérieur, comme le pancréas ou le cerveau, où ils ne sont plus impliqués dans la détection du non-soi. Ils y régulent la glycémie ou l’activation du système immunitaire. Dans le cerveau, leurs rôles demeurent mystérieux. Mon travail a consisté à déterminer: 1) si, et où les récepteurs gustatifs et olfactifs sont présents dans le cerveau humain, 2) quand, où et pourquoi les récepteurs olfactifs sont présents dans le cerveau de souris et 3) si une maladie comme Alzheimer peut modifier leur expression. Mes résultats montrent qu’ils sont présents dans l’ensemble du cerveau humain et particulièrement dans le «cerveau émotionnel». De plus, le cerveau de souris «Alzheimer» surexprime des récepteurs olfactifs, notamment dans les neurones. Le cerveau est donc capable de goûter et sentir son monde intérieur. On peut imaginer que ces récepteurs jouent un rôle dans la détection de la maladie et, qui sait, qu’ils participent à la lutte contre ses effets néfastes
Taste molecules and odours bind to so-called gustatory and olfactory receptors present in the mouth and nose. They are therefore in contact with the surrounding world. However, they are also found in organs isolated from the outside, such as the pancreas or brain, where they are no longer involved in the detection of non-self. They regulate blood sugar levels or the activation of the immune system. In the brain, their roles remain mysterious. My work consisted in determining: 1) if, and where, taste and smell receptors are present in the human brain, 2) when, where and why smell receptors are present in the mouse brain, and 3) whether a disease like Alzheimer's can change their expression. My results show that they are present in the entire human brain and particularly in the "emotional brain". In addition, the brains of "Alzheimer" mice overexpress olfactory receptors, particularly in neurons. The brain is therefore able to taste and feel its inner world. It is conceivable that these receptors play a role in detecting the disease and, who knows, in combating its harmful effects

L'utilisation des antirétroviraux (ART) a permis une augmentation de la durée des patients infectés par le VIH. Par ailleurs, les comorbidités, retrouvées au cours du vieillissement physiologique, semblent être plus fréquentes et d'apparition plus précoce ce qui pourrait suggérer une modification du programme de vieillissement chez ces patients. L'étude ANRS EP45 « Aging » (clinicalTrials.gov, NCT01038999) a pour objectif d'analyser chez des patients infectés par le VIH traités ou non les mécanismes cellulaires connus pour être impliqués dans le vieillissement. Les PBMC d'une cohorte de 130 patients infectés par le VIH 1 appariés en âge et en sexe avec 49 sujets séronégatifs ont été analysés. Trois centres spécialisés (Marseille, Montpellier, Nice) ont recruté des patients infectés naïfs ou sous première ligne de traitement. Les résultats présentés dans ce manuscrit rapportent l'analyse des mitochondries et des lamines nucléaires. La maturation de la lamine A ne semble pas modifiée dans les PBMC de patients sous traitement contenant un inhibiteur de protéase. Cependant, ces cellules pourraient ne pas être le modèle le plus adapté pour explorer ce volet. D'autre part, l'infection est responsable d'anomalies mitochondriales dans les lymphocytes, partiellement corrigées par les traitements antirétroviraux qui modifient les mitochondries des monocytes moins sensibles à l'infection. Bien que les secondes générations de ART soient moins toxiques que les premières, leurs effets secondaires pourraient néanmoins, sur « le long terme » et/ou généralisés à l'ensemble de l'organisme, être l'un des facteurs modifiant le programme de vieillissement de ces patients
Antiretroviral therapy (ART) has increased life expectancy in HIV-infected patients. Moreover, some age-related disorders were found to be more frequent in HIV infected and treated patients than in an age-matched general population, suggesting a modified time course of aging in HIV infected patients. The ANRS EP45 « Aging » study (clinicalTrials.gov, NCT01038999) investigated in PBMC from HIV-1 infected patients under treatment or not the cellular mechanisms known to be involved in aging. The study was performed on a cohort of 130 patients HIV-1 infected age- and sex-matched with 49 seronegative control subjects. Patients never treated with ART (naïve) or under first line were recruited by 3 AIDS centres (Marseille, Montpellier, Nice). Results presented here describe explorations of mitochondria and nuclear lamin. No alteration of lamin A maturation was detected in PBMC from HIV-1 infected patients under treatment with protease inhibitor. However, these cells could not be the most appropriate models to investigate lamin A-related aging pathway. On another hand, mitochondrial modifications were observed in lymphocytes from HIV infected naive patients. These alterations were only partly rescued by ART whereas its induced slight changes in monocytes that appeared to be less sensitive to infection. While second generation of ART are less toxic than the first one, their secondary effects, due to long term exposure and/or generalised to different tissues, could lead to a modified time course of aging in HIV infected patients

La sénescence cellulaire est une réaction de stress complexe qui arrête la prolifération cellulaire et s'accompagne de bouleversements généralisés du métabolisme, de la structure de la chromatine et de l'expression des gènes, y compris la surexpression et la sécrétion de facteurs inflammatoires. La sénescence cellulaire a des effets bénéfiques en tant que mécanisme suppresseur de tumeurs et facilite le développement embryonnaire ainsi que la régénération tissulaire. Cependant, ce processus est également considéré comme un acteur important du vieillissement et des maladies liées à l'âge, principalement par son phénotype inflammatoire, appelé SASP (Senescence-associated secretory phenotype). Les recherches actuelles pointent vers un rôle de PARP1 (poly(ADP-ribose) polymérase 1) dans la régulation transcriptionnelle des processus inflammatoires et la modulation de la structure de la chromatine. Néanmoins, les mécanismes exacts par lesquels PARP1 exerce ses fonctions de régulation et ses rôles dans le contexte de la régulation transcriptionnelle de la sénescence demeurent peu connus. Dans ma thèse, j'ai entrepris de définir le rôle fonctionnel des activités catalytique et de liaison à la chromatine de PARP1 dans la régulation transcriptionnelle et la structure de la chromatine dans les cellules en sénescence. J'ai réalisé des analyses transcriptomiques à résolution temporelle, des études d'accessibilité de la chromatine et du paysage chromatinien de PARP1 par ChIP-Seq, ainsi que de la chromatine ADP-ribosylée en développant une nouvelle technique le CRAP-seq (Chromatin-Ribosylation-Affinity-Pulldown). Ces analyses ont permis d’identifier une dichotomie de la fonction de PARP1 - l'une liée à son activité enzymatique d’ADP-ribosylation et l'autre à son activité de liaison à la chromatine non enzymatique - avec des impacts distincts sur le programme transcriptionnel de la sénescence. Sur la base de ces résultats, j’ai pu définir un nouveau rôle global pour PARP1 dans la modulation de la structure de la chromatine, d’une part par la stabilisation du positionnement des nucléosomes au niveau des promoteurs géniques et d’autre part par l’ADP-ribosylation des éléments régulateurs en cis pour finement réguler la transcription des gènes peu exprimés. Ainsi, ces recherches permettent d’envisager le rôle des inhibiteurs de PARP dans les thérapies ciblant la sénescence (thérapies sénolytiques) pour le traitement des pathologies liées au vieillissement
Cellular senescence is a complex stress response that arrests cell proliferation and is accompanied by widespread changes in metabolism, chromatin structure, and gene-expression, including the overexpression and secretion of inflammatory factors. Cellular senescence is health-promoting as a tumor-suppressive mechanism, facilitating embryonic development and tissue regeneration. However, it is also considered a major contributor to aging and age-related diseases, mostly through its inflammatory phenotype, the so-called SASP (senescence-associated secretory phenotype). Current research supports the role of PARP1 (Poly (ADP-ribose) polymerase 1) in the transcriptional regulation of inflammatory processes and modulation chromatin structure. However, the exact mechanisms by which PARP1 exerts its regulatory functions, and its roles in the context of regulating senescence gene-expression are underexplored. In my thesis, I set out to define the functional role of PARP1 catalytic and chromatin binding activities in gene regulation and chromatin structure in cells undergoing senescence. I performed time-resolved transcriptomics, chromatin-accessibility studies, and mapping of the genome-wide locations of PARP1 using ChIP-seq and ADP-ribosylated chromatin using a novel technique CRAP-seq (Chromatin-Ribosylation-Affinity-Pulldown). Together, I identified a dichotomy of PARP1 function – one related to its enzymatic ADP-ribosylation activity and the other related to its non-enzymatic chromatin binding activity – with distinct impacts on the senescence transcriptional program. Based on these findings, I can define a novel and global role for PARP1 in and chromatin structure modulation by stabilizing nucleosomes positioning at gene promoters and ADP-ribosylation of cis-regulatory modules to fine-tune transcription of lowly expressed genes. Indeed, based on my investigations, the role of PARP-inhibitors in senescence targeting therapies (senolytic therapies) for the treatment of age-related pathologies can be envisioned

La progéria ou HGPS (Hutchinson-Gilford progeria syndrome) est une maladie caractérisée par un vieillissement prématuré et accéléré extrêmement rare. Son incidence est estimée à environ 1 cas pour 4 à 8 millions de naissances selon les études. Les signes cliniques qui la caractérisent incluent notamment un retard de croissance majeur, une lipodystrophie, des ostéolyses distales et une atteinte cardiovasculaire qui est la cause du décès à l'âge moyen de 13 ans. La progéria est causée de façon prédominante par une mutation de novo dans le gène LMNA codant les lamines A et C, découverte par notre équipe en 2003. Cette mutation récurrente, prédite pour être silencieuse (c.1824C>T; p.Gly608Gly), active un site d'épissage cryptique qui génère une forme tronquée, anormalement prénylée et toxique de la lamine A, appelée la progérine. Ce travail de thèse a eu pour objectifs : 1) la caractérisation de différents marqueurs moléculaires et phénotypiques des lignées de patients atteints d'HGPS ou de syndromes apparentés ainsi que dans le modèle murin de progéria LmnaG609G/G609G, 2) la caractérisation des aspects cognitifs de ce modèle murin ainsi qu'une étude élargie de l'expression des lamines dans le cerveau, 3) le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans le cadre de la progéria, in vitro et in vivo, incluant notamment l'exploration des effets d'une molécule antioxydante, le resvératrol, ainsi que l'adaptation de l'approche thérapeutique par oligonucléotides antisens (AON) (Osorio et al. 2011) visant à son administration par voie orale
Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) is an extremely rare genetic disease characterized by premature, accelerated and segmental aging with an estimated incidence of 1 in 4 to 8 million of births. Children with HGPS present with major growth retardation, lipodystrophy, distal osteolysis and cardiovascular defects that cause their death at the mean age of 13 years. In 2003, our team discovered the causative mutation of HGPS in the LMNA gene. Despite being predicted as silent (c.1824 C>T; p.Gly608Gly), this de novo mutation activates a cryptic splicing site leading to the production of a truncated, aberrantly prenylated and toxic form of lamin A, called progerin. The main objectives of this thesis have been: 1) characterizing molecular and cellular biomarkers in HGPS or related syndromes patients' cell lines, together with the progeria mouse model LmnaG609G/G609G, 2) characterizing cognitive aspects as well as lamins' and progerin expression in the central nervous system in the same in vivo model and 3) the developement, in vitro and in vivo, of novel therapeutic approaches for progeria using either resveratrol, an antioxidant molecule, or micelle-coated antisense oligonucleotides with the intent of adapting an oral treatement for progeria children