Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Cellules végétales – Cultures cellulaires“

La microdissection laser permet d’isoler des cellules, phénotypiquement identiques, à partir d’une lame de microscope portant un tissu biologique, dans l’optique de réaliser des analyses moléculaires différentielles, spécifiques de ces populations isolées. La technologie s’applique notamment en oncologie, pour préciser des mécanismes moléculaires qui permettent d’adapter un traitement lié au diagnostic et à la recherche en biologie, mais aussi en criminalistique, pour la sélection tissulaire, en neurologie pour des études post-mortem sur des patients atteints de maladie d’Alzheimer, pour des études de clonalité à partir de cultures cellulaires, et en cytogénétique, pour décrypter les réarrangements chromosomiques. C’est le chaînon manquant entre observations cliniques et mécanismes physiologiques intrinsèques des tissus biologiques. Nous aborderons dans cette revue ses applications majeures.

L'objectif des travaux presentes est d'approfondir les connaissances relatives aux mecanismes metaboliques et physiologiques impliques dans la biogenese des monoterpenes par des cellules de plantes cultivees "in vitro", composes responsables de la flaveur des baies de raisin muscat. En particulier ont ete etudies: la nature et l'evolution quantitive des glycosides monoterpeniques elabores au cours de la bioconversion du nerol et du geraniol exogenes, l'origine et le devenir metabolique des alcools monoterpeniques libres et glucosyles synthetises par les suspensions de cellules de raisin muscat au cours de la biotransformation du 1-**(3)h geraniol exogene

Les premières cultures cellulaires végétales in vitro ont été développées à partir de carotte, grâce à Gautheret en 1939. Il a obtenu ce résultat par la découverte au préalable du pouvoir de totipotence des cellules végétales (Haberland 1902). Afin d’obtenir les cellules indifférenciées Gautheret a utilisé des milieux de culture contenant des macroéléments (K, N et P), des microélements (Mg, B,…), des vitamines, du sucre et des phytohormones. Dans la littérature, plusieurs compositions sont souvent utilisées comme White (1934), Murashige and Skoog (1962)) ou Gamborg, Miller et Ojima (1970). Les nuances entre ces milieux se basent sur des concentrations modifiées en phosphates, nitrates ou en phytohormones (auxine/cytokinine). Chaque espèce a besoin d’un milieu particulier pour induire la callogénèse. En effet, selon l’origine (géographique) et le type d’explant (feuilles, racines, tiges,…) traité les conditions d’induction de la callogénèse varieront. De nombreuses personnes portent un intérêt aux cultures cellulaires pour leur utilisation en cosmétique ou en pharmacie. Actuellement, deux entreprises produisent ces cellules à l’échelle industrielle. Ainsi, Phyton Biotech (entreprise allemande) purifie du taxol à partir d’If (Taxus baccata) et Mitsui petrochemical produit de la skinonine à partir de grémils (Lithospernum erythrorizon)
The first plant cell culture has been developed by Gautheret in 1939 based on carrot plant cell tissus. He obtained these results through the discovery of the plant totipotency power (Haberland, 1902). He used for cal production a culture medium composed by macroelements (K, N, P…) and microelements (Mg, B …), vitamin, sugar. Later on, several mediums were used like and described in literature i.e. Murashige and Skoog (1962), White (1934) or Gamborg, Miller and Ojima (1970). The differences between such medium consisted mainly concentrations especially of phosphates, nitrates or auxin/cytokinine balance. However, each species needs specific medium for growth. Any people works of this subject and the interest for pharmaceutical and cosmetical industry grow up. Plant cell culture is a difficult technology an industrial use. Recently, two companies performed industrial production of taxol (Taxus baccata) and shikonin (Lithospernum erythrorizon) respectively PhytonBitotech and Mitsui petrochemical. My thesis work was to develop plant cell cultures fom unusual plants which can be used for the industrial production of cosmetics

Le trans-resvératrol (trans-3-5-4’ trihydroxystilbène), composé phénolique de la famille des stilbènes, participe aux mécanismes de défense de la vigne. Cette molécule présente de nombreuses activités biologiques intéressantes pour la santé humaine. L’ensemble de ces éléments fait du resvératrol une molécule d’intérêt mais les mécanismes liés à sa biosynthèse restent à approfondir. Le recours à un modèle d’étude simplifié, comme des suspensions cellulaires, autorise un accès facilité aux études à l’échelle cellulaire. Au cours de ce travail, nous avons utilisé une suspension cellulaire de Vitis 41B, dont les caractéristiques ont été déterminées, tant au niveau de sa croissance que de sa capacité à produire du resvératrol. Différents inducteurs de la production du resvératrol ont été testés. Le méthyl-jasmonate à la concentration de 0,2 mM s’est avéré le plus efficace. Le scale-up en bioréacteur de 2 L a été réalisé et a conduit à la purification et à l’identification de viniférines en plus du resvératrol (200 mg/L). Les résultats montrent également que la formation des viniférines semble directement liée à la métabolisation du resvératrol présent dans le milieu de culture. La seconde partie du travail a consisté à caractériser la synthèse précoce du resvératrol à l’échelle cellulaire. L’utilisation de la vidéomicroscopie et de la microscopie confocale a permis de montrer que la synthèse du resvératrol était cytosolique et que son excrétion est localisée. Ces travaux montrent clairement que les suspensions cellulaires de vigne représentent un système biotechnologique pertinent pour l’étude fondamentale de la biosynthèse du resvératrol et sa bioproduction
Stilbenes are phenolic compounds produced by different plant species. The most well known stilbene is the trans-resveratrol (trans-3-5-4’ trihydroxystilbene) which acts as a phytoalexine on grapevine. Its discovery inside red wine led to enlighten its biological activities on human health. So the resveratrol became an interesting and hopeful molecule in medicine and also for understanding grapevine defenses but the biosynthetic mechanisms of this compound stayed unclear. Along this work, we used a Vitis 41B cell suspensions obtained from calli. In a first time, the cell growth kinetic was determined and we evaluated its ability to produced resveratrol. In order to study parameters which led to the resveratrol synthesis, we have tested various inducers and a concentration of 0,2 mM methyljasmonate showed the best induction. A scale-up in a 2-L bioreactor was conducted and led to the purification and identification of viniferins and allowed to obtain a 200 mg/L resveratrol accumulation. These results seem indicate that the viniferin production is linked to the metabolisation of the resveratrol inside the culture medium. The second part of this work focussed on the early synthesis of the resveratrol at the cellular scale. We have used videomicroscopy and confocal microscopy in order to show that the resveratrol synthesis takes place inside the cytosol and that its excretion is localized. Our study clearly showed that the grapevine cell suspension represents a pertinent and powerful system to study the resveratrol biosynthesis and its bioproduction

La présente thèse a pour objectif d'améliorer les connaissances sur la production de biomasse par la culture de cellules végétales en suspension, en prenant une souche modèle de luzerne (Medicago sativa). En premier lieu sont comparés des modes de culture discontinus et continus par leurs productivités en biomasse brute et leurs coûts industriels. Une seconde approche évalue l'impact de différents milieux de culture sur les paramètres cinétiques comme la croissance, le décès et la consommation des substrats. Pour cela est effectué un suivi des milieux intra- et extra-cellulaires, ainsi que la viabilité de la biomasse. Ensuite, une nouvelle méthode basée sur la teneur en estérases de la biomasse est exposée pour déterminer sa viabilité avec d'avantage de rapidité et de précision. La mesure de cette activité enzymatique libérée dans le milieu de culture permet un suivi précis des cinétiques de croissance, de décès et de lyse cellulaire. Les informations recueillies sur le comportement cinétique de la souche sont structurées sous la forme de deux modélisations mathématiques. La première décrit les évolutions extracellulaires, la viabilité de la biomasse et les phénomènes de lyse. La seconde améliore les prédictions du modèle précédent par l'adjonction des évolutions de la composition ionique intracellulaire. Celle-ci résulte d'une entrée des nutriments par diffusion, du catabolisme et de phénomènes d'équilibration avec le milieu de culture quand les cellules décèdent.

Une souche heterotrophe et une souche photomixotrophe de tephrosia vogelii hook f. , papilionaceae tropicale accumulant dans ses feuilles des rotenoides (insecticides biodegradables) ont ete etudiees dans le but de cerner l'impact de la lumiere sur la production de metabolites secondaires in vitro. Deux systemes de culture ont ete employes: culture en erlenmeyer et culture en bioreacteur. Les cinetiques de production de biomasse, d'accumulation et d'excretion de rotenoides, l'evolution de la teneur en chlorophylles et de l'activite respiratoire et photosynthetique ainsi que les modifications intra et extracellulaires en certains constituants glucidiques, azotes et phosphates ont ete compares. Des differences importantes de comportement en fonction des potentialites photosynthetiques de la souche consideree et du systeme de culture employe ont ete mise en evidence. Dans tous les cas, la production de rotenoides est amelioree en condition de photomixotrophie et est correlee positivement a la croissance. Des essais d'optimisation de la production ont ete realises: incorporation de l-phenylalanine, stimulation par differents stress. Cette etude est completee par un essai de caracterisation de l'activite phenylalanine ammonialyase, enzyme cle de la voie de biosynthese des rotenoides. Son evolution au cours du cycle de culture des suspensions cellulaires heterotrophes et photomixotrophes et lors de traitements differents a ete suivi. Le role de la pal dans les mecanismes de regulation de la voie de biosynthese des rotenoides est discute

Un des caractères physiologiques des cellules vététales en culture in vitro est leur tendance à devenir anergiées ou habituées, c'est à dire autotrophes aux substances de croissance. Ce phénomène pourrait être un des facteurs expliquant la diminution des capacités d'accumulation de métabolites secondaires. Notre travail vise à savoir si des gènes sont réprimés ou mis en expression au cours de ce processus. Nous utilisons un modèle dans lequel les cellules anergiées (ne produisant plus d'alcaloïdes) dérivent de cellules 2,4 D dépendantes utilisées comme témoins et qui peuvent accumuler des alcaloïdes. C'est pourquoi nous avons recherché si des polypeptides apparaissent ou disparaissent au cours de ce processus. Plus précisément, 3 polypeptides ayant pour masse moléculaire 28, 17 et 16kDa, paraissant reliés à l'accumulation alcaloïdique, ont pu être caractérisés dans les cellules 2,4-D dépendantes. Par ailleurs un polypeptide o de 53kDa, de caractéristiques électrophorétiques très proches de celles de la tryptophane décarboxylase, est toujours fortement cumulé dans la souche anergiée. Cinq polypeptides dont le polypeptide s (28kDa), liés semble-t-il à la biosynthèse alcaloïde, sont absents ou ne sont plus régulés par les cytokinines dans la souche anergiée. L'abondance en polypeptide o et l'absence en polypeptide s dans les cellules anergiées seraient des caractères liés à l'anergie. Les effets de l'anergie sont beaucoup plus marqués au niveau des protéines membranaires. Un polypeptide membranaire m1 de 16kDa, préférentiellement accumulé dans la souche anergiée a été isolé et microséquence. Les sondes oligonucléotidiques obtenues ont servi au criblage d'une banque de cADNs issus des ARNm de cellules 2,4D dépendantes conduisant à l'isolemetn de sept clones spécifiques. L'élucidation du rôle de ce polypeptide pourrait permettre de progresser dans la compréhension des mécanismes de l'autotrophie hormonale dans les souches cellulaires de Catharanthus roseus
Habituation is known as a common character of in vitro plant cells. This phenomenon can be considered as a genral tendancy of plant cells to loose their exogenous hormonal requirement. Habituation is often correlated with lack of the synthesis and production of secondary metabolites. In this work we attempted to identify genes which were newly expressed or repressed during the transition from the normal to the habituated state. Our aim was to elucidate some biochemical aspects associated with hormonal autotrophy of plant cells. We compared the protein patterns of a 2,4 D dependant line to those of a 2,4 D independent cell line selected from the previous one. We had two major objectives : detect the polypeptides related to the habituated state ; compare changes in their expression patterns under a defined hormonal treatment, ie cytokinin or auxin supply in the culture medium. In the course of this study, 3 polypeptides with 28, 17 and 16kDa molecular mass were detected. Their synthesis appeared to be correlated with indole alkaloid accumulation in the 2,4 D dependent cell line. On the other hand a 53kDa polypeptide was always expressed at high level in habituated cell line, while a group of 5 polypeptides inluding polypeptide s was either completely lacking or at least not regulated by cytokinins in the habituated cell line. Abundance of th e 53kDa polypeptide and the attenuated expression of the polypeptide s 28kDa can be considered as the main traits of all habituated suspension cell lines of Catharanthus roseus. Differences in protein patterns were more important in membrane extracts. We found that microsomal protein profiles were relatively more differents between the two cell lines with a 16kDa polypeptide m1 expressed intensively in habituated cells. Cytokinins and auxins can modify the expression pattern, and in case of this peculiar regulation, the polypeptide m1 was purified and the corresponding sequence was determined. The oligonucleotides probes constructed from the N-terminal sequence were used for screening a cDNA library from Catharanthus roseus mRNA poly(A). Six specific clones were isolated. Elucidation of m1 gene function could perhaps bring new information about the hormonal autotrophy mechanism in Catharanthus roseus cell lines ?