Dissertationen zum Thema „Cellules tumorales pulmonaires“

Les adénocarcinomes pulmonaires font partie des cancers bronchiques non à petites cellules qui représentent 85% des diagnostics de cancers pulmonaires. En fonction du stade du cancer déterminé, l’espérance de vie à 5 ans est autour de 68% pour les stades précoces et proche de 0% pour les stades les plus avancés. Ces cancers présentent diverses caractéristiques mutationnelles qui peuvent expliquer les différents degrés de gravité. La Liver Kinase B, connue sous l’acronyme LKB1, est mutée dans 8 à 21% des adénocarcinomes pulmonaires. Bien que n’étant pas initiatrice de la tumorigenèse pulmonaire, la perte de cette protéine entraine une aggravation notable du pronostic des patients.LKB1 est une sérine thréonine kinase codée par le gène STK11 qui joue un rôle clé au cours du développement et du maintien de nombreux organes. Notre équipe a mis en évidence des régulations métaboliques par LKB1 essentielles pour divers lignages d’une population particulière de cellules souches embryonnaires, les cellules de crêtes neurales (CCNs). Au cours de ma thèse, j’ai participé à l’exploration des contributions de LKB1 lors de la mise en place du système nerveux entérique, un réseau de ganglions qui contrôle la motricité digestive et dérive intégralement des CCNs. Nous avons montré le rôle crucial de LKB1 pour la différenciation des neurones entériques et le maintien des cellules gliales entériques via la limitation du stress oxydant et l’activité du facteur de transcription p53.Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont également exploré si les régulations métaboliques exercées par LKB1 lors de la formation des CCNs contribueraient également à l’activité suppresseur de tumeur de LKB1. Par l’analyse in silico de données transcriptomiques de patients mutés pour LKB1 (en association avec les mutations oncogéniques KRAS) et porteurs d’adénocarcinomes pulmonaires, j’ai montré que la perte de fonction de LKB1 est associée à une modulation importante du métabolisme des acides aminés. En particulier, l’expression de nombreuses enzymes du métabolisme de l’alanine est augmentée en absence de LKB1 dans les adénocarcinomes pulmonaires. Cette augmentation est corrélée à des données obtenues en culture de cellules tumorales pulmonaires qui montrent des taux d’alanine plus importants en absence de Lkb1. De plus, les mutations de LKB1 s’associent avec une dérégulation de métabolites et enzymes de l’homéostasie rédox, ainsi qu’une stabilisation de p53 et des modifications d’expression de ces gènes cibles.Ainsi, mes résultats mettent en lumière des régulations communes entre l’activité développementale de LKB1 dans les CCNs et son activité suppresseur de tumeur dans les adénocarcinomes pulmonaires. Ces analyses obtenues chez les patients LUAD renforcent la contribution potentielle de la signalisation LKB1 dans des syndromes développementaux chez l’homme bien que des mutations de cette voie ne soient pas connues dans les neurocristopathies, les pathologies dues à une malformation des CCNs. Enfin, l’identification d’autres dérégulations dans les LUAD (régulation du stress oxydant par la voie NRF2-KEAP1, dérégulation du facteur de transcription et régulateur de la chromatine BRG1 par exemple) constituent une source d’inspiration réciproque pour mieux comprendre les fonctions de LKB1 développementales. Dans leur ensemble, ces données ouvrent un nouveau regard sur la recherche de pistes thérapeutiques des pathologies liées à une réduction de la signalisation LKB1
Lung adenocarcinomas (LUAD) are a subset of non-small-cell lung cancers, comprising approximately 85% of diagnosed lung cancer cases. The 5-year survival rate varies depending on the tumor stage, with approximately 68% survival for early-stage cases and nearly 0% survival for the most advanced stages. These cancers exhibit a range of mutational characteristics that may account for the varying degrees of severity. Liver Kinase B, abbreviated as LKB1, is found to be mutated in 8 to 21% of LUAD cases. While it is not the initiating factor in lung tumorigenesis, the loss of this protein significantly worsens the prognosis for affected patients.LKB1 is a serine-threonine kinase encoded by the STK11 gene, and it plays a pivotal role in the development and maintenance of various organs. Our team has uncovered essential metabolic regulations governed by LKB1 in distinct lineages of a specific embryonic stem cell population known as neural crest cells (NCCs). During my PhD, I contributed to investigating the significance of LKB1 in the establishment of the enteric nervous system—a complex network of ganglia responsible for regulating digestive motility and entirely derived from NCCs. Our research demonstrated the critical role of LKB1 in the differentiation of enteric neurons and the maintenance of enteric glial cells by limiting oxidative stress and modulating the activity of the p53 transcription factor.In this context, my doctoral research also delved into whether the metabolic regulations governed by LKB1 during NCC formation could also contribute to LKB1's tumor-suppressive activity. By conducting in silico analysis of transcriptomic data from LUAD patients with LKB1 mutations (in conjunction with oncogenic KRAS mutations), I have demonstrated that the loss of LKB1 function is linked to significant alterations in amino acid metabolism. Specifically, the expression of numerous enzymes involved in alanine metabolism is increased in the absence of LKB1 in lung adenocarcinomas. This increase aligns with data obtained from lung tumor cell cultures, which indicate higher levels of alanine in the absence of LKB1. Furthermore, LKB1 mutations are associated with dysregulation of metabolites and enzymes related to redox homeostasis, global epigenetic changes, as well as the stabilization of p53 and alterations in the expression of its target genes.Hence, my findings underscore the shared regulatory mechanisms between LKB1's developmental role in NCCs and its tumor-suppressive function in lung adenocarcinomas. These analyses, conducted in LUAD patients, further underscore the potential significance of LKB1 signaling in human developmental syndromes, even though mutations in this pathway are not currently associated with neurocristopathies—pathologies stemming from NCC malformations. Additionally, the identification of other dysregulations in LUADs, such as the regulation of oxidative stress via the NRF2-KEAP1 pathway and the deregulation of the transcription factor and chromatin regulator BRG1, reciprocally inspire a deeper understanding of LKB1's developmental functions. Collectively, these findings pave the way for exploring novel therapeutic strategies for conditions linked to diminished LKB1 signaling

Le développement tumoral implique non seulement la cellule cancéreuse mais aussi son environnement qui apporte les facteurs nutritifs nécessaires à la cellule tumorale, fourni le support sur lequel les cellules tumorales se développent mais aussi les facteurs de croissance dont la tumeur dépend.
Endocan, une molécule de cet environnement tumoral, est un protéoglycane secrété spécifiquement par la cellule endothéliale et dont l'expression, à l'état normal, est limitée principalement à l'endothélium pulmonaire et rénal. Endocan, par son glycane, interagit avec les facteurs de croissance et stimule la prolifération des cellules épithéliales. Endocan pourrait également intervenir dans la régulation de la migration leucocytaire trans-endothéliale en modulant l'interaction des intégrines (comme par ex le LFA-1) avec leur ligand. Endocan est surexprimé dans un nombre important de localisations tumorales comme le poumon, le sein, le colon et le rein. Dans le cancer du poumon et du sein, endocan fait partie d'un cluster de gènes de mauvais pronostic, sa surexpression étant liée à une mortalité plus précoce ou à des métastases plus fréquentes.
Nous avons montré qu'endocan a un effet de promotion de la croissance tumorale et que cette fonction est dépendante de l'interaction de son glycane avec les facteurs de croissance du microenvironnement tumoral.
Dans les modèles expérimentaux de cancer chez la souris SCID, nous avons démontré que le blocage d'endocan par l'intermédiaire d'anticorps monoclonaux freine la croissance tumorale, est que ce freinage est associé à un recrutement de leucocytes intra-tumoraux.
Dans les cancers broncho-pulmonaires humains nous avons démontré qu'endocan est surexprimé de manière importante et que cette expression est corrélée, avec celle du VEGF. Les taux circulants d'endocan sont également corrélés avec le pronostic des malades, avec une survie plus courte pour les patients ayant des taux élevés d'endocan. De manière intéressante les taux d'endocan étaient corrélés avec la présence de métastases à distance et au niveau ganglionnaire mais pas avec la taille tumorale. Endocan pourrait représenter un marqueur pronostique les cancers bronchopulmonaires et être le reflet de la stimulation angiogénique tumorale.
Nous nous sommes également intéressés à une autre pathologie néoplasique pulmonaire qu'est le mésothéliome pleural et les métastases pleurales des carcinomes. Nous avons pu montrer que les taux sériques d'endocan sont aussi liés au pronostic dans les adénocarcinomes métastasés à la plèvre mais pas dans le mésothéliome pleural. Nous avons pu montrer que les peptides solubles dérivés de la mesotheline (SMRP) sont un bon marqueur diagnostique du mésothéliome pleural épithélioïde. L'ostéopontine (une molécule pléiotrope impliquée, entre autres, dans l'adhésion et la survie cellulaire), et qui a été proposée comme marqueur pour le diagnostic précoce du mésothéliome pleural malin n'a que peu d'utilité dans le diagnostic des pleurésies chez les patients exposés à l'amiante. Par contre les deux marqueurs sont des facteurs indépendants de pronostic pour les mésothéliomes pleuraux.

L’extension lymphatique des cancers pulmonaires, facteur pronostique indépendant, reste d’évaluation difficile compte tenu de la complexité des voies possibles de dissémination et du large fossé entre l’imagerie morphologique, seule disponible en routine clinique, et les études plus fondamentales en biologie moléculaire, permettant de détecter des petites quantité de cellules tumorales dont l’impact sur l’évolution tumorale reste incertain. En effet, le profil évolutif de certains stades précoces (stades IA et IB), présentant des récidives tumorales métastatiques précoces, fait suspecter la possible existence de métastases occultes non détectées en histologie conventionnelle de routine et de modes de dissémination tumorale atypiques ou mal connus. Les travaux rapportés ici abordent plusieurs volets de cette dynamique tumorale analysant d’une part les voies de propagation sous la forme de courants lymphatiques issus des organes intra-thoraciques avec leurs variantes et d’autre part les moyens simples, par étude cytologique, ou plus complexes par biologie moléculaire, permettant de détecter ces progressions tumorales. L’impact de ces résultats et de la connaissance des voies de dissémination se situe dans les options thérapeutiques pluridisciplinaires, à la fois au niveau de la chirurgie mais aussi du choix des traitements adjuvants, en apportant des éléments supplémentaires sur l’état de la dissémination tumorale
Lymphatic spread of lung cancer, an independent prognosis factor, remains a difficult assessment due to the complexity of dissemination paths and the wide gap between morphological radiology, only feasible clinically, and fundamental studies in molecular biology which allows detection of small quantities of tumor cells with uncertain impact on tumoral course. Indeed, the progressive nature of early-stage metastasis in pre-maturely recurring metastasis leads one to suspect the possible existence of occult metastasis undetected by conventional histological analysis, and atypical or unkown tumoral dissemination. In this study, we analyze several aspects concerning tumoral dissemination: firstly, through propagation paths via lymphatic drainage from intra-thoracic organs and their variants; secondly, through simple cytological study or through molecular biology, allowing detection of tumoral progression. These results coupled with the knowledge of tumoral dissemination paths impact multi-disciplinary therapeutic strategy, not only from a surgical procedure point of view, but also from among the choice of adjuvant treatments

Les avancées récentes dans la connaissance de la biologie moléculaire du cancer ont permis le développement des thérapeutiques ciblées, parmi lesquelles les traitements antiangiogéniques (AA), qui enrichissent les stratégies de prise en charge du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC). Induisant plus souvent un effet cytostatique que cytotoxique, les AA mettent en défaut les critères morphologiques d’évaluation de la réponse tumorale tels que les critères RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors).Ce travail s’est attaché à explorer la perfusion tumorale en tomodensitométrie (TDM) dynamique. La première étude a validé le substratum anatomopathologique des informations quantitatives sur le volume sanguin (VS) et la perméabilité capillaire (PC) intratumoraux sur 15 CBNPC traités chirurgicalement. La maîtrise des techniques d’acquisition et de post-traitement a permis de les appliquer à l’évaluation de la néoangiogénèse tumorale de CBNPC sous chimiothérapie. Il a été possible de démontrer une réduction significative du VS et de la PC sous chimiothérapie standard associée à un agent AA (bevacizumab) (Groupe 1; n=17), non observés sous chimiothérapie standard seule (Groupe 2; n=23). Dès la première cure d’AA, la réduction du VS était significativement plus marquée chez les patients répondeurs que chez les non-répondeurs (p=0.0128), la réponse n’étant établie qu’après 3 cures de chimiothérapie. Objectivant des modifications précoces de la vascularisation avant toute modification de la taille tumorale, la TDM de perfusion permet de prédire la réponse du CBNPC au traitement AA
Recent advances in molecular biology have dramatically accelerated our understanding of tumoral lesions and triggered development of novel targeted therapies. Among them, antiangiogenic drugs represent a promising strategy for non-small cell lung carcinomas (NSCLC). These agents are more cytostatic rather than cytotoxic, explaining the limitations of tumor response assessment based on morphological criteria, such as the RECIST criteria (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors). The purpose of this thesis was to investigate tumoral perfusion using dynamic contrast-enhanced (DCE) CT, a novel technology enabling whole-tumor analysis with 64 slices per rotation. Our first study validated the pathological substratum of quantitative CT information on tumoral blood volume (BV) and capillary permeability (CP) in 15 NSCLC treated by surgery. Confident interpretation of CT data sets then allowed us to investigate changes in tumoral neovascularisation of NSCLC under chemotherapy. DEC-CT showed significant reduction in BV and CP of tumors treated by standard chemotherapy combined with antiangiogenic drugs (bevacizumab) (Group 1; n=17), not observed in tumors treated by standard chemotherapy alone (Group 2; n=23). In Group 1, the reduction in BV after one cycle of chemotherapy was significantly higher in responders than in non-responders (p=0.0128), response to treatment being only defined after 3 cycles of chemotherapy. DCE-CT can depict early changes in lung cancer vascularity, before tumour shrinkage, that may help predict response to antiangiogenic drugs

Le FcRn ou récepteur néonatal du Fc des IgG est un récepteur " clé " qui prolonge la demi-vie des IgG et de l’albumine et assure leur biodistribution. Récemment, son rôle s'est étendu à la réponse immunitaire humorale et anti-tumorale. Par ailleurs, certains travaux indiquent que le niveau d’expression du FcRn dans les différents tissus pourrait être à l’origine d’une modulation de ses fonctions. Dans ce contexte, nous avons démontré que l’expression du FcRn était diminuée dans le tissu cancéreux par rapport au tissu sain, chez des patients atteints du cancer du poumon et que cet effet était corrélé à leur pronostic. Afin de comprendre les répercussions de cette diminution sur la tumorigenèse, nous avons mis en place le modèle murin de métastases pulmonaires B16F10, chez les souris FcRn-/-. L'absence de FcRn influence la réponse anti-tumorale, en altérant le nombre de cellules dendritiques et des TCD8+. Pour la première fois, nous avons montré que l'absence du FcRn influençait le développement/maturation et fonctions des cellules NK, fragilisant ainsi encore plus l'immunosurveillance antitumorale. Ces résultats mettent en avant un nouveau rôle du FcRn dans la biologie des cellules NK. Les mécanismes à l’origine de cet effet restent à élucider
FcRn or neonatal receptor for the Fc portion of IgG is a "key" receptor since it extends the half-life of IgGs and albumin and ensures their biodistribution. Recently, its role has been extended to the humoral and anti-tumor immune. Moreover, some studies indicate that the expression level of FcRn in the different tissues may modulate its functions. In this context, we showed that the expression of FcRn was decreased in lung cancer tissue compared to healthy tissue, in patients with NSLC. This decreased expression is correlated with the prognosis of the patients. In order to understand the impact of the reduced FcRn expression on tumorigenesis, we implemented a murine model of lung metastases, implanting B16F10 cells in FcRn deficient mice. The absence of FcRn influences the anti-tumor response, by altering the number of dendritic cells and TCD8+ cells. We showed for the first time that the lack of FcRn altered the development / maturation and the functional activity of NK cells, thus weakening even more anti-tumor immunosurveillance. These new results on NK highlight a new role of FcRn in the biology of NK cells. The mechanisms underlying this effect need to be elucidated

L’hypoxie tumorale par l’intermédiaire d’une de ses cibles HIF-1α, est associée à la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) dans de nombreuses tumeurs solides. La TEM a été associée aux résistances à la chimiothérapie et aux métastases dans de nombreux cancers. Dans ce travail, nous avons montré que l’hypoxie tumorale définit un pronostic péjoratif après chirurgie d’un cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC). Nous avons également montré sur des lignées cellulaires de CBNPC présentant des mutations activatrices de l’EGFR, que l’hypoxie via HIF-1α, induit la TEM, avec activation de différents facteurs de transcription dépendant du statut mutationnel des lignées : induction de SNAIL-1/SNAIL-2 dans la lignée H1650 ayant une deletion de l’exon 19 et induction de SNAIL-1/ZEB-1 dans la lignée H1975 ayant la mutation L858R de l’exon 21 et T790M de l’exon 20. En considérant l’ensemble de ces données, il apparaît que HIF-1α peut être une nouvelle cible thérapeutique
Tumoral hypoxia, and his target HIF-1α, are linked to the epithelial to mesenchymal transition (EMT) in various solid tumors. EMT has been linked to chemotherapy resistance and metastases in many cancers. In this work, we have shown that tumoral hypoxia may help to define a worst prognosis in case of hypoxia after non-small cell lung cancer surgery (NSCLC). We have also shown that on NSCLC cell lines harboring activating EGFR mutations, hypoxia trough expression of HIF-1α, was able to induce EMT, with activation of different transcription factors according to cell mutational status: induction of SNAIL-1/SNAIL-2 in H1650 cell line harboring exon 19 deletion, induction of SNAIL-1/ZEB-1 in H1975 cell line harboring both exon 21 L858R and exon 20 T790M mutations. Considering all these data, it appears that HIF-1α may be considered a a new therapeutic target

La progression tumorale est caractérisée par deux processus clés, la prolifération et l’invasion cellulaires. Les nAChRs, activés par la nicotine et ses nitrosamines dérivées (NNN et NNK), modulent les concentrations calciques intracellulaires et activent in vitro la prolifération, l’apoptose, la migration et l’invasion de lignées cellulaires tumorales. Dans cette étude, nous montrons, en utilisant des cultures primaires de cellules dérivées de cancers pulmonaires non à petites cellules (carcinomes épidermoïdes et adénocarcinomes), que les nAChRs α7 régulent différemment la prolifération cellulaire en fonction du stade de différenciation des tumeurs. Le nAChR α7 agit comme répresseur de la prolifération cellulaire dans les tumeurs bien différenciées et dans l’épithélium respiratoire normal, alors que dans les tumeurs peu différenciées, il stimule la prolifération cellulaire en réponse à la nicotine. A l’inverse, le nAChR α3α5β2 n’est que partiellement impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire aussi bien dans les tumeurs pulmonaires que dans l’épithélium respiratoire normal. Les nAChRs α7 et nAChRs α3α5β2 sont tous les deux impliqués dans la stimulation de l’invasion des cellules tumorales des carcinomes épidermoïdes et adénocarcinomes. Le polymorphisme non-synonyme rs16969968 de la sous-unité α5 induit une mutation au niveau d’un acide aminé hautement conservé (D398N). De nombreuses études d’association pangénomiques lient ce polymorphisme au développement des cancers pulmonaires. Dans cette étude nous montrons que les nAChRs exprimant la sous-unité α5 mutée (D398N) altèrent la prolifération et la différenciation des cellules respiratoires et modulent l’invasion des cellules tumorales, en synergie avec les nAChRs α7
Tumor progression is characterized by two key processes, cell proliferation and invasion. Nicotinic receptors, activated by nicotine and its derived nitrosamines (NNK and NNN) modulate intracellular calcium concentrations and activate in vitro proliferation, apoptosis, migration and invasion of tumor cell lines. In this study, we show, by using primary cell cultures from lung cancer tumors, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma, that nAChR α7 differently regulates cell proliferation according to the state of tumor differentiation. The α7 nAChRs acts as a repressor of cell proliferation in differentiated lung cancer tissues and in the normal respiratory epithelium, while it stimulates cell proliferation in response to nicotine, in poorly differentiated tumors. Conversely, the α3α5β2 nAChR is only partially involved in the regulation of cell proliferation in lung cancers and in the normal respiratory epithelium. The α7 and α3α5β2 nAChRs are both involved in the in vitro invasion process of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Non-synonymous polymorphism rs16969968 in the CHRNA5 gene induces a mutation in a highly conserved amino acid (D398N). Many genome-wide association studies have demonstrated the relationship between this polymorphism and the incidence of lung cancer. In this study, we show that nAChRs, expressing the mutated α5 subunit (D398N), are in involved in the alteration of the proliferation and the differentiation state of respiratory epithelial cells, and also modulate tumor cell invasion, in synergy with the α7 nAChRs

La sémaphorine SEMA3F est une protéine de guidage axonal également impliquée dans l'angiogenèse. Le gène SEMA3F est situé dans une région de perte d'hétérozygotie dans les tumeurs pulmonaires chez l'homme, suggérant un rôle anti-tumoral. Nous avons tout d'abord développé un modèle animal de cancer pulmonaire chez le rat en injectant des cellules tumorales pulmonaires transfectées avec SEMA3F. Ce modèle a permis de démontrer un pouvoir anti-tumoral de SEMA3F. De plus, nous avons analysé les mécanismes moléculaires qui expliqueraient le pouvoir anti-tumoral de SEMA3F. Nos résultats, basés sur une lignée cellulaire cancéreurese pulmonaire (H157), indiquent que SEMA3F inhibe l'activation de l'intégrine alphaV beta3, de la voie ILK-ERK1/2, de AKT et de STAT3. SEMA3F inhibe aussi l'expression de HIF-1 alpha et du VEGF, ce qui pourrait être à l'origine des effets anti-angiogéniques que nous avons observés dans un modèle de tumorigenèse sous-cutanée chez la souris ainsi que dans un modèle d'angiogenèse chez le poulet in ovo. Nos résultats montrent que SEMA3F bloque le développement tumoral pulmonaire, probablement en affectant des voies de signalisation intracellulaire participant à l'angiogenèse tumorale
The semaphorin SEMA3F is a secreted protein involved in axon repulsion and angiogenesis. The SEMA3F gene is located in a region of loss of heterozygosity in human lung tumors, suggesting a role as a tumor suppressor gene. We have developped an animal model of lung tumorigenesis in the rat by injecting SEMA3F-transfected tumor cells. This model allowed us to demonstrate that SEMA3F has an anti-tumorigenic effect in vivo. In addition, we have identified several molecular mechanisms that could explain SEMA3F anti-tumorigenic effect. Our results, based on the H157 human lung cancer cell line, show that SEMA3F inhibits activation of alphav beta3 integrin, activation of ILK-ERK1/2, AKT and STAT3. Moreover, SEMA3F inhibits HIF-1 alpha and VEGF expression, potentially explaining the anti-angiogenic effects that we have observed in a mouse tumor model as well as in the chick CAM angiogenesis model in ovo. Ou results demonstrate that SEMA3F is an inhibitor of tumorigenesis, probably through the inhibition of signaling pathways that contribute to tumor angiogenesis

Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent une source de matériel tumoral accessible de manière non invasive, susceptible de fournir des informations cliniques et fondamentales. Ces cellules issues de tumeurs primitives ou métastatiques représentent une population hétérogène d’éléments très rares circulant dans le sang. La personnalisation des traitements en oncologie repose sur la caractérisation moléculaire de biopsies tumorales mais celles-ci peuvent être difficiles à réaliser ou peu informatives. De ce fait, la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des CTC présente un double intérêt, clinique pour identifier des biomarqueurs de sensibilité à des traitements, et fondamental pour étudier les mécanismes qui sous-tendent leur potentiel à initier des tumeurs.Les objectifs de ma thèse ont été d’une part de caractériser par séquençage de l’exome (WES) les CTC à l’échelle de cellule unique de patients atteints de cancers de la prostate (PCa) métastatiques et d’autre part d’établir puis caractériser des modèles de xénogreffes dérivés de CTC (CDX) chez des patients atteints de cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) ou de PCa.Pour répondre au premier objectif, nous avons développé une méthode expérimentale globale incluant trois approches technologiques permettant d’enrichir et d’isoler des CTC individuelles de différents phénotypes (épithélial, épithélio-mésenchymateux et mésenchymateux), d’amplifier la totalité du génome (WGA) et de le séquencer. Le WES a été réalisé pour 34 échantillons de CTC sélectionnés sur des critères de qualité du WGA, ainsi que pour les biopsies de métastases correspondantes chez sept patients. Deux patients présentant une hétérogénéité phénotypique de leurs CTC, ont été analysés en profondeur. Nous avons mis en évidence des mutations partagées entre les CTC et les biopsies tumorales correspondantes ainsi que des mutations uniquement retrouvées dans les CTC. Ces mutations spécifiques aux CTC sont présentes dans tous les phénotypes et affectent particulièrement les gènes impliqués dans le remodelage du cytosquelette, la réparation de l’ADN ou l’invasion. L’existence de mutations communes entre les CTC de différents phénotypes suggère une relation phylogénique entre ces cellules mais une évolution divergente pendant le processus métastatique. Ce travail est soumis pour publication.Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons implantés les CTC de 67 patients atteints de CBNPC et 24 patients atteints de PCa chez des souris immunodéprimées. Nous avons établis quatre CDX de CBNPC et un CDX de PCa. La caractérisation de ces modèles, des biopsies tumorales, des CTC collectées au moment de la xénogreffe, des CDX et des lignées cellulaires établies à partir du CDX, ont révélé que les CTC, le CDX et les lignées cellulaires « miment » le phénotype et le profil mutationnel des biopsies tumorales. La caractérisation plus approfondie de l’une des lignées cellulaires montre la présence d’un stress réplicatif et d’une instabilité génomique élevée. Ce résultat nous oriente sur l’hypothèse d’un rôle éventuel de l’instabilité génomique dans la tumorigénicité des CTC.Dans ce travail, nous avons montré que le profil mutationnel des CTC présente de fortes similitudes avec les biopsies tumorales des patients dans les patients atteints de PCa étudiés. De plus, nous avons observé l’existence de mutations spécifiques aux CTC, non détectées dans les biopsies tumorales. Également, nous montrons que des CTC issues de CBNPC et de PCa sont tumorigéniques in vivo et qu’elles reflètent le profil mutationnel des biopsies tumorales des patients. Ces modèles constituent des outils originaux et intéressants pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et stratégies anti-cancéreuses, et comprendre les mécanismes qui supportent le potentiel des CTC à initier des tumeurs
Circulating tumor cells (CTCs) represents an non invasive source of tumor material which may provide clinical and basic information. These cells derived from primary or metastatic tumors represents an heterogeneous population of very rare events which circulates in the blood. Oncology personnalized medicine is based on biopsies molecular characterization but these are sometimes which difficult to realize and poorly informative. Thereby molecular and functional characterization of CTCs presents a double interest, clinical to identify treatments biomarkers sensitivity and basic to study mechanisms underlying their tumor inititiating cell (TIC) potential. The two goals of my thesis were on the one hand to characterize by whole-exome sequencing (WES) at the single level the CTCs from patients with metastatic prostate cancers (mPCa) and on the other hand to establish and characterize CTC-derived xenografts (CDX) from patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) or mPCa. For the first goal we developped a global workflow which include three technological approaches to enrich and isolate individual CTCs from different phenotype (epithelial, epithelial and mesenchymal, mesenchymal), to perform whole genome amplification (WGA) and to sequence them. WES was performed on 34 CTC samples selected according to WGA quality and on corresponding metastasis biopsies from seven patients. Two patients with phenotypic heterogeneity of CTCs were deeply analyzed. We highlighted shared mutations between CTCs and matched biopsies as well as mutations only detected in CTCs. These private CTC mutations are detected in all phenotype and particularly affect genes invlved in cytoskeleton remodeling, DNA repair or invasion. The existence of common mutations between CTCs from various phenotype suggests a phylogenic link between these cells but a divergent evolution during metastatic process. This work is submitted for publication. For the second goal, we implanted CTCs from 67 NSCLC patients and 28 mPCa patients in immunocompromised mice. We established four NSCLC CDX and one mPCa CDX. The characterization of tumor biopsies, CTCs collected at the time of xenograft, CDX and CDX-derived cell lines revealed that CTCs, CDX and cell lines miror the phenotype and mutational landscape of tumor biopsies. The more deeply characterization of one cell line show the presence of a high replicative stress and genomic instability. This result directs us to the hypothesis of a possible role of the genomic instability in CTC tumorigenicity.We demonstrated in this work that CTCs mutational landscape harbors high similairities with patients tumor biopsies in mPCa. Furthermore we observed CTC private mutations not detected in tumor biopsies. Also we showed that some CTCs from NSCLC and mPCa are tumorigenic in vivo and that these CTCs mirror mutational profile of patients tumor biopsies. These models are original and interesting tools to identify new therapeutic targets and anti-tumoral strategies and understand mechanisms underlying the TIC potential of CTCs

Des glycoconjugues et des recepteurs d'osides (lectines), presents a la surface des cellules sont impliques dans les interactions au cours de la cascade metastasique. Des etudes, par cytofluorimetrie en flux, ont permis de mettre en evidence la presence, sur la membrane des cellules 3ll, de recepteurs specifiques de glycosaminoglycanes et de quantifier la capacite de ces cellules a fixer et endocyter diverses neoglycoproteines. Des cellules provenant de metastases ont ete distinguees des cellules de la tumeur primaire par leur capacite plus elevee a endocyter des neoglycoproteines glucosylees. Des sous-populations ont ete selectionnees par tri cellulaire sur la base de l'activite de leur lectine membranaire specifique de residus glucosyles. L'analyse du comportement biologique in vivo de ces cellules clonees a montre que leur activite d'endocytose, de neoglycoproteines glucosylees, reflete leur activite colonisatrice et metastasique dans les poumons. Des anticorps ont ete obtenus apres immunisation de lapins contre la lectine partiellement purifiee par chromatographie d'affinite. Une lectine specifique des residus fucosyles a par ailleurs ete purifiee. L'utilisation des anticorps en chromatographie d'affinite permettra de purifier quantitativement la lectine specifique des glucosides afin d'elucider son role biologique au cours de l'invasion metastatique

L'impact du système Neurotensine (NTS)/récepteur 1 de la NTS (NTSR1) sur la progression tumorale et la survie de l’adénocarcinome pulmonaire (ADK) et du mésothéliome malin pleural a été étudié. L’expression de la NTS et du NTSR1 a été mise en évidence par immunohistochimie dans 66% et 59% des échantillons tumoraux dans une série de 71 patients opérés d’un ADK de stade I. L’analyse multivariée a montré que un âge>65 ans et l'expression du NTSR1 étaient des facteurs indépendants de mauvais pronostic. L'analyse du transcriptome d’une deuxième série de 85 patients avec ADK de stade IB a montré que le NTSR1 était dans les premiers 48 gènes associés à un mauvais pronostic. L’étude des tumeurs expérimentales chez la souris nude a révélé que le complexe NTS/NTSR1 augmente la croissance tumorale, avec une coopérativité positive entre les cellules exprimant le complexe NTS/NTSR1 et celles qui expriment seulement le NTSR1. La NTS et le NTSR1 étaient exprimés dans 71,1% et 90,4% de tumeurs de 52 patients avec mésothéliome malin. L’analyse multivariée a montré que l'expression de la NTS et un traitement non chirurgical étaient des facteurs indépendants de mauvais pronostic.

Les cancers broncho-pulmonaires à petites cellules (CBPPC), tumeurs endocrines représentant 20% des cancers pulmonaires, sont fortement associés au tabagisme. Ils sont très agressifs en raison de leur progression rapide et de la présence de métastases souvent présentes au moment du diagnostic. Moins de 10% des patients sont opérables et la plupart des échantillons de tumeurs sont recueillis par endoscopie bronchique ou par médiastinoscopie. Dans ce travail de thèse, nous avons montré que l’expression du TFPI-2, un gène suppresseur de tumeur, était diminué dans 65% des cas de CBPPC. Afin d’étudier l’impact du TFPI-2 sur la progression tumorale, nous avons préalablement développé un modèle orthotopique murin de CBPPC qui mime le développement de ce type de cancer pulmonaire. Des cellules NCI-H209, n’exprimant pas le TFPI-2, ont été préalablement transfectées pour exprimer la luciférase et la croissance tumorale a été suivie par imagerie de bioluminescence. L’expression du TFPI-2 a ensuite été restaurée dans ces cellules et nous avons montré que la croissance tumorale était alors réduite. Cet effet peut s’expliquer par une diminution de la prolifération des cellules exprimant le TFPI-2, associée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S dû à l’expression de p15 et de p27 et à une induction de l’apoptose. Nous avons aussi démontré que lorsque le TFPI-2 est surexprimé, les transcrits et les protéines MMP-1 et -3 sont diminuées, tout comme la phosphorylation des protéines de la voie des MAP Kinases impliquées dans l’induction des transcrits de ces MMP. Cette corrélation entre l’expression du TFPI-2 et la diminution de celle de la MMP-1 a été retrouvée dans 35% des échantillons de CBPPC humains. Ces résultats suggèrent que l’inactivation du TFPI-2 dans les CBPPC peut favoriser le développement de ce cancer. Enfin, nous avons également démontré, pour la première fois que le TFPI-2 peut aussi inhiber la kallicréine 12, une protéase à sérine potentiellement anti-angiogénique. L’ensemble de ces données suggèrent que le TFPI-2 peut être un potentiel biomédicament capable de limiter la progression des carcinomes pulmonaires à petites cellules
Small Cell Lung Cancer (SCLC) is the most common neuroendocrine tumour of the lung (15% of cases) and is strongly associated with smoking. It is characterised by tumours that grow rapidly with early metastases. Less than 10% of patients with SCLC have a resectable tumour, thus surgical specimens are scarce and most tumour samples come from small biopsies obtained during bronchial endoscopy or mediastinoscopy. In this study, low levels of TFPI-2 expression were found in 65% of patients with SCLC. To study the impact of TFPI-2 in tumour progression, we first developed a clinically relevant animal model that resembles various stages of human SCLC. NCI-H209 cells, not expressing TFPI-2, were genetically modified to express firefly luciferase and the growth of the tumour was sensitively followed by bioluminescence imaging. TFPI-2 was then overexpressed in these cells and we showed that TFPI-2 inhibited lung tumour growth. Such inhibition could be explained in vitro by a decrease in tumour cell proliferation, blockade of G1/S phase cell cycle transition due to p15 and p27 expression, and an increase in apoptosis shown in NCI-H209 cells expressing TFPI-2. We also demonstrated that TFPI-2 upregulation in NCI-H209 cells decreased MMP expression, particularly by downregulating MMP-1 and MMP-3. Moreover, TFPI-2 inhibited phosphorylation of the MAPK signalling pathway proteins involved in the induction of MMP transcripts, among which MMP-1 was predominant in SCLC tissues and was inversely expressed with TFPI-2 in 35% of cases. These results suggest that downregulation of TFPI-2 expression could favour the development of SCLC. Finally, we also demonstrated for the first time that TFPI-2 could inhibit the kallikrein 12, an anti-angiogenic serine proteinase. Altogether, these results suggest that TFPI-2 could be a new potent therapeutic agent to control SCLC tumour progression in SCLC

Cette thèse présente des travaux de modélisation mathématique de la croissance tumorale appliqués aux cas de métastases pulmonaires.La première partie de cette thèse décrit un premier modèle d’équations aux dérivées partielles permettant de simuler la croissance métastatique mais aussi la réponse de la tumeur à certains types de traitements. Une méthode de calibration du modèle à partir de données cliniques issues de l’imagerie médicale est développée et testée sur plusieurs cas cliniques.La deuxième partie de ces travaux introduit une simplification du modèle et de l’algorithme de calibration. Cette méthode, plus robuste, est testée sur un panel de 36 cas test et les résultats sont présentés dans le troisième chapitre. La quatrième et dernière partie développe un algorithme d’apprentissage automatisé permettant de tenir compte de données supplémentaires à celles utilisées par le modèle afin d’affiner l’étape de calibration
This thesis deals with mathematical modeling and simulation of lung metastases growth.We first present a partial differential equations model to simulate the growth and possibly the response to some types of treatments of metastases to the lung. This model must be personalized to be used individually on clinical cases. Consequently, we developed a calibration technic based on medical images of the tumor. Several applications on clinical cases are presented.Then we introduce a simplification of the first model and the calibration algorithm. This new method, more robust, is tested on 36 clinical cases. The results are presented in the third chapter. To finish, a machine learning algorithm

Le cancer broncho-pulmonaire (CBP) le 4ème cancer le plus répandu au niveau mondial après les cancers de la prostate, du sein et du côlon. Diagnostiqués à des stades tardifs, il est la première cause de cancer par décès. Cependant, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents au cancer a permis de développer des thérapies personnalisées pour chaque patient. L’émergence des thérapies ciblées et de l’immunothérapie a révolutionné la prise en charge thérapeutique, permettant d’améliorer la survie globale, la survie sans progression et les effets secondaires des patients en comparaison avec les traitements de chimiothérapies conventionnelles. La prescription des thérapies personnalisées est basée sur les caractéristiques moléculaires de la tumeur et, par conséquent, nécessite des analyses moléculaires innovantes. Néanmoins, entre 10 et 30% des analyses moléculaires des patients atteints de CBNPC sont non contributives et l’accès aux thérapies ciblées est compromis. De plus, même si l’analyse anatomo-pathologique reste utile pour l’évaluation du stade ou encore de l’histologie, elle reste peu adaptée en cas d’actes répétitifs, tout au long de la maladie. La « biopsie liquide », est un concept émergeant, correspondant à l’analyse des acides nucléiques circulants mais aussi des cellules tumorales circulantes (CTC), issus de la tumeur. Cette méthode faiblement invasive, basée sur un prélèvement sanguin, permet d’analyser le patrimoine tumoral circulant et donne accès aux informations moléculaires de la tumeur primaire. Le développement de nouvelles activités de diagnostic est donc primordial pour répondre à ses nouvelles demandes cliniques. Depuis 2015, les Hospices Civils de Lyon (HCL) ont déployé un programme de recherche translationnelle, appelé CIRCAN « CIRculating Cancer » dans lequel s’inscrit ce travail de thèse. De nombreuses méthodes de détection des biomarqueurs pertinents en oncologie thoracique dans l’ADNcir ont été développées et été validées au laboratoire pour plus de 1500 patients actuellement, leur permettant de bénéficier de thérapies ciblées. L’optimisation et la validation des technologies de biologie moléculaire telles que le séquençage à haut débit et la PCR digitale ultra-sensible ont été réalisées durant ce travail de thèse et valorisées dans des journaux internationaux. Au-delà des thérapies ciblées, les immunothérapies représentent les nouveaux traitements prometteurs pour ces patients dont le taux d’expression PD-L1 sur biopsie tissulaire est le biomarqueur de choix. Etant donné les contraintes qu’occasionne la biopsie tissulaire, nous avons développé un protocole de caractérisation phénotypique de PD-L1 dans les CTC. De plus, de nombreuses études montrent la pertinence clinique de l’utilisation de la charge mutationnelle (TMB) comme marqueur prédictif de réponse à l’immunothérapie. En parallèle, nous avons développé des outils moléculaires en cours de validation pour le calcul du TMB dans l’ADNcir et dans les CTC en comparaison avec celui calculé dans le tissu, et le taux de PD-L1 évalué par immunohistochimie. Toutefois, pour environ 50% des patients atteints de CBP, aucun biomarqueur n’est retrouvé, bloquant l’accès à des thérapies personnalisées et réduisant les chances de survie du patient. A la recherche de nouveaux biomarqueurs, nous avons développé un protocole permettant d’accéder à la signature transcriptomique des CTC à un niveau « single-cell » afin de caractériser l’hétérogénéité tumorale de ces cellules et de mieux comprendre les mécanismes de résistance mis en place. Les échantillons cliniques de patients sont en cours d’analyse, avec ce protocole validé avec une lignée cellulaire modèle. En effet, les résultats de la validation de méthode mettent en exergue la possibilité d’évaluer l’hétérogénéité tumorale et les voies de signalisation impliquées dans la dissémination métastasique, telles que la transition épithélio-mésenchymateuse
Broncho-pulmonary cancer (PBC) is the 4th most common cancer worldwide after prostate, breast and colon cancer. Diagnosed at late stages, it is the leading cause of cancer death. However, a better understanding of the molecular mechanisms underlying cancer has led to the development of personalized therapies for each patient. The emergence of targeted therapies and immunotherapy has revolutionized the therapeutic management, improving the overall survival, progression-free survival and side effects of patients compared to conventional chemotherapy treatments. The prescription of personalized therapies is based on the molecular characteristics of the tumor and, therefore, requires innovative molecular analyzes. Nevertheless, between 10 and 30% of the molecular analyzes of NSCLC patients are non-contributory and access to targeted therapies is compromised. Moreover, even if the pathological analysis remains useful for stadium evaluation or histology, it remains unsuitable for repetitive actions throughout the illness. The "liquid biopsy", is an emerging concept, corresponding to the analysis of circulating nucleic acids but also circulating tumor cells (CTC), derived from the primary tumor. This low-invasive method, based on a blood sample, makes it possible to analyze the circulating tumor inheritance and gives access to the molecular information of the primary tumor. The development of new diagnostic activities is therefore essential to meet its new clinical demands. Since 2015, Hospices Civils de Lyon (HCL) has deployed a translational research program, called CIRCAN "CIRculating Cancer" in which this thesis. Many methods for detecting relevant biomarkers in thoracic oncology in circulating free DNA (cfDNA) have been developed and validated in the laboratory for more than 1500 patients currently, allowing them to benefit from targeted therapies. The optimization and validation of molecular biology technologies such as high-throughput sequencing and ultra-sensitive digital PCR were performed during this thesis work and published in international journals. Beyond targeted therapies, immunotherapies represent promising new treatments for these patients whose PD-L1 expression level on tissue biopsy is the biomarker of choice. Given the constraints of tissue biopsy, we have developed a phenotypic characterization protocol for PD-L1 in CTCs. In addition, numerous studies show the clinical relevance of the use of mutational load (TMB) as a predictive marker of response to immunotherapy. In parallel, we have developed molecular tools undergoing validation for the calculation of TMB in cfDNA and in CTC compared with the value calculated in tissue, and the PD-L1 level evaluated by immunohistochemistry. However, for about 50% of patients with CBP, no biomarker is found, blocking access to personalized therapies and reducing the patient's chances of survival. In search of new biomarkers, we have developed a protocol allowing access to the transcriptomic signature of CTCs at a "single-cell" level in order to characterize the tumor heterogeneity of these cells and to better understand the resistance mechanisms implemented. The clinical samples of patients are being analyzed, with this protocol validated with a model cell line. Indeed, the results of the method validation highlight the possibility of evaluating tumor heterogeneity and the signaling pathways involved in metastatic spread, such as the epithelial-mesenchymal transition

Il est maintenant bien établi que le système immunitaire joue un rôle majeur dans le contrôle des tumeurs, y compris dans les carcinomes pulmonaires. Cependant, les interactions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral sont mal connues. Dans ce travail, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques et moléculaires des cellules tumorales provenant d’adénocarcinomes pulmonaires et leur association avec la composition du microenvironnement immunitaire. Nous avons rapporté la valeur pronostique des paramètres morphologiques de ces tumeurs, comme le grade histologique des adénocarcinomes, et leur association avec le statut moléculaire EGFR et KRAS. Nous avons émis l’hypothèse que la diversité morphologique et moléculaire de ces tumeurs pouvait être associée à une signature immunitaire intra-tumorale spécifique et que cela pourrait avoir un impact pronostique. Nous avons mis en évidence que la densité des cellules dendritiques matures, situées au sein de structures lymphoïdes tertiaires, variait en fonction du statut moléculaire EGFR et KRAS des tumeurs. De même, l’impact pronostique des cellules dendritiques matures et des lymphocytes CD8+ variait en fonction du statut moléculaire des tumeurs. Nous avons également retrouvé la valeur pronostique de l’environnement immunitaire, représenté par la densité en cellules dendritiques matures et en lymphocytes CD8+, sur la survie à long terme des carcinomes pulmonaires de stade III-N2 opérés après chimiothérapie néoadjuvante. Enfin, nous avons démontré que la chimiothérapie n'est pas associée à de profondes modifications de l’infiltrat immunitaire, alors qu’elle entraîne des modifications des cellules tumorales. L’ensemble de ces résultats suggère que l’infiltrat immunitaire est intimement lié à la cellule tumorale et que la composition du microenvironnement immunitaire varie avec les caractéristiques de la tumeur. Cette interaction entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires contribue au pronostic de ces tumeurs. Ces données démontrent l’intérêt d’utiliser des traitements combinant des drogues cytotoxiques, telle la chimiothérapie conventionnelle, à des traitements immunomodulateurs permettant de favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale efficace
The major role of the immune system against tumor development is now clearly established, including lung carcinoma. Nevertheless, interaction between tumoral cells and immune environment is less well-defined. In that study, we have studied morphological and molecular tumoral cells characteristics from lung adenocarcinoma and their role in the composition of immune environment. We reported the prognostic value of morphological parameters, as histological grade of adenocarcinoma, and their association with molecular EGFR and KRAS status. We hypothesized that morphological and molecular diversity of these tumors could be associated with a specific intratumoral immune signature, and could have an impact in prognosis. We showed that mature dendritic cells density, located in tertiary lymphoid structures, differed according to EGFR and KRAS status. Morever, molecular status of tumors modified the pronostic value of mature dendritics cells and CD8+ T cells. We found a prognostic value of immune environment, represented by dendritic cells and T CD8+ cells, in operated stage III-N2 lung carcinomas treated by neoadjuvant chemotherapy. At last, we demonstrated that chemotherapy is not associated with wide modifications in immune infiltrate, whereas it induced modifications in tumoral cells. All together, these data strongly argue for a close link between tumoral cells and immune environment, which seems to depend on tumoral cell characteristics. This interaction between tumoral cells and immune cells contribute to the prognosis of these tumors. These results show the evidence that combine cytotoxic treatment, like conventional chemotherapy, with immunomodulators, favour a protective anti-tumor immune response

Le but de cette étude a été d’analyser l’intérêt de l’aérosolthérapie d’anticorps monoclonaux (AcM) dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC) en utilisant le cetuximab, un AcM anti-EGFR. L’expression du récepteur FcRn, essentiel dans la pharmacocinétique et la biodistribution des IgGs thérapeutiques a été étudiée dans le CBNPC. Nos résultats montrent que l’AcM peut résister aux contraintes physiques de la nébulisation. Les données de biodistribution et pharmacocinétique, obtenues dans un modèle animal, indiquent que l’Ac administré par aérosol, s’accumule de façon prolongée au niveau pulmonaire. De plus, les tumeurs chez la souris paraissent sensibles à l’aérosolthérapie avec l’AcM. Par ailleurs, le récepteur FcRn est moins exprimé au niveau transcriptionnel et protéique dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur dans le CBNPC. Cette altération de l’expression pourrait être due à l’hyperméthylation du promoteur de ce gène
The project aims at determining whether aerosoltherapy is well suited for monoclonal antibodies (Mab), in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). In addition, exploration of the expression of FcRn, an IgG receptor contributing to increased half-life and biodistribution of Mab, has been studied in NSCLC. Using cetuximab, an anti-EGFR Mab, we showed that Mab resist the physical constraints of nebulization. Biodistribution and pharmacokinetic analyses, using a murine model, revealed that cetuximab is highly and durably accumulated within the lungs and slowly and weakly released into the bloodstream following airways delivery. Moreover, animal tumors seem sensitive to cetuximab aerosoltherapy. Expression analysis of FcRn at both the transcript and protein levels showed that the receptor is downregulated in NSCLC. FcRn alteration of expression in the tumor might be due to hypermethylation of the gene promoter as often found in cancer

Au cours de la conversion métastatique des tumeurs épithéliales, les cellules tumorales acquièrent des capacités invasives/migratoires nouvelles. Ce changement phénotypique est associé au processus de TEM durant lequel les composants des jonctions serrées sont réorganisés. Parmi eux, la protéine adaptatrice sous membranaire zonula occludens (ZO)-1 est délocalisée de la membrane vers le cytoplasme et/ou le noyau où elle joue un rôle pro invasif au cours de la progression tumorale. Dans cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à l’implication fonctionnelle de la fraction cyto-nucléaire de ZO-1 dans la régulation de l’expression de la chimiokine CXCL8/IL-8. In vitro, le niveau d’expression de l’IL-8 a été corrélé aux capacités invasives des cellules tumorales bronchiques et à la localisation de ZO-1. Par différentes techniques, nous avons montré non seulement que ZO-1 régule spécifiquement l’expression de l’IL-8 mais également qu’il régule la transcription du gène CXCL8 à travers l’activation du facteur de transcription NF-κB dans les cellules bronchiques et mammaires. En parallèle, l’étude de l’implication fonctionnelle de cet axe de régulation, dans des modèles ex vivo et in vivo, a mis en évidence le rôle pro-angiogénique de ZO-1 dont l’expression cyto-nucléaire dans les cancers bronchiques non-à petites cellules (CBNPC) a été corrélée avec une augmentation de la vascularisation de ces tumeurs.Ainsi, cette étude décrit le nouveau rôle de ZO-1 dans l’établissement d’un microenvironnement pro tumoral pro-angiogénique à travers sa capacité à moduler l’expression de l’IL-8 selon un mécanisme de régulation dépendant de la signalisation NF-κB
In metastatic epithelial tumor conversion, cancer cells acquire new invasive and migratory capacities in association with epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) process. During EMT, the junctional components are reorganized and the sub-membrane scaffolding protein zonula occludens (ZO)-1 relocates from tight junctions into cyto-nuclear compartment where it displays pro-invasive functions during tumor progression. In the present study, we focused on functional involvement of cyto-nuclear pool of ZO-1 on CXCL8/IL-8 regulation. In vitro, we observed correlation between level of IL-8 protein, invasive capacities of lung cancer cells and ZO-1 location. By overexpression of various ZO members, we showed that ZO-1 controls specifically IL-8 expression and active CXCL8 gene transcription by NF-κB dependent mechanism in lung and breast cancer cells. We also reported by in vitro assays that ZO 1 activates NF-κB. Investigation of functional implication of this regulatory axis next showed the pro-angiogenic activity of ZO-1 in both ex vivo and in vivo angiogenesis assays. Finally, we founded that non-small cell lung carcinoma (NSCLC) presenting a cyto-nuclear ZO-1 pattern were significantly more angiogenic that those without detectable cyto-nuclear ZO-1 expression.Thus, this study presents a new role of ZO-1 in establishment of pro-angiogenic tumor microenvironment through its capacity to modulate IL-8 expression via an NF-κB dependent mechanism

Il est maintenant bien établi que le système immunitaire joue un rôle majeur dans le contrôle des tumeurs, y compris dans les carcinomes pulmonaires. Cependant, les interactions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral sont mal connues. Dans ce travail, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques et moléculaires des cellules tumorales provenant d’adénocarcinomes pulmonaires et leur association avec la composition du microenvironnement immunitaire. Nous avons rapporté la valeur pronostique des paramètres morphologiques de ces tumeurs, comme le grade histologique des adénocarcinomes, et leur association avec le statut moléculaire EGFR et KRAS. Nous avons émis l’hypothèse que la diversité morphologique et moléculaire de ces tumeurs pouvait être associée à une signature immunitaire intra-tumorale spécifique et que cela pourrait avoir un impact pronostique. Nous avons mis en évidence que la densité des cellules dendritiques matures, situées au sein de structures lymphoïdes tertiaires, variait en fonction du statut moléculaire EGFR et KRAS des tumeurs. De même, l’impact pronostique des cellules dendritiques matures et des lymphocytes CD8+ variait en fonction du statut moléculaire des tumeurs. Nous avons également retrouvé la valeur pronostique de l’environnement immunitaire, représenté par la densité en cellules dendritiques matures et en lymphocytes CD8+, sur la survie à long terme des carcinomes pulmonaires de stade III-N2 opérés après chimiothérapie néoadjuvante. Enfin, nous avons démontré que la chimiothérapie n'est pas associée à de profondes modifications de l’infiltrat immunitaire, alors qu’elle entraîne des modifications des cellules tumorales. L’ensemble de ces résultats suggère que l’infiltrat immunitaire est intimement lié à la cellule tumorale et que la composition du microenvironnement immunitaire varie avec les caractéristiques de la tumeur. Cette interaction entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires contribue au pronostic de ces tumeurs. Ces données démontrent l’intérêt d’utiliser des traitements combinant des drogues cytotoxiques, telle la chimiothérapie conventionnelle, à des traitements immunomodulateurs permettant de favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale efficace
The major role of the immune system against tumor development is now clearly established, including lung carcinoma. Nevertheless, interaction between tumoral cells and immune environment is less well-defined. In that study, we have studied morphological and molecular tumoral cells characteristics from lung adenocarcinoma and their role in the composition of immune environment. We reported the prognostic value of morphological parameters, as histological grade of adenocarcinoma, and their association with molecular EGFR and KRAS status. We hypothesized that morphological and molecular diversity of these tumors could be associated with a specific intratumoral immune signature, and could have an impact in prognosis. We showed that mature dendritic cells density, located in tertiary lymphoid structures, differed according to EGFR and KRAS status. Morever, molecular status of tumors modified the pronostic value of mature dendritics cells and CD8+ T cells. We found a prognostic value of immune environment, represented by dendritic cells and T CD8+ cells, in operated stage III-N2 lung carcinomas treated by neoadjuvant chemotherapy. At last, we demonstrated that chemotherapy is not associated with wide modifications in immune infiltrate, whereas it induced modifications in tumoral cells. All together, these data strongly argue for a close link between tumoral cells and immune environment, which seems to depend on tumoral cell characteristics. This interaction between tumoral cells and immune cells contribute to the prognosis of these tumors. These results show the evidence that combine cytotoxic treatment, like conventional chemotherapy, with immunomodulators, favour a protective anti-tumor immune response

Le terme d’« hypertension artérielle pulmonaire » (HTAP) décrit une maladie vasculaire pulmonaire caractérisée par une augmentation progressive des pressions artérielles pulmonaires (PAP), définie par une PAP moyenne supérieure ou égale à 25 mmHg au repos et dont le principal symptôme est un essoufflement à l’effort. Un remodelage artériel pulmonaire intense conduisant à une obstruction des petits vaisseaux pulmonaires est responsable de la maladie. C’est une maladie rare mais néanmoins grave car pouvant aboutir à une insuffisance ventriculaire droite et entraîner le décès du patient.Le cadre général de notre étude est l’amélioration de la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’HTAP afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement au phénotype « pseudo-tumoral » des cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CML-AP) des patients atteints d’HTAP qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire pulmonaire de l’HTAP et qui présentent des caractéristiques communes avec les cellules cancéreuses, notamment une hyper-prolifération, une résistance à l’apoptose, des désordres métaboliques et une instabilité génomique. Etant donné que la protéine p53, un des plus importants suppresseurs de tumeur, est largement décrite comme inactivée dans la plupart des cancers, nous avons émis l’hypothèse qu’elle pourrait également jouer un rôle important dans le développement de l’HTAP. Les résultats des études in vitro menées sur des CML-AP de patients atteints d'HTAP idiopathiques (HTAPi) versus des sujets contrôles semblent indiquer que la protéine p53 n’est pas altérée dans les CML-AP HTAPi. En effet, la séquence codante du gène TP53 ne présente pas de mutation dans les CML-AP HTAPi, les expressions génique et protéique de p53 (et de certaines de ses protéines cibles) ne semblent pas être différentes entre contrôles et HTAPi, ni à l’état basal ni en réponse à différents stress cellulaires inducteurs de p53 (étoposide et H2O2). Cependant, la régulation de p53 semble altérée puisque nous avons observé une augmentation du taux protéique de MDM2, principal régulateur de p53, dans les CML-AP HTAPi. Ce résultat peut être considéré comme une des caractéristiques « pseudo-tumorales » des CML-AP HTAPi mais également être un élément déterminant du mécanisme d’action de la Nutlin-3a, qui a montré des effets anti-prolifératifs accrus dans les CML-AP HTAPi.Dans des études in vivo menées chez le rat, la protéine p53 semble jouer un rôle dans l’initiation de la pathogénèse d’une HTAP. En effet, les taux protéiques pulmonaires de p53, de sa cible p21 et de son régulateur (mais également cible transcriptionnelle) MDM2 sont diminués lors de la première semaine dans un modèle d’induction d’HTAP par mono-injection de monocrotaline (MCT) chez le rat, au cours duquel la pathologie se développe à partir de la 2ème semaine. De plus, l’administration quotidienne à des rats d’un inhibiteur de l’activité transcriptionnelle de p53, le pifithrin-α (PFT), conduit au développement d’une HTAP en 14 jours, au même titre qu’une mono-injection de MCT, et aggrave l’HTAP induite par la MCT. Des effets pro-prolifératifs et anti-apoptotiques du PFT révélés sur des CML-AP indiquent que l’inhibition de l’activité transcriptionnelle de p53 est à l'origine d'une prolifération exagéree et une résistance à l'apoptose, deux composantes clés dans le remaniement vasculaire pulmonaire et le développement de l'HTAP.En conclusion, ces résultats mettent en évidence l’implication de l’inactivation de la voie de p53 lors de la phase initiatrice du développement de l’HTAP, alors qu’aux stades tardifs et sévères de la maladie, il semble il y avoir une normalisation de p53. En revanche, l’augmentation de l’expression de son principal régulateur MDM2 observée dans les CML-AP de patients HTAP semble être une cible thérapeutique potentiellement intéressante
Pulmonary artery hypertension (PAH) is a severe pulmonary vascular disease characterized by a progressive increase of the pulmonary arterial pressure (PAP), defined by a mean PAP greater than or equal to 25 mmHg at rest. The main symptom is a shortness of breath. An intense pulmonary arterial remodeling that leads to an obstruction of the small pulmonary vessels is responsible of the disease. PAH is a rare but severe disease that develops into right ventricular cardiac failure leading to the patient's death.The general framework of our study was to improve the understanding of the pathophysiology of PAH in order to identify new potential therapeutic targets and improve the clinical management of patients. In particular, we were interested in the “cancer-like phenotype” of PAH patient pulmonary arterial smooth muscle cells (PA-SMCs). PA-SMCs play a key role in the pulmonary vascular remodeling of PAH. These cells share characteristics with cancerous cells, such as: exaggerated proliferation, apoptosis resistance, metabolic disorders and genomic instability. Owing to the growth-suppressive and pro-apoptotic functions of p53 protein and its inactivation largely described in cancer, we hypothesized that the p53 pathway could also be altered during PAH development in PA-SMCs.The results of in vitro studies on PA-SMCs of late stage patients with idiopathic PAH (iPAH) versus control patients suggest that the p53 protein nor pathway is not altered in iPAH PA-SMCs. Indeed, the coding sequence of the TP53 gene presented no mutations in iPAH PA-SMCs. Analysis of mRNA and protein levels of p53 and its target proteins showed no difference between controls and iPAH PA-SMCs, neither in a basal state or in response to various cellular stresses such as etoposide and H2O2. However, regulation of p53 may be altered in iPAH PA-SMCs as we observed an increase of the MDM2 (the main p53 regulator) protein level compared to control. This last result may be considered as a “cancer-like” characteristic of iPAH PA-SMCs and also be a determining factor in the mechanism of action of Nutlin-3a, which had more important anti-proliferative effects in iPAH PA-SMCs than in control cells.In vivo studies in rats revealed, however, that the p53 pathway may play a role in the initiation stage of PAH pathogenesis. Indeed, kinetics evaluation of p53 lung expression in the PAH model, induced by a single injection of monocrotaline (MCT), revealed a decrease in the p53 protein level during the first week, followed by a normalization by the second week. PAH symptoms are developed in MCT rats after two weeks. Similarly, the protein levels of p21, a p53 target, and MDM2, the major p53 regulator, and also a transcriptional target of p53, decreased during the first week in the MCT-PAH model. In addition, daily treatment in rats with an inhibitor of p53 transcriptional activity, pifithrin-α (PFT), led to the development of PAH in 14 days, similarly to MCT, and worsened the PAH induced by MCT. Pro-apoptotic and anti-proliferative effects of PFT on PA-SMCs indicate that inhibition of p53 transcriptional activity causes an excessive proliferation and an apoptosis resistance, which are two key components of the pulmonary vascular remodeling and development of human and experimental PAH.In conclusion, these results demonstrate the involvement of the p53 pathway inactivation in the initiation stage of PAH development, whereas in late and severe stages of disease, its role seems to be less implicated. In contrast, the increased expression of MDM2 observed in PA-SMCs of PAH patients may be a potential therapeutic target

Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. En dépit de la variété de traitements disponibles, tels que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie, la survie moyenne à 5 ans est de 60 %. L’une des raisons sous-jacente est une très grande variabilité de réponse au traitement, expliquée par les antécédents génétiques du patient et depuis peu par son microbiote. Le terme « microbiote » regroupe les bactéries, les archées, les champignons, les virus et les protistes qui colonisent notre organisme. Des études utilisant des modèles animaux montrent que le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans la réponse de l’hôte au traitement, via la stimulation du système immunitaire. Dans ce contexte, plusieurs « axes de communication » entre le site intestinal et les sites tumoraux distaux commencent à émerger, y compris l’axe « intestin-poumon ». Cependant, le microbiote pulmonaire, qui pourrait directement influencer la réponse tumorale et interagir avec le microbiote intestinal, est pour l’heure peu caractérisé. Afin de développer cette idée d’un axe « intestin, poumon et cancer du poumon », nous avons inclus dans notre étude 18 patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules (CBNPC) admissibles à la chirurgie. Nous avons analysé leurs microbiotes par séquençage à haut débit à partir de quatre échantillons différents de poumon (tissu sain, tissus péritumoral et tumoral et fluide de lavage broncho-alvéolaire LBA) mais également à partir d’échantillons de salive et de fèces. Nous avons également analysé plusieurs marqueurs immunitaires (infiltration lymphocytaire des tumeurs, profils Th et neutrophiles, cytokines dans le LBA et le sang), des marqueurs inflammatoires et enfin les acides gras à chaînes courtes dans les fèces. Une caractérisation détaillée de ces quatre types d’échantillons de poumons nous a permis de montrer que le microbiote du LBA présente une communauté nettement distincte de celle du tissu pulmonaire. Les tumeurs des lobes inférieurs prédisant le plus mauvais pronostic, nous avons décidé d’étudier le lien entre l’emplacement des tumeurs et la composition du microbiote. Les microbiotes du tissu péritumoral et du LBA ont été identifiés comme étant les plus impactés en terme d’abondance et de diversité ; la tumeur est quant à elle moins impactée. Cependant nous avons observé que le phylum des Firmicutes, décrit comme étant élevé dans les maladies pulmonaires obstructives chroniques, est plus abondant dans le microbiote des lobes inférieurs du poumon. Par conséquent, nous pouvons émettre l’hypothèse que l’augmentation des Firmicutes et les variations importantes du microbiote dans le tissu péritumoral pourraient être associés à une agressivité accrue des tumeurs du lobe inférieur. Nous avons ensuite démontré que la présence de ganglions lymphatiques (GL) métastatiques, marqueur d’un pronostic négatif dans le NSCLC, influence considérablement le microbiote local de par le profil respiratoire du tissu. Nous avons en effet observé que les bactéries anaérobies étaient plus abondantes dans les tumeurs en présence de LN métastatiques. Les bactéries aérobies sont quant à elles plus représentées dans les tumeurs sans GL métastatiques. Nous avons cependant observé la situation inverse dans les tissus extratumoraux. L’hypothèse avancée est celle d’une migration bactérienne en fonction des préférences de conditions de croissance, directement liées aux caractéristiques de la tumeur. Ceci nous permet de proposer plusieurs biomarqueurs pour la détection de GL métastatique, facilitant ainsi leur détection sans imposer de biopsie. Enfin, nous montrons que le microbiote du LBA est d’avantage associé à la réponse immunitaire locale et est indépendant de la présence de GL métastatique. Les recherches à venir porteront sur l’exploration de l’interaction entre le microbiote pulmonaire, l’immunité systémique et le microbiote intestinal
Lung cancer is the main cause of death by cancer worldwide. Despite the variety of available treatments, including surgery, chemotherapy, radiotherapy, and immune therapy, the average 5-year survival is 60%. One of the underlying reasons is a very high variability in patients’ susceptibility to treatment, explained by genetic background and since recently – our microbiota. The term microbiota includes bacteria, archaea, fungi, viruses and protists that inhabit our organism. The studies in animal models show that the gut microbiota (focused on bacteria) has a crucial role in host’s responsiveness to therapy through the stimulation of immune system. In this light, several “communication axes” between the gut and distal tumour sites have started to develop, including the “gut-lung” axis. However, the resident microbiota in the lungs that could directly influence the tumour response and interact with the gut microbiota has been scarcely characterised. To enable further development of the idea of the “gut-lung-lung cancer” axis, we included 18 non-small cell lung cancer (NSCLC) patients eligible for surgery and analysed the microbiota from four different lung samples (non-malignant, peritumoural and tumour tissue and bronchoalveolar lavage fluid; BAL), saliva and faeces by high-throughput sequencing. We also analysed several immune markers, as lymphocytic tumour infiltrate, Th and neutrophil profiles and cytokines in BAL and blood, and inflammatory markers in faeces along with short-chain fatty acids. Focusing first on the lungs, we show that BAL microbiota represents a significantly distinct community compared to lung tissue microbiota by providing detailed characterisation of the four different lung samples. Since tumours in lower lobes are reported as the ones with the worse prognosis, we investigated how the lobe location affected the microbiota composition. Peritumoural tissue and BAL microbiota were identified as the most affected in both abundance and diversity, and tumour as the least affected. However, phylum Firmicutes, previously reported as elevated in chronic obstructive pulmonary disease compared to controls, was found more abundant in microbiota from lower lung lobes. Therefore, we propose that both increase in Firmicutes and extensive changes in peritumoural tissue could be associated to increased aggressiveness of the lower lobe tumours. Next, we show that the presence of metastatic lymph nodes (LN), negative prognostic marker in NSCLC, significantly influence the local tissue microbiota in relation to its respiratory profile. We reported that anaerobic bacteria were more abundant within the tumour in the presence of metastatic LN, and aerobic bacteria within the one without it. Moreover, exactly inverse was observed for the same bacteria in extratumoural tissues. Along with migratory hypothesis depending on the bacterial preference for growth conditions shaped by tumour’s features, we propose several biomarkers for detection of metastatic LN that might facilitate their detection without imposing LN biopsy. Finally, we showed that BAL microbiota is the most associated to the local immune response and independent of the presence of metastatic LN. Future research will focus on the exploration of the interaction between the lung microbiota, systemic immunity and the gut microbiota

Les cellules du système immunitaire sont programmées pour reconnaître et éliminer les cancéreuses, pourtant les cellules tumorales ont la capacité de mettre en œuvre les divers moyen pour échapper à la mort induite par les effecteurs du système immunitaire. Au cours de cette thèse, nous avons étudié plus particulièrement PD-L1, qui est impliqué dans la protection des cellules tumorales contre une attaque du système immunitaire et induit au cours de la TEM
EMT foster cancer progression by acting on mechanisms allowing tumors to exide immune surveillance. Recent clinical advances immunotherapy demonstrated that some cancer with established lymphocyte infiltrates, express immune checkpoint inhibitory molecules, such as PD-L1, to allow their progression. During this thesis, another link between EMT and immune escape, through the regulation of PD-L1 in non-smal cell lung caricinoma was established. A new role of IKKƐ in the regulation of PD-L1 during EMT was also been shown