Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Cellules spermatiques“

AbstractUltrastructural observations show that in Saduria entomon (L., 1758) sperm bundles are organized already in the testis, and that a crucial function in this process is played by Sertoli cells, whose protrusions are connected with maturing spermatids. The specific arrangement of maturing spermatids around a Sertoli cell protrusion and their turned-out tails lying centrally in channels reflect the arrangement of spermatozoa in a later bundle. One might assume, therefore, that the pattern along which sperm bundles are organized, which results from their specific structure, is made possible by the way in which the lumen of the testis is penetrated by protrusions of the Sertoli cells. A further role of the Sertoli cells is to produce and secrete matrix components and precursor material for extracellular tubules. Both structures are permanent elements of sperm bundles in isopods. In S. entomon extracellular tubules have a diameter of 80 nm, and their assembling proceeds in close contact with the membrane of a Sertoli cell protrusion. Des observations ultrastructurales montrent que, chez Saduria entomon (L., 1758), les masses spermatiques sont deja organisees dans le testicule et qu'un role crucial dans le processus est joue par les cellules de Sertoli, dont les protrusions sont connectees avec les spermatides en maturation. L'arrangement specifique de ces dernieres autour d'une protrusion de cellule de Sertoli et de leurs queues retournees en position centrale dans les canaux reflete l'arrangement des spermatozoodes dans une masse ulterieure. On peut de ce fait presumer que le modele suivant lequel les masses spermatiques sont organisees, et qui resulte de leur structure specifique, est rendu possible par la facon par laquelle les protrusions des cellules de Sertoli penetrent le testicule. Un autre role des cellules de Sertoli est de produire et de secreter les composants de la matrice et le materiel precurseur pour les tubules extracellulaires. Les deux structures sont des elements permanents des masses spermatiques chez les isopodes. Chez S. entomon, les tubules extracellulaires ont un diametre de 80 nm, et leur assemblage s'effectue en etroit contact avec la membrane d'une protrusion de cellule de Sertoli.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre du projet CRB-Anim (Centre de Ressources Biologiques d’Animaux Domestiques) dont le but est de constituer une cryobanque nationale et d’améliorer les techniques de cryoconservation. Aujourd’hui, les ressources biologiques de type reproductif (embryons, sperme, ovocytes) et de type somatique (fibroblastes et cellules souches pluripotentes) sont conservées dans des milieux contenant des produits d’origine animale (POA). L’utilisation actuelle des POA (sérums, lait, jaune d’œuf) pose des problématiques sanitaires (risque de contamination) et scientifiques (manque de reproductibilité liée à la variabilité de composition des POA). Cette étude a pour objectif d’évaluer l’effet d’un milieu de préservation synthétique, chimiquement défini, breveté pour la congélation de cellules de sang de cordon (STEMALPHA.CRYO3) sur la cryoconservation de sperme ovin et bovin, et de cellules souches pluripotentes de lapin. Pour cela, une approche biologique (étude in vitro et in vivo sur le terrain), alliée à une approche physique (étude des cinétiques de refroidissement et caractérisation des propriétés thermodynamiques des milieux de congélation) ont été mis en place.Nos résultats montrent l’intérêt de l’utilisation du STEMALPHA.CRYO3, en tant que substituant aux sérums, dans les solutions de cryoconservation des cellules souches pluripotentes. Néanmoins, notre étude indique que ce produit n’est pas efficace pour protéger le sperme lors de la congélation. Cette thèse confirme l’intérêt de standardiser les procédures de cryoconservation afin d’assurer la qualité des ressources biologiques pour les cryobanques et les échanges internationaux
Nowadays, reproductive (embryos, sperm, oocytes) and somatic (fibroblasts and pluripotent stem cells) resources are cryopreserved in media containing animal-derived products (serum, egg yolk, milk). Using these products raises sanitary (risk of contamination) as well as scientific concerns (reproducibility limits due to the variability of their composition). This study aims to replace animal derived-product in assessing the effect of a synthetic and chemically defined medium, STEMALPHA.CRY03® (Stem Alpha, France), on the cryopreservation of ovine and bovine sperm, and on rabbit pluripotent stem cells. First, a physical approach permitted to study the cooling rates and the characterization of thermodynamic properties of the freezing media. The differential scanning calorimetry allowed us to define their phase transition temperatures (crystallization temperature, melting temperature and enthalpy variation of crystallization, proportional to the amount of crystallized ice). Second, a biological approach was used for the cryopreservation of bovine and ovine sperm, as well as rabbit pluripotent stem cells. Flow cytometry and computer- assisted sperm analyses showed that STEMALPHA.CRY03® impaired bovine sperm, compared to a medium containing animal derived-product. These last results were confirmed in ovine species. Nevertheless, artificial insemination by laparoscopy (n = 270 ewes) counteracts this impairment and allowed an average pregnancy rate of 70 %. Moreover, without any additive in the freezing medium, a similar pregnancy rate was obtained. The study of pluripotent gene expression profile, and analyses of viability and growth rates for the cryopreservation of rabbit pluripotent stem cells confirmed that synthetic media, STEMALPHA.CRY03® (with 4, 5 or 10 % of cryoprotectant) and CryoStor® CS10 (containing 10 % of cryoprotectant) were more efficient than serum-based media. We demonstrate that it is possible to cryopreserve sperm cells and pluripotent stem cells in synthetic and chemically defined media. 0ur results confirmed the interest of a standardized approach for cryopreservation procedures of genetic resources in mammals. This work meets the needs of cryobanking activities (quality policy) and of the regulation development within the framework of international trade

Chez les espèces aviaires, le stockage des spermatozoïdes s’étend sur plusieurs semaines principalement au niveau du réservoir de la jonction utéro-vaginale, contenant les tubules de stockage des spermatozoïdes (SST). Les mécanismes impliqués dans ce processus restent indéterminés. L’effet de l’insémination artificielle (IA) a été évalué sur le protéome du fluide utérin (FU), des protéines cibles et des glycanes dans les SST, provenant de poules possédant une longue (F+) ou courte (F-) durée de stockage. La longue durée de stockage est associée à une abondance relative dans le FU après IA des protéines exosomales (ANXA4, ANXA5), des protéoglycanes (TSKU), des protéines liant les protéoglycanes (HAPLN3, FN1, VTN), des transporteurs de lipides (VTG1, VTG2, APOA1, APOA4, APOH), et des protéines matricielles de la coquille (OCX32). Au contraire, la faible capacité de stockage est associée à la régulation après IA des protéines immunitaires (PIGR, immunoglobulines) ou pro-inflammatoire (LTA4H), des protéases (XPNPEP1), des chaperones (HSPA8), des mucines (MUC5AC, MUC5B), et de l’ovalbumine (OVALY). Au niveau des SST, les protéines matricielles de la coquille (OC-116, OCX36, OC-17) ont été identifiées dans l’épithélium et la lumière. La longue durée de stockage est associée à la sécrétion luminale de résidus Glc/GlcNAc, à la mobilisation apicale de protéines exosomales (ANXA4), et la non-activation des voies métaboliques impliquant les protéines PIGR, HSPA8, et ANXA5 dans les SST. En conclusion, la composition protéique du FU et des SST requièrent des régulations spécifiques après IA certainement pour garantir le stockage des spermatozoïdes
In avian species, the sperm storage mainly takes place in uterovaginal sperm storage tubules (SST) during several weeks. Mechanisms implied in this process are not fully understood. The effect of artificial insemination (AI) has been evaluated on the uterine fluid (UF) proteomic composition, and on SST candidate proteins, from hens exhibiting long (F+) or short (F-) sperm storage duration. Long sperm storage duration was associated with the relative abundance in UF after AI of proteoglycans (TSKU), proteoglycan binding proteins (HAPLN3, FN1, VTN), lipid transporters (VTG1, VTG2, APOA1, APOA4, APOH), and eggshell matrix proteins (OCX32). In contrast, poor sperm storage ability was associated with the regulation of immune factors (PIGR, immunoglobulins), pro-inflammatory factors (LTA4H), proteases (XPNPEP1), chaperone (HSPA8), mucins (MUC5AC, MUC5B), and ovalbumin related protein Y (OVALY). At the level of SST, eggshell matrix proteins (OC-116, OCX36, OC-17) were identified in SST cells and lumen. Long sperm storage duration was associated in SST with the luminal secretion of Glc/GlcNAc residues, ANXA4 apical mobilization, and non-activation of metabolic pathway implying PIGR, HSPA8, and ANXA5. In conclusion, the proteomic composition of UF and SST require specific regulation after insemination, most probably to guarantee the success of sperm storage process

Les biotechnologies de la reproduction par insémination artificielle sont largement répandues dans le secteur primaire de l'élevage, notamment pour des espèces telles que les bovins, les porcins, les équins et les aviaires. L'insémination artificielle permet de maîtriser la fertilité et d'améliorer la génétique des cheptels en s'affranchissant des contraintes liées au déplacement des animaux. Elle rend possible la fécondation d'un grand nombre de femelles avec la semence d'un seul mâle. Les descendants héritant d'une partie du patrimoine génétique du mâle, ce dernier est choisi en fonction de ses qualités, comme le développement musculaire pour un taureau de race à viande par exemple. D'autres avantages de l'insémination artificielle incluent la réduction des coûts grâce à une diminution de la population de reproducteurs mâles, la limitation des risques sanitaires (maladies sexuellement transmissibles), et le contrôle de la période de mise-bas. Chez plusieurs espèces, le conditionnement cryogénique des semences est devenu une pratique courante, facilitant ainsi la conservation et la distribution internationale des ressources génétiques animales. Dans ce contexte, l'utilisation de biopolymères pourrait apporter des avantages notables. Leur aptitude à former des gels ou des milieux visqueux et à stabiliser les suspensions pourrait améliorer l'efficacité de la conservation des semences animales
Reproductive biotechnologies using artificial insemination are widely spread in the primary livestock sector, particularly for species such as cattle, pigs, horses, and poultry. Artificial insemination allows for the control of fertility and the improvement of herd genetics without the constraints associated with moving animals. It makes it possible to fertilize many females with the semen of a single male. As the offspring inherit part of the male's genetic makeup, the male is selected based on his qualities, such as muscle development in the case of a beef breed bull. Other advantages of artificial insemination include cost reduction through a decrease in the population of male breeders, the limitation of health risks (sexually transmitted diseases), and the control of birthing periods. In several species, the cryogenic preservation of semen has become a common practice, facilitating the conservation and international distribution of animal genetic resources. In this context, the use of biopolymers could offer significant benefits. Their ability to form gels or viscous media and stabilize suspensions could enhance the effectiveness of animal semen preservation

Les étapes d'adhésion et de fusion entre l'ovocyte et le spermatozoïde sont des étapes cruciales dans le processus de fécondation. Cependant, de nombreuses questions sont posées aujourd'hui à propos des processus moléculaires qui sous-tendent la réussite de ces étapes. Ces dernières années, un nombre important de molécules clés ont été identifiées comme ayant un rôle majeur dans l'interaction gamétique. A ce jour, la seule protéine membranaire connue dont l'absence cause un échec total de la fécondation est la protéine spermatique Izumo1.
Izumo1 est une protéine transmembranaire, membre de la famille des protéines Izumo et de la superfamille des Immunoglobulines. Malgré son rôle clé dans l'interaction gamétique, ses propriétés fonctionnelles en tant que protéine d'adhésion, de fusion ou ayant la capacité d'organiser des réseaux comprenant des protéines de fusion n'est pas encore élucidé.
Dans cette étude nous nous sommes intéressés au rôle d'Izumo1 dans l'interaction gamétique.
Pour cela, nous avons généré deux variantes exogènes de la protéine Izumo1et les avons surexprimées à la membrane de plusieurs lignées cellulaires. L'interaction entre ces cellules exprimant la protéine et l'ovocyte a été analysée au moyen d'une technique de micromanipulation de cellules couplée à l'imagerie confocale. Nous avons ainsi mis en évidence une forte adhésion entre les cellules exprimant Izumo1 et les ovocytes et nous avons quantifié sa cinétique. Nous avons également généré le domaine extracellulaire recombinant afin de déterminer si Izumo1 seule était capable de se lier directement à l'ovocyte et comment. Nous avons sondé au moyen d'une technique fine de mesure de forces, le biomembrane force probe, l'interaction entre un Izumo1 unique et l'ovocyte. Ces expériences permettent de confirmer que c'est bien Izumo1 et non un partenaire qui est responsable de la forte adhésion entre cellules et ovocytes. Par observation en microscopie confocale d'un ovocyte interagissant avec des cellules surexprimant Izumo1-GFP, nous avons observé l'accumulation d'Izumo1-GFP dans la zone d'adhésion. Le fait que ce processus se reproduise lorsque plusieurs cellules adhèrent à l'ovocyte suggère qu'Izumo1 possède une molécule partenaire largement exprimée à la membrane de l'ovocyte avec laquelle il interagit pour créer de l'adhésion.

Les problèmes de fertilité s'appliquent à l'homme, touchant une part croissante de la population, et aux espèces d'élevage comme le porc, freinant la diffusion de caractères d'intérêt. Dans ce projet, nous avons étudié deux mécanismes liés à l'infertilité : la dérégulation du profil de méthylation de l'ADN gamétique et les remaniements chromosomiques. Nous avons d'abord constaté que le niveau de méthylation de l'ADN spermatique est conservé entre trois espèces de mammifères au niveau global et local, ainsi qu'entre verrats fertiles et infertiles. Une augmentation de la méthylation dans le locus GNAS a été mise en évidence, ainsi qu'une dérégulation de son expression chez certains animaux infertiles, reliant pour la première fois hyperméthylation de cette région et infertilité chez les mammifères. Nous avons ensuite choisi de produire des lignées de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) par reprogrammation cellulaire de fibroblastes issus d'animaux infertiles porteurs de remaniements chromosomiques, pour étudier ensuite leur différentiation dans la voie germinale. Les lignées obtenues pour un verrat azoospermique t(Y;14) possèdent de nombreuses caractéristiques des cellules pluripotentes : expression de gènes spécifiques, cycle cellulaire modifié, et capacité à évoluer vers l'état naïf dans un milieu de culture adapté. Toutefois, leur capacité de différenciation est faible et elles présentent une instabilité génomique augmentant avec les passages que nous avons associé à la méthode intégrative de reprogrammation. L'utilisation d'une méthode non intégrative a montré que les cellules iPS ainsi obtenues sont plus stables et pourraient constituer un meilleur outil
Fertility issues concern both humans, affecting a growing part of the population, and farm animals including pigs in which they slow down the diffusion of agronomical traits of interest. In this project, we focused on two mechanisms linked to infertility: alterations in gametic DNA methylation and chromosomal rearrangements. We first observed that the methylation level of spermatic DNA is conserved between three mammalian species, both at the global and local level as well as between fertile and infertile boars. A specific increase in DNA methylation in the GNAS locus was identified, as well as a deregulation of its expression in some boars with low quality semen, linking for the first time hypermethylation of this region and male infertility in mammals. We then chose to produce induced pluripotent stem cell lines (iPSCs) derived from fibroblasts of infertile boars carrying chromosomal rearrangements, as a tool for studying their differentiation towards the germ cell lineage. Cell lines derived from an azoospermic t(Y;14) boar harbor several characteristics of pluripotency: expression of specific genes, a cell cycle resembling the one of embryonic stem cells, and an ability to evolve into the naïve state in adapted culture medium. However they revealed a poor differentiation potential and a genomic instability increasing with passaging that we associated with the use a an integrative reprogramming technique. The use of a non-integrative technique demonstrated that the cell lines obtained with this method did not harbor this instability. Their preliminary characterization may be predictive of production of more stable cell lines gathering more characters of pluripotency