Dissertationen zum Thema „Candida albicans – diet therapy“

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-09Bitstream added on 2014-06-13T18:31:37Z : No. of bitstreams: 1 martins_js_me_sjc.pdf: 608313 bytes, checksum: e32f819f13bdf398082ecb9e208a1b5a (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica sobre a patogenicidade de C. albicans e C. dubliniensis na candidose bucal em ratos. Foram utilizados 96 ratos (Rattus norvegicus, Albinus, Wistar), sendo que 80 animais foram submetidos à indução de candidose experimental no dorso da língua por C. albicans ou C. dubliniensis e 16 ratos não foram infectados por Candida. Após 5 dias da indução da candidose, foram realizados diferentes tratamentos: laser e azul de metileno como fotossensibilizador (Grupo L+F+), apenas laser (Grupo L+F-), apenas fotossensibilizador (Grupo L-F+) e grupo sem laser e fotossensibilizador (Grupo L-F-). Após 1 dia, amostras do dorso da língua foram coletadas e semeadas em ágar Sabouraud para contagem de UFC/mL recuperadas da cavidade bucal. Os animais foram submetidos à eutanásia para análise microscópica do dorso da língua. Foi avaliada também a capacidade de produção de fosfolipase e proteinase por C. albicans e C. dubliniensis. Os resultados demonstraram que a quantidade de C. albicans recuperadas da cavidade bucal dos ratos foram semelhantes entre os quatro grupos estudados. C. dubliniensis não foi recuperarada da cavidade bucal dos ratos estudados. Na análise microscópica do dorso da língua, observou-se a presença de várias lesões teciduais induzidas por C. albicans, sendo que no grupo L+F+ essas lesões foram menores em relação aos demais grupos estudados. C. dubliniensis exibiu lesões teciduais discretas sem diferença estatística entre os grupos. Em relação aos fatores de patogenicidade de C. albicans, o grupo L+F+ produziu menor quantidade de fosfolipase e proteinase em relação aos demais grupos. C. dubliniensis produziu menor quantidade de fosfolipase em relação à C. albicans, sem diferença entre os 4 grupos estudados. Entretanto, C. dubliniensis não foi capaz de produzir proteinase...
The objective was to evaluate the effects of photodynamic therapy on the pathogenicity of C. albicans and C. dubliniensis in oral rats candidosis. Were evaluated 96 rats, while 80 were subjected to candidosis experimental induction on the tongue dorsum by C. albicans or C. dubliniensis and 16 rats were not infected. After 5 days of induction candidosis, different treatments were performed: laser and methylene blue as photosensitizers (Group L+F+), laser only (Group L+F-), only photosensitizers (Group L-F+) and without laser neither photosensitizers group (Group L-F). After 1 day, samples of the tongue dorsum were collected and sown on Sabouraud agar for counts of UFC/mL recovered from the oral cavity. The animals were submitted to euthanasia for microscopic analysis. It also evaluated the production capacity of a proteinase and phospholipase C. albicans and C. dubliniensis. The results showed that the amount of C. albicans recovered from rats oral cavity were similar among the four groups. To recover C. dubliniensis of the oral cavity from studied rats was not possible. In microscopic examination of tongue dorsum, was seen the presence of multiple tissue lesions induced by C. albicans, whereas in group L+ F+ these lesions were smaller than in other groups. C. dubliniensis showed slight tissue lesions with no statistic difference between groups. Regarding the factors of pathogenicity of C. albicans, the group L+F+ produced smaller amounts of phospholipase and proteinase compared to other groups. C. dubliniensis produced fewer quantitiy of phospholipase related to C. albicans, without difference between the 4 (four) groups studied. However, C. dubliniensis was not able to produce proteinase. It was concluded that the development of experimental candidosis by C. dubliniensis was less than that induced by C. albicans. Photodynamic therapy was effective on treatment... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-20Bitstream added on 2014-06-13T18:09:12Z : No. of bitstreams: 1 pereira_ca_me_sjc.pdf: 3427201 bytes, checksum: 7d684064d1dd59c89bf2d7b2b63a765e (MD5)
O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) em biofilmes formados por C. albicans (GI), S. aureus (GII) e S. mutans (GIII), isolados e em associações (GIV-VII). Os biofilmes foram formados em discos de resina acrílica esterilizados imersos em caldo de infusão cérebro coração com 5% de sacarose, inoculados com a suspensão microbiana e incubados por 5 dias. Após o período de incubação, os discos foram lavados com solução fisiológica esterilizada para remover as células não-aderidas. Foram avaliados os efeitos do fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentração de 0,1 mg/mL por 5 min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s, isolados e em conjunto. Os biofilmes foram desprendidos em solução fisiológica em agitador ultrasônico. Foram realizadas diluições e alíquotas semeadas em ágar seletivos e incubadas por 48 h. Os números de UFC/mL em Log10 foram analisados estatisticamente (ANOVA, teste de Tukey, p< 0.05). Também foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos discos com biofilmes dos grupos controle e TFD. Foram observadas reduções significativas na viabilidade de todos os biofilmes expostos ao AM e laser. As reduções (log10) foram maiores em biofilmes isolados, com: 40.22% para C. albicans (GI), 55.91% para S. aureus (GII) e 47.35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes mistos as reduções (log10) foram: 35.08% para C. albicans e 43.9% para S. aureus (GIV); 31.54% para C. albicans e 38.7% para S. mutans (GV); 40.12% para S. aureus e 37.14% para S. mutans (GVI); 19.56% para C. albicans, 28.41% para S. aureus e 24.94% para S. mutans (GVII). As imagens de MEV demonstraram uma fotossensibilização letal predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes. Conclui-se que a TFD pode ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais.
The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial effect of photodynamic therapy (PDT) in biofilms formed by C. albicans (GI), S. aureus (GII) and S. mutans (GIII), alone and in associations (GIVGVII). The biofilms were grown in acrylic resin discs immersed in sterile brain heart infusion broth (BHI) containing 5% sucrose, inoculated with microbial suspension and incubated for 5 days. On the fifth day, the discs were washed in sterile saline solution in order to remove loosely bound material. The effects of the methylene blue (MB) photosensitizers at a concentration of 0,1 mg/mL for 5 min and AsGaAl laser (660 nm) for 98 s, alone and conjugated were evaluated. The dics were placed into tubes with sterile saline solution and sonicated for 30 s in order to disperse the biofilms. Ten-fold serial dilutions were carried out and aliquots plated in selective agar which were then incubated for 48 h. Then the numbers CFU/mL (log10) were counted and analyzed statistically (ANOVA, Tukey´s test, p< 0,05) Scanning electron microscopy (SEM) on discs with PDT and control biofilms groups were performed. Significant decreases in the viability of all microorganisms were observed when biofilms were exposed to both MB and laser. Reductions (log10) in single-species biofilms were greater than associated biofilms with: 40.22% for C. albicans (GI), 55.91% for S. aureus (GII) and 47.35% for S. mutans (GIII). In associated biofilms the reductions (Log10) were: 35.08% for C. albicans and 43.9% for S. aureus (GIV); 31.54% for C. albicans and 38.7% for S. mutans (GV); 40.12% for S. aureus and 37.14% for S. mutans (GVI); 19.56% for C. albicans, 28.41% for S. aureus and 24.94% for S. mutans (GVII). Scanning electron microscopy micrographs suggested that lethal photosensitization occurred predominantly in the outermost layers of the biofilms. It was concluded that PDT using MB photosensitizer and laser may be a useful approach in the control of oral biofilms.

Orientador: Juliana Campos Junqueira
Banca: Antonio Olavo Cardoso Jorge
Banca: Martha Simões Ribeiro
Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica sobre a patogenicidade de C. albicans e C. dubliniensis na candidose bucal em ratos. Foram utilizados 96 ratos (Rattus norvegicus, Albinus, Wistar), sendo que 80 animais foram submetidos à indução de candidose experimental no dorso da língua por C. albicans ou C. dubliniensis e 16 ratos não foram infectados por Candida. Após 5 dias da indução da candidose, foram realizados diferentes tratamentos: laser e azul de metileno como fotossensibilizador (Grupo L+F+), apenas laser (Grupo L+F-), apenas fotossensibilizador (Grupo L-F+) e grupo sem laser e fotossensibilizador (Grupo L-F-). Após 1 dia, amostras do dorso da língua foram coletadas e semeadas em ágar Sabouraud para contagem de UFC/mL recuperadas da cavidade bucal. Os animais foram submetidos à eutanásia para análise microscópica do dorso da língua. Foi avaliada também a capacidade de produção de fosfolipase e proteinase por C. albicans e C. dubliniensis. Os resultados demonstraram que a quantidade de C. albicans recuperadas da cavidade bucal dos ratos foram semelhantes entre os quatro grupos estudados. C. dubliniensis não foi recuperarada da cavidade bucal dos ratos estudados. Na análise microscópica do dorso da língua, observou-se a presença de várias lesões teciduais induzidas por C. albicans, sendo que no grupo L+F+ essas lesões foram menores em relação aos demais grupos estudados. C. dubliniensis exibiu lesões teciduais discretas sem diferença estatística entre os grupos. Em relação aos fatores de patogenicidade de C. albicans, o grupo L+F+ produziu menor quantidade de fosfolipase e proteinase em relação aos demais grupos. C. dubliniensis produziu menor quantidade de fosfolipase em relação à C. albicans, sem diferença entre os 4 grupos estudados. Entretanto, C. dubliniensis não foi capaz de produzir proteinase... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The objective was to evaluate the effects of photodynamic therapy on the pathogenicity of C. albicans and C. dubliniensis in oral rats candidosis. Were evaluated 96 rats, while 80 were subjected to candidosis experimental induction on the tongue dorsum by C. albicans or C. dubliniensis and 16 rats were not infected. After 5 days of induction candidosis, different treatments were performed: laser and methylene blue as photosensitizers (Group L+F+), laser only (Group L+F-), only photosensitizers (Group L-F+) and without laser neither photosensitizers group (Group L-F). After 1 day, samples of the tongue dorsum were collected and sown on Sabouraud agar for counts of UFC/mL recovered from the oral cavity. The animals were submitted to euthanasia for microscopic analysis. It also evaluated the production capacity of a proteinase and phospholipase C. albicans and C. dubliniensis. The results showed that the amount of C. albicans recovered from rats oral cavity were similar among the four groups. To recover C. dubliniensis of the oral cavity from studied rats was not possible. In microscopic examination of tongue dorsum, was seen the presence of multiple tissue lesions induced by C. albicans, whereas in group L+ F+ these lesions were smaller than in other groups. C. dubliniensis showed slight tissue lesions with no statistic difference between groups. Regarding the factors of pathogenicity of C. albicans, the group L+F+ produced smaller amounts of phospholipase and proteinase compared to other groups. C. dubliniensis produced fewer quantitiy of phospholipase related to C. albicans, without difference between the 4 (four) groups studied. However, C. dubliniensis was not able to produce proteinase. It was concluded that the development of experimental candidosis by C. dubliniensis was less than that induced by C. albicans. Photodynamic therapy was effective on treatment... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-25Bitstream added on 2014-06-13T18:56:12Z : No. of bitstreams: 1 costa_acbp_me_sjc.pdf: 3713548 bytes, checksum: 5d63f9c051b3f55b3f5296a1362fb144 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Os objetivos do presente estudo foram avaliar a ação antifúngica da Terapia Fotodinâmica (TFD) em culturas planctônicas e biofilmes de Candida albicans formados in vitro e em modelo de candidose experimental em camundongos, bem como sua interferência na aderência de C. albicans às células epiteliais bucais humanas in vitro. Foi utilizada cepa padrão de C. albicans (ATCC 18804) para os ensaios. Como fonte de luz foi utilizado o Diodo Emissor de Luz (LED) com emissão de luz verde (532±10 nm) com potência de 90 mW e fotossensibilizador eritrosina nas concentrações variando de 200 a 0,39 μM para os ensaios em cultura plactônica. O biofilme foi formado em placas de 96 poços e tratado com o fotossensibilizador eritrosina na concentração de 400 μM e luz LED. 56 camundongos machos e adultos foram imunossuprimidos e inoculados com suspensões contendo 108 células/mL de C. albicans. Os animais foram submetidos a TFD mediada pelo corante eritrosina (400 μM) e irradiados por LED. Antes e após os tratamentos, foram recuperadas leveduras da cavidade bucal dos animais. As leveduras recuperadas após a TFD e grupo controle foram avaliadas quanto a interferência da TFD na aderência de C. albicans às células do epitélio bucal humano. Em seguida, os animais foram sacrificados e as línguas retiradas para análise macroscópica e histológica. Os biofilmes, línguas e lâminas de aderência foram também analisados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A análise dos dados foi feita por ANOVA e Teste de Tukey, teste t de Student e Kruskal-Wallis (P < 0,05). A TFD aplicada à cultura planctônica de C. albicans foi dose-dependente com redução significativa a partir da menor concentração testada (0,39 μM) e 100% de morte das células a partir de 3,12 μM. A TFD em biofilme formado in vitro reduziu 0,74 log10 de C. albicans com redução de leveduras e hifas...
The aims of the present study were evaluate the antifungal action of Photodynamic Therapy (PDT) on Candida albicans planktonic cultures and biofilms formed in vitro and experimental candidosis model in mice, as well as its interference on C. albicans adherence on humans buccal epithelial cells in vitro. Standard strain of C. albicans (ATCC 18804) was used for assays. Green Light Emitting Diode (LED- 532 ± 10 nm) was used as light source with an output power of 90 mW and erythrosine photosensitizer at concentrations range from 200 to 0.39 μM for the assays on plaktonic cultures. The biofilm was formed on plates of 96- wells and treated with the erythrosine photosensitizer at a concentration of 400 μM and LED light. 56 adults and males mice were immunosuppressed and inoculated with suspensions containing 108 cells/ mL of C. albicans. The animals were submitted to erythrosine dye- mediated PDT (400 μM) and irradiated by LED. Before and after the treatments, yeasts from the animals´ oral cavities were recovered. The yeasts recovered after PDT and control group were evaluated for interference of PDT on C. albicans adherence to humans buccal epithelial cells. Following, the animals were sacrified and their tongues taken away for macroscopic and histological analysis. The biofilms, tongues and adherence slices were also analized by Scanning Electron Microscopy (SEM). The analysis of the dates were done by ANOVA and Tukey test, Student t test and Kruskal-Wallis (P < 0.05). PDT applied on C. albicans planktonic culture was concentrationdependent with significant reduction from minor concentration tested (0.39 μM) and 100% of cells death from 3.12 μM. C. albicans biofilm formed in vitro was reduced 0.74 log10 by PDT with reduction of yeasts and hyphaes verified by SEM. In vivo, 0.73 log10 of C. albicans and 35% adherence on buccal epithelial cells were reduced, but there was not... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge
Banca: Juliana Campos Junqueira
Banca: Aguinaldo Silva Garcez Segundo
Resumo: Os objetivos do presente estudo foram avaliar a ação antifúngica da Terapia Fotodinâmica (TFD) em culturas planctônicas e biofilmes de Candida albicans formados in vitro e em modelo de candidose experimental em camundongos, bem como sua interferência na aderência de C. albicans às células epiteliais bucais humanas in vitro. Foi utilizada cepa padrão de C. albicans (ATCC 18804) para os ensaios. Como fonte de luz foi utilizado o Diodo Emissor de Luz (LED) com emissão de luz verde (532±10 nm) com potência de 90 mW e fotossensibilizador eritrosina nas concentrações variando de 200 a 0,39 μM para os ensaios em cultura plactônica. O biofilme foi formado em placas de 96 poços e tratado com o fotossensibilizador eritrosina na concentração de 400 μM e luz LED. 56 camundongos machos e adultos foram imunossuprimidos e inoculados com suspensões contendo 108 células/mL de C. albicans. Os animais foram submetidos a TFD mediada pelo corante eritrosina (400 μM) e irradiados por LED. Antes e após os tratamentos, foram recuperadas leveduras da cavidade bucal dos animais. As leveduras recuperadas após a TFD e grupo controle foram avaliadas quanto a interferência da TFD na aderência de C. albicans às células do epitélio bucal humano. Em seguida, os animais foram sacrificados e as línguas retiradas para análise macroscópica e histológica. Os biofilmes, línguas e lâminas de aderência foram também analisados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A análise dos dados foi feita por ANOVA e Teste de Tukey, teste t de Student e Kruskal-Wallis (P < 0,05). A TFD aplicada à cultura planctônica de C. albicans foi dose-dependente com redução significativa a partir da menor concentração testada (0,39 μM) e 100% de morte das células a partir de 3,12 μM. A TFD em biofilme formado in vitro reduziu 0,74 log10 de C. albicans com redução de leveduras e hifas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The aims of the present study were evaluate the antifungal action of Photodynamic Therapy (PDT) on Candida albicans planktonic cultures and biofilms formed in vitro and experimental candidosis model in mice, as well as its interference on C. albicans adherence on humans buccal epithelial cells in vitro. Standard strain of C. albicans (ATCC 18804) was used for assays. Green Light Emitting Diode (LED- 532 ± 10 nm) was used as light source with an output power of 90 mW and erythrosine photosensitizer at concentrations range from 200 to 0.39 μM for the assays on plaktonic cultures. The biofilm was formed on plates of 96- wells and treated with the erythrosine photosensitizer at a concentration of 400 μM and LED light. 56 adults and males mice were immunosuppressed and inoculated with suspensions containing 108 cells/ mL of C. albicans. The animals were submitted to erythrosine dye- mediated PDT (400 μM) and irradiated by LED. Before and after the treatments, yeasts from the animals' oral cavities were recovered. The yeasts recovered after PDT and control group were evaluated for interference of PDT on C. albicans adherence to humans buccal epithelial cells. Following, the animals were sacrified and their tongues taken away for macroscopic and histological analysis. The biofilms, tongues and adherence slices were also analized by Scanning Electron Microscopy (SEM). The analysis of the dates were done by ANOVA and Tukey test, Student t test and Kruskal-Wallis (P < 0.05). PDT applied on C. albicans planktonic culture was concentrationdependent with significant reduction from minor concentration tested (0.39 μM) and 100% of cells death from 3.12 μM. C. albicans biofilm formed in vitro was reduced 0.74 log10 by PDT with reduction of yeasts and hyphaes verified by SEM. In vivo, 0.73 log10 of C. albicans and 35% adherence on buccal epithelial cells were reduced, but there was not... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0
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Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia)
IPEN/D-MPLO
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, São Paulo

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:26:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0
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Dissertacao (Mestrado)
IPEN/D
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge
Banca: Aguinaldo Silva Garcez Segundo
Banca: Luciane Dias de Oliveira
Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) em biofilmes formados por C. albicans (GI), S. aureus (GII) e S. mutans (GIII), isolados e em associações (GIV-VII). Os biofilmes foram formados em discos de resina acrílica esterilizados imersos em caldo de infusão cérebro coração com 5% de sacarose, inoculados com a suspensão microbiana e incubados por 5 dias. Após o período de incubação, os discos foram lavados com solução fisiológica esterilizada para remover as células não-aderidas. Foram avaliados os efeitos do fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentração de 0,1 mg/mL por 5 min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s, isolados e em conjunto. Os biofilmes foram desprendidos em solução fisiológica em agitador ultrasônico. Foram realizadas diluições e alíquotas semeadas em ágar seletivos e incubadas por 48 h. Os números de UFC/mL em Log10 foram analisados estatisticamente (ANOVA, teste de Tukey, p< 0.05). Também foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos discos com biofilmes dos grupos controle e TFD. Foram observadas reduções significativas na viabilidade de todos os biofilmes expostos ao AM e laser. As reduções (log10) foram maiores em biofilmes isolados, com: 40.22% para C. albicans (GI), 55.91% para S. aureus (GII) e 47.35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes mistos as reduções (log10) foram: 35.08% para C. albicans e 43.9% para S. aureus (GIV); 31.54% para C. albicans e 38.7% para S. mutans (GV); 40.12% para S. aureus e 37.14% para S. mutans (GVI); 19.56% para C. albicans, 28.41% para S. aureus e 24.94% para S. mutans (GVII). As imagens de MEV demonstraram uma fotossensibilização letal predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes. Conclui-se que a TFD pode ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais.
Abstract: The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial effect of photodynamic therapy (PDT) in biofilms formed by C. albicans (GI), S. aureus (GII) and S. mutans (GIII), alone and in associations (GIVGVII). The biofilms were grown in acrylic resin discs immersed in sterile brain heart infusion broth (BHI) containing 5% sucrose, inoculated with microbial suspension and incubated for 5 days. On the fifth day, the discs were washed in sterile saline solution in order to remove loosely bound material. The effects of the methylene blue (MB) photosensitizers at a concentration of 0,1 mg/mL for 5 min and AsGaAl laser (660 nm) for 98 s, alone and conjugated were evaluated. The dics were placed into tubes with sterile saline solution and sonicated for 30 s in order to disperse the biofilms. Ten-fold serial dilutions were carried out and aliquots plated in selective agar which were then incubated for 48 h. Then the numbers CFU/mL (log10) were counted and analyzed statistically (ANOVA, Tukey's test, p< 0,05) Scanning electron microscopy (SEM) on discs with PDT and control biofilms groups were performed. Significant decreases in the viability of all microorganisms were observed when biofilms were exposed to both MB and laser. Reductions (log10) in single-species biofilms were greater than associated biofilms with: 40.22% for C. albicans (GI), 55.91% for S. aureus (GII) and 47.35% for S. mutans (GIII). In associated biofilms the reductions (Log10) were: 35.08% for C. albicans and 43.9% for S. aureus (GIV); 31.54% for C. albicans and 38.7% for S. mutans (GV); 40.12% for S. aureus and 37.14% for S. mutans (GVI); 19.56% for C. albicans, 28.41% for S. aureus and 24.94% for S. mutans (GVII). Scanning electron microscopy micrographs suggested that lethal photosensitization occurred predominantly in the outermost layers of the biofilms. It was concluded that PDT using MB photosensitizer and laser may be a useful approach in the control of oral biofilms.
Mestre

Submitted by LÍVIA MARA ALVES FIGUEIREDO (livia.figueiredo@fosjc.unesp.br) on 2017-06-06T17:36:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao mestrado final Livia.pdf: 1565199 bytes, checksum: f314f31c7fc2eba675f89a17f244abd2 (MD5)
Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-06T17:49:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 figueiredo_lma_me_sjc.pdf: 1565199 bytes, checksum: f314f31c7fc2eba675f89a17f244abd2 (MD5)
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A terapia fotodinâmica (TFD) tem demonstrado ação antimicrobiana sobre as leveduras do gênero Candida, sendo considerada uma técnica promissora para o tratamento de candidose. Recentemente foi relatado que a aplicação de TFD também pode resultar em ativação do sistema imunológico, contribuindo para a melhora da infecção. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a ação da TFD e da terapia laser sobre a resposta imunológica à candidose experimental utilizando Galleria mellonella como modelo hospedeiro de infecção. Larvas de G. mellonella foram infectadas com diferentes cepas de Candida albicans e, após 30 min, foram tratadas com TFD mediada por azul de metileno e laser diodo emitido em 660 nm. A seguir, as larvas foram incubadas a 37°C por sete dias e analisadas diariamente para determinação da curva de sobrevivência. Para o estudo da resposta imunológica, após os tempos de 3, 6, 18 h da TFD foram realizados testes de determinação da densidade de hemócitos na hemolinfa de G. mellonella. Os dados obtidos na curva de sobrevivência foram avaliados pelo teste de Log-rank (Mantel Cox) e os resultados da análise imunológica por análise de variância ANOVA e teste de Tukey, com significância de 5%. Os resultados obtidos demonstraram que tanto para a cepa ATCC 18804 como para a cepa clínica 17 de C. albicans, a TFD prolongou a sobrevivência das larvas de G. mellonella infectadas por uma dose fúngica letal. Entretanto, houve diferença estatisticamente significante entre os grupos PDT e controle somente com cepa ATCC (p=0,0056). Foi verificado também que a infecção pela cepa ATCC 18804 de C. albicans em G. mellonella levou a uma redução no número de hemócitos na hemolinfa, e o tratamento com TFD e terapia laser conseguiram aumentar o número de hemócitos, mas sem apresentar diferença estatística significante. Foi possível concluir com esse estudo que a TFD bem como a terapia laser influenciaram de maneira positiva na melhora da infecção por C. albicans no modelo de G. mellonella.
Photodynamic therapy (PDT) has demonstrated antimicrobial activity on the yeast of the genus Candida and is considered a promising technique for the treatment of candidiasis. Recently it was reported that the application of PDT may also result in activation of the immune system, contributing to the improvement of the infection. The objective of this study is to evaluate the action of PDT and laser therapy on the immune response to experimental candidiasis using Galleria mellonella as host of the infection. G. mellonella larvae were infected with different Candida albicans strains and, after 30 min were treated with methylene blue-mediated PDT and laser diode emitted at 660 nm. Then, the larvae were incubated at 37° C for seven days and analyzed daily in order to determine the survival curve. For the study of the immunological response, after intervals of 3, 6, 18 h of the PDT, tests were performed to determine the density of hemocytes in the hemolymph of G. mellonella. The data obtained in the survival curve were evaluated by the Log-rank test (Mantel Cox) and the results of the immunological analysis by analysis of variance ANOVA and Tukey test, with significance of 5%. The results demonstrated that for both the ATCC 18804 strain and the C. albicans clinical strain 17, PDT prolonged the survival of the infected G. mellonella larvae by a lethal fungal dose. However, there was a statistically significant difference between the PDT and the control groups only with ATCC strain (p = 0.0056). It was also found that infection by the C. albicans ATCC 18804 strain in G. mellonella led to a reduction in the number of hemocytes in the hemolymph, and the treatment with PDT and laser therapy succeeded in increasing the number of hemocytes but without significant statistical difference . It was possible to conclude from this study that PDT as well as laser therapy positively influenced the improvement of C. albicans infection in the G. mellonella model.

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-05-20T18:06:29Z No. of bitstreams: 0
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Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear)
IPEN/T
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Neste estudo foi proposto um modelo de formação de biofilme fúngico formado por Candida albicans em dois diferentes substratos associado ou não à glicose para o estudo dos efeitos da terapia fotodinâmica (PDT) utilizando o azul de metileno (AM) como fotossensibilizador, avaliando os efeitos de dois comprimentos de onda distintos incluindo a investigação na captação do AM quando sensibilizados previamente com a glicose. Foi avaliada a susceptibilidade da levedura em suspensão de células crescidas por 24 h (início da fase estacionária) com e sem a adição prévia da glicose. Foram investigadas duas linhagens de C. albicans para a padronização do biofilme, ATCC 90028 e ATCC 10231. Com os biofilmes formados, avaliamos a captação de AM para determinarmos a mais eficiente concentração e tempo de pré-irradiação (PIT). Por último, avaliamos sua sensibilidade à PDT em dois comprimentos de onda distintos (λ = 645 nm e λ = 660 nm) em função do tempo de irradiação (potência = 16 mW, taxa de fluência = 127,3 mW/cm2). A linhagem de célula que possibilitou a formação de biofilme foi a ATCC 10231 em discos de hidrogel. A menor concentração que possibilitou uma melhor captação do AM foi de 500 μM com um PIT de 30 min e em contato prévio com a glicose 50 mM por 90 min. O comprimento de onda mais eficiente, que promoveu redução em leveduras e biofilmes foi o de λ = 660 nm, reduzindo melhor no estudo de leveduras quando sensibilizados com glicose. Nos biofilmes, a redução foi iniciada mais precocemente sem a adição de glicose (com 6 min de irradiação e fluência = 46 J/cm2), porém, em 12 min (fluência = 92 J/cm2) o grupo com glicose passou a ter maior eficiência.
In this study we propose a fungal biofilm model of Candida albicans developed on different substrates for photodynamic effect of photodynamic therapy (PDT) study, using the methylene blue (MB) as photosensitizer, evaluating the effects on two wavelengths distinct, including investigating the difference in uptake of MB when sensitized with glucose. Susceptibility was evaluated in the yeast cell suspension with or without the prior addition of glucose to cells grown for 24 h (early stationary phase). Two strains of C. albicans were investigated for the standardization of the biofilm, ATCC 90028 and ATCC 10231. In biofilms, we evaluated the uptake of MB including cell suspension to determine the most efficient concentration and pre-irradiation time (PIT). Finally, we assess its sensitivity to PDT in two distinct wavelengths (λ = 645 nm and λ = 660 nm) as a function of irradiation time (power = 16 mW, fluence rate = 127,3 mW/cm2). The ATCC strain that allowed the biofilm formation was ATCC 10231 on hydrogel disks. The lowest concentration that enabled better uptake of MB was 500 μM with a PIT 30 min and prior contact with 50 mM glucose f or 90 min. The most effective wavelength, which promoted a reduction in biofilms and yeasts was λ = 660 nm, reducing yeast best when primed with glucose and reduction in biofilms started earlier without the addition of glucose (6 min irradiation, fluence = 46 J/cm2), but at 12 min (fluence = 46 J/cm2) the glucose group now has greater efficiency.

A candidíase vaginal (CV) é uma doença causada por fungos do gênero Candida spp. que acomete milhares de mulheres no mundo. Estima-se que 75% das mulheres sofrerão CV pelo menos uma vez durante a vida fértil, 40 a 50% terão o segundo episódio e 5 a 8% sofrerão a forma recorrente, caracterizada pela ocorrência de quatro ou mais episódios durante um ano. O tratamento ainda permanece um desafio para as candidíases complicadas. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica que utiliza substâncias fotossensibilizadoras (FS) e uma fonte de luz, que juntas, produzem espécies reativas de oxigênio, tóxicas para micro-organismos e inofensivas para a célula animal hospedeira. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antifúngicos e anti-inflamatórios da TFD mediada por azul de metileno (AM) e laser de emissao vermelha (LEV) no tratamento da CV em modelo animal. Fêmeas de camundongos BALB/c, com 6 a 10 semanas foram estrogenizadas e, 72h após, receberam via intravaginal 20μL de suspensão contendo 107 UFC/mL de C. albicans ATCC 90028. Cinco dias após, a TFD foi aplicada na vagina das fêmeas, utilizando AM 1000μM e laser (100mW, 660nm, energia de 36J por 6 min ou duas aplicações de 18J por 3min, com intervalo de 24h entre sessões). Após 0, 24 e 96h foram feitas lavagens vaginais para recuperação fúngica, cultivo microbiológico, eutanásia para remoção das vaginas e estudo histológico. Lâminas coradas por hematoxilina e eosina foram utilizadas para contagem da área de células inflamatórias (ACI), utilizando o programa ImageJ. Os resultados mostraram que TFD in vivo reduziu a carga fúngica em aproximadamente 1,6 log UFC/mL e, quando aplicada em duas sessões de 18J por 3min, diminuiu a ACI. A TFD mediada por LEV e AM 1000μM mostra-se como alternativa promissora para o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para vaginites fúngicas.
Vaginal candidiasis (VC) is a disease caused by fungi of the genus Candida spp. that affects thousands of women worldwide. It is estimated that 75% of women in childbearing age will have VC at least once, 40 to 50% will have a second episode and 5 to 8 % will suffer recurrent form, characterized by the occurrence of four or more episodes during one year. Treatment remains a challenge for complicated candidiasis. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality that uses photosensitizing (FS) substances and a light source, which together produce reactive oxygen species, toxic to microorganisms and harmless to host animal cell. The aim of this study was to evaluate antifungal and anti - inflammatory effects of PDT mediated by methylene blue (MB) and red laser (RL) in the treatment of CV in an animal model. Female BALB/c mice 6 to 10 weeks were estrous and 72h after received intravaginally 20μL of suspension containing 107 CFU/mL of C. albicans ATCC 90028. Five days after, PDT was applied in the vagina of females using MB 1000μM and laser (100mW, 660nm, 36J for 6 min or two applications of 18J for 3 min, with an interval of 24h between sessions). Vaginal washes for fungal recovery and microbiological culture, and euthanasia for removal of vaginas and histological study were made after 0, 24 and 96h. Glass slides stained by hematoxylin and eosin were used for counting the area of inflammatory cells (AIC) using ImageJ software. PDT in vivo reduced the fungal burden in approximately 1.6 log CFU/mL, and, when applied in two sessions with 18J for 3min, decreased the AIC. PDT mediated by RL and MB 1000μM shown as a promising alternative for the development of new therapeutic modalities for yeast vaginitis.

Estudos têm demonstrado o potencial da terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) na inativação de diferentes células microbianas. No geral, são três as fases de crescimento dos microrganismos: fase lag, exponencial e estacionária. Os objetivos deste estudo foram avaliar a susceptibilidade de células de Candida albicans em diferentes fases de crescimento, submetidas à aPDT, associando azul de metileno (50 μM) e luz de emissão vermelha (λ= 660 nm) e investigar alterações morfológicas, mecânicas e bioquímicas, antes e depois da aPDT, por microscopia eletrônica de varredura, de força atômica e por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier. Os resultados obtidos sugerem que, em parâmetros letais, células em fase estacionária de crescimento (48 h) são menos susceptíveis à aPDT, quando comparadas àquelas em fases lag (6 h) e ex-ponencial (24 h) de crescimento. Entretanto, em parâmetros subletais, células de 6 h e 48 h mostraram a mesma susceptibilidade à aPDT. Em sequência, os experimentos foram realizados em parâmetros considerados subletais para células crescidas por 6 e 48 h. A avaliação morfológica mostrou menor quantidade de matriz extracelular em células de 6 h comparada àquelas de 48 h. A espectroscopia de força atômica mostrou que células em fase lag perderam a rigidez após a aPDT, enquanto que células em fase estacionária mostraram comportamento in-verso. Ainda, células de 48 h diminuíram sua adesividade após a aPDT, enquanto que células de 6 h e 24 h tornaram-se mais adesivas. Os resultados bioquímicos revelaram que as diferenças mais significativas entre as células fúngicas de 6 h e 48 h ocorreram na região de DNA e carboidratos. A aPDT promoveu mais alterações bioquímicas na região de DNA e carboidratos em células de 6 h e em lipídios e ácidos graxos em células de 48 h. Nossos resultados indicam que a fase de crescimento celular desempenha papel importante no sítio de ação da aPDT em células de C. albicans.
Studies have demonstrated the potential of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) on the inactivation of different microbial cells. Overall, there are three phases of cell growth: lag phase, exponential phase and stationary phase. The objectives of this study were to evaluate the susceptibility of Candida albicans in different growth stages submitted to aPDT, with methylene blue (50μM) and red light (λ = 660 nm) and to investigate morphological, mechanical and biochemical changes before and after aPDT, by scanning electron microscopy, atomic force microscopy and by Fourier transform infrared spectroscopy. The results suggested that with lethal parameters, cells in stationary phase (48 h) are less susceptible to aPDT, compared to those in lag phase (6 h) and exponential phase (24 h). However, in sub-lethal parameters 6 h and 48 h cells showed the same susceptibility to aPDT. The following results were obtained in sub-lethal parameters. The morphological evaluation showed lower amount of extra-cellular matrix at 6 h compared to cells growth for 48 h. The atomic force spectroscopy showed that cells in lag phase lost cell wall rigidity after aPDT, while cells in stationary phase showed a reverse behavior. Furthermore, 48 h cells presented a decrease in their adhesiveness after aPDT, whereas cells growth for 6 h and 24 h become more adhesive. The biochemical evaluation showed that the most significant differences among the fungal cells growth for 6 h and 48 h in DNA and carbohydrates. The aPDT caused more expressive alterations on DNA and carbohydrates in cells growth for 6 h, while cells growth for 48 h presented significant alterations on lipids and fatty acids. Our results indicate that cell growth phase play an important role on the target sites affected by aPDT in C. albicans cells.

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Tese (Doutoramento)
IPEN/T
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-06-19T15:58:48Z No. of bitstreams: 1 Nadua Apostolico.pdf: 2774487 bytes, checksum: c4de48bfb4f153970bee3d2f104e406e (MD5)
Made available in DSpace on 2018-06-19T15:58:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nadua Apostolico.pdf: 2774487 bytes, checksum: c4de48bfb4f153970bee3d2f104e406e (MD5) Previous issue date: 2015-12-16
The sterilization step for acellular lungs prior to recellularization is important to ensure that they are free of any risk of transmitting infections from the donor to the recipient tissue/organ to be transplanted. However, there are no data on the mechanical effects induced in the lungs when subjected to a given dose of sterilization radiation through a 660-nm LED. The aim of this study was to evaluate the extracellular matrix (ECM) and lung mechanic parameters of decellularized lungs undergoing photodynamic therapy (PDT) with the purpose of sterilization, and also to perform microbiological analyses of lungs infected with C. albicans to determine the effectiveness of PDT. The lung mechanical evaluation parameters, Resistance (RL) and elastance (EL), exhibited no significant differences between groups. Also, there were no changes observed over time of irradiation, representing a maintenance of the viscoelastic behavior of the lung scaffold after 1h exposure to LED light. The ECM components remained virtually unchanged in the acellular lungs of both groups. We also showed that there was a reduction in fungi infection population after 45 minutes of PDT. However, more studies should be performed to establish and verify the effectiveness of PDT as a possible means for sterilizing lung scaffolds.
A esterilização de scaffolds pulmonares, antes de se iniciar a recelularização, é um fator importante visando assegurar que pulmões acelulares estejam livres de qualquer risco de transmissão de infecções a partir do doador para o receptor do tecido / órgão a ser transplantado. No entanto, não existem dados sobre os efeitos mecânicos induzidos nestes pulmões quando submetidos a terapia fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi analisar a matriz extracelular (MEC) e avaliar parâmetros de mecânica pulmonar de pulmões descelularizados submetidos à terapia fotodinâmica (TFD) como possível esterilização, e também realizar análises microbiológicas de pulmões infectados por C. albicans para determinar a efetividade da TFD. Os valores obtidos para avaliação do comportamento da mecânica pulmonar, resistência (RL) e elastância (EL), não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Além disso, não foram observadas alterações ao longo do tempo de irradiação, o que representa uma manutenção do comportamento viscoelástico dos scaffolds de pulmão, após 1h de exposição a luz LED. Os componentes da matriz extracelular permaneceram praticamente inalterados nos pulmões acelulares de ambos os grupos. Também foi evidenciado que houve uma redução fungica após 45 minutos de PDT. No entanto, mais estudos devem ser realizados para estabelecer e verificar a eficácia do TFD como um possível meio para esterilizar scaffolds pulmonares.

Submitted by Pedro Silva Filho (pfsilva@ipen.br) on 2017-10-09T19:13:18Z No. of bitstreams: 0
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Estudos têm demonstrado o potencial da terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) na inativação de diferentes células microbianas. No geral, são três as fases de crescimento dos microrganismos: fase lag, exponencial e estacionária. Os objetivos deste estudo foram avaliar a susceptibilidade de células de Candida albicans em diferentes fases de crescimento, submetidas à aPDT, associando azul de metileno (50 μM) e luz de emissão vermelha (λ= 660 nm) e investigar alterações morfológicas, mecânicas e bioquímicas, antes e depois da aPDT, por microscopia eletrônica de varredura, de força atômica e por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier. Os resultados obtidos sugerem que, em parâmetros letais, células em fase estacionária de crescimento (48 h) são menos susceptíveis à aPDT, quando comparadas àquelas em fases lag (6 h) e ex-ponencial (24 h) de crescimento. Entretanto, em parâmetros subletais, células de 6 h e 48 h mostraram a mesma susceptibilidade à aPDT. Em sequência, os experimentos foram realizados em parâmetros considerados subletais para células crescidas por 6 e 48 h. A avaliação morfológica mostrou menor quantidade de matriz extracelular em células de 6 h comparada àquelas de 48 h. A espectroscopia de força atômica mostrou que células em fase lag perderam a rigidez após a aPDT, enquanto que células em fase estacionária mostraram comportamento in-verso. Ainda, células de 48 h diminuíram sua adesividade após a aPDT, enquanto que células de 6 h e 24 h tornaram-se mais adesivas. Os resultados bioquímicos revelaram que as diferenças mais significativas entre as células fúngicas de 6 h e 48 h ocorreram na região de DNA e carboidratos. A aPDT promoveu mais alterações bioquímicas na região de DNA e carboidratos em células de 6 h e em lipídios e ácidos graxos em células de 48 h. Nossos resultados indicam que a fase de crescimento celular desempenha papel importante no sítio de ação da aPDT em células de C. albicans.
Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear)
IPEN/T
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Orientadores: Maria Luiza Moretti, Rogerio de Jeus Pedro
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-11T04:29:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delgado_AnaCeciliaNastrini_D.pdf: 4216034 bytes, checksum: 9c8e2de690455b1af06e61e9e3ce2bd6 (MD5) Previous issue date: 2008
Resumo: OBJETIVOS: Avaliar a incidência de colonização oral por Candida spp. em pacientes com HIV em uso de terapia anti-retroviral, comparando os resultados dos grupos de pacientes colonizados e não colonizados, assim como estudar os aspectos microbiológicos das cepas isoladas. PACIENTES E MÉTODOS: Foi realizado estudo transversal de pacientes assistidos no HC/Unicamp, de agosto de 2003 a abril de 2004, com coleta única por paciente de swab da cavidade oral. CHROMagar Candida® e ID32C® foram utilizados no cultivo, isolamento e identificação de Candida spp. e Candida Check® na determinação dos sorotipos de C. albicans. C. dubliniensis foi identificada por seqüenciamento no aparelho ABI PRISM 3100® GENETIC ANALYZER. O perfil genômico foi estudado por PFGE, usando o sistema CHEF e a sensibilidade aos azólicos, 5-fluocitosina, anfotericina B e nistatina, baseada na microdiluição em caldo (CLSI). Por meio da revisão dos prontuários foi avaliado: gênero, idade, raça, ano de diagnóstico da infecção pelo HIV, tipo de exposição ao HIV, carga viral, contagem de linfócito TCD4+, infecções oportunistas, classificação clínica da infecção pelo HIV, terapia anti-retroviral e terapia antifúngica. RESULTADOS: Foram identificados 140/324 pacientes colonizados e 184/324 não colonizados: gênero masculino (63% e 60%), exposição sexual (81,5% e 80,5%) e idade média de 38,9 anos. A presença de colonização/infecção foi significativamente maior em pacientes com carga viral detectável (p=0,002) e CD4+<200/mm3 (p=0,006). Foi evidenciada incidência de candidíase oral (31,2%), tuberculose (20,9%), herpes zoster (16,3%), pneumonia por Pneumocystis carinii (PCP) (15,7%) e toxoplasmose (11,7%), no total de pacientes estudados. Não foi observada diferença significativa de colonização por Candida entre os pacientes em uso de TARV com ou sem IP. O uso prévio de nistatina foi maior no grupo colonizado (p=0,014). Foram isoladas 115/154 C. albicans sorotipo A, 15/154 C. albicans sorotipo B e 24/154 Candida não albicans. Doze pacientes apresentaram colonização mista. O estudo genômico de C. albicans sorotipo A identificou 15 perfis diferentes, com predomínio do A1 (56,5%), que mostrou similaridade de 100% entre o perfil de C. albicans sorotipo B predominante B1 (86,6%). O perfil genômico de C. glabrata mostrou-se heterogêneo. C. albicans sorotipo A e B mostraram-se sensíveis a todos os antifúngicos avaliados. C. glabrata e C. krusei apresentaram S-DD para os azólicos. CONCLUSÃO: O trabalho contribuiu de forma significativa para traçar o perfil epidemiológico/clínico dos pacientes HIV em uso de TARV e verificou que o uso de IP não influenciou na presença ou ausência de colonização oral por Candida
Abstract: OBJECTIVES: Evaluating de incidence of oral colonization by Candida spp. in patients in use of antiretroviral therapy, comparing the results of the groups of patients colonized and non-colonized, as well as study the microbiological aspects of the isolated strains. PATIENTS AND METHODS: It was made a cross sectional study assisted at HC/UNICAMP, from August, 2003 to April, 2004, with unique collect of the oral cavity by patient using a swab. CHROMagar Candida® and ID32C® were used in growth, isolation and identification of Candida spp. and Candida Check® for determination of C. albicans sorotypes. C. dubliniensis was identified by sequencing in ABI PRISM 3100® GENETIC ANALYZER device. The genomic profile was studied by PFGE, using the system CHEF and azoles, 5-FC, amphotericin B and nistatine sensibility, based broth microdilution (CLSI). It was evaluated through the review of the prontuaries: genre, age, race, year of HIV infection diagnosis, type of exposition, viral load, TCD4+ linfocyte counting, opportunistic infections, antiretroviral therapy and antifungal therapy. RESULTS: It was identified 140/324 colonized patients and 184/324 non-colonized patients: male gender (63% and 60%), sexual exposition (81,5% and 80,5%) and average age of 39,8 years old. The presence of colonization was significantly greater in patients with detectable viral load (p=0,002) e CD4+<200/mm3 (p=0,006). The incidence of oral candidiasis (31,2%), tuberculosis (20,9%), herpes zoster (16,3%), Pneumocystis carinii pneumonia (PCP) (15,7%) and toxoplasmosis (11,7%) was seen among the total of studied patients. It was not observed a significant difference regarding colonization by Candida among the patients in use of ARVT with or without usage of PI. The early usage of nistatine was bigger in the colonized group (p=0,014). It was isolated 115/154 C. albicans sorotype A, 15/154 C. albicans sorotype B and 24/154 non albicans Candida . Twelve patients presented mixed colonization. The genomic study of C. albicans sorotype A, identified 15 different profiles, with dominance of A1 (56,5%), which shown 100 % similarity between C. albicans sorotype B and predominant B1 (86,6%). The genomic profile of C. glabrata showed heterogeneous. C. albicans serotype A and B showed sensible to all evaluated antifugicals. C. glabrata e C. krusei showed S-DD to azoles. CONCLUSION: This work contributed significantly to trace an epidemiological/clinical profile of the HIV patients in usage of ARV therapy and the lack of influence of IP in the presence or absence of colonization of oral Candida
Doutorado
Ciencias Basicas
Doutor em Clínica Médica

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-04-22T17:22:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO_SANDRA_VERSÃO FINAL_2015.pdf: 2139559 bytes, checksum: e490501d790358d3a45c1e36eb66e72c (MD5)
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FACEPE
A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) tem sido proposta como um método alternativo para o tratamento de infecções causadas por micro-organismos como bactérias e fungos. Tal técnica baseia-se na ação simultânea de uma fonte luminosa e um agente fotossensibilizador, que na presença de luz, geraa produção de oxigênio singleto e espécies reativas de oxigênio que ao interagirem com componentes celulares, promovem a morte celular desses micro-organismos. Esse estudo teve como objetivo avaliar a ação da TFDa explorando nanopartículas de prata (com tamanho médio de 13 nm) e moléculas de riboflavina(157 μM) em conjunto com um LED (Light Emitting Diode) com comprimento de onda no azul (λ=455 ± 20nm), sobre cepas de Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosae Candida albicans. As cepas de S. mutans foram repicadas em BHI (Brain Infusion Heart) e incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC, em atmosfera de 5% de CO2 por 48 he os inóculos de P. aeruginosa foram cultivados e estocados em TSA (Tryptic Soy Agar), em presença de O2, a 37º C, por 24 horas. Decorrido o tempo de incubação, colônias dos micro-organismos foram suspensas em Phosphate Buffered Saline (PBS) a uma densidade de1x107 Unidades Formadoras de Colônia (UFC)/mL.As culturas de Candida albicansforam cultivadas em meio SAB+Y (Agar Sabouraud Dextroseenriquecido com extrato de levedura). A incubação foi realizada à temperaturade 37ºC, durante período de 24 horas. Em seguida,foram preparadassuspensões com concentração de 5x106 células/mL,correspondente à turbidez de 0,5 na escala McFarland.O experimento foi dividido em doze grupos–o grupo controle, o grupo apenas com o tratamento com a luz (L), tratamento com a riboflavina (Rb), utilização da prata (Ag) e o sistema NPsAgRb+L. Posterior aotratamento, foi realizado diluição seriada e as placasincubadas a 37 ºC por 24 horas para bactérias e 48 hs para Candida sp. Ao final foi realizada a contagem de UFC/mLde ambos os micro-organismos. Os resultados foram submetidos à análise estatística descritiva. Na redução de UFC/mL foi estatisticamente significante em culturas de S. mutans com redução de 3 logs no número de células viáveis após 6 minutos de irradiação (p ˂0,05).A inativação fotodinâmica contra P. aeruginosa não foi observada estatística significativa após tratamento (p > 0,05). O mesmo foi observado nas culturas de C. albicans(p > 0,05), concluindo-se que a utilização de nanopartículas próximas ao fotossensibilizador foi eficiente contra bactérias Gram-positivas.
Antimicrobial Photodynamic Therapy (TFDA) has been proposed as an alternative method for treating infections caused by microrganisms such as bacteria and fungi. This technique is based on the simultaneous action of a light source and a photosensitizing agent, in the presence of light, generates the singlet oxygen and reactive oxygen species to interact with cellular components and promote cell death of these microrganisms. This study aimed to evaluate the action of TFDa exploring silver nanoparticles (with an average size of 13 nm) and riboflavin molecules (157 mM) in conjunction with an LED (Light Emitting Diode) with a wavelength in the blue (λ = 455 ± 20nm) on Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans. The strains of S. mutans were subcultured in BHI (Brain Heart Infusion) and incubated in bacteriological incubator at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2 for 48 h and the inocula of P. aeruginosa were grown and stored in TSA (Tryptic Soy Agar) in the presence of O2 at 37ºC for 24 hours. After the incubation time, colonies of microrganisms were suspended in Phosphate Buffered Saline (PBS) at a density of 1x107 colony forming units (CFU)/mL. The Candida albicans cultures were grown in SAB + Y (Sabouraud Dextrose Agar enriched with yeast extract). Incubation was carried out at 37°C temperature for 24 hours. Then, suspensions were prepared with a concentration of 5x106 cells/mL, corresponding to 0.5 on the McFarland turbidity scale. The experiment was divided into twelve groups - a control group, the only group with treatment with light (L), treatment with riboflavin (Rb), use of silver (Ag) and NPsAgRb + L system. After the treatment was carried out serial dilutions and the plates incubated at 37°C for 24 hours for bacteria and 48 hours for Candida sp. At the end it was performed CFU counts / ml of both microrganisms. The results were submitted to descriptive statistical analysis. The reduction of CFU/mL was statistically significant in cultures of S. mutans to 3 logs reduction in the number of viable cells after 6 minutes of irradiation (p ˂ 0.05). The photodynamic inactivation against P. aeruginosa was no statistically significant after treatment (p> 0.05). The same was observed in cultures of C. albicans (p> 0.05), it was concluded that the use of nanoparticles next to the photosensitizer was effective against Gram-positive bacteria.

ABSTRACT External otitis and its treatment. Is a group III steroid without antibiotics sufficient therapy? – Experimental and clinical studies Per Emgård, Department of Otorhinolaryngology, University of Umeå and Ystad Hospital, Umeå and Ystad, Sweden External otitis is one of the most common ear, nose and throat (ENT) diagnoses in out-patient clinics. The clinical course of external otitis includes itching, pain, redness, swelling and effusion of the external auditory canal (EAC) with normal tympanic membrane status. The inflammatory condition is often associated with infection by bacteria, e.g. Pseudomonas aeruginosa, or skin bacteria such as Staphylococcus species. Fungi are present only in a low percentage of cases and if present Candida albicans infection is the most frequent in northern countries such as Sweden and the UK. Topical therapy is recommended in most countries and dominates the therapy in most studies. Topical drugs used are usually a combination of antibiotics and a steroid. However, external otitis is treated with surprisingly many strategies – eleven different ones in Sweden, for example, and 18 in the UK. The aims of the present studies were to – -establish an animal model, infected and uninfected, suitable for testing various treatment strategies of external otitis; and -perform a clinical study in patients to elucidate whether a group III steroid alone is as efficient for treatment of external otitis as is the commonly used topical drug containing a combination of a steroid and antibiotics. The animal model was established through mechanical irritation of the external ear canal skin of Sprague-Dawley rats. An evaluation scale for characterization of the clinical status of the ear canal was introduced, recording redness, swelling and occurrence of effusion in a standardized way. Specimens of the ear canal skin were analysed by histological techniques. A topical solution of 0.05% bethametasone dipropionate (BD) was compared with a 1% hydrocortisone solution with antibiotics oxytetracycline and polymyxin B added (HCPB), administered in the external otitis model infected or non-infected with bacteria (P. aeruginosa) and a fungus (C. albicans). The same drugs were tested in a randomized parallel-group multi-centre study in 51 patients. The clinical status of the external otitis patients was evaluated on a similar scale as used in the animal model. Early normalization of the ear canal skin status and frequency of relapses during the 6-month follow-up period were used as end-points of the study. The studies showed the following: -An animal model for external otitis, infected or uninfected, could be established. -A new scale for evaluation of the external ear canal status with regard to redness, swelling and occurrence of effusion was introduced for the animal model as well as for the investigations in patients. -Treatment with a group III steroid topical solution without antibiotics was superior to treatment with a group I steroid with antibiotics added in achieving resolution of external otitis. -The effectiveness of the topical drugs in the clinical studies in external otitis patients was similar to that in animal external otitis models. We conclude that a group III steroid solution cures external otitis more effectively than does a solution containing a group I steroid combined with antibiotics, whether infected by bacteria or by fungi. No difference was evident regarding adverse effects. Furthermore, costs favour a solution without any antibiotic components. In view of these observations a group III steroid solution is preferred for remedy of external otitis in the clinical situation. Key words: external otitis, external auditory canal (EAC), animal model, treatment, betamethasone, hydrocortisone, antibiotics, human study, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans.

Discovery of new antifungal chemo-therapeutics for humans is limited by the large degree of conservation among eukaryotic organisms. In recent years, the histone acetyl-transferase Rtt109 was identified as the sole enzyme responsible for an abundant and important histone modification, histone H3 lysine 56 (H3K56) acetylation. In the absence of Rtt109, the lack of acetylated H3K56 renders yeast cells extremely sensitive to genotoxic agents. Consequently, the ability to sustain genotoxic stress from the host immune system is crucial for pathogens to perpetuate an infection. Because Rtt109 is conserved only within the fungal kingdom, I reasoned that Rtt109 could be a novel drug target. My dissertation first establishes that genome stability provided by Rtt109 and H3K56 acetylation is required for Candida albicans pathogenesis. I demonstrate that mice infected with rtt109 -/- cells experience a significant reduction in organ pathology and mortality rate. I hypothesized that the avirulent phenotype of rtt109 -/- cells is due to their intrinsic hypersensitivity to the genotoxic effects of reactive oxygen species (ROS), which are utilized by phagocytic cells of the immune system to kill pathogens. Indeed, C. albicans rtt109 -/- cells are more efficiently killed by macrophages in vitro than are wild-type cells. However, inhibition of ROS generation in macrophages renders rtt109 -/- and wild-type yeast cells equally resilient to killing. These findings support the concept that ability to resist genotoxic stress conferred by Rtt109 and H3K56 acetylation is a virulence factor for fungal pathogens and establish Rtt109 as an opportune drug- target for novel antifungal therapeutics. Second, I report the discovery of a specific chemical inhibitor of Rtt109 catalysis as the initial step in the development of a novel antifungal agent. We established a collaboration with the Broad Institute (Cambridge, MA) to perform a high-throughput screen of 300,000 compounds. From these, I identified a single chemical, termed KB7, which specifically inhibits Rtt109 catalysis, with no effect on other HAT enzymes tested. KB7 has an IC50 value of approximately 60 nM and displays noncompetitive inhibition regarding both acetyl-coenzyme A and histone substrates. With the genotoxic agent camptothecin, KB7 causes a synergistic decrease in C. albicans growth rate. However, this effect is only observed in an efflux-pump mutant, suggesting that this compound would be more effective if it were better retained intracellularly. Further studies through structure-activity relationship (SAR) modifications will be conducted on KB7 to improve its effective cellular concentration.

La nistatina es un polieno macrólido, antifúngico de amplio espectro, restringido en principio al uso tópico, debido a su toxicidad tras administración sistémica. Los objetivos de este trabajo son el diseño, desarrollo y optimización de una emulsión parenteral de nistatina apta para su administración por vía intravenosa. Se diseñó y optimizó un sistema de circuito cerrado que permitió la elaboración de las emulsiones lipídicas inyectables (ELI) por sonicación. La formulación resultante se compara con un producto comercial disponible en el mercado (Intralipid® 20%). Las condiciones de fabricación se optimizaron mediante un diseño factorial. Las formulaciones se evaluaron en términos de parámetros físico-químicos, estabilidad, perfil de liberación y l actividad antimicrobiana. Los valores de tamaño medio de gota oscilaron entre 192,5 y 143,0 nm, el índice de polidispersidad entre 0.170 y 0.135, el potencial zeta entre -46 y -44 mV, el pH entre 7.11 y 7.53 y el volumen (LD99) entre 580 y 670 nm. La formulación de nistatina seleccionada (NYS- ELI 4), integrada por aceite de soja (30%), lecitina de soja (2%), Solutol ® HS 15 (4%) y glicerol (2,25%) es físicamente estable durante al menos 60 días. Los estudios in vitro de liberación de fármaco de esta formulación sugieren un perfil de liberación sostenida, presentando además una actividad antimicrobiana más alta que el fármaco libre, por lo que se presenta como un potencial sistema de administración de fármacos para el tratamiento de infecciones fúngicas sistémicas.
Nystatin is a polyene macrolide with broad antifungal spectrum restricted to topical use owing to its toxicity upon systemic administration. The aims of this work were the design, development and optimization of Nystatin loaded lipid emulsion for intravenous administration. A closed circuit system was designed to apply ultrasound during the elaboration of the lipid intravenous emulsions. Additionally a comparison with the commercially available Intralipid® 20% was also performed. Manufacturing conditions were optimized by a factorial design. Formulations were evaluated in term of physicochemical parameters, stability, release profile and antimicrobial activity. The average droplet size, polydispersity index, zeta-potential, pH and volume distribution values ranged between 192.5 and 143.0 nm, 0.170 and 0.135, -46 and -44 mV, 7.11 and 7.53, 580 and 670 nm, respectively. The selected nystatin loaded lipid intravenous emulsion (NYS-LIE54) consisted of soybean oil (30%), soybean lecithin (2%), Solutol® HS 15 (4%) and glycerol (2.25%) was stable for at least of 60 days. In vitro drug release studies of this formulation suggested a sustained release profile. Equally, NYS-LIE54 showed the best antimicrobial activity being higher than the free drug. Thus it could be a promising drug delivery system to treat systemic fungal infections.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A candidíase vulvovaginal (CVV) é uma doença causada por espécies do gênero Candida spp. no trato genital inferior feminino que afeta um grande número de mulheres em todo mundo. Porém o uso sistêmico de fármacos causa muitas reações adversas e as formulações tópicas possuem um baixo tempo de retenção na mucosa vaginal devido à diluição dos sistemas na cavidade vaginal. Esse estudo propõe uma terapia antifúngica alternativa empregando sistemas precursores de cristais líquidos mucoadesivos (SPCLM) para a liberação de hipericina (HIP), um potente fotossensibilizador isolado de plantas do gênero Hipericum com e sem o emprego da terapia fotodinâmica (TFD). O sistema visa aumentar o tempo de permanência da formulação, bem como reduzir o número de aplicações e a quantidade de fármaco empregada. O emprego da TFD, por sua vez, se faz como uma forma de diminuir a resistência pelos microrganismos. Observou-se a formação de sistemas isotrópicos no sistema constituído por 30% da fase oleosa constituída por ácido oleico e colesterol na razão de 7:1, 40% de Procetyl AWS como tensoativo e 30% de uma dispersão de poloxamer à 16% empregando as técnicas de microscopia de luz polarizada e espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Após a introdução de três diferentes concentrações de fluido vaginal simulado FVS (30, 50 e 100%), as formulações resultantes passaram a apresentar anisotropia e picos característicos de fase lamelar. Análises das propriedades mecânicas, reológicas e mucoadesivas das formulações indicaram que a organização e a mucoadesão dos sistemas aumentaram à medida que a quantidade de FVS aumentou. Os ensaios de validação da metodologia analítica para quantificação de HIP indicaram que o método é aceitável segundo agências regulatórias. Os testes de liberação in vitro demonstraram perfil de liberação sustentada da HIP provavelmente devido à sua alta afinidade pelos componentes da fase oleosa dos sistemas de liberação. Além disso, os SPCLM causaram aumento da retenção e baixa permeação da HIP em mucosa suína. Ensaios microbiológicos indicaram que a HIP é um agente eficaz para inativação das leveduras de Candida albicas com emprego da TFD, porém os SPCLM com HIP não potencializaram a ação antifúngica deste composto, possivelmente devido ao longo período necessário para sua liberação. Os testes de citotoxicidade indicaram que todas as formulações apresentam baixa toxicidade, porém os sistemas com hipericina incorporada apresentaram maior toxicidade para células tumorais L292. Ensaios in vivo do sistema em modelo de CVV são necessários para comprovar a viabilidade do sistema desenvolvido.
Vulvovaginal candidosis (VVC) is a disease induced by Candida strains in the female genital tract that affects a great number of women worldwide. However, systemic drugs cause many adverse reactions. Also, currently employed topical dosage forms present low retention times due to their dilution in vaginal fluids. This study proposes an alternative antifungal therapy through the development of liquid crystalline precursor systems (LCPS) for hypericin release, a potent photosensitizer isolated from Hipericum plants with and without photodynamic inactivation (PDI). The developed system aims to increase the residence time of the formulations, as well as decrease the number of applications and the amount of drug. Photodynamic therapy was used to reduce microorganism resistance. Polarized light microscopy and Small-Angle X-Ray Scattering confirmed the formation of an isotropic system composed of 30% of oil phase containing oleic acid and cholesterol in (ratio of 7:1). After addition of three different concentrations of simulated vaginal fluid -SVF (30, 50 and 100%), the resultant formulations presented anisotropy and characteristic peaks of lamellar phases. Mechanical, rheological and mucoadhesive assays indicated the formation of long-range ordering systems as the amount of SVF increased. Drug validation assays indicated that the method is aceptable for hypericin quantification according to regulatory agencies. In vitro drug release assays exhibited a sustained release profile probably due to the high affinity between HIP and the oily phase components. In addition, the LCPS lead to poor permeability and enhanced retention of HIP in the porcine mucosa. Microbiological assays pointed out that HIP effectively inactivated Candida albicans yeasts with PTD, however the HIP loaded LCPS did not potentiate the antifungal activity of HIP, probably due to the long period for HIP release. Cytotoxic tests indicated that all formulations presented low toxicity, however the HIP loaded presented higher toxicity to L292 tumor cells. In vivo assays should be performed to confirm the viability of the developed system.
001

A dissertation submitted to the Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, Johannesburg, in fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science in Medicine.
Introduction Despite the availability of several antifungal drugs, Candida infections remain a major health threat worldwide. The Candida infections problem has been amplified by the emergence of multidrug resistant Candida species towards the conventional antifungal drugs. In addition, activation of antioxidant defense system by Candida species has been known to be forefront mechanism to escape drug toxicity.This indicates an urgent need for the development of new therapeutic strategies and antifungal drugs. Natural products have served for centuries for the treatment of infectious diseases and are among the major sources for finding new antifungal drugs. Berberine (BER), an isoquinoline alkaloid found in a variety of plant species, has been shown to possess multiple biological and pharmacological properties including antimicrobial activity against C. albicans and other Candida species. However, the mechanism of action exerted by BER and its effect on Candida cells is not yet fully elucidated. Therefore, this study was conducted to evaluate the role of antioxidant enzymes in the susceptibility to fluconazole (FLC) in C. albicans. Another aspect was to determine the effect of BER on growth, antioxidant enzymes and their gene expression in C. albicans. Materials and methods Candida albicans clinical isolates (10 FLC susceptible and 10 FLC resistant) and one ATCC strain were obtained from the Department of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, University of the Witwatersrand. Species identification was confirmed using API 20C AUX. Antifungal susceptibility was determined following CLSI M27-A3 guidelines. Gene expression of SOD1, SOD2, GPx2, GLR1, GTT11, and CAT1 in untreated and BER treated C. albicans cells was measured by RT-qPCR. The activity level of the corresponding enzymes in the presence of BER was determined using a spectrophotometer. Results Gene expression analysis showed an increase in mRNA expression level of SOD1, SOD2, GPx2, GLR1 and GTT11 genes in FLC resistant isolates than in the susceptible group. The most significantly expressed gene was SOD1 with 50.69-fold increase. The other genes showed moderate increase in the expression with fold change ranging from 1.2 to 4.2. The susceptibility test showed MICs ranging from 125 to 500 μg/ml with a significant difference in the activity of BER between FLC susceptible and resistant C. albicans. BER treatment induced upregulation in the mRNA expression and enzymatic activities of major antioxidants. In FLC resistant C. albicans, treatment with ½ MIC value of BER caused downregulation of the targeted antioxidant genes indicating that BER at this concentration induced an intense oxidative stress, therefore, surpassing the antioxidant capacity of the cells. Conclusion The findings in this study showed that drug resistance is not only caused by mutations in a particular gene but could also arise from proteomic modulations. The study . The study also demonstrated that C. albicans activates several antioxidant enzymes that form an integral component of the cell’s response against oxidative stress. Candida albicans showed efficient antioxidant response at lower concentrations of BER. However, BER at ½ MIC value induced robust oxidative stress, especially in FLC resistant C. albicans, surpassing the antioxidant capacity of the cells. This demonstrates that BER at sub-inhibitory concentrations is able to render C. albicans avirulent by suppressing its antioxidant defense response without compromising cell viability of the fungi. Therefore, BER has a potential to be developed into BER has a potential to be developed into a therapeutic agent a therapeutic agent for for the the treatment oftreatment of C. albicansC. albicans infections and other pathogenic fungi to infections and other pathogenic fungi to overcome drug resistance. overcome drug resistance.
E.K. 2019

Dissertação de mestrado integrado em Biomedical Engineering
The incidence of fungal infections has increased significantly in the last years, contributing to the augment of morbidity and mortality in health care system. A raise in antimicrobial resistance, the number of immunosuppressive patients and the restricted number of antifungal drugs are the most common causes of these infections, where Candida species are the major responsible. The prevalence of these opportunistic infections, named candidiasis, has been attributed mostly to Candida albicans. Currently, conventional therapies, as antifungal drugs tend to be limitant in the control of these infections, and therefore antisense therapy (AST) arises as an alternative treatment. So, the main aim of this work was the development of a nano-drug, based in AST, for the control of virulence factors associated with Candida albicans infections. To accomplish the main goal, the C. albicans inter-strains variability concerning their ability to filament and adhere on abiotic surfaces, important virulence factors to be targeted by AST, was assessed. Then, an antisense oligonucleotide (ASO), capable of inhibiting the expression of HWP1 gene in C. albicans and reducing adhesion and filamentation was designed and optimized. The specificity and sensitivity of the probe was evaluated using C. albicans and other species by FISH assays. The ASO effects in the filamentation and adhesion was evaluated by microbiologic assays and the HWP1 expression levels determined by qRT-PCR. The results for inter-strains variability showed that strains SC5314 and 569322 had the highest capacity to adhere and filament and that 324LA/94 and 568426 were the strains with the lower capacity of filamentation. After the design of ASO and optimization of FISH conditions (37ºC as hybridization temperature, 4M of urea and 400 nM of ASO concentration), it was verified that the ASO was able to block 60% and 80% of the gene expression using concentrations of 40 nM and 200 nM, respectively, at 4h. On the other hand, the phenotype results demonstrated that the percentage of filamentation was only reduced by 3% and 6% for the 40 and 200 nM of ASO, respectively. However, the inclusion of urea, increased to 6 to 10% the reduction on filamentation. It was also possible to verify that the presence of urea inhibits the expression of this gene. In conclusion, it was demonstrated the possibility these nano-drugs, based in AST, as a novel strategy to control in future C. albicans virulence factors.
A incidência de infeções fúngicas aumentou significativamente, contribuindo para uma maior morbidade e mortalidade nos cuidados de saúde. Um aumento na resistência antimicrobiana, o número de pacientes imunossupressores e o número restrito de drogas antifúngicas são as causas mais comuns dessas infeções, onde as espécies de Candidas são as principais responsáveis. A prevalência dessas infeções oportunistas, denominadas por Candidíases, têm sido atribuídas principalmente a Candida albicans. Atualmente, as terapias convencionais, como drogas antimicóticas, tendem a ser cada vez mais limitantes no controlo dessas infeções e, portanto a terapia antisense surge como um tratamento alternativo. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu no desenvolvimento de uma nano-droga baseada na tecnologia antisense, para o controlo de fatores de virulência associados infeções por Candida albicans. Para atingir o objetivo principal, foi avaliada a variabilidade inter-estirpes de C. albicans quanto à sua capacidade de filamentar e aderir às superfícies abióticas, importantes fatores de virulência a serem alvo da tecnologia antisense. Em seguida foi definida e otimizada a respetiva sonda de oligonucleótidos capaz de inibir a expressão do gene HWP1 em C. albicans, reduzindo assim alguns dos fatores de virulência associados. A especificidade e sensibilidade da sonda foram avaliadas através de C. albicans e outras espécies respetivamente, por ensaios de FISH. Os efeitos da sonda foram avaliados por ensaios microbiológicos e os níveis de expressão do gene HWP1 determinados por qRT-PCR. Os resultados da variabilidade entre estirpes, demonstraram que as estirpes SC5314 e 569322 possuíam a maior capacidade de adesão e filamentação, e as estirpes 324LA/94 e 568426 a menor capacidade de filamentar. Em relação à sonda definida, e após a otimização dos parâmetros de FISH (37ºC para temperatura de hibridação, 4M de ureia e uma concentração de sonda de 400 nM), verificou-se a capacidade de bloquear a expressão do gene em aproximadamente 60% e 80% para concentrações de 40 nM e 200 nM, respetivamente, às 4h. Por outro lado, os resultados do fenótipo demonstraram que a percentagem de filamentação foi reduzida apenas na ordem 3% e 6% para os 40 e 200 nM de ASO, respetivamente. No entanto, a inclusão de ureia aumentou para aproximadamente 6 e 10% o efeito na redução da filamentação. Apesar disso, também foi possível verificar que a presença de ureia inibe a expressão do gene HWP1. Em conclusão, ficou assim demonstrada a possibilidade de aplicar estas nano-drogas, baseadas na tecnologia antisense, como uma estratégia promissora para o controlo de infeções por C. albicans.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica
The incidence of fungal infections has increased in the last decades, being Candida albicans the most common etiologic agent of fungal-related biofilm infections. In the last years, Candida strains have shown high levels of drug resistance, so the interest in new antifungal therapeutic options has increased. The antimicrobial photodynamic therapy (APDT) has been shown to be an emerging and promising approach to treat localized infections. The present dissertation aimed to optimize the antifungal photodynamic efficacy of two new benzophenoxazine-type fluorescent dyes against C. albicans biofilms by APDT, as well as to understand the different APDT outcomes achieved. The antifungal susceptibility of C. albicans planktonic cells to dyes N-[5-(3- hydroxypropylamino)-10-methyl-9H-benzo[a]phenoxazin-9-ylidene]ethanaminium chloride (FSc) and N-(5-(11-hydroxyundecylamino)-10-methyl-9H-benzo[a]phenoxazin-9-ylidene)ethanaminium chloride (FSd) with concentrations in the range of 0-100 μM during 48 h was firstly determined. The potential photodynamic activity of dyes against C. albicans biofilms was then evaluated and optimized by incubation of biofilms with dyes in the range of 100-300 μM for 3 or 18 h followed by illumination at fluences of 12 or 36 J cm-2 through the use of a xenon arc lamp (600 ± 2 nm). In order to understand the APDT outcomes achieved, dye uptake by the biofilm matrix and cells during dark incubation was also evaluated by spectrofluorimetric analysis (ex=590 nm; em=645 nm) and fluorescence microscopy. On antifungal susceptibility assays, FSc dye showed no growth inhibition of C. albicans cells, while FSd produced a very poor growth inhibition when used at 50 and 100 μM. Regarding to APDT outcomes, only FSc dye showed to have photosensitizing activity against C. albicans biofilms. Using FSc at 300 μM for 18 h followed by illumination with 36 J cm-2 of fluence, a total photoinactivation of C. albicans biofilm cells was achieved. The notorious uptake of FSc over FSd dye by biofilms may explain its higher photodynamic effectiveness. In summary, data suggests that FSc-mediated APDT might be successfully used to treat C. albicans infections.
A incidência de infeções fúngicas tem aumentado nas últimas décadas, sendo a espécie C. albicans o agente etiológico mais comum nas infeções causadas por biofilmes. Nos últimos anos, as estirpes do género Candida têm demonstrado elevados níveis de resistência aos agentes antifúngicos convencionais, impulsionando o interesse por novas terapias antifúngicas. A fototerapia dinâmica antimicrobiana é uma nova abordagem terapêutica que se tem demonstrado bastante promissora no tratamento de infeções localizadas. A presente dissertação teve como objetivo otimizar a inativação de biofilmes de C. albicans pela ação fotodinâmica antifúngica de dois novos corantes fluorescentes do tipo benzofenoxazina, assim como analisar as diferentes eficácias fotodinâmicas encontradas. Inicialmente determinou-se a suscetibilidade antifúngica aos corantes cloreto de N-(5-((3- hidroxipropil)amino)-10-metil-9H-benzo[a]fenoxazina-9-ilidene)etanamínio (FSc) e cloreto de N-(5- ((11-hidroxiundecil)amino)-10-metil-9H-benzo[a]fenoxazina-9-ilidene)etanamínio (FSd) - utilizando concentrações de 0-100 μM durante 48 h em células planctónicas de C. albicans. A potencial atividade fotodinâmica dos corantes em biofilmes de C. albicans foi posteriormente avaliada e otimizada incubando os biofilmes de C. albicans com os corantes com concentrações de 100- 300 μM durante 3 ou 18 h, seguido de irradiação com uma lâmpada de arco de xénon (600 ± 2 nm) com fluência de 12 ou 36 J cm-2. Com o intuito de entender as diferentes eficácias fotodinâmicas observadas, foi também avaliada a absorção dos corantes por espetrofluorimetria (ex=590 nm; em=645 nm) e microscopia de fluorescência. Os ensaios de suscetibilidade antifúngica revelaram que o corante FSc não apresenta efeito de inibição de crescimento, enquanto o corante FSd produz um pequeno efeito de inibição do crescimento quanto utlizado a 50 ou 100 μM. Relativamente à ação fotodinâmica antimicrobiana apenas o corante FSc demonstrou ter atividade fotossensibilizante nos biofilmes de C. albicans. Da incubação dos biofilmes com corante FSc a 300 μM durante 18 h, seguido de irradiação com 36 J cm-2 de fluência, obteve-se uma total inativação celular. A notória absorção do corante FSc em relação ao FSd pelos biofilmes poderá explicar a sua maior eficácia fotodinâmica. Em suma, os resultados indicam que o corante FSc poderá ser um potencial agente fotossensibilizante para a fototerapia dinâmica antifúngica de infeções provocadas por C. albicans.

Blood is an essential body fluid but is yet a source of microbial infections transmission. Consequently, the ability to disinfect blood and its derivatives has assumed great importance. Currently, the most used method for inactivating microorganisms, which can be only used in plasma or protein concentrates, is the combined use of a tri(n-butyl)phosphate and the detergent Tween 80. However, these chemicals must be removed after disinfection procedure once they are harmful to the membranes of erythrocytes and platelets of blood receptors. Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) has been suggested as an alternative technique to blood disinfection. Methylene blue (MB), psoralen and riboflavin are already approved photosensitizers (PS) in some countries to disinfect plasma/platelets, but there is no aPDT approved application for whole blood and erythrocytes concentrates. The aim of this study was to evaluate the effectiveness of aPDT to inactivate Candida albicans in blood, a microorganism frequently involved in bloodstream infections. For that, several cationic porphyrin derivatives were used to photoinactivate C. albicans in phosphate buffered saline (PBS), plasma and whole blood. Once MB is the mostly used PS to disinfect plasma, its efficacy was also evaluated for comparison. Samples and controls were exposed for 270 min to white light (380-700 nm) at an irradiance of 2.5 mW/cm2 and 150 mW/cm2 for PBS and whole blood/plasma, respectively. All the tested cationic porphyrin derivatives were effective to photoinactivate C. albicans in PBS. However, MB under the same conditions (concentration and light dose) did not appear to be efficient in C. albicans inactivation. In plasma, FORM and Tri-Py(+)-Me proved to be promising PSs in C. albicans photoinactivation. Although in whole blood the inactivation rates obtained with porphyrin derivatives were higher than the ones obtained with MB, further improvements are required. Nevertheless, the results indicate that aPDT using cationic porphyrinic photosensitizers seems to be a promising approach for the photoinactivation of C. albicans in plasma. Additionally, none of these PSs, in the tested concentrations in plasma and whole blood, had promoted significant hemolysis at the isotonic conditions when hemolysis was evaluated in whole blood and after the addition of aPDT treated plasma with these PSs to concentrated erythrocytes.
O sangue é um recurso essencial, porém também é uma fonte de transmissão de infeções. Consequentemente, a capacidade de desinfetar o sangue e seus derivados assume uma grande importância na prática clínica. Atualmente, o método de desinfeção mais eficaz na inativação de microrganismos usado apenas em plasma e concentrados proteicos, baseia-se no uso combinado do tri(n-butil)fosfato e do detergente Tween 80. No entanto, estes produtos devem ser removidos após o procedimento de desinfeção, pois são prejudiciais quer para as membranas dos eritrócitos quer para as plaquetas dos indivíduos transfundidos. A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) tem sido sugerida como uma técnica alternativa à desinfeção do sangue. Os fotossensibilizadores (PS) azul-de-metileno (MB), derivados de psoraleno e riboflavina já se encontram aprovados em alguns países para desinfetar plasma e plaquetas, no entanto não há até à data nenhuma aplicação aprovada baseada em aPDT para a desinfeção de sangue total e de concentrados de eritrócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da aPDT na inativação de Candida albicans, um microorganismo frequentemente envolvido em infeções sistémicas. Para isso, foram usados derivados porfirínicos catiónicos na fotoinativação de C. albicans em tampão fosfato-salino (PBS), plasma e sangue total. Uma vez que o MB é o PS mais usado para desinfetar plasma, a sua eficácia também foi avaliada para comparar com a eficiência dos derivados porfirínicos testados. As amostras e os controlos foram expostos durante 270 min a luz branca (380-700 nm) com uma irradiação de 2,5 e 150 mW/cm2 para PBS e sangue total / plasma, respetivamente. Todos os derivados porfirínicos catiónicos testados foram eficazes na fotoinativação de C. albicans em PBS, no entanto, o MB nas mesmas condições (concentração e dose de luz) não demonstrou possuir capacidade de inativar C. albicans. No plasma, a FORM e Tri-Py(+)-Me provaram ser fotossensibilizadores promissores na inativação de C. albicans. Apesar de no sangue total as taxas de fotoinativação obtidas com os fotossensibilizadores porfirínicos tenham sido mais altas que as obtidas com MB, mais estudos serão necessários para melhorar as taxas de inativação obtidas. No entanto, os resultados indicam que a aPDT usando fotossensibilizadores porfirínicos catiónicos parece ser uma abordagem promissora para a fotoinativação de C. albicans no plasma. Destaca-se o facto que nenhum destes fotossensibilizadores porfirínicos nas concentrações testadas no plasma e no sangue total promoveu hemólise significativa em condições isotónicas. Uma situação similar foi observada quando foi avaliada a hemólise após a adição de plasma tratado com esses PSs a concentrados de eritrócitos.
Mestrado em Biomedicina Molecular

With the global increasing and spreading of antibiotic-resistant microorganisms, there is a need to develop strategies capable of inactivating plantonic and biofilm-forms of pathogenic microorganisms that causes untreatable and mortal infections. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is an alternative approach capable of combating microorganisms independently of their resistance profile. Althought this technique presents great results and advantages, the neutral and monocationic photosensitizers (PS) do not usually kill efficiently gram-negative bacteria and fungi, and their synthetic preparation are usually expensive and laborious. In this The results of these experiments demonstrated that FORM is efficient on inactivating planktonic forms of bacteria, fungi and viruses and that when combined with KI was clearly more effective to inactivate all the microorganisms. This combination allows also to destroy efficiently the preformed biofilms of bacteria and fungi and avoided also the formation of E. coli and S. aureus biofilms, contrarily to that observed with FORM but without KI. The use of FORM combined with KI allowed to reduce PS concentration and the treatment time which will promote to transpose the aPDT to the clinic or environment fields.context, it is needed to develop new approaches that can improve the antimicrobial effect of a PS and simultaneously to allow the decrease of the applied PS concentration and also of the treatment time. Recent studies have reported a enhancer effect on antimicrobial photoinactivation by the combined used of some PS and potassium iodide (KI), an inorganic salt. These studies have always shown potentiating effect of KI for the tested PS. The main goal of this work was, in a first phase, to achieve an insight into the KI potentiation effect on diferent groups of PS; tetraarylporphyrins positively charged at meso (including a formulation consisting of five cationic porphyrins - FORM) or β-pyrrolic positions and non-porphyrinic dyes, using a bioluminescent Escherichia coli as bacterial model. The results of these studies pointing out that the presence of KI can enhance the aPDT killing effect of some PS, but this enhancement is not general for all PS. The comparison of the obtained results with the ones from the literature allowed to confirm that the enhance effect of KI is related to the generation of 1O2 by PS, PS structure (charge number and charge position), aggregation behavior and its affinity for the external structures of the microorganisms. In a second phase, the aPDT effect of the FORM (easy to prepare when compared with their corresponding porphyrins that constitute the mixture in the pure form) and of its combined effect with KI (100mM) on planktonic and biofilm forms of a broad-spectrum of microorganisms. Therefore, this study was performed on the free and biofilms forms of gram-negative and gram-positive bacteria: E. coli resistant to chloramphenicol and ampicillin, and Staphylococcus aureus resistant to methicillin (MRSA), of the fungi Candida albicans as well as on the free-form of a T4 like bacteriophage as a model of human viruses.
O aumento e disseminação da resistência a antimicrobianos torna necessário o procura de novas estratégias para combater infeções não tratáveis e muitas vezes mortais, causadas por microrganismos quer na forma planctónica quer organizados em biofilmes. A terapia fotodinâmica antimicrobiana tem-se revelado uma alternativa capaz de inativar microrganismos, independentemente do seu perfil de resistência aos antimicrobianos convencionais. Contudo, a baixa eficácia de fotosensibilizadores (PS) neutros e aniónicos na inactivação de bactérias de gram-negativo e fungos, bem como os elevados custos de produção e purificação associados, tem exigido à comunidade científica encontrar moleculas ou coadjuvantes que permitam aumentar a fotoinactivação microbiana (aPDT) e com diminuição dos custos associados quer pela diminuição da quantidade de composto aplicado quer pela diminuição do tempo de tratamento. Estudos recentes, demonstraram que o iodeto de potássio (KI), um sal inorgânico, é capaz de potenciar o efeito de alguns PS porfirínicos e não porfirínicos catiónicos e não catiónicos. Estes estudos mostraram sempre nos PS testados um efeito potenciador do KI. Assim, o presente trabalho teve como objectivo determinar as características dos PS que influenciam o efeito potenciador do KI, usando para tal PS com características diferentes. Para tal, foram realizados ensaios de aPDT usando como modelo uma estirpe de Escherichia coli bioluminescente. Nestes ensaios o KI (50 mM e 100 mM) foi testado na presença de diferentes PS porfirínicos catiónicos substituídos quer em posições meso (incluindo uma formulação constituída por uma mistura de cinco porfirinas - FORM) quer nas posições ‐pirrólicas, e PS não porfirínicos [Azul de metileno (MB), Rosa Bengal (RB), Azul de Toluidina (TBO), Violeta Cristal (CV) e Verde de Malachita (MG)]. Os resultados evidenciam que o KI é capaz de potenciar o efeito antibacteriano da maior parte dos PS testados, permitindo reduzir ainda o tempo de irradiação necessário para produzir o efeito fotodinãmico desejado. Contudo, não se observa o efeito potenciador do KI quando combinado com todos os PS porfirínicos e não-porfirínicos. Uma comparação dos resultados obtidos com os da literatura permite confirmar que o efeito potenciador quando o sal KI é combinado com um PS depende da produção de oxigénio singleto (1O2) por parte do PS, da sua estrutura (número de cargas e a sua posição espacial), da sua tendência para agregar e da sua afinidade para com as estruturas externas dos microrganismos. Na segunda fase do trabalho pretendeu-se avaliar a capacidade da formulação porfirínica (FORM, de fácil preparação e obtenção comparativamente com as respectivos constituintes puros), e da combinação da FORM com KI (100 mM) na inativação de vários microrganismos (bactérias e fungos) quer na forma planctónica quer em biofilmes. Para tal, foram realizados ensaios com os seguintes microrganismos: E. coli resistente ao clorofenicol e à ampicilina (bactéria de gram-negativo), Staphyloccocus aureus resistente à meticilina (bactéria de gram-positivo), o fungo Candida albicans; quer na forma livre quer em biofilmes; bem como um bacteriófago tipo T4, utilizado como modelo de vírus humano. Os resultados obtidos mostraram que a FORM isoladamente é eficaz na inativação de bactéias, fungos e vírus na sua forma planctónica, e quando usada em combinação com o KI o seu efeito antimicrobiano é intensificado. A combinação da FORM com o KI foi também eficaz na destruição de biofilmes bacterianos e fúngicos, e evitou a formação de biofilmes bacterianos, o que não se verifica quando a FORM foi utilizada isoladamente. A utilização da FORM combinada com KI em aPDT permitiu reduzir a concentração de PS e o tempo de tratamento o que facilitará possíveis aplicações quer na clínica quer no ambiente.
Mestrado em Microbiologia