Dissertationen zum Thema „Bioinoculants“

Para alimentar a população mundial crescente é necessário um aumento sustentável na produtividade agrícola. Nesse sentido, Rizobactérias Promotoras de Crescimento de Plantas (RPCPs) têm sido continuamente buscadas para formulações inoculantes por sua capacidade de incremento na produção vegetal aliado ao seu potencial de redução e/ou substituição do uso de fertilizantes minerais, insumos que causam grandes impactos ambientais, na saúde humana e econômicos. A RPCP Bacillus sp. RZ2MS9, um representante da biodiversidade amazônica brasileira, é uma forte candidata a bionoculante por seu efeito benéfico, previamente descrito, em uma ampla gama de culturas, incluindo milho e soja. Essas duas culturas representam mais de 80% da área cultivada com grãos no Brasil, de forma que incrementos relativamente modestos de crescimento e produtividade poderiam gerar ganhos significativos. Membros do gênero Bacillus apresentam vantagem em formulações inoculantes, principalmente devido a sua capacidade de formação de esporos resistentes ao calor e dissecação. Seus modos de ação são diversos, tornando o entendimento da sua interação com plantas bastante desafiador. Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou, dentre os mecanismos envolvidos na promoção de crescimento vegetal, a produção de Ácido Indol Acético (AIA) e sideróforos, solubilização de fosfato e fixação biológica de nitrogênio, in vitro. No presente trabalho, foi buscado um entendimento detalhado dos mecanismos de ação dessa rizobactéria, explorando desde seu genoma até seu desempenho em condições de campo. O draft genômico (genoma parcial) bacteriano foi obtido utilizando a tecnologia de sequenciamento Illumina, o qual possibilitou a detecção de genes envolvidos nos mecanismos potencialmente relacionados ao efeito benéfico dessa bactéria, que vão desde sua formação de esporos, atração por exsudatos radiculares, motilidade e competição na rizosfera até mecanismos de solubilização de fosfato, produção de sideróforos, entre outros. As informações obtidas permitem uma exploração genética desses mecanismos, fornecendo uma oportunidade de maximizar essa interação e, futuramente, favorecer os benefícios em campo. Adicionalmente, foi demonstrado o potencial de quimiotaxia (atração) de RZ2MS9 em direção a raízes de milho. Um estudo filogenético dessa RPCP, utilizando um método de tipagem com o gene pycA (piruvato carboxilase), mostrou que o Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou-se distante do clado altamente monomórfico de B. anthracis, patógeno humano, e se afiliou a um grupo composto por linhagens de B. thuringiensis (Bt) comercializadas como produtos biopesticidas há mais de 60 anos, o que sugere a potencial possibilidade de seu uso seguro no campo. Sabe-se que a maioria, se não todas, atividades fisiológicas das plantas é regulada por fitormônios como a auxina AIA, os quais podem ser sintetizados também por RPCPs. Com mais detalhamento, os genes envolvidos nas vias biossintéticas desse fitormônio foram detectados no draft genômico de RZ2MS9, indicando que sua produção ocorre através da via IPA (Indol-3-Piruvato). Além disso, plantas de tomate anão Micro-Tom (MT) e seu mutante Δdgt, defectivo na sensibilidade a auxinas, foram utilizadas para caracterizar especificamente o efeito do AIA produzido por Bacillus sp. RZ2MS9 na promoção de crescimento vegetal. A aplicação de RZ2MS9 causou inibição no crescimento de raízes primárias, aumento no comprimento de raízes laterais e na área superficial total de raízes de plantas MT, efeitos característicos daqueles proporcionados por auxinas. Esse incremento radicular refletiu, ainda, em aumento da biomassa da parte aérea de plantas MT. Os mesmos efeitos não foram observados em plantas Δdgt, insensíveis a auxinas, indicando que a elicitação de promoção de crescimento em MT por RZ2MS9 ocorre por meio desses fitormônios. Finalmente, foi demonstrado o efeito sobre o desenvolvimento e produtividade de milho e soja da aplicação de Bacillus sp. RZ2MS9 em condições de campo, sendo comparado com o desempenho de bioinoculantes comerciais. No milho, o efeito da inoculação bacteriana foi, ainda, associado à adubação nitrogenada para verificar a possibilidade de redução desses insumos. Bacillus sp. RZ2MS9 apresentou efeitos significativos sobre o desenvolvimento tanto da soja (comparáveis aos efeitos de rizóbios) quanto do milho, os quais, porém, não refletiram em aumento significativo de produtividade em ambas as culturas. No entanto, o potencial dessa rizobactéria é bastante claro pois, com um custo de produção inferior a R$1,00 por hectare, sua inoculação causou incremento de 16 sacas de milho por hectare com redução de 30% na adubação nitrogenada, assim como um incremento de 11 sacas de soja por hectare, ambos comparados ao controle não inoculado. Os resultados apresentados no presente trabalho vão, portanto, de encontro à grande expectativa na obtenção de linhagens microbianas promissoras visando sistemas agrícolas mais sustentáveis.
To feed the growing global population, a sustainable increase of agricultural production and crop yield is required. In this sense, Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) have been continuously sought to inoculant formulation due to their capacity to increase plant yield along with their potential to reduce and/or replace the use of mineral fertilizers, inputs that cause serious impacts on environment, human health and economy. The PGPR Bacillus sp. RZ2MS9, a representative of the Brazilian Amazonian biodiversity, is a great candidate to bioinoculant because of its beneficial effect on a broad range of crops, including maize and soybean. These two crops represent more than 80% of the area planted with grains in Brazil, so relatively modest growth and yield increases could generate significant gains. Bacillus spp. have advantage in inoculant formulations, mainly due to their ability to form heat- and dissecation-resistant spores. Their modes of action are diverse, making the understanding of its interaction with plants quite challenging. Bacillus sp. RZ2MS9 displays, between the mechanisms involved in plant growth, Indole Acetic Acid (IAA) and siderophore production, phosphate solubilization and biological nitrogen fixation, in vitro. In the present work, we seek a detailed understanding of this rhizobacterium mechanisms of action, exploring from its genome to its performance in field conditions. The bacterial draft genome was obtained using Illumina sequencing technology, making possible the detection of genes involved in mechanisms potentially related to the beneficial effect of this bacterium, and range from its spore formation, attraction by root exudates, motility and competition in the rhizosphere to mechanisms of phosphate solubilization, siderophore production, among others. The information obtained allow a genetic exploration of these mechanisms, providing an opportunity to maximize this interaction and, in the future, favor benefits in field. Additionally, it was demonstrated the chemotaxis (attraction) potential of RZ2MS9 towards maize roots. A phylogenetic study of this PGPR, using a typing method with the pycA (pyruvate carboxylase) gene, showed that Bacillus sp. RZ2MS9 was distant from the highly monomorphic clade of B. anthracis, a human pathogen, and affiliated with B. thuringiensis (Bt) strains marketed as biopesticides for more than 60 years, suggesting the potential possibility of its safe use in the field. It is known that most, if not all, physiological activities of plants are regulated by phytormones such as the auxin IAA, which can also be synthesized by PGPRs. With more detail, genes involved in biosynthetic pathways of this phytormone were detected in the RZ2MS9 draft genome, indicating that its production occurs via the IPA (indole-3-pyruvate) pathway. In addition, plants of the dwarf tomato Micro-Tom (MT) and its mutant Δdgt, impaired in auxin sensibility, were used to specifically characterize the effects of IAA produced by Bacillus sp. RZ2MS9 in the plant growth promotion. The inoculation of RZ2MS9 caused inhibition in the primary roots growth, increase in lateral roots length and in roots total surface area of MT plants, characteristic effects of those provided by auxins. This root growth also reflected in an increase of MT plants shoot biomass. The same effects were not observed in Δdgt plants, insensitive to auxins, suggesting that the elicitation of growth promotion in MT by RZ2MS9 occurs through these phytormones. Finally, we demonstrated the effect of inoculation with Bacillus sp. RZ2MS9 on maize and soybean development and productivity under field conditions, being compared with the performance of commercial bioinoculants. In maize, the effect of bacterial inoculation was also associated with nitrogen fertilization to verify the possibility of reducing these inputs. Bacillus sp. RZ2MS9 showed significant effects on the development of both soybean (comparable to the effects of rhizobia) and maize, which, however, did not reflect a significant increase in productivity in both crops. However, the potential of this rhizobacterium is very clear because, with a cost of production of less than R$1.00 per hectare, its inoculation caused an increase of 16 sacks of maize per hectare with a 30% reduction in nitrogen fertilization, as well as an increase of 11 sacks of soybean per hectare, both compared to uninoculated control. The results presented in this study meet the great expectation of obtaining promising microbial strains aiming at more sustainable agricultural systems.

Soil micro-organisms are a fundamental component of soil ecosystem services. Plant yields have shown to be increased through processes mediated by fungi, such as increased acquisition of important plant nutrients e.g. phosphate (P) and nitrogen (N). This has seen micro-organisms exploited commercially to create bio-inoculants (BIs). However, it is remarkably difficult to determine the effectiveness of commercially-available BIs that claim to promote crop yields as in most cases the underlying mechanisms responsible for these beneficial effects are unknown. The aims of the thesis were to examine, both within the laboratory and field, the efficacy of some commercially available BIs. Focusing on mechanisms of increased P acquisition mediated by the application of BIs. The effects of soil-P availability on BI performance were also explored. Whilst next generation DNA sequencing was utilised to explore changes in soil fungal assemblages after the introduction of BIs. As illustrated in Chapter 2, there exists much variability in efficacy testing and there is a distinct lack of robust field-based testing of commercial BIs. Chapter 3 consisted of two laboratory-based pot-trials; the first investigated the efficacy of five commercial BIs on Lolium perenne growth, the second explored the effect of an inert carrier media utilised in BI manufacture. Results found that all tested BIs increased grass yields significantly, and while many BIs contain non-living additives, treatments with living microbial fractions were found to have significantly more roots, leading to increased growth per unit P taken up by the grass. The second bioassay found the dual application of carrier media and mycorrhizal spores significantly increased grass yield, the inert carrier media a significant factor with respect to mycorrhizal root colonisation, increasing from 20% to 36%. Chapter 4 explored the phosphate solubilisation and mineralisation potential of the BI products. All BIs successfully mobilised P from recalcitrant P sources (ranging from 164 - 490 mg l-1, for inorganic-P and 0 - 39 mg l-1 for organic-P). A pot trial investigated the phosphorus efficiency ratio of Lolium perenne following application of two inorganic fertilisers of varying solubility, triple super phosphate and rock phosphate. Two of the tested BIs were found to exhibit P mediated growth gains in the form of increased yield, total shoot P, and phosphorous efficiency ratio. Yield and shoot P gains were found to be mediated by differing fractions of the living component of each BI dependent on P source. Chapters 5 and 6 were field trials exploring BI effectiveness on sites of varying P availability. Chapter 5 was on a soil of adequate P (21 mg kg-1). Overall the studies found limited benefits of BI application. Chapter 6 consisted of two field trials, one with a range of P availability (3.3 - 32 mg kg-1), the second with low P availability (8 mg kg-1). Results of the first found positive correlations with the % P and total forage P with increasing plant-available soil-P of BI-treated grass, but no significant increases in yield. The increased P acquisition and lack of yield would suggest that yield limitation was not driven by P. Similarly the results of the second trial found that while some of the BI treated grass yielded moderately higher than controls, there were no significant treatment effects on % P and total forage P, again suggesting yield gains were due to other factors. All BI treatments found to increase the N content of the forage compared to control. Chapter 7 examined the effects of various management practices on soil fungal abundances. Using DNA sequencing, fungal assemblages were found to be significantly affected by both treatment (BI application and N fertiliser), soil type and sampling date. N fertiliser was the only treatment to significantly affect fungal diversity and equitability measures. The study was able to show the potential of NGS technology, Ion Torrent™, for examining changes in fungal communities within the field. The results suggest soils with adequate levels of plant-available P may not see much benefit to warrant the application of BIs, or at least at the application rates recommended. Overall, much work is still required both within science and industry in the development and manufacture of bio-inoculants as a reliable method to increase crop yields.

En los diferentes ecosistemas de la Amazonía peruana, las raíces de la gran mayoría de plantas forman una simbiosis de tipo mutualista con hongos de micorriza arbuscular (HMA). Se conoce que estos hongos constituyen un componente clave para el funcionamiento eficiente de los bosques, principalmente por dar a las plantas una mayor capacidad para absorber fósforo y agua del suelo, ayudar en la agregación de las partículas del suelo dándole mayor estabilidad y contribuir con el almacenamiento de carbono en el suelo a través de la producción de glomalina.Por otro lado, en la Amazonía del Perú existen siete tipos de suelos dominantes, de los cuales los Ultisoles ocupan aproximadamente el 65% del total, equivalentes a 49,7 millones de hectáreas, que se caracterizan por ser deficientes en fósforo. En estudios realizados en bosques en las localidades de Yurimaguas y Pucallpa, donde prevalece este tipo de suelos, se ha encontrado la presencia de HMA, asociados con la mayoría de especies vegetales nativas, lo que indica su importancia para el crecimiento y desarrollo de estas. Sin embargo, cuando se evalúan las pérdidas de la biodiversidad causadas principalmente por la deforestación se toman solo en cuenta a las especies de flora y de fauna y no se considera a la biota del suelo, incluyendo a los HMA, como si esta no tuviera relevancia en el funcionamiento de los bosques. Por otro lado, la distribución geográfica de las poblaciones de HMA es muy variable, tal como se ha descubierto en los estudios realizados que corroboran descubrimientos hechos en la Amazonía de Colombia y Brasil, de que la biota que podría estar perdiéndose por prácticas poco conservadoras de manejo y explotación. Se discuten las posibles causas de estos hallazgos y los efectos de la deforestación en las poblaciones de estos hongos y se presenta a la investigación en cuanto a la distribución geográfica de los HMA como una prioridad en la Amazonía peruana, especialmente dirigida a su utilización en programas de reforestación y recuperación de áreas degradadas con especies nativas en las diferentes áreas deforestadas de la Amazonía

Phosphorus (P) is one of the most limiting and important elements in crop production, yet often has limited availability in the soil. Manufactured inorganic P fertilisers are required to improve soil and crop P supply but their use depletes finite reserves of rock phosphate and impacts on water quality and ecosystem biodiversity. Bio-inoculants have a potential role to increase soil P supply and reduce dependence on expensive fertilisers. The objective of this thesis was to further understand the role of mycorrhizae (M) and P solubilizing bacteria (PSB) bio-inoculants and external P sources (super phosphate (SP), struvite (AMP) and rock phosphate (RP)on phosphorus availability in soil and their effects on the growth, yield and P uptake of barley. Field experiments on low P status soils in 2010 and 2011 demonstrated the potential for the use of bio-inoculants (PSB and M) in mobilizing P from soil and significantly (P <0.05) enhancing P uptake to increase growth of barley, and to a lesser extent, grain yield. It was postulated that bio-inoculant effects in the field were compromised by the presence of native M and PSB. Glasshouse pot experiments were conducted with a range of growth media: horticultural sand (zero P), field soil (low P status but with native micro-organisms) and heat sterilized field soil. These demonstrated the effects of bio-inoculants without the presence of native M and PSB, and to a lesser extent in the presence of native micro-organisms, in terms of increased plant root and shoot growth, grain yield and tissue P concentration. Across all experiments bio-inoculants (M and PSB) increased the effectiveness of water soluble SP, partially soluble AMP and insoluble RP. M and PSB were equally effective. In combination with these external P sources, bio-inoculants (M and PSB) significantly (P < 0.05) increased yield, P concentration and total P uptake, plant dry matter and concentration of P in the grain compared to P fertilizers without bio-inoculants. However, applications of P fertilizers reduced the colonization of roots by mycorrhizae. The potential role of P uptake enhancing bio-inoculants in reducing external inputs in agriculture is discussed.

Este estudio tiene como finalidad de confirmar la capacidad solubilizadora de las cepas aisladas que se puede esperar sean de uso potencial para la formulación de un bioinoculante efectivo para el cultivo de la papa.
RESUMEN El fósforo es el segundo nutriente necesario para el desarrollo de las plantas, y de los microorganismos que habitan la rizósfera. En un modelo agrícola convencional, la mayoría de los cultivos requieren cerca de 10 a 30 kg de fósforo por hectárea que se suministran en forma de fertilizantes sintéticos, los cuales debido a sus formas no disponibles tienden a acumularse y modificar las condiciones fisicoquímicas del suelo por la inmovilización química del elemento fierro, aluminio y calcio principalmente, si bien se incrementa el rendimiento de las cosechas, no se consideran los impactos negativos que se producen, como la eutrofización de cuerpos de agua, disminución de las principales reservas de nutrientes, inmovilización de nutrientes en el suelo con los consecuentes desbalances en cultivos, aumento de los costos de producción, entre otros. Atendiendo a esta problemática surge un concepto de agricultura sustentable a través de la generación de biofertilizantes, a partir del estudio, entendimiento y aplicación de microorganismos que actúan como promotores del crecimiento vegetal o que presentan rasgos que favorecen la disponibilidad de micro y macro elementos. El presente trabajo se orientó en el aislamiento de bacterias solubilizadoras de fósforo a partir de suelo cultivado con papa (Solanum tuberosum L.) en el Estado de México. Se llevó a cabo la caracterización fisicoquímica del suelo de las zonas muestreadas, se aislaron y contabilizaron la Bacterias Heterótrofas totales, y se seleccionaron bacterias efectivas para la solubilización de fosfato mediante la siembra en medio Pikovskaya sólido, obteniendo un total de 5 cepas de las que se determinó el diámetro de halo de solubilización, siendo la cepa A3 la que presento un mayor diámetro con 19mm aproximadamente. Al confirmar la capacidad solubilizadora de las cepas aisladas se puede esperar sean de uso potencial para la formulación de un bioinoculante efectivo para el cultivo de la papa.
la clave se otorgo por parte de la SIEA de la UAEM, sin financiamiento con clave: 4635/2019SF.

Evalúa la capacidad promotora de crecimiento vegetal (PGPR) de actinomicetos aislados de la rizósfera de plantaciones de papa colectadas en el distrito de San Jerónimo - Andahuaylas. Para ello, se evalúan 4 características relacionadas a las bacterias consideradas como PGPR (Solubilización de fosfatos, fijación de nitrógeno, producción de AIA y sideróforos). De las 49 cepas de actinomicetos rizosféricos aisladas y evaluadas, la cepa AND 13 presenta mejor rendimiento en las pruebas como PGPR, así como, gran capacidad de adaptación y crecimiento a diferentes temperaturas y pH; siendo identificada mediante pruebas bioquímicas y moleculares como Streptomyces sampsonii. Estos resultados indican que la cepa AND 13 podría ser utilizada a futuro como una solución alterna ante el uso excesivo de agroquímicos.
Tesis

As culturas da soja e milho são de grande importância econômica mundial e também para o Brasil, onde a área cultivada com essas duas culturas está estimada em 45.855.900 mil hectares, distribuídas em todos estados produtores conforme suas características. A estimativa da safra mundial de soja em 2015/16 apresentou uma redução na produção global da oleaginosa para 319,0 milhões de ton, volume 1,1 milhão de ton inferior ao levantamento de dezembro de 2015. Ainda assim, trata-se de um volume recorde. Para o milho, a produção global foi de 967,9 milhões de ton, com uma redução no volume de 5,9 milhões de ton em relação ao levantamento realizado em dezembro de 2015. Nessas duas culturas são comumente utilizadas bactérias fixadoras de nitrogênio (BFN), reduzindo ou até mesmo, eliminando a aplicação de adubos nitrogenados. Estudos apontam que a simbiose entre BFN e as culturas soja e milho pode ser otimizada mediante a coinoculação com rizobatérias promotoras de crescimento de plantas (RPCP). Apesar de promissora, o estudo da utilização de BFN em associação com RPCPs é incipiente no Brasil. Assim, o presente trabalho teve como objetivo monitorar, a partir da marcação bacteriana, a interação entre a linhagem de Burkholderia ambifaria (RZ2MS16), uma rizobactéria proveniente do guaranazeiro e previamente descrita como promotora de crescimento em soja e milho e linhagens das espécies Bradyrhizobium japonicum (SEMIA5079), Bradyrhizobium diazoefficiens (SEMIA5080) e Azospirillum brasilense (Ab-v5 e Ab-v6) que são comercialmente utilizadas como bioinoculantes nessas culturas respectivamente. Os efeitos sinergisticos da interação entre RZ2MS16 e bioinoculantes comercias foram avaliados em experimento de casa de vegetação. Também foi avaliado o efeito da coinoculação de bioinculantes com outra rizobactéria proveniente do guaranazeiro, Bacillus sp. (RZ2MS9). As linhagens foram inoculadas separadamente e coinoculadas, sendo melhores resultados observados com a coinoculação das linhagens. As linhagens marcadas com genes de fluorescência selecionadas para estudo de interação foram RZ2MS16, Ab-v5 e SEMIA5080, sendo essa interação observada por microscopia de fluorescência, com também pelo reisolamento das linhagens marcadas. As linhagens RZ2MS16:pNKGFP e Ab-v5: pWM1013 e SEMIA5080:pWM1013 colonizaram todos os nichos avaliados em milho e soja, respectivamente, sendo também caracterizadas como endofíticos. Assim se observa que estudos desta natureza são de grande importância para um melhor entendimento da interação entre bactéria planta e o efeito da coinoculação no melhor desenvolvimento de plantas comercialmente utilizadas.
The soybean and corn are of great global economic importance and also to Brazil, where the area cultivated with these two crops is estimated at 45.8559 billion hectares, distributed in all producing states according to their characteristics. The estimate of the global soybean crop in 2015/16 showed a reduction in global production of oilseeds to 319.0 million tons, volume 1.1 million tons lower than the survey of December 2015. Still, it is a record volume. For corn, the total production was 967.9 million tons, with a reduction in volume of 5.9 million tons compared to the survey conducted in December 2015. In these two crops are nitrogen fixing bacteria commonly used (BFN), reducing or even eliminating the application of nitrogenous fertilizers. Studies show that the symbiosis between BFN and cultures soy and corn can be optimized by coinoculation with rhizobacteria promoting plant growth (PGPR). Although promising, the study of the use of BFN in association with RPCPs is incipient in Brazil. Thus, this study aimed to monitor, from the bacterial marking the interaction between the strain of Burkholderia ambifaria (RZ2MS16) a rhizobacteria from the guarana and previously described as a growth promoter in soybean and corn and strains of the species Bradyrhizobium japonicum (SEMIA5079), Bradyrhizobium diazoefficiens (SEMIA5080) and Azospirillum brasilense (Ab-v5 and v6-Ab) that are commercially used as inoculant these cultures respectively. The synergistic effects of the interaction between RZ2MS16 and commercial inoculant were evaluated in a greenhouse experiment. It was also evaluated the effect of coinoculation of inoculant with other rhizobacteria from the guarana, Bacillus sp. (RZ2MS9). The strains were inoculated separately and coinoculated, with best results seen with coinoculation lineages. The lines marked with fluorescence genes selected for study interactions were RZ2MS16, Ab-v5 and SEMIA5080, this interaction being observed by fluorescence microscopy with also by reisolation of the marked strains. Strains RZ2MS16: pNKGFP and Ab-v5: pWM1013 and SEMIA5080: pWM1013 colonizing all niches evaluated in corn and soybeans, respectively, also being characterized as endophytes. Thus it is observed that such studies are of great importance for a better understanding of the interaction between plant and bacteria coinoculation the effect of the improved development of plants used commercially.

Aisla y selecciona rizobacterias del género Azotobacter y Bacillus con potencial aplicación como bioinoculante en el cultivo de Mangifera indica L (mango). El aislamiento se realizó a partir de muestras de rizósfera de plantaciones de mango del departamento de Piura. Se logró aislar 23 cepas del género Bacillus, de las cuales, 8 (34,8%) presentaron antagonismo antifúngico frente a Lasiodiplodia theobromae, 7 (30,4%) frente a Colletotrichum gloeosporioides y 1 (4,3 %) frente a Phytophthora sp. Asimismo 6 (26,1 %) fueron antagonistas tanto a Fusarium sp. como a Alternaria sp. En el caso de Azotobacter de las 29 cepas aisladas, 5 (17,2 %) presentaron antagonismo antifúngico frente a Lasiodiplodia teobromae y Phytophthora sp., 6 (20,7 %) frente a Colletotrichum gloeosporioides, 12 (41,4 %) frente a Fusarium sp. y 11 (37,9 %) frente a Alternaria sp. Por otro lado 7 (30,4%) de las cepas de Bacillus sp y 18 (62,1 %) de las cepas de Azotobacter sp presentaron capacidad solubilizadora de fosfatos. El 39,1% (9) de Bacillus sp y el 65,5 % (19) de Azotobacter sp lograron producir acido indol acético (AIA). En ambos géneros el 100% presentó capacidad potencial de fijación de nitrógeno. Se realizaron pruebas a nivel de almácigo con 7 cepas del género Bacillus y 5 del género Azotobacter seleccionadas para uso como potenciales bioinoculantes debido a que presentaron los mejores resultados en las pruebas anteriores. Se observó que todas las cepas usadas tuvieron efecto positivo en cuanto a la 2 reducción del tiempo de germinación, incremento en la altura de tallo y número de hojas y ausencia de síntomas de micosis. Se demuestra de esta forma que la rizósfera del cultivo de mango presenta bacterias de los géneros Azotobacter y Bacillus con potencial aplicación como bioinoculante para la mejora de la producción de mango orgánico.
Tesis

Soil contamination is a present-day worldwide concern due to the contribution of numerous anthropogenic activities, such as mining activities. The disposal of mine tailings along with deterioration of soil properties can generate several environmental and health problems, thus leading to metal contamination of extensive areas. Borralha mine was one of the biggest producers of tungsten in the past century, until its deactivation. Energy crops, such as sunflower can grant added value to this area since it integrates soils with high levels of metals. Therefore, PhytoSUDOE project intends to restore these contaminated sites, through the implementation of phytoremediation techniques, in order to stimulate ecosystem functionality. Microbial inoculants such as Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) and Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) can enhance phytoremediation efficiency through enhanced plant growth, when exposed to stress conditions (e.g. metal contamination). On the other hand, the application of organic soil amendments, like biochar (BC) can influence soil pH, water retention, and nutrient maintenance. Through its adsorption capacity towards metals, it can also reduce the levels of these contaminants and consequent bioavailability in contaminated soil. The main objective of this work was to evaluate the potential of BC amendment and application of microbial inoculants to perform as phytoremediation assistants, for plant growth promotion, specifically for sunflower plants grown in a mining metal-contaminated soil. Sunflower seedlings were inoculated with the bacteria Pseudomonas reactans (B), a commercial AMF (F) and with a mixture of P. reactans and AMF (Mix) grown in a mine soil amended with four percentages of BC (0, 2.5, 5 e 10% (w/w)). Increasing BC levels induced a generic reduction of plant biometric parameters, although inoculation (particularly F and mixed inoculation) had a positive influence on these parameters, since they increased significantly biomass production and balanced nutrient uptake, thus reducing the harmful effects of metals on sunflower growth. Cu accumulation in plant tissues was generally higher in roots than in shoots. BC addition at 2.5 and 5% induced average increases of 28 and 29% respectively, when in comparison to Cu content in roots. However, higher levels of Zn were recorded on sunflower shoots than on roots, as well as N and P contents. The bacterial communities present in rhizospheric samples was analyzed by amplifying 16S rRNA gene fragments, which were separated by DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis). In general, the bacterial communities varied in accordance with the microbial inoculant, where the AMF inoculation appeared to have a higher influence on the bacterial soil communities. This work demonstrates the potential of combining BC and bioinoculants in order to promote sunflower growth in metal contaminated soils and their potential for implementing different phytomanagement strategies.
A contaminação dos solos é uma preocupação global dos tempos atuais, devido à contribuição de numerosas atividades antropogénicas como a exploração mineira. A remoção de resíduos mineiros e a consequente deterioração das propriedades do solo, pode causar vários problemas ambientais e de saúde, levando à contaminação de extensas áreas com metais. A mina da Borralha até a sua desativação no século passado foi um dos maiores produtores de volfrâmio. Plantas com valor energético, como o girassol podem conferir um valor acrescentado a esta área, uma vez que os solos deste local possuem altos níveis de metais. Assim, o projeto PhytoSUDOE pretende restaurar estes locais contaminados através da implementação de técnicas de fitorremediação, de forma a estimular a funcionalidade do ecossistema. Inóculos microbianos como rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (sigla inglesa PGPR) e fungos micorrízicos arbusculares (sigla inglesa AMF) podem melhorar a eficiência da fitorremediação, através da promoção do crescimento de plantas quando expostas a condições adversas (e.g. contaminação com metais). Por outro lado, a aplicação de fertilizantes orgânicos como o biochar (BC) pode influenciar o pH do solo, a retenção de água e a manutenção de nutrientes. Pela sua capacidade adsortiva em relação aos metais, podem ainda reduzir os níveis destes contaminantes e a consequente biodisponibilidade nos solos. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial do BC e dos inoculantes microbianos para atuarem como auxiliadores da fitorremediação, para a promoção do crescimento de girassol num solo mineiro contaminado com metais. As sementes de girassol foram inoculadas com a bactéria Pseudomonas reactans (B), o AMF comercial (F) e com uma mistura de P. reactans e AMF (Mix) e semeadas num solo mineiro suplementado com quatro percentagens de BC (0, 2.5, 5 e 10% (m/m)). O aumento da concentração de BC induziu uma redução generalizada nos parâmetros biométricos da planta, contudo a inoculação teve uma influência positiva nestes parâmetros, particularmente a inoculação com F e Mix, uma vez que aumentaram significativamente a produção de biomassa e absorção equilibrada dos nutrientes, reduzindo desta forma os efeitos nocivos dos metais no crescimento de girassol. A acumulação de Cu nos tecidos vegetais foi, em geral, mais alta nas raízes do que na parte aérea. A adição de BC a 2.5 e 5% resultou em aumentos médios de 28 e 29% respetivamente, para o conteúdo em Cu nas raízes do girassol. Contudo, os níveis de acumulação de Zn foram maiores na parte aérea do que na raiz desta planta. O conteúdo em azoto e fósforo nos tecidos vegetais foi geralmente maior na parte aérea do que nas raízes. As comunidades bacterianas presentes nas amostras rizosféricas foram analisadas pela amplificação do gene 16S rRNA e separação dos fragmentos por DGGE (Eletroforese em gel de gradiente desnaturante). Em geral, a comunidade bacteriana variou de acordo com o inoculante microbiano aplicado, onde a inoculação com AMF aparentou ter uma maior influência na comunidade microbiana do solo. Este trabalho demonstrou o potencial da combinação do BC e dos inóculos microbianos de formar a promover o crescimento do girassol em solos contaminados com metais e o seu potencial para a implementação de diferentes estratégias de fitogestão.
Mestrado em Microbiologia

Iron (Fe) deficiency is an important micronutrient disorder that leads to severe yield losses and low nutritional crop value, particularly in calcareous soils. There is an urgent need to find sustainable and greener agricultural practices to achieve higher crop yields with higher nutritional value. Biofortification allows the increase of micronutrient concentrations in edible crop tissues and contributes to achieving such demands. The utilization of bioinoculants (BIs) with plant growth-promoting bacteria (PGPB) has been suggested as a promising approach for biofortification and prevention of Fe deficiency. So far, little work has been done on the role of PGPB in soybean (Glycine max) grown under alkaline conditions. The main purpose of this study was to test the potential of PGPB on plant growth and Fe uptake, unveiling mechanisms underlying Fe uptake and accumulation. Soybean was selected as a model species since it is severely affected by Fe deficiency and several underlying factors related to Fe homeostasis are identified. Firstly, an in-depth and critical literature review was conducted concerning the global importance of Fe and the Fe deficiency, the importance of soybean in the fulfillment of global policies, and the potential of PGPB as a sustainable approach to improve Fe nutrition and cope with Fe deficiency. Concerning the experimental work, the first study of this thesis aimed to evaluate the ability of 24 PGPB strains from a CBQF collection to enhance Fe uptake-related processes in soybean grown for 21 days in calcareous soil. Sphingobium fuliginis ZR 1-6 and Pseudomonas jessenii ZR 3-8 were selected based on their in vitro ability to produce indole-3-acetic acid (IAA), 1-aminocyclopropane-1- carboxylic acid (ACC) deaminase, siderophores, and organic acids, to tolerate high pH, and to reduce Fe3+. Bacterial isolates were inoculated singly and as a mixture, and a series of morphological, physiological, and molecular parameters were evaluated. S. fuliginis improved ferric chelate reductase (FC-R) activity (111 %), FRO2 expression (646 %), and root Fe (62 %); combined inoculation fostered Fe accumulation in trifoliates (144 %) and increased IRT1 (239 %) and FER4 expression (5036 %). Overall, S. fuliginis alone or in combination with P. jessenni were the best treatments. In a second study, PGPB were isolated from root tissues and rhizosphere of soybean grown in a Portuguese soil; 76 bacterial strains were isolated from roots (53 %), rhizosphere (29 %), and shoots (18 %), and 29 genera were identified. Two bacterial strains – B. licheniformis P2.3 and B. aerius S2.14 – were selected for in vivo experiments, and inoculated plants were grown to maturity. Photosynthetic parameters, chlorophyll content, total fresh weight, and Fe concentrations were not significantly affected by inoculation. Nevertheless, inoculation with B. licheniformis increased pod number (33 %), decreased FC-R activity (45 %), and increased expression of Fe-related genes; inoculation with B. aerius decreased root length (20 %), FC-R activity (55 %), and FRO2 expression, and increased expression of the remaining genes. Furthermore, inoculation with bacterial isolates improved the accumulation of Mn, Zn, and Ca in soybean tissues. In this study, B. licheniformis showed potential to be incorporated in formulations for improving soybean grown in calcareous soil. The formulation of BIs contemplate a series of requirements and their effective implementation is still challenging. However, they are a promising trend to the accomplishment of future global politics and present a series of advantages to greener agriculture practices that are critically reviewed in the last part of this thesis. In general, the results presented in this thesis contribute to better understand the mechanisms by which PGPB improve Fe uptake and plant growth, under alkaline conditions, and their potential as bioinoculants in a sustainable perspective.
A deficiência de ferro (Fe) é uma carência nutricional que leva a graves perdas de produtividade e valor nutricional das culturas, particularmente em solos calcários. Existe uma necessidade urgente de encontrar práticas agrícolas mais sustentáveis para a produção de culturas com maior rendimento e valor nutricional. A biofortificação permite aumentar a concentração de micronutrientes nas culturas e contribui para cumprir estas necessidades. A utilização de bioinoculantes (BIs) com bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCP) tem sido sugerida como uma abordagem de biofortificação e prevenção da deficiência de Fe. Até agora, existem poucos estudos sobre o papel das BPCP em soja crescida em condições alcalinas. O objetivo principal deste estudo foi testar o potencial de BPCP no crescimento das plantas e na absorção do Fe, elucidando os mecanismos subjacentes à absorção e acumulação do Fe. A soja foi escolhida pois é bastante afetada pela deficiência de Fe, e foram identificados vários fatores subjacentes relacionados com a sua homeostasia. Inicialmente, fez-se uma revisão crítica da literatura tendo em conta a importância do Fe e da sua carência, o papel da soja face às políticas globais, e o potencial das BPCP como abordagem sustentável para melhorar a nutrição de Fe e combater a sua deficiência. O primeiro estudo experimental teve como objetivo avaliar a capacidade de 24 estirpes de BPCP de uma coleção do CBQF em melhorar os processos de absorção do Fe em soja crescida em solo calcário durante 21 dias. Sphingobium fuliginis ZR 1-6 e Pseudomonas jessenii ZR 3-8 foram selecionadas com base na sua capacidade in vitro de produzir ácido indol-3-acético (AIA), ácido 1- carboxílico-1-aminociclopropano (ACC) oxidase, sideróforos e ácidos orgânicos, tolerar pH elevado, e reduzir Fe3+. Os isolados bacterianos foram inoculados isoladamente e em mistura, e foram avaliados vários parâmetros morfológicos, fisiológicos e moleculares. S. fuliginis melhorou a atividade da redutase férrica (FC-R) (111 %), a expressão de FRO2 (646 %), e a concentração de Fe na raiz (62 %); a inoculação combinada promoveu a acumulação de Fe nos trifoliados (144 %) e aumentou a expressão de IRT1 (239 %) e FER4 (5036 %). No geral, a inoculação com S. fuliginis sozinho ou em combinação com P. jessenni revelaram-se os melhores tratamentos. Num segundo estudo, as BPCP foram isoladas dos tecidos e da rizosfera de soja cultivada num solo português; foram isoladas 76 estirpes das raízes (53 %), rizosfera (29 %), e parte aérea (18 %), e foram identificados 29 géneros bacterianos. Foram selecionadas duas estirpes – B. licheniformis P2.3 e B. aerius S2.14 – para experiências in vivo em plantas crescidas até à maturidade. Os parâmetros fotossintéticos, teor de clorofila, peso fresco total e concentrações de Fe não foram afetados significativamente pela inoculação. No entanto, a inoculação com B. licheniformis aumentou o número de vagens (33 %), diminuiu a atividade da FC-R (45 %) e aumentou a expressão de genes relacionados com o Fe; a inoculação com B. aerius diminui o comprimento da raiz (20 %), a atividade da FC-R (55 %) e a expressão de FRO2, e aumentou a expressão dos restantes genes. Além disso, a inoculação com as bactérias melhorou a acumulação de Mn, Zn e Ca nos tecidos da soja. Neste estudo, B. licheniformis apresentou potencial para ser incorporado em formulações para o melhoramento da soja crescida em solo calcário. A formulação de BIs contempla vários requisitos e sua implementação representa ainda um desafio. No entanto, estes são uma tendência promissora para o cumprimento das políticas globais futuras, apresentado várias vantagens para práticas agrícolas mais “verdes”, analisadas na última parte desta tese. No geral, os resultados apresentados contribuem para compreender melhor os mecanismos pelos quais as BPCP melhoram a absorção do Fe e o crescimento das plantas em condições alcalinas, e demonstram o seu potencial como bioinoculantes numa perspetiva sustentável.