Torossian, Nouritza. "Study of long non-coding RNAs and reference-free detected RNAs as potential biomarkers and actors of Triple Negative Breast Cancers' chemoresistance." Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2023. http://www.theses.fr/2023UPSLS057.
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Les cancers du sein triple négatifs (CSTN) sont un sous-type hétérogène représentant 12% à 24% de tous les cancers du sein. Ils ont les plus mauvais pronostics et touchent souvent les femmes jeunes. Le traitement au stade localisé repose essentiellement sur la chimiothérapie, sans thérapie ciblée (hors cas de mutations germinales de BRCA). Quasiment toutes les patientes reçoivent la même chimiothérapie néoadjuvante (CNA) avec anthracyclines et taxanes, ce qui grève leur survie en l’absence de réponse complète pathologique (RCp). L’intensification thérapeutique est la tendance actuelle, notamment avec l’addition d’immunothérapie, afin d’améliorer taux de RCp et survie. Les signatures d’expression génique standard ne pas utilisables en pratique clinique pour prédire la chimiorésistance des CSTNs à la CNA, alors qu’elles permettraient de sélectionner les patientes pour une intensification thérapeutique. D’où l’intérêt d’explorer les transcrits issus des 90% du génome restant, constitué de régions non codantes et non référencées. Parmi eux, les ARNs longs non-codant (lnc) qui se caractérisent par une longueur d’au moins 200 nucléotides présentent l’intérêt pour certains d’entre eux d’avoir une expression tissu- voire cancer- spécifique. De plus, certains ARNs lnc ont un rôle démontré dans différents mécanismes de chimiorésistance. Les ARNs lnc ne sont cependant pas bien annotés dans le génome humain et de nouveaux transcrits non référencés, codant ou non, et de nouvelles isoformes de gènes connus, sont découverts quotidiennement.Mon 1er objectif de thèse était d’évaluer le transcriptome non référencé en tant que réservoir potentiel de biomarqueurs prédictifs de chimiorésistance des CSTN à la CNA. Nous avons analysé une cohorte de 78 CSTNs avant CNA, et comparé les cas chimiosensibles (chS) et chimiorésistants (chR) selon le score RCB (Residual Cancer Burden). Nous avons comparé l’analyse d’expression génique différentielle standard (DE-seq) sur les gènes annotés, et sur de nouveaux ARNs lnc détectés grâce à un profiler ARN, et une analyse non biaisée par les annotations génomiques, de fragments de transcrits différentiels. L’analyse non biaisée a permis d’obtenir la meilleure séparation des cas chS et chR dans notre cohorte exploratoire. Nous avons ensuite évalué cette approche sur une cohorte indépendante, et nous l’avons optimisée, en considérant les régions génomiques d’expression différentielle. Ceci nous a permis d’obtenir une signature reproductible entre les deux cohortes. Au total, ces résultats montrent le potentiel d’une approche non référencée pour générer une signature de chimiorésistance précoce des CSTN. Des validations supplémentaires sont nécessaires sur des cohortes plus larges.Mon 2nd objectif de thèse était d’évaluer les ARNs lnc en tant que potentiels acteurs/cibles thérapeutiques dans les CSTNs chR. Nous avons sélectionné les ARNs lnc surexprimés dans les CSTNs chR pre-CNA (versus les CSTNs chS pre-CNA) et dans les CSTNs chR post-CNA (versus les CSTNs chR pre-CNA). En intégrant leurs niveaux et spécificités d’expression, leurs localisations génomiques et les données préexistantes suggérant une fonction potentielle, nous avons retenu trois ARNs lnc (AL450326.1, LINC02609 et MIR503HG). Nous avons évalué l’impact de l’inactivation de leur expression sur la cytotoxicité du Docetaxel dans un modèle de lignée cellulaire de CSTN. L’inactivation de l’expression de chacun des trois ARNs lnc a induit une cytotoxicité accrue du Docetaxel. Une clonogénicité spontanée diminuée et une mort cellulaire accrue sous Docetaxel ont de plus été observées après la déplétion d’AL450326.1 et de LINC02609. Au total, nous avons identifié trois ARNs lnc jouant un rôle dans la chimiorésistance des CSTN. Des tests fonctionnels supplémentaires sont nécessaires pour en décrypter les mécanismes, avec pour objectif à long terme d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques contrant la chimiorésistance des CSTNs à la CNA<br>Triple-negative breast cancers (TNBC) represent a heterogeneous subtype of breast cancers including 12% to 24% of all cases, having the poorest prognoses and often affecting young women. Treatment at localized stage is mainly based on chemotherapy, with no targeted therapy (except germline BRCA mutated patients). Nearly all patients receive the same Neo-Adjuvant Chemotherapy (NAC) with anthracyclines and taxanes, that badly impacts survival in the absence of pathological complete response (pCR). Therapeutic intensification, notably with addition of immunotherapy, is the current trend to increase pCR rate and improve survival. Standard gene expression signatures have failed to provide effective tools to predict TNBC chemoresistance, probably due to their incomplete nature, as they are mostly based on expression of protein coding genes and/or referenced transcripts and up to date there is no clinically useful transcriptomic signature predicting TNBC chemoresistance to NAC. Such a predictive signature would allow patient selection for therapeutic intensification. Therefore, it is important to explore the remaining 90% of the genome consisting of non-coding and non-referenced regions. One class of non-coding RNAs that is of great interest are long non-coding (lnc) RNAs, that are at least 200 nucleotides long, some of them being specifically expressed in cancer. Moreover, some lncRNAs have been shown to be implicated in different mechanisms of chemoresistance. LncRNAs are not fully well annotated in the human genome and new unreferenced transcripts, coding or not, and new isoforms of known genes are discovered daily.Therefore, the first goal of my PhD was to assess reference-free transcriptome as a potential reservoir of predictive biomarkers of TNBC chemoresistance. A cohort of 78 TNBCs before NAC was analyzed, comparing chemosensitive (chS) and chemoresistant (chR) cases based on international Residual Cancer Burden (RCB) score. A standard differential gene expression analysis (DE-seq) on annotated genes, and on new lncRNAs detected with a de novo RNA-profiler, and a reference-free analysis of differential fragments of transcripts without annotation bias were compared. Reference-free approach showed best separation of chS and chR patients in the training cohort. Further, based on comparison with an independent validation cohort, an optimized approach was proposed, where specific genomic regions with differential expression were selected. This technique gave a reproducible signature of chemoresistance between the two cohorts. In all, these results show the potential of a reference-free approach to generate a transcriptomic signature as predictive biomarker of early TNBC chemoresistance. Further investigation is needed to validate the signature using larger validation cohorts.The second objective of my PhD was to assess lncRNAs as potential actors/therapeutic targets in chR TNBCs. For that we selected lncRNAs upregulated in chR pre-NAC TNBCs (compared with chS pre-NAC TNBCs) and in chR post-NAC TNBCs (compared with chR pre-NAC TNBCs). Considering lncRNAs level and specificity of expression, genomic position, and pre-existing data of their potential function, three lncRNAs (AL450326.1, LINC02609 and MIR503HG) were retained for functional analysis. By knocking down levels of these lncRNAs in TNBC cell line model, an impact on Docetaxel cytotoxicity was assessed. All three lncRNAs knock downs showed an improved Docetaxel induced cytotoxicity. Knock down of AL450326.1 and LINC02609 resulted in a decreased spontaneous clonogenicity and increased Docetaxel induced cell death, giving a first indication of their mode of action. In all, we identified three lncRNAs playing a role in NAC chemoresistance. Further functional studies will allow to decipher the mechanisms by which the identified lncRNAs affect chemoresistance with the ultimate goal to identify new therapeutic approaches to circumvent NAC chemoresistance of TNBCs