Dissertationen zum Thema „ARN longs non-Codant“

Le cancer du sein représente à l’échelle mondiale le deuxième cancer le plus fréquent et la première des tumeurs malignes de la femme. Actuellement, seuls certains biomarqueurs (RO, RP, récepteur HER2, index Ki67) et la signature transcriptomique PAM50 sont pris en compte dans la classification morphologique et l’orientation thérapeutique. Les analyses transcriptomiques à haut débit ont révélé que plus de 80% du génome humain est transcrit en ARN. Parmi les ARNs non codants, les transcrits dont la longueur est supérieure à 200 nt sont arbitrairement qualifiés de longs ARNs non codants (lncRNAs). Les lncRNAs jouent un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et présentent des profils d’expression anormaux dans diverses pathologies, dont le cancer. L’objectif principal de mon projet de thèse a consisté à analyser l’expression des lncRNAs, leur fonctionnalité et leur rôle dans l’oncogénèse mammaire. La première partie s’est focalisée sur l’étude des gènes ANRIL (ainsi que 10 gènes de la même voie de signalisation) et MALAT1, deux lncRNAs dont les mécanismes d’action et la signification clinique au cours de la cancérogénèse mammaire sont encore controversés. ANRIL et MALAT1 sont respectivement surexprimés dans 20% et 14% des tumeurs de notre série, confirmant leurs rôles pro-oncogénique dans la cancérogénèse mammaire. La surexpression de MALAT1 se traduit en RNA-FISH par la présence de volumineux speckles intranucléaires. La complexité de leur dérégulation est liée à la présence d’isoformes et de réseaux d’interactions avec les mRNAs et les miRNAs. Concernant les sous-unités appartenant aux complexes Polycomb PRC2 et PRC1qui interagissent avec ANRIL, EZH2 (PRC2) est normalement ciblé par 3 miRNAs onco-suppresseurs (miR-26A1, miR-125B et miR-214) qui sont sous-exprimés dans notre série de CCIs. Les 2 oncomiRs miR-181B1 and miR-181A2 qui ciblent et inactivent CBX7 (PRC1), apparaissent surexprimés dans notre série, en relation avec l’activation de l’oncogène HMGA1. Concernant MALAT1, le complexe de biogénèse des miRNAs Drosha-DGCR8-Microprocesseur régule l’expression d’un variant d’épissage ∆-MALAT1 et ce dernier est impliqué dans l’activation de la voie PI3K/Akt. Des corrélations significatives sont observées entre MALAT1 et des gènes impliqués dans l’épissage alternatif, le cycle cellulaire, l’apoptose, la réparation de l’ADN et la migration cellulaire. Les profils transcriptomiques aberrants de ces 2 lncRNAs semblent caractéristiques des carcinomes mammaires. Ainsi, ANRIL (i) présente une association positive inattendue avec le cluster p16-CDKN2A/p15-CDKN2B/p14-ARF dans notre série, alors que cette association apparait négative dans les carcinomes de prostate et (ii) inactive épigénétiquement les miRNAs onco-suppresseurs miR-99a/miR-449a dans les carcinomes gastriques et non dans notre série de CCIs. D’un point de vue clinique, deux signatures pronostiques indépendantes ont pu être identifiées, l’une intégrant les 2 partenaires protéiques d’ANRIL appartenant aux complexes Polycomb (surexpression d’EZH2 / sous-expression de CBX7), et l’autre représentée par la sous-expression de Δ-MALAT1, observée dans 20% des tumeurs de notre série. La présence de variants d’épissage alternatifs, de réseaux d’interactions multiples et d’une spécificité d’organe devra être prise en compte lors de l’évaluation des thérapies épigénétiques ciblant ANRIL (inhibiteurs des bromodomaines et des oncoMIRs) ou MALAT1 (ASOs) dans les cancers du sein. La deuxième partie du projet de thèse a consisté en l’analyse du transcriptome non codant des carcinomes mammaires par une stratégie pangénomique, afin d’identifier de nouveaux types de lncRNAs, tels les nouveaux lncRNAs antisens, circulaires et associés à des séquences ultra-conservées ou induisant des résistances médicamenteuses
Breast cancer is the second most common cancer and the first malignancy of women. Currently, only few biomarkers (ER, PR, receptor HER2, index Ki67) and transcriptomic signature PAM50 are included in the morphological classification and therapeutic orientation. Transcriptome genome-wide analyses unexpectedly revealed that over 80% of the DNA is transcribed into RNA. Among these noncoding RNAs, transcripts longer than 200 nt are arbitrarily qualified as long noncoding RNAs (lncRNAs). LncRNAs play a crucial role in maintenance of cellular homeostasis and present abnormal expression patterns in various diseases, including cancer. The main objective of my project was to analyze expression of lncRNAs, their functionality and their roles in breast oncogenesis. The first part focused on the study of ANRIL and MALAT1 genes, two lncRNAs whose mechanisms of action and clinical significance in breast carcinogenesis are still controversial. ANRIL and MALAT1 respectively overexpressed in 20% and 14% of tumors in our series, confirming their pro-oncogenic roles in mammary carcinogenesis. MALAT1 overexpression results in RNA-FISH by presence of huge intranuclear speckles. Complexity of their deregulation is associated with presence of various isoforms and interaction networks with miRNAs, mRNAs and other lncRNAs. Concerning PRC2/PRC1 polycomb sub-units interacting with ANRIL, EZH2 (PRC2) is normally targeted by 3 onco-suppressor miRNAs (miR-26A1, miR-125B and miR-214) that are under-expressed in our series of CCIs. The 2 oncomiRs miR-181B1 and miR-181A2 that normally target and inactivate CBX7 (PRC1) appear overexpressed in our series of CCIs, resulting from activation of the oncogene HMGA1. Concerning MALAT1, the miRNAs biogenesis complex Drosha-DGCR8-Microprocessor regulates expression levels of the splicing variant Δ-MALAT1 and the latter is involved in activation of PI3K/Akt pathway. Significant correlations were observed between MALAT1 and genes involved in alternative splicing, cell cycle, apoptosis, DNA repair and migration. Aberrant transcriptomic profiles of these two lncRNAs seem characteristics of mammary carcinomas. Thus, ANRIL (i) presents an unexpected positive association with the p16-CDKN2A/p15-CDKN2B/p14-ARF cluster in our series of CCIs, whereas this association appears negative in prostate carcinomas and (ii) epigenetically inactivates onco-suppressor miRNAs miR99a/miR-449a in gastric carcinomas, but not in our series. From a clinic point of view, two independent prognostic signatures were identified, one incorporating two protein partners of ANRIL belonging to the polycomb complexes (EZH2 overexpression / CBX7 under-expression) and the other represented by under-expression of the variant Δ-MALAT1 observed in 20% of tumors in our series. The presence of alternative splice variants, multiple interactions with mRNAs and miRNAs and organ specificity should be considered when evaluating epigenetic antitumoral drugs designed to target ANRIL (bromodomains and oncoMIRs inhibitors) and MALAT1 (ASOs) in breast cancers. The second part of the project involved analysis of non-coding transcriptome of mammary carcinomas to identify new types of lncRNAs, including new antisens lncRNAs, circular lncRNAs, induced lncRNAs, noncoding ultraconserved transcripts and lncRNAs associated with resistance to systemic treatments. The preliminary analysis performed on a small cohort of breast cancers (n=8) will allow the implementation of the main (n=40) which will enhance robustness of identified signatures

Les cancers bronchopulmonaires non à petites cellules (CBNPC) sont la première cause de décès par cancer, les adénocarcinomes étant la forme la plus fréquente. Malgré une prise en charge précoce, ils constituent, par leur taux de récidive important et leur mauvais pronostic, un véritable problème de santé publique. Nous nous intéressons à l'hypoxie, un facteur agressivité des ADC, et à la famille des longs ARNs non codants (lncARNs), dérégulés dans de nombreux cancers et en réponse à l'hypoxie, mais peu caractérisés sur le plan structural et fonctionnel. Ces transcrits représentent un espoir pour le développement de nouvelles thérapies. Au cours de ma thèse, j'ai identifié une dizaine de lncARNs régulés par l'hypoxie in vitro et in vivo dans des ADC de stades précoces. j'ai caractérisé NLUCAT1, un transcrit nucléaire induit par l'hypoxie. L'invalidation de ce transcrit par le système CRISPR/Cas9 a révélé une diminution de la prolifération et de l'invasion cellulaires, et une augmentation du stress oxydatif et de la sensibilité au cisplatine, traduisant un potentiel rôle pro-oncogénique de ce transcrit dans les ADC. L'analyse du transcriptome a révélé une répression des réseaux de gènes contrôlés par NRF2, HIF et NFkβ dans les cellules déficientes pour NLUCAT1. Nous avons notamment identifié des gènes de la réponse anti-oxydante régulés par NRF2 dont l'ARN interférence mime en partie les conséquences de l'inactivation de NLUCAT1 sur l'apoptose. Nos résultats démontrent que NLUCAT1 exerce des activités pro-tumorales dans les ADC et suggère qu'il pourrait représenter une cible thérapeutique potentielle dans ce type de cancer
Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer death worldwide, with poor prognosis and a high rate of recurrence despite early surgical removal. It is therefore essential to identify new prognostic markers and new therapeutic targets. We are interested in gene regulation related to hypoxia, a factor associated with relapse of lung adenocarcinomas (LUAD). The roles of long non coding RNAs (incRNAs) in cancer development and hypoxic response are largely unexplored. A transcriptome profiling of early-stage LUAD samples indicated that a set of incRNAs was correlated to a metagene hypoxic signature. Some of these transcripts were also sensitive to hypoxia in LUAD cell lines. We focused on a new "hypoxaLinc", named NLUCAT1 that is strongly up-regulated by hypoxia in vitro and correlated to hypoxic markers and bad prognosis in LUAD samples. Full molecular charactherization of NLUCAT1 showed that LUCAT1 is mainly regulated by NF-kβ and NRF2 transcription factors. Targered deletion of NLUCAT using CRISPR/CAS9 in A549 LUAD cell line, revelated a decrase in proliferative and invasive properties, an increase in oxidative stress and a higher sensisivity to displatin-induced apoptosis. We identified genes of the NRF2-regulated and anti-oxidant response whose RNA interference partially mimicked the consequences of NLUCAT1 inactivation on ROS-dependent caspase activation. Overall, our data strongly demonstrate that NLUCAT1 exerts pro-tumoral activities in early stages hypoxic LUADs ans suggest it could represent a new potential therapeutic target in lung cancer

Seul 1,2% du génome code des protéines :98,8% est non-codant,cependant 93% du génome est transcrit, principalement en longs ARN non-codants (lncRNA). Or ces lncRNA constituent une nouvelle classe de régulateurs génomique agissant à tous les niveaux d’expression des gènes et ils sont fortement spécifiques du tissu,modulés au cours du temps et en conditions physiopathologiques.Ainsi,nous proposons que chaque cellule spécifiée exprime son répertoire de lncRNA spécifique avec une carte des zones de chromatines ouvertes renseignant son identité cellulaire.Dans cette perspective,nous avons isolé par FACS 2types cellulaires impliqués dans des pathologies: i) des neurones dopaminergiques humains(nDA) différenciés à partir d’hiPS et ii) des neurones DA et sérotoninergiques (n5-HT)murins.Sur ces 2types neuraux isolés,nous avons identifié 1363 lncRNA exprimés dans les nDA (dont 989nouveaux) constituant le répertoire des neurones DA et 1257 lncRNA dans les n5-HT (719nouveaux) constituant le répertoire des n5-HT.Or leur comparaison a montré que seuls 194 lncRNA sont communs aux 2types cellulaires:la majorité des lncRNA est exprimée soit dans les nDA soit dans les n5-HT,attestant leur spécificité cellulaire.De plus,39%des zones de chromatines ouvertes/potentiellement régulatrices des nDA ne sont pas non plus retrouvées dans les n5-HT.Ainsi, nous avons généré un catalogue d’éléments non codants constituant des signatures moléculaires spécifiques des nDA et n5-HT,ouvrant de nouvelles pistes physiopathologiques:Dans cette optique,les signatures non codantes DA ont été comparées avec les SNP associés à la maladie de Parkinson et des études de fonction sur des lncRNA candidats ont été réalisées
Only 1.2% of the genome codes for proteins; 98.8% is thus non-coding, despite 93% of the human genome being actively transcribed, mostly in long non-coding RNA (lncRNA).These lncRNA constitute a new class of genomic regulator capable of acting at all levels of gene expression and their expression is highly tissue-specific,modulated during the time and under normal/pathological conditions.Thus, we propose that each specified cell expresses a specific repertoire of lncRNA correlated to open/active chromatin regions specifying its cellular identity.In this context, we isolated by FACS 2neural types involved in many pathologies: i) human dopaminergic neurons (nDA) differentiated from hiPS and ii) DA and serotoninergic (n5-HT) neurons. From these 2neural types, we identified 1,363 lncRNA in nDA (among which 989 new, whether 73%) constituting the repertoire of nDA, and 1,257 lncRNA (among which 719 new) constituting the repertoire of n5-HT. Moreover,their comparison has shown that only 194 lncRNA are common to both neural types:thus the majority of lncRNA is expressed either in nDA or in n5-HT, indicating a high degree of cell-specificity.In addition, 39% of open chromatin regions, potentially regulatory, were also not detected in the n5-HT.Thus, we have generated DA and 5-HT specific catalogues of non-coding elements of the genome, which constitute DA and 5-HT specific molecular signatures, that could participate in deepening our knowledge regarding nDA or n5-HT development and dysfunctions. With this in mind,these DA specific elements have been compared with the SNP described as Parkinson Disease risk variants and candidate lncRNA were selected to perform studies of function

Les cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules, et plus particulièrement les adénocarcinomes (ADC), constituent la première cause de mortalité due au cancer dans les pays développés. Malgré des prises en charge précoces, leur fort taux de récidive, nécessite l'identification de nouveaux marqueurs pronostics et de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans cette optique, nous nous intéressons à l'hypoxie, un facteur d’agressivité tumoral, et à la famille émergente des longs ARNs non codants qui régulent l’expression génique par le biais de complexes ribonucléoprotéiques. Des analyses transcriptomiques de cohortes de patients d’ADC pulmonaires ont permis l’identification d'une quarantaine de longs ARNs non codants (lncARN) corrélés au statut hypoxique des tumeurs et/ou à un mauvais pronostic vital. Nous nous sommes focalisés sur deux candidats, NLUCAT1 et LINC01116, induits par l'hypoxie et associés à une diminution de la survie des patients. NLUCAT1 est un transcrit nucléaire de 9800 nt dont l’invalidation par le système CRISPR/Cas9 réduit les propriétés prolifératives et invasives des cellules et augmente la production de RLO et l'apoptose induite par le cisplatine ou un stress oxydatif. L’analyse comparative des transcriptomes de cellules invalidées ou non pour NLUCAT1 a révélé son implication dans la régulation du stress oxydatif via un rétrocontrôle positif sur des gènes de la réponse anti-oxydante. Par ailleurs, LINC01116 est cytosolique et exprimé conjointement dans les cellules cancéreuses et dans les cellules endothéliales du microenvironnement tumoral. J'ai montré que des siARNs réduisent l'adhésion et augmentent la perméabilité trans-endothéliale suggérant des défauts au niveau des contacts intercellulaires. J'ai ensuite entrepris l'étude du mode d'action de LINC01116 par l'identification de ses partenaires protéiques. Des expériences de "RNA pulldown" couplées à de la spectrométrie de masse ont permis d’identifier les protéines ILF3 et PABPC1. Ces interactions ont été validées par des expériences inverses d'immunoprécipitation d'ARN (RIP). L’implication de ces protéines dans le mode d’action de LINC01116 nécessite des études complémentaires.L’ensemble des résultats collectés durant ma thèse ont mis en évidence l’action pro-tumorale du transcrit NLUCAT1 dans les ADC et l'implication de LINC01116 dans la modification du microenvironnement vasculaire tumoral. Ces transcrits, associés à un mauvais pronostic des ADC, pourraient représenter des cibles thérapeutiques potentielles pour la prise en charge des patients
Lung cancers, and notably Lung Adenocarcinomas (LUAD) are the leading cause of cancer death worldwide. Their high rate of recurrence despite early, requires new prognostic markers and new therapeutic targets. The combined study of local cohort (CHU of Nice) and large scale (TCGA) transcriptomes of LUAD allowed the identification of a shortlist of 28 long non-coding RNAs (lncRNA) correlated with hypoxia, a factor of tumor aggressiveness, and a poor prognosis. LncRNAs are transcripts that modulate gene expression through the recruitment of proteins and/or nucleic acids and represent an interesting source of new therapeutic targets. Two lncRNAs candidate were selected and molecular characterization was undertaken by sequencing, RT-PCR and smRNA FISH and concern the nuclear lncRNA NLUCAT1 of 9,8kb and the cytosolic lncRNA LINC01116 of 1,2kb. Experiments with loss of function via CRISPR/Cas9 systems, interference RNA and gain of function allowed to characterize the function of these transcripts. Invalidation of NLUCAT1 by CRISPR/Cas9 reduces proliferation, migration, invasion and increases cisplatin sensitivity and ROS production. Bioinformatic analysis of transcriptomes from cells invalidated or not for NLUCAT1 has demonstrated its involvement in the mechanisms of regulation of oxidative stress via a positive feedback from the NRF2 antioxidant pathway. On the other hand, lncRNA LINC01116 is mainly expressed in endothelial cells of the tumor microenvironment and its inhibition by interfering RNA reduces the adhesion capacities and increases the permeability of the endothelium. Mechanistic characterization was perform for LINC01116 via RNA pulldown-MS co-precipitation experiments and idenfied a list of potential partner proteins. The proteins of RNA metabolism and stability, ILF3 and PABPC1 were identified and their interactions with LINC01116 were validated by RNA immunoprecipitation (RIP). Overall, during my thesis, I determine the pro-tumoral action of the NLUCAT1 in LUAD and the involvement of LINC01116 in the modification of the tumor microenvironment. These two transcripts could represent potential therapeutic targets in the management of lung cancer

Les longs ARN non codants (lncRNAs) sont définis comme des transcrits de plus de 200nt et n'ayant pas de potentiel codant. Des études récentes ont démontré que les lncRNAs pouvaient être impliqués dans la régulation de la transcription, de la traduction, de la différenciation cellulaire, de l'expression génique, du cycle cellulaire et des modifications de la chromatine. De plus, il a été montré un impact fonctionnel de certains lncRNAs dans le processus de cancérogenèse mais nos connaissances actuelles sur ces molécules dans le cancer, et plus particulièrement dans la leucémie, restent extrêmement limitées. Au cours de cette étude, nous avons analysé l'expression des lncRNAs par RNA-sequencing sur 40 patients atteints de leucémie aiguë myéloblastique (LAM) à caryotype normal. Parmi les 11065 lncRNAs exprimés dans nos échantillons, nous avons identifié une signature de lncRNAs associée à la mutation de NPM1. Afin de mettre en évidence les fonctions putatives des lncRNAs sélectionnés, nous avons utilisé un algorithme de prédiction d'interaction protéine/ARN. De manière intéressante, plus de la moitié des lncRNAs présentent des sites d'interactions potentiels à SUZ12, une sous unité du complexe PRC2 (Polycomb repressive complex 2), connu pour être recruté par des lncRNAs pour la régulation épigénétique de gènes cibles. Par RNA immunoprécipitation (RIP) de SUZ12, nous avons pu démontrer que le lncRNA XLOC_087120 interagissait avec SUZ12. De plus, son expression est anti-corrélée avec celle des gènes voisins codants des histones, suggérant un rôle dans la régulation négative des histones par ce lncRNA. L'impact de la dérégulation de XLOC_087120 sur les histones a été confirmé par des expériences de surexpression et d'inhibition de ce lncRNA dans des lignées de LAM. De plus, même si la mutation NPM1 ne semble pas affecter directement l'expression de ce lncRNA, des expériences d'infection de la forme mutée de NPM1 dans une lignée LAM ont montré que NPM1 pourrait réguler la localisation nucléaire/cytoplasmique de XLOC_087120 et moduler sa fonction de répresseur. En conclusion, ces données suggèrent que les lncRNAs sont des facteurs clés dans la pathogenèse des LAMs
Long noncoding RNAs (lncRNAs) are defined as RNA transcripts that are larger than 200 nt but do not appear to have protein- coding potential. Recent studies have demonstrated that lncRNAs regulate many processes such as transcription, translation, cellular differentiation, gene expression regulation, cell cycle regulation, and chromatin modification. Cumulative evidence points towards an important role of lncRNAs in cancer initiation, development, and progression. However, our overall knowledge of lncRNAs in cancer, including leukemia, remains extremely limited. In this study, we investigated lncRNA expression by RNA-sequencing in 40 acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. Among 11065 lncRNA expressed in our samples, we identified specific lncRNA signature associated with the presence of NPM1 mutation. To go further into the putative function of these lncRNAs, we used catRAPID Omics algorithm to predict potential protein partners. Interestingly, the majority of the selected lncRNAs contains putative SUZ12 binding sites, a PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) component known to be linked to lncRNAs and to epigenetically regulates target genes. By using SUZ12 RNA Immunoprecipitation, we identify one lncRNA named XLOC_087120 linked to SUZ12. XLOC_087120 is located in a region enriched in histone genes. Pearson correlation showed a significative anti-correlation between XLOC_087120 and histone neighboring coding gene expression suggesting a role of this lncRNA in the regulation of histone genes. The impact on histone genes expression was confirmed by overexpression and inhibition of XLOC_087120 in AML cell lines. Overexpression of NPM1 mutant in an AML cell line showed that NPM1 modulates the nuclear/cytoplasmic localization of XLOC_087120 and consequently its repressive function. Altogether, these data suggest that lncRNAs should be considered as key players in the pathogenesis of acute myeloid leukemias

Les applications des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) dans le domaine biomédical sont particulièrement prometteuses, aussi bien au niveau expérimental qu’au niveau clinique. Leur utilisation comme source inépuisable de cellules permettant de tester et développer de nouvelles molécules thérapeutiques (notamment par modélisation de pathologies in vitro, criblage haut-débit et tests de cytotoxicité) s’ajoute à l’important potentiel qu’elles présentent en médecine régénérative et en thérapie cellulaire. Utilisables comme matériel biologique permettant de restaurer partiellement ou totalement un organe ou un tissu défaillant, il reste essentiel de vérifier l’intégrité génétique des lignées cellulaires utilisées afin de garantir une utilisation sécurisée pour le patient. Parmi les facteurs responsables de l’apparition d’anomalies génétiques chez les CSP, les conditions cultures jouent un rôle essentiel. Des techniques de culture inadaptées peuvent facilement provoquer l’émergence d’une instabilité génomique. Toute altération doit être détectée et documentée afin de pouvoir définir des critères d’acceptation préalable à leur utilisation clinique.Les CSP sont des cellules particulièrement sensibles au stress qui peut résulter de techniques de repiquage inappropriées. La dérive génétique qui découle de ce stress peut être précoce et apparaître dès les premiers passages des lignées cultivées. Notre équipe a pu tester de nombreuses méthodes de repiquage sur différentes lignées cellulaires pluripotentes. Nous avons notamment observé que des anomalies génétiques majeures caryotypiques (trisomies) et infra-caryotypiques (SNPs) ainsi que des changements phénotypiques (survie augmentée, acquisition de mobilité) apparaissaient rapidement suite à l’utilisation de techniques de repiquage basées sur l’utilisation d’enzyme de dissociation (TryPLE). Ces altérations apparaissent dans des lignées qui s’adaptent progressivement à la dissociation en cellules uniques (dissociation « single-cell ») provoquées par ces enzymes.Notre équipe étudie les conséquences cellulaires liées à ce phénomène d’adaptation des CSP provoquée par la dissociation « single-cell ». Grâce à des techniques de séquençage dernière génération (RNA-Seq), nous avons comparé les profils transcriptomiques de CSP repiquées par des techniques standard (comme le passage mécanique) et par des techniques basées sur la dissociation « single-cell » (comme le passage enzymatique par TryPLE). Cette comparaison a montré au niveau transcriptionnel une surexpression spectaculaire d’ARNs non codants appartenant à une classe récemment décrite : les longs ARNs non codants (lncRNAs).L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’évaluer le niveau d’implication de ces lncRNAs dans le processus d’adaptation des CSP en culture, et leur rôle fonctionnel potentiel. Nous avons ainsi dans un premier temps déterminé in silico quels lncRNAs étaient différentiellement exprimés dans les CSP adaptées, et après validation expérimentale par biologie moléculaire des candidats les plus prometteurs, nous avons utilisé des tests fonctionnels (notamment par RNA interférence (siRNA)) afin de déterminer le rôle de ces lncRNAs dans la machinerie cellulaire et la pluripotence des CSP. Autour de ce projet principal, nous avons essayé de comprendre les mécanismes régissant les changements phénotypiques et comportementaux provoquées par la dissociation « single-cell ». Nous avons notamment pu suggérer la mise en place d’un phénomène de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) chez des CSP dissociées. Enfin, l’attractivité que représente un sujet d’étude récent comme les lncRNAs et la disponibilité croissante de publications les concernant nous ont poussé à publier une revue approfondie ainsi qu’une méta-analyse sur l’implication des longs ARN non codants dans le développement précoce de l’embryon et dans les cellules souches pluripotentes
The actual and future applications of human pluripotent stem cells (PSC) in the biomedical field are highly promising. Their use for the discovery of new therapeutic drugs through the development of high-throughput screening tests, cytotoxicity tests and in vitro disease modeling has been added to their tremendous interests in regenerative medicine and cellular therapy. As a source of biological material that can be used to restore partially or totally the lost functions of a damaged organ or tissue, or as a source of normal cells to study human development or test putative new drugs, their genomic integrity has to be thoroughly assessed. Therefore, an effective optimization of their culture conditions has to be considered, in order to control the absence of genomic instability and prevent their potential emergence. Any genetic or epigenetic alteration resulting from cell culturing must be detected in order to define and characterize acceptance criteria for scientific and medical purposes.PSC are particularly sensitive to stress resulting from unappropriated passaging techniques, which cause rapid genetic drift. Indeed, our team observed that many genomic abnormalities arise from aggressive single cell, enzymatic based, passaging methods, and that substantial phenotypical changes such as increased survival after cell dissociation and variation in cell shape can then occur.In order to understand the mechanisms governing the emergence of those adverse alterations, the team focused on the consequences resulting from the adaptation of PSC to single-cell dissociation. By using new generation sequencing techniques as RNA-Seq, we compared transcriptomics of PSC passaged by standard techniques (such as mechanical passaging) versus single-cell enzymatic dissociation (such as TRyPLE-based single-cell passaging). This comparison showed that the most striking difference in the gene expression pattern between adapted and non adapted cells concerned the dramatic overexpression of RNAs from a recently discovered class: long non-coding RNAs (lncRNAs).The aim of this thesis work was to determine to which extent some of these lncRNAs were functionally linked to adaptation of PSC. In order to address this matter, we first investigated in silico which lncRNAs were upregulated by single-cell dissociation, and after experimental validation of lncRNA candidates by molecular biology, we performed functional in vitro analysis (notably by siRNA-mediated loss of function) and sought their cellular localization in order to decipher their role in the cellular machinery and their level of implication. Beside this main project, other auxiliary projects were grafted. The observation of major changes in cell phenotype and behavior led to the investigation of the global mechanisms governing these modifications, underlining the potential role of epithelial-to-mesenchymal transition provoked by single-cell dissociation. Finally, the global attractiveness of lncRNAs and the emergence of exponential documentation concerning non-coding RNAs prompted the writing of an extensive review and meta-analysis concerning the implications of lncRNAs during embryo development and in pluripotent stem cells

Le développement du séquençage ARN, ou RNAseq, a permis l'essor de la recherche intensive de biomarqueurs dans de nombreux domaines de la biologie. L’information complète du transcriptome contenue dans les données de sorties, permet à un bioinformaticien assidu de dépasser les connaissances actuelles et d’accéder, grâce à des pipelines informatiques avancés, à d’innombrables signatures d’intérêts inédites. Dans cette thèse nous mettons en avant que ces marqueurs potentiels, essentiellement explorés pour répondre à des problématiques clinique en conditions pathologiques, peuvent être utilisés pour affiner la caractérisation de types de cellules sans marqueurs strictement spécifiques. Nous nous sommes intéressés aux cellules souches mésenchymateuses (MSCs), un type de cellules souches adultes multipotentes, fortement utilisées en clinique mais ne possédant pas de marqueurs positifs strictement spécifiques.Notre étude se concentre sur la recherche des ARN longs non-codants non annotés. Ces ARNs, aussi nommés "lncRNA", constituent une classe émergente de transcrits encore peu explorée à ce jour. De plus, cette catégorie démontre une spécificité conditionnelle et tissulaire élevée. Nous avons élaboré un pipeline d’analyse RNAseq optimisé pour la reconstruction et la quantification de lncRNAs non annotés.En utilisant les données publiques de RNAseq, venant de différentes sources de MSCs et d'autres types de cellules, nous avons identifié de nouveaux lncRNA non annotés exprimés spécifiquement dans les MSCs.Nous avons développé pour ce projet Kmerator.jl, un outil qui permet de décomposer un transcrit en sous séquences spécifiques (k-mers) afin de chercher et quantifier plus rapidement la signature de nos candidats dans un grand nombre de données RNAseq. Kmerator a également été utilisé dans d'autres applications pour tester la qualité des données RNA-seq disponibles en accés public.Après validation de ces nouveaux biomarqueurs de MSCs par qPCR, nous avons eu recours à plusieurs outils informatiques pour prédire leurs fonctions potentielles. Enfin, nous avons analysé des données RNAseq « single-cell » pour aborder l’hétérogénéité d’expression au sein des populations MSCs
The development of RNA sequencing, or RNAseq, have opened the path of intensive biomarkers research in many areas of biology. The complete information of the transcriptome contained in the output data, allows a bioinformatician to surpass the current knowledge and to access, thanks to advanced computer pipelines, to signatures of new interest. In this thesis, we are showing that these potential markers, classically used in clinical and pathological conditions, can be used to characterize cell types without extensive markers profile. We have studied mesenchymal stem cells, a type of adult multipotent stem cells, strongly used in clinics but without strickly specific positive markers. Our study mainly focuses on the search for non-annotated, long non-coding RNAs. These RNAs, also called "lncRNA", constitute an emerging class of transcripts and are still lightly explored.In addition, this category presents a highly tissue-related specificity. We have developed an optimized RNAseq pipeline for the reconstruction and quantification of non-annotated lncRNAs.Using public data from RNAseq, coming from different sources of MSC and other cell types, we have identified new non-annotated lncRNAs clearly and specifically expressed in MSCs. to complete this project, we developed Kmerator.jl, a bioinformatical tool that allows to decompose a transcript in k-mer, and select specific sub-sequences, in order to search and quantify at a faster rate the signature of our candidates in a large number of RNAseq dataset. After validation of these new biomarkers of MSCs by qPCR, we used several computer tools to predict their potential functions. Finally, we analyzed single-cell RNAseq data to address the heterogeneity of expression within MSC populations

Topaz1 (pour Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1) est un gène très conservé chez les vertébrés qui présente une expression spécifique dans les cellules germinales. La caractérisation du modèle murin dépourvu du gène Topaz1 a mis en évidence son rôle indispensable pour la fertilité mâle. Les souris mutantes présentent un arrêt de la spermatogenèse lors de la première division méiotique. Les spermatocytes Topaz1-/- bloqués en fin de prophase I de méiose présentent un défaut d’alignement des chromosomes le long de la plaque métaphasique. D'un point de vue histologique, les différences observées entre les testicules de souris Topaz1-/- et Topaz1+/+ apparaissent entre 15 (P15) et 20 (P20) jours après la naissance. Une première analyse transcriptomique par puce à ADN a montré que 10% des gènes dérégulés (DEGs) à P20 sont des ARN non codants longs (lncRNAs). Au cours de cette thèse, des analyses transcriptomiques à haut débit (RNAseq) ont été réalisées à P16 et P18 afin de mieux caractériser le phénotype testiculaire des souris dépourvues du gène Topaz1. Dès P16, le transcriptome testiculaire est perturbé et le nombre de DEGs est multiplié par 10 à P18. Des gènes associés au centrosome, centriole, à la dynamique des microtubules et à la spermatogenèse appartiennent aux voies moléculaires les plus perturbées. De plus, un quart des DEGs sont des lncRNAs. Trois d'entre eux, dérégulés à P16 et à P18, ont été étudiés par hybridation in situ et biologie moléculaire et sont spécifiques des cellules germinales. Puis une lignée de souris exempt d'un de ces lncRNA a été générée grâce à la technologie CripsR/Cas9. Ces animaux mutants se développent normalement et sont fertiles pour les deux sexes.Néanmoins, les souris mâles mutantes présentent une diminution de plus de 50% de la concentration de spermatozoïdes épipidymaires ainsi qu’une modification de paramètres de motilité par rapport à des souris sauvages. Des nouvelles analyses RNAseq ont été réalisées afin d'étudier le transcriptome testiculaire de ces souris. Elles mettent en évidence que ce lncRNA régule un nombre important de gènes codants pour les protéines (environ 80% des DEGs à P18). Là encore, certains d'entre eux régulent la dynamique des microtubules, la spermatogenèse et la génération des gamètes haploïdes.En conclusion, le gène Topaz1 murin est donc essentiel pour la mise en place d’un fuseau bipolaire en fin de prophase I de méiose et son absence empêche la première division méiotique. La dérégulation d’un nombre important de gènes codants pour des protéines du centrosome, des microtubules et de la spermatogenèse ainsi que la forte répression de l'expression de lncRNAs au sein du testicule murin laisse à penser que des complexes ARNs-protéines se forment au cours de la méiose.Dans cette étude, la suppression d'un de ces lncRNA ne perturbe pas la fertilité des souris bien que la concentration spermatique soit réduire de moitié. Chez l'homme, une telle baisse pourrait conduire à des infertilités masculines. Une mutation du gène Topaz1 chez l'homme pourrait aussi induire une azoospermie non obstructive. L'étude des complexes ARN-protéines pourrait représenter un nouveau champ d’investigation dans l’étude des infertilités et notamment de la régulation de la méiose
Topaz1 (Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1), a germ cell specific factor, is a highly conserved gene in vertebrates. The study of the Topaz1-inactivation mouse model demonstrated its essential role for male fertility. The absence of Topaz1 in mutant mice caused spermatogenesis arrest during the first meiotic division. Topaz1-/- spermatocytes, blocked at the end of meiotic prophase I, showed chromosome misalignment along the metaphase I plate. Histological experiments specified that the differences observed between Topaz1-/- and Topaz1+/+ mouse testes appeared between 15 (P15) and 20 (P20) days post-partum. Previously, transcriptomic analyses using a whole-genome expression array indicated that 10% of P20-deregulated genes (DEGs) were long non-coding RNAs (lncRNAs). During this thesis, high throughput transcriptomic analyses (RNAseq) were performed at P16 and P18 in order to better characterise the testicular phenotype of mice lacking the Topaz1 gene. From P16, the testicular transcriptome was disturbed and the DEGs number was multiplied by 10 at P18. Genes associated with centrosome, centriole, microtubule dynamics and spermatogenesis belonged to the most disturbed molecular pathways. Moreover, a quarter of DEGs were lncRNAs. Three of them, deregulated at P16 and P18, were studied by in situ hybridization and molecular biology techniques. They were germ cell specific. Thus, a new mouse model deleted for one of these lncRNAs was generated using CRISPR/Cas9 technology. These mutant mice developed normally and were fertile in both sexes. However, mutant male mice presented a more than 50% decrease in the epididymal sperm concentration as well as a change in motility parameters compared to wild-type mice. New RNAseq analyses were realised to study testicular transcriptome of these mice. These showed that this lncRNA regulates a large number of protein-coding genes (approximately 80% of the DEGs at P18). There again, some of them regulated microtubule dynamics, spermatogenesis and haploid gamete generation.In conclusion, this work shows that the murine Topaz1 gene is therefore essential for the establishment of the bipolar spindle during the transition from late prophase I to metaphase I and its absence prevents the first meiotic division. The deregulation of a significant number of protein-coding genes of the centrosome, microtubule movements and spermatogenesis, as well as the strong repression of lncRNAs expression within mouse testis, suggests that RNAs-proteins complexes are formed during meiosis.In this study, deletion of one of these lncRNA did not affect fertility in mice even though sperm concentration was halved. In men, such a decrease could lead to male infertility. A mutation of the Topaz1 gene in men could also induce non-obstructive azoospermia. The study of RNAs-proteins complexes could represent a new field of investigation in the understanding of infertility, particularly in meiotic regulation

Les cancers du sein triple négatifs (CSTN) sont un sous-type hétérogène représentant 12% à 24% de tous les cancers du sein. Ils ont les plus mauvais pronostics et touchent souvent les femmes jeunes. Le traitement au stade localisé repose essentiellement sur la chimiothérapie, sans thérapie ciblée (hors cas de mutations germinales de BRCA). Quasiment toutes les patientes reçoivent la même chimiothérapie néoadjuvante (CNA) avec anthracyclines et taxanes, ce qui grève leur survie en l’absence de réponse complète pathologique (RCp). L’intensification thérapeutique est la tendance actuelle, notamment avec l’addition d’immunothérapie, afin d’améliorer taux de RCp et survie. Les signatures d’expression génique standard ne pas utilisables en pratique clinique pour prédire la chimiorésistance des CSTNs à la CNA, alors qu’elles permettraient de sélectionner les patientes pour une intensification thérapeutique. D’où l’intérêt d’explorer les transcrits issus des 90% du génome restant, constitué de régions non codantes et non référencées. Parmi eux, les ARNs longs non-codant (lnc) qui se caractérisent par une longueur d’au moins 200 nucléotides présentent l’intérêt pour certains d’entre eux d’avoir une expression tissu- voire cancer- spécifique. De plus, certains ARNs lnc ont un rôle démontré dans différents mécanismes de chimiorésistance. Les ARNs lnc ne sont cependant pas bien annotés dans le génome humain et de nouveaux transcrits non référencés, codant ou non, et de nouvelles isoformes de gènes connus, sont découverts quotidiennement.Mon 1er objectif de thèse était d’évaluer le transcriptome non référencé en tant que réservoir potentiel de biomarqueurs prédictifs de chimiorésistance des CSTN à la CNA. Nous avons analysé une cohorte de 78 CSTNs avant CNA, et comparé les cas chimiosensibles (chS) et chimiorésistants (chR) selon le score RCB (Residual Cancer Burden). Nous avons comparé l’analyse d’expression génique différentielle standard (DE-seq) sur les gènes annotés, et sur de nouveaux ARNs lnc détectés grâce à un profiler ARN, et une analyse non biaisée par les annotations génomiques, de fragments de transcrits différentiels. L’analyse non biaisée a permis d’obtenir la meilleure séparation des cas chS et chR dans notre cohorte exploratoire. Nous avons ensuite évalué cette approche sur une cohorte indépendante, et nous l’avons optimisée, en considérant les régions génomiques d’expression différentielle. Ceci nous a permis d’obtenir une signature reproductible entre les deux cohortes. Au total, ces résultats montrent le potentiel d’une approche non référencée pour générer une signature de chimiorésistance précoce des CSTN. Des validations supplémentaires sont nécessaires sur des cohortes plus larges.Mon 2nd objectif de thèse était d’évaluer les ARNs lnc en tant que potentiels acteurs/cibles thérapeutiques dans les CSTNs chR. Nous avons sélectionné les ARNs lnc surexprimés dans les CSTNs chR pre-CNA (versus les CSTNs chS pre-CNA) et dans les CSTNs chR post-CNA (versus les CSTNs chR pre-CNA). En intégrant leurs niveaux et spécificités d’expression, leurs localisations génomiques et les données préexistantes suggérant une fonction potentielle, nous avons retenu trois ARNs lnc (AL450326.1, LINC02609 et MIR503HG). Nous avons évalué l’impact de l’inactivation de leur expression sur la cytotoxicité du Docetaxel dans un modèle de lignée cellulaire de CSTN. L’inactivation de l’expression de chacun des trois ARNs lnc a induit une cytotoxicité accrue du Docetaxel. Une clonogénicité spontanée diminuée et une mort cellulaire accrue sous Docetaxel ont de plus été observées après la déplétion d’AL450326.1 et de LINC02609. Au total, nous avons identifié trois ARNs lnc jouant un rôle dans la chimiorésistance des CSTN. Des tests fonctionnels supplémentaires sont nécessaires pour en décrypter les mécanismes, avec pour objectif à long terme d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques contrant la chimiorésistance des CSTNs à la CNA
Triple-negative breast cancers (TNBC) represent a heterogeneous subtype of breast cancers including 12% to 24% of all cases, having the poorest prognoses and often affecting young women. Treatment at localized stage is mainly based on chemotherapy, with no targeted therapy (except germline BRCA mutated patients). Nearly all patients receive the same Neo-Adjuvant Chemotherapy (NAC) with anthracyclines and taxanes, that badly impacts survival in the absence of pathological complete response (pCR). Therapeutic intensification, notably with addition of immunotherapy, is the current trend to increase pCR rate and improve survival. Standard gene expression signatures have failed to provide effective tools to predict TNBC chemoresistance, probably due to their incomplete nature, as they are mostly based on expression of protein coding genes and/or referenced transcripts and up to date there is no clinically useful transcriptomic signature predicting TNBC chemoresistance to NAC. Such a predictive signature would allow patient selection for therapeutic intensification. Therefore, it is important to explore the remaining 90% of the genome consisting of non-coding and non-referenced regions. One class of non-coding RNAs that is of great interest are long non-coding (lnc) RNAs, that are at least 200 nucleotides long, some of them being specifically expressed in cancer. Moreover, some lncRNAs have been shown to be implicated in different mechanisms of chemoresistance. LncRNAs are not fully well annotated in the human genome and new unreferenced transcripts, coding or not, and new isoforms of known genes are discovered daily.Therefore, the first goal of my PhD was to assess reference-free transcriptome as a potential reservoir of predictive biomarkers of TNBC chemoresistance. A cohort of 78 TNBCs before NAC was analyzed, comparing chemosensitive (chS) and chemoresistant (chR) cases based on international Residual Cancer Burden (RCB) score. A standard differential gene expression analysis (DE-seq) on annotated genes, and on new lncRNAs detected with a de novo RNA-profiler, and a reference-free analysis of differential fragments of transcripts without annotation bias were compared. Reference-free approach showed best separation of chS and chR patients in the training cohort. Further, based on comparison with an independent validation cohort, an optimized approach was proposed, where specific genomic regions with differential expression were selected. This technique gave a reproducible signature of chemoresistance between the two cohorts. In all, these results show the potential of a reference-free approach to generate a transcriptomic signature as predictive biomarker of early TNBC chemoresistance. Further investigation is needed to validate the signature using larger validation cohorts.The second objective of my PhD was to assess lncRNAs as potential actors/therapeutic targets in chR TNBCs. For that we selected lncRNAs upregulated in chR pre-NAC TNBCs (compared with chS pre-NAC TNBCs) and in chR post-NAC TNBCs (compared with chR pre-NAC TNBCs). Considering lncRNAs level and specificity of expression, genomic position, and pre-existing data of their potential function, three lncRNAs (AL450326.1, LINC02609 and MIR503HG) were retained for functional analysis. By knocking down levels of these lncRNAs in TNBC cell line model, an impact on Docetaxel cytotoxicity was assessed. All three lncRNAs knock downs showed an improved Docetaxel induced cytotoxicity. Knock down of AL450326.1 and LINC02609 resulted in a decreased spontaneous clonogenicity and increased Docetaxel induced cell death, giving a first indication of their mode of action. In all, we identified three lncRNAs playing a role in NAC chemoresistance. Further functional studies will allow to decipher the mechanisms by which the identified lncRNAs affect chemoresistance with the ultimate goal to identify new therapeutic approaches to circumvent NAC chemoresistance of TNBCs

En dépit des avancées thérapeutiques récentes, le MM reste à ce jour une maladie incurable, dont les voies moléculaires impliquées dans l’hétérogénéité clinique, la progression, et l’agressivité du MM restent encore relativement peu connues. Au cours de cette dernière décennie, le rôle des lncRNAs a été de plus en plus étudié. En effet, les données génomiques, les études globales d’expression spatio-temporelle et l’existence de plusieurs lncRNAs démontrés comme impliqués dans différentes voies physiologiques suggèrent que les lncRNAs sont des régulateurs transcriptionnels et post-transcriptionnels importants, et la dérégulation de leur expression a maintenant été observée dans de nombreux cancers. Dans ce contexte, l’objectif principal de ma thèse a été de d’identifier les lncRNAs potentiellement impliqués dans le MM, et de caractériser les voies moléculaires via lesquelles ils exercent leur fonction. Pour étudier le rôle des lncRNAs dans le MM, nous avons dans un premier temps utilisé une analyse de données transcriptomiques publiées de plasmocytes tumoraux de patients atteints de MM au diagnostic, afin d’extraire les données concernant spécifiquement les lncRNAs. Grâce à cela, nous avons pu identifier 105 lncRNAs dont l’expression est dérégulée dans le MM, dont CRNDE, un lncRNA précédemment identifié comme oncogène dans plusieurs cancers.CRNDE est surexprimé dans les plasmocytes de patients atteints de MM comparé aux plasmocytes contrôle dans notre propre cohorte de patients de l’hôpital Saint-Louis. De plus, nous avons observé qu’une forte expression de CRNDE est corrélée à un mauvais pronostic. En utilisant une approche de délétion par la technique de CRISPR/Cas9 dans une lignée de MM, nous avons pu démontrer que CRNDE régule la prolifération, l’apoptose, ainsi que la tumorigénicité de ces cellules. Ce modèle cellulaire nous a également servi pour montrer que CRNDE régule l’expression du récepteur à l’IL6, et que la diminution de la prolifération observée dans les clones CRNDEΔ/Δ semble être en grande partie due à une perte de réponse à l’IL6, une cytokine jouant un rôle central dans la physiologie du MM.L’ensemble de ces résultat ont permis de démontrer un rôle important d’un lncRNA dans le MM, CRNDE, ainsi que de déterminer le mécanisme d’action par lequel il exerce son effet
Multiple myeloma (MM) is a malignancy of antibody-secreting plasma cells which remains incurable. MM is characterised by a wide clinical and prognostic spectrum, even within groups bearing the same primary cytogenetic event, for which the secondary molecular mechanisms responsible are still incompletely understood. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are now recognised as an important class of regulatory molecules which are increasingly implicated in tumorigenesis and cancer progression. While recent studies have demonstrated prognostically relevant changes in the lncRNA expression profile in MM, the functional significance and molecular pathways downstream of these changes remain poorly characterised. In this study we have undertaken a thorough functional and molecular characterisation of the effect in MM cells of Colorectal Neoplasia Differentially Expressed (CRNDE), a known oncogenic lncRNA which has been previously implicated in diverse solid and haematological malignancies. CRNDE is overexpressed in plasma cells of MM patients, where it is a poor prognostic marker. CRISPR-mediated deletion of the CRNDE locus decreases proliferation and adhesion properties of MM cells in vitro and reduces tumour growth in an in vivo xenograft model. Transcriptomic profiling in CRNDE-deleted cells demonstrated that CRNDE activates expression of a number of genes previously implicated in the aetiology of MM, including the gene encoding the receptor of IL6 (IL6R), a cytokine critical for MM cell proliferation and survival. We further demonstrate that deletion of the CRNDE locus impacts upon IL6 signalling and proliferative responses in MM cells. Altogether this study reveals a novel mechanistic pathway by which the lncRNA CRNDE impacts upon MM growth and disease progression, by regulating the expression of IL6R and thus controlling response to IL6 signalling

L’autisme est un syndrome neuro-développemental hétérogène à l’étiologie génétique complexe. Afin d’identifier les dérèglements initiaux responsables de ce mal-développement cérébral, des travaux antérieurs au sein de notre équipe se sont basés sur des cellules représentatives des stades précoces de l’ontogenèse : les cellules souches olfactives. Le gène MOCOS, codant pour la sulfurase du cofacteur à molybdène, a été trouvée sous-exprimé chez la majorité des patients autistes comparés à des sujets contrôles de même âge et du même sexe.Nous avons ensuite postulé que la dissection minutieuse des mécanismes moléculaires pouvant rendre compte de cette dérégulation aiderait à trouver des mécanismes sous-jacents contribuant aux troubles du spectre autistique (TSA). Ceci a conduit à l'identification de COSMOC, un long ARN non codant généré à partir d'une transcription divergente dans la région promotrice de MOCOS, dont l'expression est diminuée chez 10 des 11 patients autistes de notre cohorte. A l’aide de diverses techniques de biologie moléculaire, nous avons montré que la déplétion de COSMOC induit : (1) une sous-expression de MOCOS, (2) une déstabilisation de l'organisation de la chromatine, ce qui suggère une fonction de régulateur transcriptionnel, et (3) une altération du métabolisme des lipides et de l’homéostasie redox de la cellule, deux voies dérégulés dans les TSA. Par ailleurs, COSMOC régule de l’expression de la PTBP2 (polypirimidine track biding protein 2), un facteur d’épissage contrôlant l’expression de nombreuses protéines synaptiques. En conclusion, la dérégulation de COSMOC pourrait expliquer certains des dysfonctionnements observés dans les TSA
Autism is a heterogeneous neuro-developmental syndrome with a complex genetic etiology. In order to unveil the initial disturbances responsible for this brain maldevelopment, previous works in our team relied on cells representative of the early stages of ontogenesis: olfactory stem cells. The MOCOS gene, coding for molybdenum cofactor sulfurase, was found under-expressed in most of autistic patients of our cohort when compared with age- and gender-matched control adults without any neuropsychiatric disorders. We postulated that the meticulous dissection of the molecular mechanisms involved this deregulation would help to unveil pathogenic mechanisms underlying autism spectrum disorders (ASD). This led to the identification of COSMOC, a long non-coding RNA, generated from a divergent transcription in the promoter region of MOCOS, whose expression is decreased in 10 out of 11 autistic patients in our cohort. Using various molecular biological techniques (interference RNA, DNA microarray, qPCR...), we showed that COSMOC depletion induces: (1) an under-expression of MOCOS, (2) a destabilization of chromatin organization, suggesting a transcriptional regulatory function, and (3) an alteration of cellular lipid metabolism and redox homeostasis, two deregulated pathways in ASD. In addition, COSMOC regulates the expression of PTBP2 (polypirimidine track biding protein 2), a splicing factor that controls the expression of many synaptic proteins, including PSD95. In conclusion, the deregulation of COSMOC may explain some of the dysfunctions observed in ASDs

Chez la majorité des être vivants des systèmes d’horloge circadiennes (=environ 24h) se sont développés afin d’anticiper les variations journalière de l’environnement. Ces horloges endogènes reposent sur des oscillateurs moléculaires régulant l’expression circadienne de nombreux gènes. Récemment il a pu être montré que des régulations post-transcriptionnelles jouaient un rôle majeur dans la rythmicité de nombreux gènes.Dans la lignée cellulaire hypophysaire GH4C1, nous avons étudié un mécanisme post-transcriptionnel impliquant des corps nucléaires appelés paraspeckles. L’élément principal des paraspeckles est le long ARN non codant (lncRNA) Neat1 auquel s’associe des protéines de liaison aux ARNs. Il a été montré que les paraspeckles ont la capacité de retenir dans le noyau des ARNs, en particulier ceux qui présentent des motifs IRAlu dans leur région 3’ non codante. Nous avons montré que dans les GH4C1, les paraspeckles se forment avec une rythmicité circadienne. Grâce à la mise au point d’une méthode dite de RNA pull-down, permettant l’étude des cibles ARNs d’un lncRNA, nous avons montré que les paraspeckles s’associent et induisent la rétention nucléaire circadienne d’ARNs hypophysaires. Chez ces ARNs nous avons montré l’absence de motifs IRAlu. L’étude d’ARN cibles des paraspeckles a montré que la reconnaissance par les paraspeckles pouvait se faire par des motifs localisés hors de la région 3’ non codante, et que plusieurs séquences dans un même ARN pouvaient participer à la liaison aux paraspeckles.Cette étude nous a donc permis d’identifier un nouveau mécanisme post-transcriptionnel régulant l’expression circadienne de gènes dans les cellules hypophysaires
Most living organisms have developed circadian (=close to 24h) clock to face daily changes in their environment. Those clocks rely on molecular oscillators to drive the circadian expression of many genes. In the pituitary cell line GH4C1, we studied a post-transcriptional mechanism involving nuclear bodies called paraspeckles. Paraspeckles main element is the long non-coding RNA Neat1 to which several RNA binding proteins are associated. Paraspeckles have been shown to retain RNAs in the nucleus, in particular RNAs that display an IRAlu element in their 3’ translated region (3’UTR).In GH4C1, we showed that paraspeckles display a circadian rhythm of formation. We created the RNA pull-down method, which allows to purify a lncRNA with all its RNA targets, This allowed us to demonstrate that paraspeckles induce the circadian nuclear retention of several endogenous RNAs. Finally, we showed the absence of IRAlu elements in those RNAs. The study of tree target RNAs of paraspeckles showed that elements localized out of the 3’UTR could be involved in the recognition by paraspeckles, but also that several elements could be necessary to induce the RNA retention by paraspeckles.To conclude, this study allowed us to identify a new post-transcriptional mechanism regulating the circadian expression of pituitary genes

De récentes données suggèrent un rôle clé des longs ARNs non codants (lncRNAs) dans le développement et l’apparition de certaines maladies. Les lncRNAs se sont avérés difficiles à étudier en raison de leur faible niveau d’expression souvent tissu-spécifique, du manque de conservation de leur séquence, et du manque d’outils d’analyse spécifiques. Nous avons émis l’hypothèse que les méthodes d’étude des ARNs messagers peuvent être adaptées aux lncRNAs. Pour valider cette hypothèse, nos objectifs sont : 1-l’utilisation des nouvelles approches dérivées du système CRISPR/Cas9 pour activer et inhiber l’expression génique et 2-l’utilisation des méthodes conventionnelles de surexpression pour étudier les lncRNAs. Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes concentrés sur un nouveau lncRNA, appelé Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA). Ce lncRNA est nécessaire au maintien des cellules souches embryonnaires, mais aussi à leur différenciation vers le lignage neural. Résultats : la nouvelle approche CRISPR-a/i permet d’activer/inhiber le promoteur de Tuna et de réguler l’expression endogène de celui-ci. Ce système s’étant révélé efficace pour Tuna, cela suggère qu’il peut être appliqué à l’étude d’autres lncRNAs. D’autre part, la particularité de cet ARN est qu’il contient une région conservée entre les espèces d’environ 200 nucléotides, correspondant à un ORF pour un peptide de 48 acides aminés. En utilisant des méthodes conventionnelles de marquage par FLAG, on démontre que Tuna code pour ce peptide. Par ailleurs, en supprimant un site de liaison à la protéine HUR dans la région 3’UTR, on altère l’expression du peptide. Cela suggère que ce site est important pour la régulation de la traduction du peptide encodé par Tuna. En conclusion, nos résultats montrent que certaines méthodes d’étude des ARNs messagers sont transposables aux lncRNAs. Cependant, du fait des caractéristiques propres à ces derniers, d’autres approches sont à envisager pour mieux saisir leurs mécanismes. En perspective, ces méthodes vont permettre de mieux comprendre la fonction de Tuna dans les différents états cellulaires où il est exprimé.

H19 est un long ARN non codant jouant un rôle clé dans la tumorigenèse et la progression tumorale de nombreux cancers. Notre équipe a montré que l’expression du gène H19 est activée par E2F1, réprimée par des suppresseurs de tumeur comme p53 et RB, et impliquée dans le cycle cellulaire des cellules cancéreuses mammaires. Mes travaux de thèse démontrent que H19 interagit avec p53 dans les cellules cancéreuses mammaires. Ceci entraîne la dégradation de p53, et altère son activité en empêchant sa translocation dans le compartiment nucléaire. Nous montrons que H19 interagit non seulement avec p53 mais aussi avec MDM2, formant un complexe ternaire. De plus, H19 réduit l’activité transcriptionnelle de p53 et empêche l’arrêt du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et la sénescence des cellules après endommagement de leur ADN. En outre, nous mettons en évidence que l’expression de H19 favorise l’instabilité génomique, entraînant l’accumulation de mutations. Ensuite, nous avons analysé l’implication de H19 dans la réponse aux dommages de l’ADN. Nous montrons que H19 réprime la phosphorylation du variant d’histone H2AX. Ceci s’accompagne d’une augmentation de l’activité de réparation par jonction des extrémités non homologues (NHEJ) et par recombinaison homologue (HR). Des essais comètes révèlent que l’expression de H19 réduit la proportion de cassures de l’ADN, suggérant que H19 permet l’accélération de la réparation de l’ADN. Enfin, nous avons étudié l’implication ainsi que la contribution relative de H19 et de son miR-675 dans l’augmentation du potentiel métastatique mammaire. Nous montrons que H19 comme le miR-675 favorisent la migration et l’invasion des cellules, ainsi que leur clonogénicité. H19 induit la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules, mais le miR-675 semble augmenter l’expression des marqueurs épithéliaux et mésenchymateux, suggérant un phénotype hybride ou une transition mésenchymo-éphithéliale. De plus, nous montrons pour la première fois que le miR-675, comme H19, favorise le phénotype souche des cellules cancéreuses mammaires. Pour conclure, mes résultats de thèse mettent en évidence de nouveaux mécanismes impliquant le lncRNA H19 dans la tumorigenèse et la progression tumorale mammaire, suggérant ainsi un rôle pertinent pour H19 en tant que marqueur diagnostic et thérapeutique
H19 is a long non-coding RNA described to play key roles in the progression and metastasis of cancers from different tissue origins. We have previously shown that the H19 gene is activated by E2F1, repressed by p53 and RB tumor suppressors and implicated in breast cancer cell cycle progression. My PhD work demonstrates that H19 can interact with p53 in breast cancer cells. This interaction induces p53 degradation but also impairs p53 function by preventing its translocation into the nuclear compartment. We show that H19 interacts not only with p53 but also with MDM2 to form a ternary complex. Moreover, H19 reduces p53 transcriptional activities and impairs cell cycle blockage, apoptosis induction and senescence of cells after DNA damage. Furthermore, we highlight that H19 expression favors also genetic instability, allowing for the accumulation of gene mutations. Thereafter, we investigated the implication of H19 during the DNA damage response. We show that H19 expression represses the activation of histone variant H2AX. Interestingly, this is accompanied by enhanced repair mechanisms such as non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Comet assays revealed that H19 expression reduces the DNA breaks proportion, suggesting that H19 accelerates DNA repair. Finally, we determine the implication but also the relative contribution of H19 and its miR-675 in the enhancement of breast cancer metastatic potential. We show that both H19 and miR-675 enhance cell migration and invasion as well as colony formation. H19 induces epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) but interestingly, miR-675 seems to simultaneously increase the expression of both epithelial and mesenchymal markers, suggesting the induction of a hybrid phenotype or mesenchymal-to-epithelial transition (MET). Finally, we demonstrated for the first time that miR-675, like its precursor H19, increases stemness properties of breast cancer cells. To conclude, our findings highlight new mechanisms of lncRNA H19 in breast cancer tumorigenesis and aggressiveness, thus suggesting an interesting role for H19 as a prognostic and therapeutic marker

La maladie de Chagas est une maladie parasitaire causée par le protozoaire Trypanosoma cruzi et transmise par des insectes hématophages . Elle est composée de 2 phases : la phase aiguë et la phase chronique. Parmi les individus infectés, 30 % développent la forme chronique de la maladie. Les patients présentent des atteintes cardiaques, digestives (œsophage, côlon) et cardiodigestives. Notre étude a été focalisée sur les patients atteints de cardiomyopathie chagasique (CCC). Notre objectif est d’identifier des gènes de susceptibilité pouvant être impliqués dans le développement des formes chroniques. Notre étude a permis de mettre en évidence une variation d’expression de certains gènes entre les CCC et les contrôles. Nous nous sommes également intéressés aux processus épigénétiques pouvant réguler l’expression des gènes. Une étude de la méthylation de l’ADN croisée avec l’étude du transcriptome nous ont permis d’identifier des gènes présentant à la fois des variations d’expression et de méthylation. Pour certains de ces gènes, nous avons démontré que la méthylation est responsable de la variation d’expression observée. Enfin, nous avons étudié un ARN long non-codant, MIAT. Nous avons démontré qu’il est surexprimé chez les CCC par rapport aux contrôles et dans un modèle murin infecté par T. cruzi. De plus, l’analyse de l’expression de micro-ARNs couplée à une analyse de transcriptome nous a permis d'identifier plusieurs micro-ARNs indispensables à la régulation de l’expression des gènes. Enfin, une étude protéomique nous a permis de mettre en évidence une augmentation de la production de protéine pour certains gènes, en lien avec l’augmentation de l’expression observée
Chagas disease is a parasitic disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and transmitted by the hematophagous insects. The disease is composed by acute and chronic phases. Among the infected individuals, 30 % develop chronic form. They suffer from heart, digestive (esophagus, colon) and cardiodigestives injury. Our study was focused on patients with dilated chagasic cardiomyopathy (CCC). Our goal is to identify susceptibility genes that may be involved in the development of chronic forms. Our study revealed a variation in the expression of certain genes between CCC group and controls. We are also interested in epigenetic processes that can regulate the expression of genes. A study of the DNA methylation crossed with the transcriptome allowed us to identify genes presenting both variations in expression and methylation. For some of these genes we demonstrated that methylation is responsible for the expression variation observed. Finally, we studied a long non-coding RNA called MIAT. Our study demonstrated that it is overexpressed in CCC compared to controls and in a murine model infected by T. cruzi. Furthermore, the analysis of the expression of micro-RNAs crossed with transcriptome analysis allowed us to identify several micro-RNAs whose functions are essential in the regulation of gene expression. Finally, a proteomic study allowed us to demonstrate an increase in the production of protein for certain genes, correlated with the increase in expression levels observed

Les cancers de l’ovaire présentent un taux de survie à 5 ans inférieur à 40% et constituent la principale cause de décès par cancer gynécologique dans le monde. Ce sombre pronostic s’explique par un diagnostique tardif (du à un développement asymptomatique dans les premiers stades) et une résistance aux traitements existants et souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. La découverte ces dernières années, d’un nombre important de lncRNAs a permis d’ouvrir de nouvelles perspectives pour la recherche en oncologie. Peu d’études ont à ce jour exploré leur implication dans la chimiorésistance, a fortiori dans les cancers de l’ovaire. Parmi ces lncRNAs, ‘UCA1’ exerce de multiples fonctions oncogéniques par des mécanismes encore peu décrits. Son expression constitue un facteur de mauvais pronostique dans diverses tumeurs malignes dont les cancers de l’ovaire. Nous avons pu démontrer un rôle de ceRNA pour le miR-27a-5p, qui une fois libéré suite à l’inhibition d’UCA1, régule négativement UBE2N, une cible directe. UBE2N est un acteur connu des voies de réparation de l’ADN et de la régulation de la voie NF-kB, et son inhibition dans nos modèles entraîne une augmentation de l’expression de BIM et perturbe les mécanismes de réparation de l’ADN, sensibilisant des cellules cancéreuses ovariennes à l’action des sels de platine et des PARPi. L’inhibition d’UBE2N sensibilise également aux sels de platine plusieurs cultures organoïdes tridimensionnelles dérivées de patientes, et pourrait ainsi constituer une stratégie thérapeutique innovante pour lutter contre la chimiorésistance dans le cancer de l'ovaire
Ovarian cancers present a 5-year survival rate of under 40% and are the leading cause of death from gynecological cancer worldwide. This poor prognosis is explained by a late diagnosis (due to asymptomatic development in the early stages) and resistance to existing treatments and highlights the need to develop new therapeutic approaches. The discovery in recent years of a significant number of lncRNAs has opened up new opportunities for oncology research. Few studies have so far explored their involvement in chemoresistance, let alone ovarian cancer. Among these lncRNAs, 'UCA1' performs multiple oncogenic functions through mechanisms not yet well described. Its expression is a factor of poor prognosis in various malignant tumours including ovarian cancers. We were able to demonstrate a role of ceRNA for miR-27a-5p, which when released following the inhibition of UCA1, negatively regulates UBE2N, a direct target. UBE2N is a known actor in DNA repair pathways and NF-kB pathway regulation, and its inhibition in our models leads to an increase in BIM expression and disrupts DNA repair mechanisms, sensitizing ovarian cancer cells to the action of platinum salts and PARPi. The inhibition of UBE2N also sensitizes to platinum salts, several three-dimensional organoid cultures derived from patients, thus may provide an innovative therapeutic strategy to combat chemoresistance in ovarian cancer

NEAT2 est un long ARN non-codant surexprimé dans plusieurs cancers. Toutefois, les études actuelles ne sont qu’associatives et ne permettent pas d’établir de lien direct de cause à effet ainsi que son mécanisme d’action dans la carcinogenèse. Dans cette étude, nous avons déterminé le rôle de NEAT2 et de ses domaines fonctionnels dans la prolifération et le métabolisme énergétique des hépatocytes. La prolifération était diminuée significativement (14-35%) lorsque l’expression de NEAT2 a été rendue génétiquement faible ou inexistante dans les modèles d’hépatocytes humains et de fibroblastes embryonnaires de souris. À l’opposé, la prolifération cellulaire était significativement augmentée (27-33%) dans les hépatocytes murins surexprimant les segments NEAT2 et mascRNA. Le domaine mascRNA entraîne également une augmentation significative de l’entrée de glucose dans la cellule. En somme, ces résultats démontrent l’importance de mascRNA dans la prolifération cellulaire et le métabolisme du glucose des hépatocytes.
NEAT2 is a long ncRNA overexpressed in a various type of cancer. However, whether NEAT2 directly impacts on carcinogenesis remains poorly investigated. Here, we report the role of NEAT2 and its functional domains on proliferation and energy metabolism of hepatocytes. In this study, we show a significant decrease in proliferation (14-35%) after knocked-down or knockout of NEAT2 expression in both human hepatocytes and mouse embryonic fibroblasts. On the other hand, we observed a significant increase in proliferation (27-33%) in mice hepatocytes overexpressing NEAT2 and the mascRNA domain. The overexpression of the mascRNA domain also resulted in a significant increase in cellular glucose uptake, suggesting a role in glucose utilization. Our study highlights the significance of NEAT2 and its mascRNA domain in cellular proliferation and glucose metabolism. These data suggest an important role for the mascRNA domain in the regulation of hepatocyte proliferation by NEAT2.

Les ARNs long non codants (ARNlnc) jouent un rôle clé dans les processus cellulaires vitaux, notamment le remodelage de la chromatine, la réparation de l'ADN et la traduction. Cependant, la taille et la complexité des ARNlnc présentent des défis sans précédent pour les études moléculaires mécanistiques, de sorte qu'il s'est avéré difficile jusqu'à présent de relier l'information structurelle à la fonction biologique pour les ARNlnc.Le gène 3 humain exprimé maternellement (de l’anglais "maternally expressed gene 3", MEG3), est un ARNlnc abondant, soumis à empreinte parentale et épissé alternativement. Pendant l'embryogenèse, MEG3 contrôle les protéines Polycomb, régulant la différenciation cellulaire, et dans les cellules adultes, MEG3 contrôle p53, régulant la réponse cellulaire aux stress environnementaux. Dans les cellules cancéreuses, MEG3 est régulé négativement, mais la surexpression ectopique de MEG3 réduit la prolifération incontrôlée, ce qui prouve que MEG3 agit comme un suppresseur de tumeur. Les données suggèrent que les fonctions de MEG3 pourraient être régulées par la structure de MEG3. Par exemple, on pense que MEG3 se lie directement aux protéines p53 et Polycomb. De plus, les différents variants d'épissage de MEG3, qui comprennent différents exons et possèdent ainsi des structures potentiellement différentes, présentent des fonctions différentes. Enfin, la mutagenèse par délétion, basée sur une structure de MEG3 prédit in silico, a permis d’identifier un motif MEG3 supposé structuré impliqué dans l'activation de p53. Cependant, au début de mes travaux, la structure expérimentale de MEG3 était inconnue.Pour comprendre la structure et la fonction de MEG3, j'ai utilisé des sondes chimiques in vitro et in vivo pour déterminer la structure secondaire de deux variants humains de MEG3 qui diffèrent par leurs niveaux d'activation de p53. À l'aide d'essais fonctionnels dans les cellules et de mutagenèse, j'ai systématiquement analysé la structure de MEG3 et identifié le noyau activant p53 dans deux domaines (D2 et D3) qui sont conservés structuralement dans les variants humains et conservés dans l’évolution chez les mammifères. Dans D2-D3, les régions structurales les plus importantes sont les hélices H11 et H27, car dans ces régions, j’ai pu supprimer l'activation de p53 grâce à des mutations ponctuelles, un degré de précision jamais atteint pour les autres ARNlnc jusqu’ici. J'ai découvert de manière surprenante que H11 et H27 sont reliés par des boucles connectées l’une à l’autre (de l’anglais "kissing loops") et j'ai confirmé l'importance fonctionnelle de ces interactions de structure tertiaire à longue distance par mutagenèse compensatoire. Allant au-delà de l’état de l’art, j'ai donc essayé de visualiser la structure 3D d’une isoforme de MEG3 longue de 1595 nucléotides, par diffusion de rayons X à petit angle (SAXS), microscopie électronique (EM) et microscopie à force atomique (AFM). Alors que le SAXS et l’EM sont limités par des défis techniques actuellement insurmontables, l’imagerie par AFM m’a permis d’obtenir la première structure 3D à basse résolution de MEG3 et de révéler son échafaudage tertiaire compact et globulaire. Plus remarquable encore, les mêmes mutations qui perturbent la connexion entre les «boucles» H11-H27 et qui inhibent la fonction de MEG3, perturbent aussi la structure 3D de cet ARNlnc, fournissant ainsi le premier lien direct entre la structure 3D et la fonction biologique pour un ARNlnc.Sur la base de mes découvertes, je peux donc proposer un mécanisme de l’activation de p53 basé sur la structure de MEG3, avec des implications importantes pour la compréhension de la cancérogenèse. Plus généralement, mes travaux prouvent que les relations structure-fonction des ARNlnc peuvent être disséquées avec une grande précision et ouvrent la voie à des études analogues visant à obtenir des informations mécanistes pour de nombreux autres ARNlnc d’importance médicale
Long non-coding RNAs (lncRNAs) are key players in vital cellular processes, including chromatin remodelling, DNA repair and translation. However, the size and complexity of lncRNAs present unprecedented challenges for mechanistic molecular studies, so that connecting structural information with biological function for lncRNAs has proven difficult so far.Human maternally expressed gene 3 (MEG3) is an abundant, imprinted, alternatively-spliced lncRNA. During embryogenesis MEG3 controls Polycomb proteins, regulating cell differentiation, and in adult cells MEG3 controls p53, regulating the cellular response to environmental stresses. In cancerous cells, MEG3 is downregulated, but ectopic overexpression of MEG3 reduces uncontrolled proliferation, proving that MEG3 acts as a tumour suppressor. Evidence suggests that MEG3 functions may be regulated by the MEG3 structure. For instance, MEG3 is thought to bind p53 and Polycomb proteins directly. Moreover, different MEG3 splice variants, which comprise different exons and thus possess potentially different structures, display different functions. Finally, deletion mutagenesis based on a MEG3 structure predicted in silico identified a putatively-structured MEG3 motif involved in p53 activation. However, at the beginning of my work, the experimental structure of MEG3 was unknown.To understand the MEG3 structure and function, I used chemical probing in vitro and in vivo to determine the secondary structure maps of two human MEG3 variants that differ in their p53 activation levels. Using functional assays in cells and mutagenesis, I systematically scanned the MEG3 structure and identified the p53-activating core in two domains (D2 and D3) that are structurally conserved across human variants and evolutionarily conserved across mammals. In D2-D3, the most important structural regions are helices H11 and H27, because in these regions I could tune p53 activation even by point mutations, a degree of precision never achieved for any other lncRNA to date. I surprisingly discovered that H11 and H27 are connected by “kissing loops”, and I confirmed the functional importance of these long-range tertiary structure interactions by compensatory mutagenesis. Going beyond state-of-the-art, I thus attempted to visualize the 3D structure of a 1595-nucleotide long MEG3 isoform by small angle X-ray scattering (SAXS), electron microscopy (EM), and atomic force microscopy (AFM). While SAXS and EM are limited by currently-insurmountable technical challenges, single particle imaging by AFM allowed me to obtain the first low resolution 3D structure of MEG3 and reveal its compact, globular tertiary scaffold. Most remarkably, functionally-disrupting mutations that break the H11-H27 “kissing loops” disrupt such MEG3 scaffold, providing the first direct connection between 3D structure and biological function for an lncRNA.Based on my discoveries, I can therefore propose a structure-based mechanism for p53 activation by human MEG3, with important implications in understanding carcinogenesis. More broadly, my work serves as proof-of-concept that lncRNA structure-function relationships can be dissected with high precision and opens the field to analogous studies aimed to gain mechanistic insights into many other medically-relevant lncRNAs

Le gène H19 est soumis à l’empreinte génomique parentale et ne code aucune protéine. Le produit de ce gène, le long ARN non codant (lncRNA) H19, agit en tant qu’ARN et est impliqué dans le développement embryonnaire ainsi que dans la tumorigenèse. Le lncRNA H19 est le précurseur du miR-675. Mes travaux de thèse ont permis d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de la tumorigenèse mammaire par le gène H19. Nous avons mis en évidence que le lncRNA H19 régule négativement la protéine p53 dans les cellules cancéreuses mammaires. Mes travaux ont démontré que le lncRNA H19 interagit physiquement avec la protéine p53 et MDM2 afin d’induire sa dégradation et empêcher sa translocation dans le noyau. Ce nouveau mode d’action d’H19 dans les cancers du sein pourrait expliquer le manque de pertinence clinique de l’étude du statut mutationnel de p53 par immunohistochimie dans ce cancer. J’ai également mis en évidence que non seulement le lncRNA H19 est impliqué dans la régulation des cellules souches cancéreuses, mais également le miR-675-5p. En effet, les tumeurs exprimant des signatures géniques associées aux marqueurs de cellules souches cancéreuses sont des tumeurs qui surexpriment le gène H19. De plus, la modulation de l’expression du lncRNA H19 et de son microARN régule les capacités fonctionnelles associées aux cellules souches cancéreuses mammaires. Pour finir, j’ai initié un projet permettant l’identification, sans a priori, des gènes cibles du lncRNA H19 et de son microARN dans les cellules cancéreuses mammaires. Pour conclure, j’ai mis en évidence l’implication du lncRNA H19 et du miR-675-5p dans différents processus impliqués dans la tumorigenèse mammaire
The H19 gene is subject to genomic imprinting and does not encode protein. The product of this gene, the long non coding RNA (lncRNA) H19, act as an RNA and is involved in development and the tumorigenesis. The H19 RNA is the precursor of miR-675. My thesis work identified new mechanism involved in the regulation of breast tumorigenesis by H19. We have demonstrated that the lncRNA H19 negatively regulates the p53 protein in breast cancer cell lines. My work revealed that H19 interacts with p53 and MDM2 to induce the degradation of p53 and impedes its nuclear localization. This new mechanism of H19 in breast cancer could explain the lack of clinical relevance of the p53 mutational state measured by immunohistochemistry in breast cancer. My work also revealed that not only the lncRNA H19 is involved in the regulation of breast cancer stem cells but also the miR-675-5p. Indeed, we have shown a correlation between overexpression of H19 and expression of a cancer stem cell phenotype in patient tumors. Furthermore, the modulation of H19 or miR-675 expression regulates the functional capacities associated with breast cancer stem cells. I also initiated a project that will allow the identification of H19 and miR-675 target genes in breast cancer cell lines. To conclude, I highlighted the implication of the lncRNA H19 and miR-675 in different process involved in breast cancer tumorigenesis

Le gène H19 est soumis à l’empreinte génomique parentale et ne code aucune protéine. Le produit de ce gène, le long ARN non codant (lncRNA) H19, agit en tant qu’ARN et est impliqué dans le développement embryonnaire ainsi que dans la tumorigenèse. Le lncRNA H19 est le précurseur du miR-675. Mes travaux de thèse ont permis d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de la tumorigenèse mammaire par le gène H19. Nous avons mis en évidence que le lncRNA H19 régule négativement la protéine p53 dans les cellules cancéreuses mammaires. Mes travaux ont démontré que le lncRNA H19 interagit physiquement avec la protéine p53 et MDM2 afin d’induire sa dégradation et empêcher sa translocation dans le noyau. Ce nouveau mode d’action d’H19 dans les cancers du sein pourrait expliquer le manque de pertinence clinique de l’étude du statut mutationnel de p53 par immunohistochimie dans ce cancer. J’ai également mis en évidence que non seulement le lncRNA H19 est impliqué dans la régulation des cellules souches cancéreuses, mais également le miR-675-5p. En effet, les tumeurs exprimant des signatures géniques associées aux marqueurs de cellules souches cancéreuses sont des tumeurs qui surexpriment le gène H19. De plus, la modulation de l’expression du lncRNA H19 et de son microARN régule les capacités fonctionnelles associées aux cellules souches cancéreuses mammaires. Pour finir, j’ai initié un projet permettant l’identification, sans a priori, des gènes cibles du lncRNA H19 et de son microARN dans les cellules cancéreuses mammaires. Pour conclure, j’ai mis en évidence l’implication du lncRNA H19 et du miR-675-5p dans différents processus impliqués dans la tumorigenèse mammaire
The H19 gene is subject to genomic imprinting and does not encode protein. The product of this gene, the long non coding RNA (lncRNA) H19, act as an RNA and is involved in development and the tumorigenesis. The H19 RNA is the precursor of miR-675. My thesis work identified new mechanism involved in the regulation of breast tumorigenesis by H19. We have demonstrated that the lncRNA H19 negatively regulates the p53 protein in breast cancer cell lines. My work revealed that H19 interacts with p53 and MDM2 to induce the degradation of p53 and impedes its nuclear localization. This new mechanism of H19 in breast cancer could explain the lack of clinical relevance of the p53 mutational state measured by immunohistochemistry in breast cancer. My work also revealed that not only the lncRNA H19 is involved in the regulation of breast cancer stem cells but also the miR-675-5p. Indeed, we have shown a correlation between overexpression of H19 and expression of a cancer stem cell phenotype in patient tumors. Furthermore, the modulation of H19 or miR-675 expression regulates the functional capacities associated with breast cancer stem cells. I also initiated a project that will allow the identification of H19 and miR-675 target genes in breast cancer cell lines. To conclude, I highlighted the implication of the lncRNA H19 and miR-675 in different process involved in breast cancer tumorigenesis

Le couple télomère/télomérase apparaît comme une cible prometteuse pour de potentiels agents anticancéreux qui seraient actifs sur un large éventail de tumeurs. Le laboratoire d’accueil a montré dans un modèle de leucémie aiguë promyélocytaire (LAP), qu'un agent utilisé en clinique, l'acide rétinoïque (ATRA), exerce une activité anti-tumorale en réprimant la transcription de la sous-unité catalytique hTERT indépendamment de la différenciation. Ce modèle (NB4) avec ses variants cellulaires résistant (NB4-LR1SFD) ou non à la répression de hTERT (NB4-LR1) par l’ATRA constitue un outil de choix pour l’identification de facteurs régulateurs de hTERT et la recherche des bases moléculaires de sa réactivation.Une approche transcriptomique a été utilisée afin d’identifier de nouveaux gènes et/ou réseaux de signalisation induits par l’ATRA et régulateurs de hTERT. L’analyse bioinformatique nous a permis de construire des profils d’expression différentielle entre les 2 lignées et des réseaux d’interaction. Parmi les candidats, H19, un ARN long de 2.5Kb, polyadénylé et non codant. H19 est classé parmi les gènes supresseurs de tumeurs : en son absence il y a développement de cancer (cas de la tumeur de Wilms, rhabdomyosarcome embryonnaire, Syndrome Beekwith-Wiedman) ; sa réintroduction par transfection conduit à une perte de tumoriginicité. Cependant H19 est reconnu de plus en plus comme un oncogène vu que son expression est élevée dans plusieurs types de cancers solides. Par contre peu d’études s’intéressent au rôle de H19 dans les leucémies, d’où notre intérêt pour l’étudier dans le modèle LAP que nous avons développé.Nous avons mis au point la mesure d’expression de H19 par RT-PCR quantitative, validé les données obtenues dans l’analyse transcriptomique et montré que le traitement ATRA induit l’expression de H19 dans les cellules NB4-LR1 alors que cette expression est plutôt diminuée dans les cellules NB4-LR1SFD. L’induction observée dans les cellules NB4-LR1 existe indépendamment de la différenciation. Par contre, cette induction peut être observée associée à la différenciation ou à l’apoptose dans la lignée cellulaire NB4-LR1SFD parallèlement à une diminution importante de l’expression de hTERT. Ce résultat important montre que la lignée NB4-LR1SFD ne présente pas de défaut général d’induction de H19. Ces données suggèrent l’existence d’une corrélation inverse entre le niveau d’expression de hTERT et celui de H19 dans ce modèle cellulaire. De façon importante, l’analyse des banques de données issues de patients LAP publiquement accessibles retrouve cette corrélation inverse.Une diminution d’activité télomérasique est observée dans des extraits cellulaires incubés en présence de l’ARN H19 transcrit in vitro. Cette diminution d’activité est observée aussi après surexpression de H19 in cellulo. Les expériences de RIP (RNA immunoprecipitation) ont montré une diminution de la quantité de hTR lié à hTERT suite à une augmentation d’expression de H19 après traitement ATRA in vitro ou après surexpression de H19 in cellulo. Une hypothèse serait que H19 induirait un déplacement de hTR du complexe hTR-hTERT. Cependant, les expériences de « pull-down » n’ont pas réussi à confirmer l’hypothèse d’une interaction possible entre l’ARN H19 et la protéine TERT.Mon travail de thèse identifie pour la première fois H19, un ARN long non codant, comme facteur régulateur potentiel de hTERT pouvant modifier son activité. Ce travail proposerait non seulement un mécanisme nouveau de régulation de l’activité télomérase mais aussi une fonction nouvelle pour H19 dans ce type de cancer
The telomere / telomerase pair appears to be a promising target for potential anticancer agents that would be active on a wide range of tumors. The host laboratory has shown in a model of acute promyelocytic leukemia (APL), that a clinically used agent, retinoic acid (ATRA), exerts anti-tumor activity by repressing the transcription of the catalytic subunit hTERT regardless of differentiation. This model (NB4) with its resistant cell variants (NB4-LR1SFD) or not to the repression of hTERT (NB4-LR1) by ATRA is a tool of choice for the identification of hTERT regulatory factors and the search for molecular bases of its reactivation.A "microarray" approach has been used to identify new ATRA-mediated genes and / or signaling networks and potential hTERT regulators. Bioinformatic analysis allowed us to build differential expression profiles between the 2 lineages and interaction networks. Among the candidates, H19, a 2.5Kb long, polyadenylated and non-coding RNA. H19 is classified as a tumor suppressor gene: in its absence there is cancer development (case of Wilms tumor, embryonic rhabdomyosarcoma, Beckwith-Wiedman syndrome); its reintroduction by transfection leads to a loss of tumorigenicity. However H19 is increasingly recognized as an oncogene as its expression is elevated in several types of solid cancers. However, few studies are interested in the role of H19 in leukemias, hence our interest in studying it in the APL model that we have developed.We developed the H19 expression measurement by quantitative RT-PCR, validated the data obtained in the "microarray" analysis and showed that the ATRA treatment induces the expression of H19 in NB4-LR1 cells whereas this expression is rather diminished in NB4-LR1SFD cells. The induction observed in NB4-LR1 cells exists independently of differentiation. On the other hand, this induction can be observed associated with the differentiation or apoptosis in the NB4-LR1SFD cell line in parallel with a significant decrease in the expression of hTERT. This important result shows that the NB4-LR1SFD line does not have a general H19 induction defect. These data suggest the existence of an inverse correlation between the expression level of hTERT and that of H19 in this cellular model. Importantly, the analysis of publicly accessible APL patients’ databases finds this inverse correlation as well.We observed a decrease in telomerase activity in cellular extracts incubated in the presence of in vitro transcribed H19 RNA. This decrease in activity was also observed after overexpression of H19 in cellulo. The RIP (RNA immunoprecipitation) experiments showed a decrease in hTR amount bound to hTERT following an increase in H19 expression after ATRA treatment in vitro or after overexpression of H19 in cellulo. We hypothesize that H19 induces a displacement of hTR from the hTR-hTERT complex. However, the "pull-down" experiments failed to confirm the hypothesis of a possible interaction between H19 RNA and TERT protein.My thesis work identifies, for the first time, the long non-coding RNA H19, as a potential regulator of hTERT that can modify its activity. This work would propose not only a new mechanism of regulation of telomerase activity but also a new function for H19 in this type of cancer

La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis), maladie autosomique récessive la plus fréquente dans la population caucasienne, se manifeste par l’atteinte de plusieurs organes due à l’absence ou au dysfonctionnement du canal CFTR. Au niveau des poumons, la perte de l’activité du canal se traduit par une déshydration du mucus, des cycles d’infections et d’inflammation aboutissant à terme à la destruction du parenchyme pulmonaire. Les thérapeutiques proposées à l’heure actuelle, sont principalement symptomatiques et l’exploration de nouvelles pistes reste nécessaire. De récents travaux émanant de notre équipe ont révélé qu’une intervention au niveau de la stabilisation des transcrits pourrait être bénéfique pour améliorer la quantité de protéines nécessaires pour restaurer une activité suffisante du canal CFTR. Une autre piste qui pourrait être explorée serait de cibler, en plus de l’expression du gène CFTR, des régulateurs clés qui participent aux processus de réparation cellulaire ou à la réponse inflammatoire. Dans cet objectif, nous nous sommes focalisés sur des régulateurs clés comme les miARN et les ARE-BP (protéines de liaison à l’ARN) qui sont dérégulés dans les tissus CF et qui peuvent agir ensemble dans le contrôle de l’expression de nombreux gènes.Les travaux que nous avons réalisés nous ont permis d’une part, de montrer la dérégulation de miARN dans des échantillons CF ainsi que des isoformes de certains miARN. Deux miARN ont retenu notre attention, le miR-101 dont la distribution de ses séquences isomiR varient dans des cultures CF et le miR-181a-5p qui présente une dérégulation de son expression dans trois modèles ex-vivo CF que nous avons utilisés. Ces miARN ont la particularité de moduler l’expression de gènes clés dans les voies de signalisation PI3K-Akt/MAPK-Erk et Wnt. D’autre part, nos travaux ont révélé la dérégulation de la protéine ARE-BP TTP (Tristétraproline ou ZFP36) en contexte CF. Cette protéine est d’autant plus intéressante qu’elle est connue pour être un régulateur clé de l’inflammation. La suite de ce travail a donc été d’étudier sa régulation et son impact sur ses ARNm cibles. L’activité de cette ARE-BP a été principalement décrite pour être contrôlée par la voie p38-MAPK. Nous montrons l’implication de la voie p42/p44-MAPK (Erk1/2) dans la régulation de la phosphorylation de TTP dans des cultures bronchiques. La recherche des interactions entre TTP et ses cibles a également révélé que cette protéine agissait sur ses propres régulateurs ainsi que sur l’ARNm CFTR. Nous montrons ainsi pour la première fois que TTP se fixe au niveau de la région 3’UTR du transcrit CFTR et joue un rôle de stabilisateur sur ce transcrit.Identifier de nouveaux acteurs de la régulation du gène CFTR mais également des régulateurs centraux des processus altérés en contexte CF offre de nouvelles opportunités pour concevoir des outils ciblés pour combattre cette maladie
Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening genetic disorder in Caucasians, affects many organs but chronic lung disease is the main cause of morbidity and mortality. This disease, characterized by CFTR gene alterations, results in ions transport dysfunctions that contribute to impair mucociliary clearance, favoring bacterial colonization and inflammation, and ultimately leading to lung destruction. Nowadays, therapeutic drugs have limited benefit, so development of new alternatives or complementary molecules remains essential. Recently, our team demonstrated that the intervention on CFTR mRNA stability leads to an increase in CFTR protein level and an improvement of the CFTR channel activity. An alternative way would be to target key actors such as miRNA and ARE-BP (RNA binding protein), deregulated in CF tissues, that display a pleiotropic activity and act together to control expression of several genes.Our findings led to the identification of dysregulated miRNA in CF samples and revealed multiple isoforms relative to miRNA of reference (i.e. isomiRs). We focused on two miRNA, miR-101, that displays a modification in isomiR distribution and miR-181a-5p that is highly deregulated, in three CF airways models. These miRNA modulate expression of key genes or related genes in PI3K-Akt/MAPK-Erk and Wnt signaling pathways.Our work also revealed the deregulation of an ARE-BP protein, TTP (Tristetraprolin, ZFP36), in CF context. This protein is a master regulator in inflammatory resolution. We next investigated the mechanism whereby this ARE-BP is regulated in bronchial cells and showed that TTP phosphorylation is regulated by MK2 through ERK activation. We also determined for the first time that TTP binds to the 3’UTR of CFTR mRNA where TTP binding stabilizes CFTR mRNA level.These data bring new insights into CF physiopathology and open new research opportunities in CF

Le génome humain est largement transcrit en milliers d’ARN non traduits en protéines. Les longs ARN non-codants (ARNlnc) ont un rôle majeur dans la régulation du génome, au cours du développement et lors de la progression de nombreuses maladies, dont les cancers. La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), donnant à une cellule la capacité de former des métastases, semble être un processus crucial transformant une tumeur bénigne en maladie mortelle. Certains ARNlnc ont été associés à ce phénomène, mais leur fonction reste à définir.Un modèle in vitro de TEM et des approches de séquençage d’ARN à très haut débit, nous ont permis de définir un catalogue d’ARNlnc dérégulés entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Parmi eux, nous avons identifié HOTAIR, étudié pour son expression aberrante dans les tumeurs métastasées et son interaction avec les complexes PRC2 et LSD1/CoREST/REST. Par des approches de perte et de gain de fonction, nous avons montré que HOTAIR n’est pas impliqué dans l’initiation de la TEM mais est un régulateur majeur de la prolifération cellulaire ainsi que des capacités de migration et d’invasion des cellules. Nous avons généré des lignées cellulaires sur-exprimant HOTAIR privé de son domaine d’interaction avec PRC2 ou LSD1. L’étude de leur phénotype et l’établissement de leur transcriptome ont permis de montrer que le domaine d’interaction avec le complexe LSD1/CoREST/REST est crucial pour la régulation de nombreux gènes par HOTAIR. Ces résultats permettent une meilleure compréhension du rôle des ARNlnc dans la TEM, et de la fonction cruciale de HOTAIR dans l’acquisition d’un phénotype métastatique par des cellules cancéreuses épithéliales
The human genome is pervasively transcribed into thousands of non-coding transcripts. Numerous studies underline the diversity and importance of long non-coding RNAs (lncRNAs) in genome regulation and their impact on development and diseases. Processes of cancer progression are extensively studied, in particular the Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) that enables epithelial cancer cells to invade other tissues to form metastases. If several lncRNAs have been associated with EMT, their molecular function is not clearly defined. Using a well-established in vitro cell model of EMT and high-throughput RNA sequencing approaches, we defined a catalogue of annotated and novel lncRNAs significantly deregulated between epithelial and mesenchymal states of HEK cells. Among them, we identified HOTAIR, linked to cancer metastasis and described as a scaffold RNA guiding chromatin-modifying complexes PRC2 and LSD1/CoREST/REST. Using loss- and gain-of-function approaches, we showed that HOTAIR is not an inducer of the EMT per se but a major regulator of cell proliferation rate, migratory and invasive capacities. We generated stable cell-lines over expressing HOTAIR transcripts lacking PRC2- or LSD1-interacting domains. Transcriptome analysis and phenotypic studies showed that LSD1-binding domain is crucial for HOTAIR-mediated gene regulation. Altogether, our results give new insights into lncRNAs role in EMT, with a better understanding of HOTAIR-mediated gene regulation mechanism and its role in the acquisition of a metastatic phenotype by cancer cells. Further studies will be performed to deeper investigate lncRNAs role in EMT, particularly for previously unannotated lncRNAs

L'expression des gènes est finement régulée dans la cellule et soumise à de multiples contrôles-qualité. Cette régulation intervient à différents niveaux, de façon à garantir une synthèse efficace des produits fonctionnels de l'expression génique, et pour assurer une adaptation à un changement environnemental. Notamment, les régulations transcriptionnelles sont cruciales pour contrôler la cinétique et le niveau d'expression des gènes. La transcription pervasive est une transcription généralisée non-codante et instable qui fut révélée chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Bien que son potentiel régulateur ait été démontré de façon ponctuelle, la question de sa fonctionnalité globale restait ouverte. Lors de ma thèse, j'ai pu montrer l'existence de phénomènes multiples d'interférence transcriptionnelle liés à la transcription pervasive, pour co-réguler un ensemble de gènes entre la phase exponentielle et la quiescence. En effet, la transcription non-codante en antisens des gènes concernés conduit à leur répression, dans des conditions où ils ne doivent pas être exprimés. Le mécanisme de répression fait intervenir des modifications de la chromatine. La levure bourgeonnante, dépourvue de la machinerie d'ARN interférence, présente donc un système fin de régulation de l'expression génique utilisant la transcription pervasive
In the cell, gene expression is finely tuned and is submitted to different quality-controls. Gene are regulated at different expression levels in order to guarantee a proper synthesis of functional products, and to ensure an optimal adaptation to environmental changes. In particular, transcriptional regulations are critical for gene expression level and kinetics.Pervasive transcription, defined as a generalized non-coding and unstable transcription, was discovered in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Although its regulatory potential was punctually shown, the question of its global functionality still remained. During my PhD, I could show the existence of numerous transcriptional interference mechanisms involved in the co-regulation of a group of genes between exponential phase and quiescence. Indeed, non-coding transcription in antisense to genes promoter leads to its repression in conditions where they have to be switched off. The repression mechanism is allowed by chromatin modifications.Hence, budding yeast that lacks RNA interference machinery has developed a fine regulation system using pervasive transcription

La récidive et la progression métastatique du cancer du sein ne sont toujours pas curables. Le concept des cellules souches cancéreuses (CSC) pourrait apporter une explication à ces échecs. Les CSC résisteraient aux thérapies conventionnelles (chimiothérapies, radiothérapie) et seraient responsables de la rechute et de la progression du cancer. L'élimination des CSC semble être un pré-requis indispensable pour le traitement des patientes. L'identité et le destin des cellules souches sont finement régulés par des acteurs épigénétiques. Les travaux de cette thèse se sont intéressés aux conséquences de la dérégulation de deux acteurs épigénétiques en particulier : les enzymes HDAC et le long ARN non-codant Xist. Nous avons montré que la modulation épigénétique via l'inhibition des HDAC (HDACi) permet d'éliminer les CSC en induisant leur différenciation. Nous présentons une nouvelle stratégie thérapeutique pour le cancer du sein : la thérapie différenciante. Nous avons déterminé Xist comme étant le biomarqueur prédictif de la réponse aux HDACi. Xist étant un partenaire clé de la plasticité cellulaire, les travaux de cette thèse se sont ensuite intéressés aux conséquences de la dérégulation de Xist dans l'initiation tumorale. Nous avons observé que l'inhibition de Xist favorise la division des cellules souches mammaires normales. Nous proposons un nouveau modèle de l'initiation tumorale où la dérégulation épigénétique est une modification précoce sans conséquence sur l'homéostasie tissulaire mais pourrait être la première étape de la transformation cancéreuse
These last decades have allowed deciphering the biology of breast cancer and improving the therapeutic management. However, recurrence and metastatic progression of the disease are still not curable. The concept of cancer stem cells (CSC) could provide an explanation for these failures. CSC would resist conventional therapies (chemotherapy, radiotherapy) and would be responsible for both relapse and progression of cancer. The elimination of CSC seems to be an essential prerequisite for the treatment of patients. The identity and fate of stem cells are tightly regulated by epigenetic mechanisms. The work of this thesis investigated the consequences of deregulation of two epigenetic players: HDAC enzymes and long non-coding RNA Xist. We have shown that epigenetic modulation via HDAC inhibitor (HDACi) eliminates the CSC by inducing their differentiation. We present a new therapeutic strategy for breast cancer: differentiation therapy. We determined Xist as the predictive biomarker of response to HDACi. Xist is a key partner of cell plasticity, the work of this thesis therefore interested in the consequences of Xist deregulation in tumor initiation. We observed that Xist inhibition promotes division of normal breast stem cells. We propose a new model of tumor initiation: epigenetic deregulation is an early change without consequence on tissue homeostasis but could be the first step of the cancerous transformation

L'expression des gènes est finement régulée dans la cellule et soumise à de multiples contrôles-qualité. Cette régulation intervient à différents niveaux, de façon à garantir une synthèse efficace des produits fonctionnels de l'expression génique, et pour assurer une adaptation à un changement environnemental. Notamment, les régulations transcriptionnelles sont cruciales pour contrôler la cinétique et le niveau d'expression des gènes. La transcription pervasive est une transcription généralisée non-codante et instable qui fut révélée chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Bien que son potentiel régulateur ait été démontré de façon ponctuelle, la question de sa fonctionnalité globale restait ouverte. Lors de ma thèse, j'ai pu montrer l'existence de phénomènes multiples d'interférence transcriptionnelle liés à la transcription pervasive, pour co-réguler un ensemble de gènes entre la phase exponentielle et la quiescence. En effet, la transcription non-codante en antisens des gènes concernés conduit à leur répression, dans des conditions où ils ne doivent pas être exprimés. Le mécanisme de répression fait intervenir des modifications de la chromatine. La levure bourgeonnante, dépourvue de la machinerie d'ARN interférence, présente donc un système fin de régulation de l'expression génique utilisant la transcription pervasive
In the cell, gene expression is finely tuned and is submitted to different quality-controls. Gene are regulated at different expression levels in order to guarantee a proper synthesis of functional products, and to ensure an optimal adaptation to environmental changes. In particular, transcriptional regulations are critical for gene expression level and kinetics.Pervasive transcription, defined as a generalized non-coding and unstable transcription, was discovered in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Although its regulatory potential was punctually shown, the question of its global functionality still remained. During my PhD, I could show the existence of numerous transcriptional interference mechanisms involved in the co-regulation of a group of genes between exponential phase and quiescence. Indeed, non-coding transcription in antisense to genes promoter leads to its repression in conditions where they have to be switched off. The repression mechanism is allowed by chromatin modifications.Hence, budding yeast that lacks RNA interference machinery has developed a fine regulation system using pervasive transcription

L’objectif de mon projet principal de thèse est de déterminer la fonction biologique d’un lncARN conservés chez le zebrafish que nous avons appelé libra. La séquence de libra étant hautement homologue à la région 3’UTR de la protéine Nrep. Ces deux transcrits, libra et Nrep, contiennent en effet un site de liaison au miARN profondément conservé et inhabituellement complémentaire au miR-29. En utilisant à le modèle souris et les cellules murines, nous avons décrypté la relation régulatrice entre ce transcrit conservé dans l’évolution des vertébrés et la voie métabolique des miARN. Nous avons montré que Nrep limite le domaine d’expression de miR-29 au cervelet, et qu’il le déstabilise en rognant sa séquence. Notre travail révèle donc le premier exemple de dégradation endogène ciblée des miARN (ou TDMD). De plus, un ensemble d’expériences in vivo sur les modèles zebrafish et souris, nous a permis de démontrer que libra et Nrep contrôlent tout les deux le comportement animal. Via la perturbation génétique du site de liaison au miARN de Nrep murin, nous avons observé que ce gène régule le dosage du miR29 de part son site de liaison aux miARN, et que cette régulation est nécessaire à un comportement animal normal. Dans la seconde partie de ma thèse, je décris une stratégie exploré afin de déréguler les lncARN de la manière la moins invasive possible. Les lncARN sont actuellement neutralisés par des approches qui introduisent de vastes changements de séquence au niveau génomique. Nous avons donc développer une stratégie in vivo, appliquée au zebrafish, qui inactive les lncARN via l’insertion génomique d’une séquence ribozyme autoclivante ou d’un signal polyA prématuré
The goal of my main thesis project was to determine the biological function of a deeply conserved zebrafish long noncoding RNAs (lncRNA) which we called libra. libra shows sequence similarity with the 3'UTR of the NREP a protein coding transcript. Both libra and Nrep contain a deeply conserved and unusually complementary microRNA (miRNA) binding site for miR-29. Using both the mouse model and mouse cell lines, we deciphered the regulatory relationship between this conserved transcript and the miRNA pathway. We showed that Nrep restricts the spatial expression domain of miR-29 in the cerebellum and that it destabilizes miR-29 through 3' trimming. Until now, only viral transcripts and artificial reporters engineered to contain highly complementary miRNA binding sites have been shown to regulate miRNAs in this fashion. Thus, our work uncovers the first example of endogenous target-directed miRNA degradation (TDMD). In addition, through a set of in vivo experiments in zebrafish and mouse, we showed that both libra and Nrep control normal animal behavior. By genetically disrupting the miR-29 binding site in Nrep in mouse, we showed that Nrep regulates miR-29 dosage through its miR-29 site and controls animal behavioral. In a second part of my thesis I describe a strategy to genetically downregulate lncRNAs in a minimally invasive manner. Approaches to knock-out lncRNAs that do not introduce vast sequence changes at the genomic level have not been adequately developed yet. I present our in vivo strategy applied to the zebrafish model using a genomic knock-in of a self-cleaving ribozyme sequence and a premature poly(A) signal to knock-out lncRNAs

L’émergence des nouvelles techniques de séquençage à haut débit a permis d’appréhender la complexité du transcriptome des eucaryotes supérieurs. La majeure partie du génome des mammifères est transcrite, et les longs ARN non codants (lARNnc) en occupe une place prépondérante, dont la fonction est encore largement énigmatique. L’étude d’une minorité d’entre eux a révélé que leur fonction peut être médiée par diverses entités telles que le transcript, l'acte de leur transcription ou les éléments régulateurs compris au sein du locus. Une caractéristique de ces lARNnc est leur faible conservation au cours de l’évolution, ce qui pose la question de leur contribution à des mécanismes de régulation spécifique à chaque espèce. L'inactivation du chromosome X (ICX) est un paradigme des processus épigénétiques médiés par les gènes des lARNnc et un puissant modèle pour explorer leurs aspects fonctionnels, mécanistiques et évolutifs. L’ICX se met en place précocement au cours du développement embryonnaire et assure la compensation de dose des gènes du chromosome X entre les individus mâles et femelles chez les mammifères. Chez la souris, l’ICX résulte de l'action combinée de multiples gènes produisant des lARNnc, parmi lesquels Xist est l’acteur majeur de l’inactivation. L’accumulation de Xist sur le chromosome à partir duquel il est transcript permet de déclencher la répression transcriptionnelle du chromosome X. Xist se situe au coeur d’une région génomique, le centre d'inactivation du chromosome X, qui comprend de nombreux autres lARNnc tantôt activateurs ou répresseurs, dont la fonction dans l’ICX dans d’autres espèces est largement méconnue. Dans cette étude, nous avons étudié la conservation fonctionnelle de deux lARNnc JPX et FTX, et leur contribution à la régulation XIST chez l'homme et la souris.Chez la souris, nous avons montré que l'ARN Jpx est nécessaire à la régulation post-transcriptionnelle de Xist, probablement en affectant son accumulation ou sa stabilité. Chez l'homme, c'est la transcription de JPX, mais pas le transcrit lui-même, qui contrôle le recrutement de l’ARN polymérase II au niveau de la région promotrice de XIST. En conséquence, alors que la fonction de JPX/Jpx dans la régulation de l'accumulation XIST/Xist est conservée chez l'humain et la souris, les mécanismes sous-jacents divergent nettement. D'autre part, les résultats préliminaires sur la fonction FTX chez l'homme suggèrent qu'il pourrait être impliqué dans la maintenance de XCI chez l'homme dans des contextes cellulaires spécifiques. Ces résultats apportent un éclairage nouveau sur l'évolution fonctionnelle du réseau de régulation XIST/Xist entre la souris et l'homme, qui pourrait être spécifiquement adaptée aux exigences de l’ICX dans chaque espèce. Ce travail met en évidence la plasticité fonctionnelle des lARNnc dans l'évolution et la façon dont il pourrait jouer un rôle important dans le mécanisme de régulation des gènes spécifique d’une espèce à l’autre
Long non-coding RNAs (lncRNAs) have emerged as the major output of mammalian transcriptomes. As of today, the function of the majority of lncRNAs remains largely enigmatic and importantly may be mediated by various entities such as the transcript itself, the act of transcription or key regulatory elements within the locus. A remarkable characteristic of lncRNAs is their poor evolutionary conservation, which raises the question of their contribution to species-specific regulatory mechanisms.X chromosome inactivation (XCI) is a paradigm for epigenetic processes mediated by lncRNA genes (LRGs) and a powerful model to explore their functional, mechanistic and evolutionary aspects. XCI is a process initiated early during embryonic development, which ensures the dosage compensation of X-linked genes between male and female in mammals. In the mouse, XCI is triggered by the combined action of several LRGs, among which Xist is the key regulator of the process. Xist is produced from a genomic region, the X-chromosome inactivation center (Xic), that is enriched for LRGs described either as positive or negative XCI regulators. In the present study, we investigated the evolutionary conservation of two candidate LRGs, JPX and FTX, and their contribution to XIST regulation in both human and mouse.In the mouse, we demonstrated that the Jpx RNA is required for proper Xist expression and acts as a post-transcriptional regulator of Xist, most likely by affecting its accumulation or stability. In striking contrast, in human, it is JPX transcription, but not the transcript itself, that controls the RNA Polymerase II (RNAPII) recruitment at XIST promoter. Accordingly, the two genes are interacting through local chromosome conformation, emphasized by RNAPII bridges in between the two loci. While the function of JPX/Jpx in promoting XIST/Xist accumulation is conserved between human and mouse, the underlying mechanisms diverge markedly. On the other hand, preliminary results on FTX function in human, suggest that it might be involved in XCI maintenance in human in very specific cellular contexts. Altogether, these results shed a new light on the functional evolution of XIST regulatory network between mouse and human that might be specifically adapted to XCI requirements in each species. This work highlights the functional plasticity of lncRNAs in evolution and how it might play important roles in species-specific mechanism of gene regulation

Le génome humain est largement transcrit en milliers d’ARN non traduits en protéines. Les longs ARN non-codants (ARNlnc) ont un rôle majeur dans la régulation du génome, au cours du développement et lors de la progression de nombreuses maladies, dont les cancers. La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), donnant à une cellule la capacité de former des métastases, semble être un processus crucial transformant une tumeur bénigne en maladie mortelle. Certains ARNlnc ont été associés à ce phénomène, mais leur fonction reste à définir.Un modèle in vitro de TEM et des approches de séquençage d’ARN à très haut débit, nous ont permis de définir un catalogue d’ARNlnc dérégulés entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Parmi eux, nous avons identifié HOTAIR, étudié pour son expression aberrante dans les tumeurs métastasées et son interaction avec les complexes PRC2 et LSD1/CoREST/REST. Par des approches de perte et de gain de fonction, nous avons montré que HOTAIR n’est pas impliqué dans l’initiation de la TEM mais est un régulateur majeur de la prolifération cellulaire ainsi que des capacités de migration et d’invasion des cellules. Nous avons généré des lignées cellulaires sur-exprimant HOTAIR privé de son domaine d’interaction avec PRC2 ou LSD1. L’étude de leur phénotype et l’établissement de leur transcriptome ont permis de montrer que le domaine d’interaction avec le complexe LSD1/CoREST/REST est crucial pour la régulation de nombreux gènes par HOTAIR. Ces résultats permettent une meilleure compréhension du rôle des ARNlnc dans la TEM, et de la fonction cruciale de HOTAIR dans l’acquisition d’un phénotype métastatique par des cellules cancéreuses épithéliales
The human genome is pervasively transcribed into thousands of non-coding transcripts. Numerous studies underline the diversity and importance of long non-coding RNAs (lncRNAs) in genome regulation and their impact on development and diseases. Processes of cancer progression are extensively studied, in particular the Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) that enables epithelial cancer cells to invade other tissues to form metastases. If several lncRNAs have been associated with EMT, their molecular function is not clearly defined. Using a well-established in vitro cell model of EMT and high-throughput RNA sequencing approaches, we defined a catalogue of annotated and novel lncRNAs significantly deregulated between epithelial and mesenchymal states of HEK cells. Among them, we identified HOTAIR, linked to cancer metastasis and described as a scaffold RNA guiding chromatin-modifying complexes PRC2 and LSD1/CoREST/REST. Using loss- and gain-of-function approaches, we showed that HOTAIR is not an inducer of the EMT per se but a major regulator of cell proliferation rate, migratory and invasive capacities. We generated stable cell-lines over expressing HOTAIR transcripts lacking PRC2- or LSD1-interacting domains. Transcriptome analysis and phenotypic studies showed that LSD1-binding domain is crucial for HOTAIR-mediated gene regulation. Altogether, our results give new insights into lncRNAs role in EMT, with a better understanding of HOTAIR-mediated gene regulation mechanism and its role in the acquisition of a metastatic phenotype by cancer cells. Further studies will be performed to deeper investigate lncRNAs role in EMT, particularly for previously unannotated lncRNAs

Mon travail de thèse se focalise sur l'étude du 1ARNnc Ftx, dont le gène est situé dans le centre d'inactivation du chromosome X , région riche en gènes codant pour des IARNncs et responsable du processus d'inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles. Le laboratoire a montré que l'expression de Ftx favorise l'expression des gènes voisins, lui conférant ainsi un rôle activateur dans le processus d'inactivation. Ftx est également exprimé dans l'organisme murin adulte, plus spécifiquement dans le cerveau, suggérant ainsi des fonctions indépendantes du processus d'inactivation. Ainsi, je me suis focalisée sur l'étude de l'implication potentielle d( Ftx dans le développement et/ou le fonctionnement du cerveau. L'expression de Ftx dans le cerveau est relativement homogène entre différentes régions, en revanche elle s'instaure que durant la période postnatale, plus précisément entre P7 et P21, où elle augmente brusquement. Cette période correspond à une importante phase de structuration du cerveau murin, à la fois en termes de myélination et de remaniement synaptique. Il est envisageable que Ftx participe à un de ces processus. En utilisant un modèle cellulaire basé sur des cellules souches embryonnaires murines sauvages et portant une délétion constitutive de Ftx, j'ai développé une technique de différenciation neurale in vitro. Malgré le fait que la perte de Ftx n'a pas d'impact majeur sur le potentiel de différenciation neurale des cellules, une analyse par puce ADN a révélé qu'elle induit une surexpression d'une grande quantité de gènes Hox. L'ensemble de ces travaux fortifient l'hypothèse initiale et donnent naissance à des pistes excitantes
My PhD project focuses on the study of the long RNAnc Ftx, whose gene is located in the X chromosome inactivation center, a region rich in genes encoding long RNAncs and in charge of the inactivation process of one X chromosome in female mammals. The team has shown that the expression of Ftx favors the expression of the neighboring genes, conferring it the role of an activator of the inactivation process. Ftx is also expressed in the adult murine organism, more specifically in the brain, suggesting thus functions independent of the inactivation process. As a consequence, I focused on the potential implication of Ftx in de development and/or the functions of the brain. Ftx expression in the brain is relatively homogeneous among different regions, although it is established only during the postnatal period, between P7 and P21, when it increases suddenly. This period corresponds to an important phase of restructuring of the murine brain like myelination and synaptic reorganization. Thus it is conceivable that Ftx takes part in one of these processes. Using a cellular model based on wild-type and Ftx-deleted mouse embryonic stem cells? I developed a technique of in vitro neural differentiation. Although the lors of Ftx does not impact in a visible way on the neural differentiation potential of the cells, an analysis by microarray revealed that it causes the overexpression of several Hox genes. These combined results reinforce the initial hypothesis and lay numerous exciting tracks

La méthylation de l'histone H3 Lysine 9 (H3K9me) est une marque de l'hétérochromatine progressivement déposée au cours du développement. Elle contribue à la restriction de certains destins cellulaires. Dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), les niveaux de H3K9me augmentent lors de la différentiation, constituant alors une barrière à la reprogrammation à l'état pluripotent. Cependant le couplage entre les niveaux d'H3K9me et la pluripotence n'a encore jamais été formellement étudié. On a ainsi identifié SUV39H1, une methyltransferase responsable de la propagation di/tri H3K9me (H3K9me2/3), comme une cible indirecte du réseau des facteurs de transcription de la pluripotence (pTFs). En effet, le pTF OCT4 active l'expression d'un ARN long non-codant Suv39h1as anti-sens à Suv39h1. Suv39h1as réprime l'expression de Suv39h1 en modifiant la chromatine au locus et possiblement en modulant l'expression de ses isoformes. L'absence de Suv39h1as induit l'augmentation de SUV39H1 ainsi que de H3K9me2/3, menant à une accélération de la spécification irréversible au cours de la différentiation. Ainsi, OCT4, Suv39h1 et Suv39h1as constituent un circuit permettant de coupler les niveaux d'H3K9me à la pluripotence dans les mESCs. De plus, une lignée de souris knock-out pour Suv39h1as a été créée et nous avons démontré que cette régulation est aussi présente dans l'ovocyte
Histone H3 Lysine 9 (H3K9) methylation, a mark of heterochromatin, is progressively implemented during development to contribute to cell fate restriction as differentiation proceeds. For instance, in mouse Embryonic Stem cells (mESCs) the global levels of H3K9 methylation are rather low and increase only upon differentiation. Conversely, H3K9 methylation represents an epigenetic barrier for reprogramming somatic cells back to pluripotency. How global H3K9 methylation levels are coupled with the acquisition and loss of pluripotency remains unknown. Here, we identify SUV39H1, a major H3K9 di- and tri-methylase, as an indirect target of pluripotency Transcription Factors (pTFs). We find that the pTFs OCT4 activates the expression of an antisense long non-coding RNA to Suv39h1, named Suv39h1as. In turn, Suv39h1as downregulates Suv39h1 expression via the modulation of the chromatin status of the locus and a possible alteration of Suv39h1 isoforms. The loss of Suv39h1as expression triggers increased SUV39H1 expression and H3K9me2/3 levels, leading to accelerated commitment into differentiation. We report, therefore, a simple genetic circuitry coupling the global levels of H3K9 methylation to pluripotency in mESCs. We also created a mouse line deleted for Suv39h1as expression and demonstrated that this regulation is also present during mouse oocyte maturation

La leucémie aiguë à cellules dendritiques plasmacytoïdes (BPDCN) fait partie des cancers incurables pour lesquels les mécanismes impliqués dans la pathogénèse restent inconnus. Dans ce travail, nous avons identifié le gène NR3C1 (5q31), qui code pour le récepteur des glucocorticoïdes (GCR), et un long ARN non-codant inter-génique (appelé ici lincRNA-3q), comme étant des cibles d'altération géniques ou de dérégulation transcriptionnelles dans les BPDCN. La translocation/délétion de NR3C1 est associée avec un temps de survie extrêmement court et des activités anormales du réseau de régulation des gènes GCR, EZH2 et FOXP3. Nous avons découvert que lincRNA-3q code pour une forme nucléaire d'ARN non-codant qui est activé de façon ectopique dans les BPDCN et les AML à haut risque. Dans les cancers myéloïdes, une déplétion de lincRNA-3q induit un arrêt du cycle cellulaire qui coïncide avec la suppression des signatures d'expression génique de E2F1/Rb et des gènes spécifiques aux cellules souches leucémiques. Nos résultats démontrent qu'une inhibition des protéines à bromodomaine BET supprime sélectivement l'expression lincRNA-3q, indiquant une stratégie thérapeutique potentielle pour contrer l'activité oncogénique de cet ARN non-codant. Ce travail défini, un nouveau cadre de recherche pour comprendre la pathogénèse et la résistance au traitement dans les BPDCN
Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) is an incurable malignancy for which disease mechanisms are unknown. Here, we identify the NR3C1 gene (5q31), encoding the glucocorticoid receptor (GCR), and a long, intergenic, non-coding RNA gene (named here lincRNA-3q), respectively, as targets for genetic alteration or transcriptional deregulation in BPDCN. NR3C1 translocation/deletion was associated to critically short survival in BPDCN and to abnormal activity of GCR, EZH2, and FOXP3 gene regulatory networks. LincRNA-3q, was found to encode a nuclear, non- coding RNA that is ectopically activated in BPDCN and high-risk AML. Depletion of lincRNA-3q in myeloid cancer cells induced cell cycle arrest, coincident to suppression of E2F1/Rb and leukemia stem cell-specific gene expression signatures. BET bromodomain protein inhibition could selectively suppress lincRNA-3q indicating a treatment strategy for counteracting oncogenic activity of this non- coding RNA. Thus, this work defines a new framework for understanding disease pathogenesis and treatment resistance in BPDCN

Le virus de la maladie de Marek (MDV) est un virus oncogène responsable des lymphomes T chez les poulets. L´infection par ce virus est divisée en une phase lytique dépendante de l´expression du gène très précoce ICP4 et une phase latente, caractérisée par l´expression de l’ARN long non codant LAT localisé en antisens. Nous avons montré que l’expression différentielle des miARN du cluster mdv1-miR-M8-M10 était directement corrélée à l’épissage alternatif de l’intron 1 du LAT et plus particulièrement à la biogenèse par le splicéosome du premier mirtron viral. La présence du mirtron mdv1-miR-M6 au milieu du cluster est associée à une cinétique d’expression des miARN. En parallèle, nous avons identifié deux promoteurs alternatifs de type Sp1, quatre signaux poly-A et trois exons associés à la régulation de la transcription du transcrit ICP4. Nous avons prédits cinq isoformes potentielles pour la protéine ICP4 et avons pu observer par immunodétection que la protéine était exprimée principalement dans le cytoplasme des cellules infectées en phase lytique ou de réactivation
The Marek disease virus (MDV) is an oncogenic herpesvirus responsible of T-cell lymphoma in chicken. MDV infections are divided into a lytic phase, depending on the expression of immediate early gene like ICP4, and a latent phase characterized by the expression of the long non-coding RNA LAT localized in antisense. In this study, we have shown the differential expression of the cluster of miRNA mdv1-miR-M8-M10 was directly correlated with the alternative splicing of LAT’s intron 1 and more specifically with the first viral mirtron biogenesis by the spliceosome. The location of the mirtron mdv1-miR-M6 inside of the cluster is associated with a two-step biogenesis of the miARN of the cluster. On the other hand, we have identified a dual promoter that responded to Sp1, four poly-A signals and three exons that are responsible of transcriptional regulation of ICP4 transcript. We also have predicted five potential isoproteines for ICP4 and were able to observe by immunodetection that ICP4 was mainly expressed in the cytoplasm of infected cells during the lytic phase or the reactivation one

La croissance fœtale et postnatale est un processus finement régulé par des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux complexes. Le système des IGFs (insulin-like growth factors) est l’un des acteurs principaux jouant un rôle crucial dans le développement fœtal et postnatal. Chez l’humain, plusieurs mutations des gènes IGF1 et IGF-1R ainsi qu’une mutation d’origine paternelle d’IGF2 ont été rapportées chez des patients ayant un retard de croissance intra-utérin (RCIU) qui peut persister et/ou s’aggraver en postnatal. Par ailleurs, les phénomènes épigénétiques comme la méthylation de l’ADN et le code histone jouent également un rôle prépondérant dans le développement fœtal et postnatal. L’empreinte parentale, mise en place grâce à des marques épigénétiques, est un des mécanismes important pour le développement fœtal. Chez l’humain, une anomalie de régulation de gènes soumis à empreinte parentale est associée à plusieurs syndromes de retard de croissance intra-utérin et postnatal ou à l’inverse de croissance excessive. Ce travail comporte deux parties: nous nous sommes dans un premier temps particulièrement intéressés à l’étude génétique et épigénétique de la région 11p15.5 et de son centre d’empreinte régulant le domaine IGF2/H19 dans une population de patients ayant une croissance excessive ou bien un RCIU (syndromes de Beckwith-Wiedemann et Silver-Russell respectivement), afin de mieux comprendre la régulation de ce domaine. Puis, la deuxième partie de notre étude a porté sur l’identification de nouvelles causes génétiques et épigénétiques de syndrome de Silver-Russell, altérant l’expression d’IGF2 mais n’étant pas directement secondaires à un défaut moléculaire de la région 11p15.5
Fetal and postnatal growth is a process finely regulated by genetic, epigenetic and environmental complex. The IGFs system (insulin-like growth factors) is one of the main actors playing a crucial role in fetal and postnatal development. In humans, several mutations of IGF1 and IGF-1R genes and a paternal IGF2 mutation have been reported in patients with intrauterine growth restriction (IUGR), which can persist and/or worsen in postnatal life. Moreover, epigenetic phenomena such as DNA methylation and histone code also play a major role in fetal and postnatal development. Genomic imprinting, established due to epigenetic marks, is one of the major mechanisms for fetal development. In humans, abnormal regulation of genes subject to imprinting is associated with several syndromes of intrauterine and postnatal growth restriction or conversely excessive growth. This work has two parts: we initially particularly interested in the genetic and epigenetic study of the 11p15.5 region and its imprinting control region regulating the IGF2/H19 domain in a population of patients with overgrowth or IUGR (Beckwith-Wiedemann syndrome and Russell-Silver respectively), to better understand the regulation of this area. Then, the second part of our study focused on the identification of new genetic and epigenetic causes of Silver-Russell syndrome, altering the expression of IGF2, without being directly caused by a molecular defect of 11p15.5 region

L’objectif de mon projet principal de thèse est de déterminer la fonction biologique d’un lncARN conservés chez le zebrafish que nous avons appelé libra. La séquence de libra étant hautement homologue à la région 3’UTR de la protéine Nrep. Ces deux transcrits, libra et Nrep, contiennent en effet un site de liaison au miARN profondément conservé et inhabituellement complémentaire au miR-29. En utilisant à le modèle souris et les cellules murines, nous avons décrypté la relation régulatrice entre ce transcrit conservé dans l’évolution des vertébrés et la voie métabolique des miARN. Nous avons montré que Nrep limite le domaine d’expression de miR-29 au cervelet, et qu’il le déstabilise en rognant sa séquence. Notre travail révèle donc le premier exemple de dégradation endogène ciblée des miARN (ou TDMD). De plus, un ensemble d’expériences in vivo sur les modèles zebrafish et souris, nous a permis de démontrer que libra et Nrep contrôlent tout les deux le comportement animal. Via la perturbation génétique du site de liaison au miARN de Nrep murin, nous avons observé que ce gène régule le dosage du miR29 de part son site de liaison aux miARN, et que cette régulation est nécessaire à un comportement animal normal. Dans la seconde partie de ma thèse, je décris une stratégie exploré afin de déréguler les lncARN de la manière la moins invasive possible. Les lncARN sont actuellement neutralisés par des approches qui introduisent de vastes changements de séquence au niveau génomique. Nous avons donc développer une stratégie in vivo, appliquée au zebrafish, qui inactive les lncARN via l’insertion génomique d’une séquence ribozyme autoclivante ou d’un signal polyA prématuré
The goal of my main thesis project was to determine the biological function of a deeply conserved zebrafish long noncoding RNAs (lncRNA) which we called libra. libra shows sequence similarity with the 3'UTR of the NREP a protein coding transcript. Both libra and Nrep contain a deeply conserved and unusually complementary microRNA (miRNA) binding site for miR-29. Using both the mouse model and mouse cell lines, we deciphered the regulatory relationship between this conserved transcript and the miRNA pathway. We showed that Nrep restricts the spatial expression domain of miR-29 in the cerebellum and that it destabilizes miR-29 through 3' trimming. Until now, only viral transcripts and artificial reporters engineered to contain highly complementary miRNA binding sites have been shown to regulate miRNAs in this fashion. Thus, our work uncovers the first example of endogenous target-directed miRNA degradation (TDMD). In addition, through a set of in vivo experiments in zebrafish and mouse, we showed that both libra and Nrep control normal animal behavior. By genetically disrupting the miR-29 binding site in Nrep in mouse, we showed that Nrep regulates miR-29 dosage through its miR-29 site and controls animal behavioral. In a second part of my thesis I describe a strategy to genetically downregulate lncRNAs in a minimally invasive manner. Approaches to knock-out lncRNAs that do not introduce vast sequence changes at the genomic level have not been adequately developed yet. I present our in vivo strategy applied to the zebrafish model using a genomic knock-in of a self-cleaving ribozyme sequence and a premature poly(A) signal to knock-out lncRNAs

L’inactivation du chromosome X (XCI) est un mécanisme qui permet l’extinction transcriptionelle d’un des deux chromosomes X chez la femelle. XCI est régulé par une région spécifique nommée centre de l’inactivation du chromosome (Xic), contenant plusieurs gènes produisant de longs ARNs non codants (lncRNAs). Parmi ces lncRNAs, le transcrit Xist est l’effecteur principal pour l’XCI. Xist peut s’accumuler en cis sur le chromosome et recruter la machinerie qui permettra l’initiation et la propagation de l’extinction transcriptionnelle à l’échelle du chromosome.Le laboratoire d’accueil a identifié un nouveau gène du Xic qui produit le lncRNA Ftx. Dans cette étude, on a pu montrer que l’inactivation du chromosome X est fortement perturbée dans les cellules Ftx-/- et s’accompagne par une forte baisse du niveau d’expression et d’accumulation de Xist. Dans ce contexte, certaines cellules parviennent à maintenir l’expression de Xist mais le profil de couverture du chromosome X par Xist est anormal, présentant un profil diffus ; ceci est associé à une extinction transcriptionnelle déficiente des gènes liés à l’X. Dans les lignées hétérozygotes Ftx+/-, l’expression et l’accumulation de Xist est aussi affectée mais dans une moindre mesure, si bien qu’il apparaît que le nombre de copies de Ftx soit important pour sa fonction. Par ailleurs, l’inactivation du chromosome X dans les cellules Ftx+/- est biaisée de telle sorte que le chromosome X portant une copie fonctionnelle de Ftx est préférentiellement inactivé, suggérant un rôle en cis de Ftx. Ces résultats montrent que Ftx est un activateur de Xist et qu’il est essentiel pour la mise en place de l’inactivation
X-chromosome inactivation (XCI) is a female-specific, chromosome-wide regulatory process that, in eutherians, ensures dosage compensation for X-linked genes between sexes. XCI is controlled by a cis-acting locus on the X-chromosome, the X-inactivation center (Xic), enriched in genes producing long non-coding RNAs (lncRNAs). The Xic-linked gene Xist is the master player of XCI, and produces a lncRNA that accumulates in cis on the X-chromosome and recruits the machinery responsible for initiation and propagation of silencing.The laboratory has identified an additional Xic-linked non-coding gene, Ftx. In this study, we could find that, in female Ftx-/- lines, XCI is strongly impaired, with a significant decrease in the levels of Xist expression and in the percentage of cells showing normal Xist accumulation patterns. Importantly, a high proportion of the cells that still retain Xist expression show abnormal X-chromosome coating and a decreased ability to silence X-linked genes. These data reveal that Ftx is a positive Xist regulator and it is required for proper XCI establishment. In female Ftx+/- lines, the levels of Xist expression and the percentage of cells showing normal Xist accumulation patterns are also decreased, albeit to a lower extent compared to Ftx-/- lines, suggesting that Ftx works in a copy-dependent manner. In addition, a high proportion of Ftx+/- cells display skewed X-inactivation, with preferential inactivation of the wild-type X chromosome. This suggests that Ftx role on Xist accumulation is mostly restricted in cis. Taken together, these results demonstrate that Ftx is required for XCI establishment, where it functions as a strong Xist activator

Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides, classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des LARNnc dans différents systèmes eucaryotes. Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84. Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil d'activation du promoteur PHO84. Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs (ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7 comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur. De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur.
Transcription is the initial step in gene expression and is subject to extensive regulation. Recently, analyses in diverse eukaryotes have revealed that in addition to protein coding genes, transcription occurs throughout the noncoding genome, producing non-coding RNAs of various lengths. Non-coding RNAs longer than 200 nucleotides, classified as long non-coding RNAs (lncRNAs), represent the most abundant class of non-coding transcripts, whose functions however are poorly understood. Recent studies suggest that many lncRNAs might have roles in transcription regulation. The goal of my PhD thesis was to elucidate the mechanisms of lncRNA mediated transcription regulation in different eukaryotic systems. For my first project, I investigated the role of an antisense long noncoding RNA in transcription regulation of the high-affinity phosphate transporter gene PHO84 in the unicellular eukaryote S. cerevisiae. Previous studies showed that deletion of the nuclear exosome component Rrp6 results in increased antisense expression and repression of PHO84. It was suggested that the loss of Rrp6 results in antisense stabilization at the PHO84 locus, leading to recruitment of the histone de-acetylase Hda1 and repression of PHO84. However, most of the mechanistic details of how Rrp6p functions in regulating PHO84 transcription were not understood. Combining single cell methods with biochemical and genetic approaches, we showed that antisense RNA levels are regulated primarily during transcriptional elongation by the Nrd1-Nab3-Sen1 complex, which requires Rrp6 for efficient recruitment to the 3’end of PHO84. Furthermore, we reveal anti-correlated expression of sense and antisense, which have distinct modes of transcription. In summary, our data suggest a model whereby antisense transcriptional read-through into the PHO84 promoter regulates the activation threshold of the gene. For my second project, I investigated the roles of enhancer derived RNAs (eRNAs). eRNAs are lncRNAs transcribed from enhancers that have been suggested to regulate transcription through different mechanisms, including enhancer-promoter looping, RNA polymerase elongation, and chromatin remodeling. However, no coherent model of eRNA function has yet emerged. Using MCF7 breast cancer cells as a model system, we sought to determine how estrogen (E2) induced eRNAs participate in estrogen receptor alpha (ERα) mediated transcription regulation at the single allele level. Using single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH), we revealed that upon E2 induction eRNAs are induced with similar kinetics as target mRNAs, but are localized exclusively in the nucleus, mostly chromatin associated, and are less abundant than mRNAs. Surprisingly, we found that eRNAs are rarely co-transcribed with their target loci, indicating that active gene transcription does not require the continuous synthesis or accumulation of eRNAs at the enhancer. Furthermore, using sub-diffraction-limit distance measurements, we demonstrated that co-transcription of eRNAs and mRNAs rarely occurs within a closed enhancer-promoter loop. Moreover, we revealed that basal eRNA transcription does not require ERα or the histone methyltransferase MLL1, which activates the enhancer through H3K4 mono-methylation. Altogether, our findings showed that eRNAs may play a role during promoter activation, but are not required to sustain mRNA transcription or stabilize enhancer-promoter looping interactions.

La maladie de Hirschsprung est une affection congénitale de la motilité intestinale caractérisée par un segment aganglionnaire dans le côlon terminal. Un criblage génétique par mutation insertionnelle aléatoire chez la souris nous a permis d’identifier la lignée transgénique Spot dont les homozygotes souffrent de mégacôlon aganglionnaire. L’analyse d’intestins d’embryons mutants a révélé une baisse de prolifération et un délai de migration des cellules de la crête neurale entériques (CCNe) progénitrices dus à leur différenciation gliale précoce, entrainant un défaut de colonisation de l’intestin et une aganglionose du côlon. Le séquençage du génome Spot indique que le transgène s’est inséré à l’intérieur du locus K12-Nr2f1 sur le chromosome 13, une région dépourvue de gènes préalablement associés à la maladie, perturbant également une séquence non-codante très conservée dans l’évolution. K12 est un gène d’ARN long non codant (ARNlnc) et antisens du gène Nr2f1, lui-même impliqué dans la gliogénèse du système nerveux central. Le séquençage du transcriptome des CCN a montré une surexpression de Nr2f1 et des formes courtes de K12 chez Spot et des essais luciférase ont révélé l’activité répressive de l’élément conservé. Nous avons observé l’expression de K12 dans les CCNe et sa localisation subcellulaire dans des zones transcriptionnellement actives du noyau. Avec l’émergence des ARNlnc régulateurs, ces données nous permettent de pointer deux nouveaux gènes candidats associés à une différenciation gliale prématurée du SNE menant au mégacôlon aganglionnaire, en supposant que la régulation de Nr2f1 se fait par son antisens, K12.
Hirschsprung disease is a congenital intestinal motility disorder characterized by an aganglionic segment in the distal colon. A genetic screen performed via random insertional mutagenesis in mice allowed identifying the Spot line, whose homozygotes suffer from an aganglionic megacolon. The analysis of mutant embryonic intestines revealed a decreased proliferation rate and a delay in migration of the enteric neural crest cell (eNCC) progenitors, secondary to their early glial differentiation, resulting in failure to properly colonize the intestine. Sequencing of the Spot genome indicated that the transgene was inserted into the K12-Nr2f1 locus on chromosome 13, a region devoid of genes associated with the disease, and disrupted in addition a highly conserved non-coding sequence. K12 is an uncharacterized long non-coding RNA (LncRNA) gene antisense to the Nr2f1 gene, which is involved in gliogenesis in the central nervous system. Sequencing of the eNCC transcriptome revealed an overexpression of Nr2f1 and short forms of K12 in Spot, and luciferase assays showed repressive activity of the conserved element. We observed the expression of K12 in the eNCC and its subcellular localization in transcriptionally active zones of the nucleus. With the recent emergence of LncRNA regulators and supposing that the regulation of Nr2f1 is done by its antisense K12, these data allowed us identifying two new candidate genes associated with a premature glial differentiation leading to aganglionic megacolon.

Les télomères forment la structure qui coiffe les extrémités des chromosomes. Ils sont essentiels pour protéger l’intégrité génomique. À cause du problème de fin de réplication, les télomères raccourcissent à chaque division cellulaire, menant à l’arrêt du cycle cellulaire, à la sénescence et à la mort cellulaire. Pour contrevenir au raccourcissement des télomères, les cellules immortalisées et hautement prolifératives, ainsi que la plupart des eucaryotes unicellulaires tels que Saccharomyces cerevisiae, expriment la télomérase, un complexe ribonucléoprotéique enzymatique qui rallonge les télomères. Pour permettre le maintien de la longueur des télomères et assurer l’intégrité du génome, plusieurs régulateurs contrôlent le recrutement et l’activité de la télomérase, s’assurant du ciblage précis de l’activité de la télomérase à ses substrats. Aux télomères, un dérèglement des mécanismes de régulation de la télomérase peut mener au raccourcissement des télomères, à des fusions de chromosomes et au développement d’un potentiel cancéreux. La télomérase peut aussi agir aux cassures d’ADN où son activité se traduit par l’ajout de novo d’un télomère et conduit à la perte de matériel génétique, à l’instabilité génomique et possiblement à la mort cellulaire. Son recrutement et son activité y sont donc inhibés. Les mécanismes par lesquels la cellule régule l’activité de la télomérase aux télomères et aux cassures d’ADN restent encore peu connus. De plus, en réponse à certains stress, ces mécanismes peuvent être altérés. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour but d’étudier les régulateurs de l’activité de la télomérase et l’impact de certains stress cellulaires sur cette régulation. Dans la première partie, nous avons étudié la localisation de l’ARN TLC1, la sous-unité ARN de la télomérase, à travers le cycle cellulaire chez S. cerevisiae. Alors que cet ARN est majoritairement dans le nucléoplasme en G1/S, il démontre une accumulation nucléolaire en phase G2/M du cycle cellulaire. Chez la levure, la réparation des cassures d’ADN se fait majoritairement par recombinaison homologue et est exclue du nucléole. Dans ce contexte, nous avons formulé l’hypothèse que l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléole en G2/M constitue un mécanisme par lequel l’ajout de novo de télomère est inhibé aux cassures d’ADN. Nous avons fixé comme buts de caractériser les mécanismes régulant l’accumulation nucléolaire de l’ARN TCL1 et d’étudier comment la présence de dommage à l’ADN influence cette régulation. Nous avons pu montrer que la localisation nucléolaire de l’ARN TLC1 dépend de l’hélicase Pif1, de la protéine de la recombinaison homologue Rad52 et que la présence de dommage à l’ADN et l’absence de Rad52 influence le trafic nucléaire de cet ARN. Dans ces conditions, la protéine de la recombinaison homologue Rad51 permet l’accumulation de Cdc13 aux cassures et favorise l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléoplasme et aux cassures d’ADN. Cette accumulation est dépendante de la SUMO ligase Siz1 et mène à une augmentation d’ajout de novo de télomère aux sites de cassures d’ADN. Pour pouvoir quantifier l’augmentation d’ajout de novo de télomère, nous avons développé une nouvelle approche basée sur le séquençage haut-débit de type Illumina pour identifier et quantifier les événements d’ajout de novo de télomère sur le génome entier de manière non-biaisée. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons étudié les mécanismes contrôlant l’expression d’un régulateur de la télomérase nommé TERRA (telomeric repeats containing RNA). TERRA est un long ARN non-codant qui est transcrit à partir des régions sous-télomériques jusqu’aux répétitions télomériques. Chez S. cerevisiae, l’expression de TERRA est inhibée au niveau de sa transcription par le complexe SIR et au niveau de sa dégradation par l’exonucléase Rat1. Pourtant, les télomères courts expriment TERRA à des niveaux élevés. Cette augmentation de l’expression de TERRA permet de concentrer et de cibler l’activité de la télomérase aux télomères courts. En étudiant l’expression de TERRA, nous avons remarqué que les télomères exprimant cet ARN démontrent une perte prématurée de leur cohésion en phase S du cycle cellulaire. Nous pensons que l’organisation structurelle des télomères et, plus particulièrement, la cohésion télomérique participe à la régulation de l’expression de TERRA. De plus, plusieurs groupes ont montré que l’expression de TERRA était régulée en réponse à plusieurs stress, de façon indépendante de la taille des télomères. Dans ce contexte, nous formulons l’hypothèse que le stress oxydatif et les changements métaboliques induits durant la transition diauxique influence l’expression de TERRA. Pour cette partie de la thèse, nous avions comme but d’étudier comment l’expression de TERRA étaient régulé par les changements métaboliques comme la transition diauxique et d’étudier le rôle joué par le complexe de la cohésine dans la régulation de l’expression de TERRA. Nous avons montré que les télomères courts montrent une perte de cohésion prématurée en début de phase S, ce qui favorise l’expression de TERRA en cis. Alors qu’une perte de fonction partielle de la cohésine résulte en une augmentation de l’expression de TERRA, la rétention forcée de cohésine à un télomère court réprime sa transcription. Cette perte de cohésion aux télomères courts est dépendante de Sir4 mais indépendante de Sir2, ce qui suggère que le rôle de Sir4 dans l’ancrage des télomères à la membrane nucléaire pourrait être impliqué dans ce phénomène. Nous avons également montré que la transcription de TERRA est induite durant la transition diauxique, une phase de croissance cellulaire où, suite à la déplétion du glucose, les cellules adaptent leur métabolisme en faveur de la respiration oxydative. Cette augmentation d’expression coïncide avec l’accumulation cytoplasmique de TERRA. Ensemble, les travaux présentés dans cette thèse explorent les liens entre les stress cellulaires tels que les dommages à l’ADN, le raccourcissement télomérique, le stress oxydatif et le métabolisme cellulaire, et leur impact sur le trafic de la télomérase et l’expression de son régulateur TERRA.
Telomeres constitute the structure at the end of linear chromosomes which is essential to protect genome integrity. Due to the end-replication problem, telomeres get shorter with every cell division, leading to cell cycle arrest, senescence and cell death. To counteract telomere shortening, highly proliferative cells and most unicellular eukaryotes, like Saccharomyces cerevisiae, express telomerase, a ribonucleoprotein enzyme that elongates telomeres. Many regulatory pathways affect telomerase activity and recruitment to assure precise targeting of telomerase activity to its proper substrate, the telomeres. Impairing these pathways can lead to telomere shortening, end-to-end chromosome fusions and immortalization. Telomerase can also be recruited at double strand breaks (DSBs), where its activity leads to de novo telomere additions which induce genomic instability, loss of genetic information and possibly cell death. For this reason, telomerase recruitment and activity is strongly inhibited at DSB. However, the mechanisms behind this regulation are still poorly understood. Furthermore, many cellular stresses affect telomerase regulation at telomeres and DSBs. Our goal is to study the regulation of telomerase activity and the impact of cellular stresses on this regulation. In the first part of this thesis, we looked at the cell cycle localization of the Saccharomyces cerevisiae RNA subunit of the telomerase, TLC1 RNA. While TLC1 RNA is mostly in the nucleoplasm in G1/S, it accumulates in the nucleolus in G2/M. In yeast, the most common DSB repair pathway is homologous recombination (HR). As HR is mostly excluded from the nucleolus in G2/M, we propose that the accumulation of TLC1 RNA in the nucleolus in G2/M may represent a regulatory pathway that repress de novo telomere addition by physically separating telomerase from sites of DNA repair by HR. We aim to characterize the mechanisms by which TLC1 RNA localization is regulated and how the presence of DSB affects this trafficking. We were able to show that the nucleolar localization of TLC1 RNA is dependent on the Pif1 helicase and on the HR protein Rad52. Furthermore, we showed that the presence of DSBs and the absence of Rad52 alter the nuclear trafficking of TLC1 RNA. In these conditions, Rad51 favors the accumulation of Cdc13 at DSBs and promotes the nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA. This accumulation is dependent on the SUMO ligase Siz1 and leads to an increased addition of de novo telomere at DNA breaks. In order to identify de novo telomere addition events genome-wide, we developed an unbiased genome-wide technique based on Illumina sequencing of genomic DNA. In the second part of this thesis, we studied another regulator of telomerase activity, the long non-coding RNA (lncRNA) TERRA (telomeric repeats-containing RNA), which is transcribed from subtelomeric regions through the telomeric tracts. In S. cerevisiae, TERRA expression is controlled at the transcriptional level by the SIR complex and its degradation by the exonuclease Rat1. Nevertheless, short telomeres escape transcriptional inhibition and degradation to express TERRA at higher levels. TERRA serves as a regulator of telomerase, allowing the concentration and the targeting of telomerase activity to short telomeres. While studying TERRA expression, we observed that TERRA-expressing telomeres display a premature S-phase loss of cohesion. We propose that cohesin and telomere cohesion are regulators of TERRA expression. In addition, other groups have shown that TERRA expression was regulated in response to different cellular stress. This regulation seems to be independent from telomere length. In these contexts, we propose that oxidative stress and metabolic changes induced during the diauxic shift affect TERRA expression. We aim to study how the diauxic shift affects TERRA expression and study the role of cohesin in regulating TERRA expression. We were able to show that telomere cohesion inhibits TERRA expression and that short telomeres display a premature loss of cohesion to allow TERRA expression. This loss of cohesion is dependent on Sir4 and probably on Sir4-mediated telomere anchoring at the nuclear membrane. Additionally, we showed that TERRA transcription is increased during the diauxic shift, when yeast cells switch from fermentative glycolysis to oxidative respiration. Yeast cells in this phase also display a cytoplasmic accumulation of TERRA molecules. Altogether, the articles presented in this thesis explore the interplay between cellular stresses such as DNA damage, telomere shortening, oxidative stress and respiratory metabolism, and their roles in the regulation of the localisation and expression of TLC1 RNA and TERRA.